Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие андрогенов и карнитина в регуляции активности ферментов лизосом и цикла ди- и трикарбоновых кислот в мужских добавочных половых железах крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Звягина, Валентина Ивановна, Рязань



МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

На правах рукописи УДК 612.617.2/7.015: [577.152 + 577.164.18

ЗВЯГИНА ВАЛЕНТИНА ИВАНОВНА

Взаимодействие андрогенов и карнитина в регуляции активности ферментов лизосом и цикла ди- и трикарбоновых кислот в мужских добавочных половых железах крыс.

03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, академик РАН Е.А. Строев Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, профессор В.Г. Макарова

Рязань - 1999

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АР - андрогенные рецепторы;

АТФ - аденозинтрифосфат;

БДД - белководефицитная диета;

ВПЖ - вентральная доля предстательной железы;

ДПЖ - добавочные половые железы;

ЖК - жирные кислоты;

ИЦДГ - изоцитратдегидрогеназа;

КАТ - карнитинацилтрансфераза;

КЛаб. " коэффициент лабильности (лизосомальной мембраны);

КоА - коэнзим А;

Кр - карнитин;

КФ - кислая фосфатаза;

МДГ - малатдегидрогеназа;

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;

ЛК - лимонная кислота;

НАД1" - никотинамидадениндинуклеотид окисленный;

НАДН2 - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный;

НАДФ+ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат окисленный;

НАДФН2- никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный;

СП - семенные пузырьки;

ТХУ - трихлоруксусная кислота;

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат;

Э - эпидидимис;

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ОГЛАВЛЕНИЕ:

Страницы

ВВЕДЕНИЕ 5 - 7

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 - 34

1.1 Механизм действия андрогенов на добавочные

половые железы 8-25

1.1.1 Влияние андрогенов на белковый обмен:

синтез белка и его деградацию. 8-19

1.1.2 Влияние андрогенов на липидный и углеводный

обмен, активность ферментов цикла Кребса. 19-22

1.1.3 Влияние андрогенов на активность ферментов

лизосом в тканях крыс. 22 - 25

1.2 Биосинтез карнитина и возможный механизм

его действия. 26 - 32

1.2.1 Биосинтез карнитина 26 - 27

1.2.2 Механизм трансмембранного переноса химической группировки карнитином.

1.3 Влияние тестостерона на содержание карнитина в мужских добавочных половых железах. 28 - 34

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 35 - 43

2.1 Объект экспериментальных наблюдений 35

2.2 Модели патологических состояний и схемы

введения препаратов 35-36

2.3 Методы определения активности ферментов 36-39

2.3.1 Взятие и подготовка материала 36

2.3.2 Методы определения лизосомальных ферментов 37

2.3.3 Методы определения активности ферментов

цикла трикарбоновых кислот 38-39

2.4 Определение содержания лимонной кислоты в тканях

2.5 Определение карнитина в тканях и сыворотке крови

2.6 Определение фруктозы

2.7 Определение содержания белка

2.8 Определение сывороточного уровня тестостерона

2.9 Статистическая обработка данных

39-40

40-41

41-42

42 42 42

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 44-120

3.1 Влияние тестостерона и карнитина на активность лизосомальных ферментов и ферментов цикла Кребса в мужских добавочных половых железах

интактных животных 44 - 63

3.2 Влияние кастрации на активность ферментов лизосом и цикла трикарбоновых кислот в добавочных половых железах крыс 64 - 94

3.3 Ферментативная активность добавочных половых желез самцов крыс при различной обеспеченности

пищевым белком 95-120

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ 121 - 130

ВЫВОДЫ 131

Практические рекомендации 132

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 133-150

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования.

Гормоны относятся к важнейшим регуляторам биохимических процессов в организме, оказывая влияние на все виды обмена веществ. Изменение их баланса, обусловленное применением гормональных препаратов или эндокринными нарушениями, может привести к возникновению сдвигов в метаболических процессах вследствие изменения активности ферментов, проницаемости биологических мембран и являться фактором риска для целого ряда заболеваний, в частности мужского бесплодия.

-Андрогены играют важную роль в развитии организма и определяют формирование ряда биологических функций, в особенности репродуктивной. Это обусловлено избирательностью действия андрогенов на ткани-мишени, к которым относятся добавочные половые железы.(51, 85, 123, 183)

Чувствительными индикаторами внутриклеточного метаболизма являются лизосомальные ферменты. В работах А.В.Дмитриева, И.В.Пляхина (19, 34) показано снижение протеолитической активности в эякуляте мужчин, страдающих бесплодием, однако, динамика их изменений при различных формах мужского бесплодия, а также зависимость их активности от ан-дрогенного статуса организма остается малоизученной.

Важным метаболическим маркером функционального состояния половых желез является карнитин. Установлено положительное влияние различных комбинаций лекарственных средств, содержащих карнитин, на регенеративные процессы в пораженном эпителиосперматогенном слое канальцев семенников (28), однако, механизм этого действия остается неизвестным.

Известно, что циклу ди- и трикарбоновых кислот совместно с процессом окислительного фосфорилирования принадлежит основная роль в энергетическом обмене клетки. Интенсивность функционирования цикла в значительной степени определяется регуляцией активности НАД+ - зависимых

дегидрогеназ (37,84), возможно, что это и есть непосредственный объект гормонального воздействия, но характер влияния тестостерона и карнитина на активность ферментов цикла Кребса остается до настоящего времени малоизученным.

Решению некоторых поставленных вопросов, касающихся взаимодействия андрогенов и карнитина в регуляции активности ферментов лизосом и цикла ди- и трикарбоновых кислот в добавочных половых железах крыс самцов посвящена настоящая диссертация.

Цель исследования.

Изучить взаимодействие андрогенов и карнитина в регуляции активности ферментов лизосом и цикла ди- и трикарбоновых кислот в мужских добавочных половых железах крыс.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние тестостерона и карнитина на активность ферментов лизосом и цикла ди- и трикарбоновых кислот в мужских добавочных половых железах крыс.

2. Оценить уровень тестостерона, карнитина, активность лизосомальных гидролаз и дегидрогеназ цикла Кребса в добавочных половых железах и сыворотке крови при гонадэктомии и на фоне введения тестостерона и карнитина.

3. Исследовать влияние белководефицитной диеты и курсового введения карнитина на концентрацию тестостерона, карнитина, активность ферментов лизосом и цикла ди- и трикарбоновых кислот в добавочных половых железах и сыворотке крови самцов крыс.

Научная новизна.

Впервые дана комплексная сравнительная биохимическая оценка состояния добавочных половых органов самцов крыс: предстательной железы, семенных пузырьков и эпидидимиса в условиях различной обеспеченности организма андрогенами. Показано наличие негативной корреляции между концентрацией тестостерона и карнитина в крови. Обнаружено, что содержание карнитина в мужских добавочных половых органах контролируется концентрацией тестостерона. Расширены представления о взаимодействии андрогенов и карнитина в мужских добавочных половых железах крыс. Показано, что содержание животных на белководефицитной диете приводит к снижению уровня тестостерона в крови, а также к уменьшению содержания карнитина, лимонной кислоты, фруктозы в добавочных половых органах крыс. Определена возможность коррекции курсовым назначением карнитина метаболических нарушений, возникающих у животных с дефицитом пищевого белка.

Научно-практическая значимость работы.

Результаты работы показывают особенности действия карнитина на структуру и функции мужских добавочных половых желез в условиях различного андрогенного статуса организма и пищевого дефицита белка.

Газохроматографический метод определения карнитина может использоваться для определения карнитина в спермальной плазме мужчин для оценки функционального состояния придатков яичка. Определение концентрации карнитина в сыворотке крови мужчин может оказаться дополнительным информативным показателем в практической медицине при комплексном исследовании бесплодия.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Механизм действия андрогенов на добавочные половые железы.

1.1.1 Влияние андрогенов на белковый обмен: синтез белка и его деградацию.

Нормальный рост и функциональная активность мужских добавочных половых желез: предстательной железы, семенных пузырьков и эпиди-димиса у взрослого человека тесно связаны с содержанием в плазме крови гормона тестостерона, 90-95% которого синтезируется в клетках Лейдига яичек под влиянием лютеинезирующего гормона (124, 155). Последний выделяется гипофизом под воздействием рилизинг-гормона ЛГ, секреция которого в свою очередь зависит от концентрации половых стероидов по механизму обратной связи (113). Остальные 5-10% тестостерона образуются в надпочечниках путем: 1) непосредственной секреции; 2) превращения андростендиона в тестостерон в жировой и мышечной тканях; 3) превращения дегидроэпиандростерона (ДГЭА) и дигидроэпиандростерона сульфата в андростендион, а затем в тестостерон в эпителии предстательной железы (182).

В крови большая часть тестостерона связана с белком. Его несвязанная часть проникает в клетку путем пассивной диффузии.

Показано существование рецепторов к белку, связывающему половые гормоны на поверхности клеток предстательной железы (177) и способность комплекса андроген - белок активировать через этот рецептор систему вторичных мессенджеров, но роль этого феномена остается неизученной.

Проникший в клетку путем диффузии тестостерон превращается в ряд 5а- восстановленных метаболитов, в том числе, при участии фермента 5а-редуктазы, локализованной на ядерной мембране, в активный метаболит 5а- дегидротестостерон.

Дегидротестостерон связывается с андрогенными рецепторами (АР), при этом происходят трансформация андрогенных рецепторов и отделение от них так называемого белка теплового шока 90 (130) и, как следствие -повышение аффинности андрогенных рецепторов к специфичным энхан-серным элементам ДНК. Комплекс дегидротестостерон- андрогенный рецептор связывается с этими элементами в виде димера и инициирует транскрипцию (134).

Связываться с андрогенными рецепторами в клетках предстательной железы может также и тестостерон, но с меньшим сродством, чем дегидротестостерон (18). Остается малоизученным вопрос о биологических эффектах комплекса Т-АР в ткани предстательной железы. В мышечной и тести-кулярной тканях эффект комплекса Т-АР полноценен.У больных псевдогермафродитизмом с врожденным дефицитом 5а- редуктазы наблюдается достаточное развитие мышечной системы при недоразвитии предстательной железы (39, 59).

Уровень дегидротестостерона в клетках предстательной железы зависит не только от активности 5а редуктазы, но и от ферментов За- и ЗР-гидроксистероидоксидоредуктаз, которые обратимо превращают ДГТ в менее активные метаболиты За-диол и Зр-диол (119). Роль этих метаболитов точно неизвестна, имеются лишь данные об их возможном влиянии на уровне трансляции (38).

У взрослых уровень андрогенных рецепторов регулируется андроге-нами и эстрогенами. Эстрогены усиливают, а андрогены подавляют синтез андрогенных рецепторов, который резко повышается после кастрации и понижается при восстановлении исходного содержания (98).

На уровне взаимодействия андрогенных рецепторов с дегидротесто-стероном осуществляется конечное действие дегидротестостерона. Регуляция репликации и транскрипции гена, стимулирование митотической активности и клеточного разрастания в целом составляют клеточные про-

цессы, обусловленные внутриклеточным скоплением дегидротестостерона (97).

Механизм внутриклеточного действия тестостерона в семенных пузырьках и придатке яичка одинаков с отмеченным в предстательной, железе, причем дегидротестостерон обуславливает активацию роста и секреторной функции этих добавочных половых желез (65, 160, 162, 165, 184).

В предстательной железе обнаружены рецепторы к прогестерону (94), гормону роста (149), лютеинизирующему (163) и фолликулстимули-рующему (101, 171) гормонам, рилизинг-фактору ЛГ (173), инсулину (72), но их значение остается неясным.

Нормальной клетке необходимы пептидные факторы роста для пролиферации, поддержания жизнеспособности и осуществления клеточных функций (18). Факторы роста синтезируются в клетках и могут действовать на поверхностные рецепторы или внутри собственно клетки (аутокринным образом), рецепторы соседних клеток (паракринным путем) или на рецепторы отдаленных клеток (эндокринным путем).

Пролиферация и поддержание жизнеспособности клетки регулируются тонким взаимодействием стимулирующих и ингибирующих пара-кринных и аутокринных факторов и гормонов (58, 143, 161).

В нормальной предстательной железе клеточный рост могут стимулировать эпидермальный фактор роста (60, 178, 182), трасформирующий фактор роста а (88) и основной фактор роста фибробластов (99). Их стимулирующий эффект уравновешивается ингибирующим влиянием трансформирующих факторов роста (3 (179).

Клетки предстательной железы синтезируют эпидермальный фактор роста и рецепторы к нему (178). Эпидермальный фактор роста и родственный ему трансформирующий фактор роста а имеют общий рецептор, который кодируется геном c-erb (60,164). Рецептор эпидермального фактора роста представляет собой одновременно и тирозинкиназу, которая активи-

руется при взаимодействии рецептора с лигандом. Рецепторная тирозинки-наза физически связана с фосфотирозинфосфатазой. Эти два фермента не просто оказывают противоположное действие (тирозинкиназа фосфорили-рует белки по тирозину, а фосфатаза - дефосфорилирует), их согласованная активность обеспечивает тонкий баланс в передаче эффекторных сигналов, необходимых для клеточного роста и дифференцировки клеток (58, 182).

Результатом фосфорилирования / дефосфорилирования ключевых белков могут быть их активация / инактивация, открытие ионных каналов, экспрессия генов (150).

Индуцированная кастрацией инволюция предстательной железы сопровождается снижением содержания мРНК фактора роста эпидермиса в вентральных долях предстательной железы, а при введении крысам андро-генов содержание мРНК фактора роста эпидермиса в предстательной железе увеличивается (178). Наличие в данном органе мРНК трансформирующего фактора роста ос, рецепторов фактора роста эпидермиса, основного фактора роста фибробластов повышается в разной степени после кастрации, а также и после введения кастрированным крысам андрогенов (79).

Фактор роста фибробластов (ФРФ) - представитель семейства гепа-ринсвязывающих факторов роста (ГСФР), которое включает в себя продукты генов ГСФР-1 (кислый ФРФ), ГСФР-2 (основной ФРФ), гена т1-2, гена 1181 (ФРФ саркомы Капоши), а также ФРФ-5, ФРФ-6 и фактор роста кера-тиноцитов (99, 187).

Фибробласты предстательной железы синтезируют основной ФРФ, который способен стимулировать их рост в культуре аутокринным образом. Рост нормальной клетки предстательной железы, стимулированных основных ФРФ, ингибируется трансформирующим фактором роста (31 (99).

Относительно регуляции андрогенами продукции основного ФРФ существуют противоречивые данные. У крыс наблюдается увеличение синтеза основного ФРФ после кастрации и после введения андрогенов кастрированным животным (79,88).

Семейство трансформирующих факторов роста ß в настоящее время представлено фактором ßl (впервые обнаружен в тромбоцитах),фактором ß2 (выявлен в тромбоцитах, костной ткани и в некоторых клеточных линиях) и фактором ß3 (обнаружен во многих клеточных линиях преимущественно мезенхимального происхождения). Все эти факторы имеют общие консервативные участки и способны ингибировать клеточную пролиферацию (112, 150).

Уровень мРНК трансформирующего фактора роста ß регулируется андрогенами и эстрогенами (95, 127).

Андрогены абсолютно необходимы для развития предстательной железы и поддержания ее функции у взрослых. Удаление андрогенов из организма приводит к быстрой инволюции предстательной железы, последующее восстановление уровня андрогенов инициирует пролиферацию и восстановление и их пролиферация прежних размеров предстательной железы.

Гибель клеток предстательной железы при кастрации после восстановления уровня андрогенов являются активными биологическими процессами с характерными особенностями и активацией определенных генов в определенном порядке (71).

Особого внимания заслуживают гены, продукты которых регулируют транскрипцию других генов (c-fos, c-myc, c-jun) (96). То что они активируются и при инволюции, и при пролиферации предстательной железы, свидетельствует об их сложном комплексном взаимодействии с другими факторами, регулирующими транскрипцию (активированные лигандом рецепторы глюкокортикоидов, эстрогенов и другие пока неизвестные факторы (56, 115, 156)).

�