Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм глюкокортикоидной регуляции экспрессии генов: взаимодействие рецептора глюкокортикоидов с ДНК гена триптофаноксигеназы крысы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Механизм глюкокортикоидной регуляции экспрессии генов: взаимодействие рецептора глюкокортикоидов с ДНК гена триптофаноксигеназы крысы"

р г б од

? о ит 1995 российская академия наук

сибирское отделение институт цитологии и генетики

На правах рукописи УДК 577.218:577.113.5

МЕРКУЛОВ Василий Михайлович

МЕХАНИЗМ ГЛЮКОКОРТИКОЩНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ: ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РЕЦЕПТОРА ГЛШОКОРТИКОИЯОВ С ДНК ГЕНА ТРИПТ0ФАН0КСИГЕНАЗЫ КРЫСЫ. (03.00.15 - Генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на

соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1995

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

H.H. Колесников Институт цитологии и генетики СО РАН

кандидат химических наук В.К.Райт Новосибирский государственный университет.

Ведущая организация: Московский государственный университет.

Защита- диссертации состоится ^ 1995г. на заседа-

нии диссертационного совета Д 002.11.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, 90, проспект акад. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " ^ T99Rr_

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

А.Д.Груздев

Актуальность проблемы.

Выяснение молекулярных механизмов регуляции транскрипции генов является одной из основных задач современной биологии. Ключевую роль в этом процессе играют регуляторнке белки, факторы транскрипции, опознающие определенные последовательности ЛНК - регуляторнне элементы. Различные комбинации регуляторяых элементов в промоторных и энхансерных районах генов определяют уровень их экспрессии в зависимости от ткани, стадии развития организма и внешних воздействий. В связи с этим большое значение млеют исследования, направленные как на выявление и изучение регуляторных элементов и регуляторных районов (промоторов, энхансеров, сайленсеров) в различных генах, так и на выяснение механизмов их действия. До последнего времени при изучении этих вопросов основное внимание уделялось 5'-фланкирующей области гена. Однако, постепенно накапливается данные о том, что регуляторная зона гена не ограничена этим участком, и становится очевидной необходимость расширения исследований регуляторных возможностей внутренних и 3'-фланкирующих областей.

Рецептор глхкокортикоидов является лиганд-зависимым фактором транскрипции: после связывания с гормоном и перехода в ядро клетки он взаимодействует с опознаваемыми им участками ЛНК - элементам! глшокортикоидной регуляции (СЕЕз), что приводит к изменению уровня экспрессии содержащих такие элементы генов. Контролируя транскрипцию большого числа различных генов, глЕкокортикоиды принимают участие в регуляции большинства процессов жизнедеятельности организма. Цель работы.

Данная работа посвящена выявлению участков специфического связывания рецептора глшскортикоидов (ГР) в гене триптофан-оксигеназы (ТО) крысы, а также изучению, на примере этого гена, влияния топологии ДНК, содержащей СЕЕз, на взаимодействие с рецептором. Для ее осуществления необходимо било отработать метод очистки рецептора глюкокортикоидов, позволяющий получать недеградированный белок, обладающий высокой специфичностью к сайтам его связывания на ДНК. В задачи работы входило также определение первичной последовательности

ДНК связывающих ГР районов, ее компьютерный анализ и изучение связывания регуляторных белков, содержащихся в экстракте ядер клеток печени, с этими участками. Научная новизна работы.

В результате работа получены экспериментальные данные о существовании потенциальной регуляторной зоны в структурной части гена триптофаноксигеназы крысы. На примере этого гена впервые показано, что взаимодействие глшокортикоидного рецептора с ДНК, содержащей элементы глюкокортикоидной регуляции. может зависеть от ее топологии. Теоретическая и практическая ценность работы.

Полученные в работе результаты способствуют дальнейшему развитию представлений о структурно-функциональной организации генов и механизмах регуляции транскрипции. Вместе с име-шимися в литературе данными они указывают на необходимость расширения исследований регуляторных возможностей внутренних районов генов, а также роли топологии ДНК в регуляции их экспрессии.

Поскольку имеются основания полагать, что повышенный уровень эагрессии или гипериндуадбе льность триптофаноксигеназы могут, обедняя путь синтеза серотонина из триптофана, служить причиной целого спектра психических заболеваний [Comings et al., 1991), полученные данные также имеют значение для медико-генетических исследований, направленных на выяснение причин наследственной предрасположенности к ряду психических расстройств. Принципиально важным в этом отношении является обнаружение потенциальной регуляторной зовы в структурной части гена ТО, поскольку анализ нуклеотидных последовательностей 5'-фланкирупцей области этого гена у больных с такими нарушениями не выявил никаких отличий по сравнению со здоровыми людьми [Comings D., Медицинский центр, Дуарте, Калифорния; личное сообщение]. Апробация работы.

Результаты работы докладывались на I и II Всесоюзных конференциях "Геном человека" (1990, 1991, Переяславль- Залес -ский), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (1990. Таллин) и франко-российском симпозиуме "Регуляция

экспрессии генов" (1995, Новосибирск). Структура диссертации.

Диссертация изложена на 122 стр.. она включает 13 рисунков и 3 таблицы, список цитированной литературы содержит 221 наименование. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, выводов.

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦиГ СО РАН при частичной финансовой поддеркке из средств Государственной научно-технической программы "Приоритетные направления генетики".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Очистка рецептора глшокортикоидов из печени крыс.

Содерзание рецептора глшокортикоидов в ткани печени составляет 1/10000 от общего содержания белка. Основная трудность очистки рецептора связана с его высокой чувствительностью к протеазам, которые в больших количествах содержатся в клетках печени, наиболее богатого и доступного источника для выделения глшокортикоидаого рецептора. В результате анализа давних литератур! и апробации известных способов очистки рецептора глшокортикоидов, а такге ряда новых процедур нами была разработана оригинальная схема очистки этого белка.

«а

Согласно этой схеме цитозоль, содержаний Н-глзжокортико-ид-рецепторный комплекс (ГлРК) в присутствии Ма^МоО^, стаби-лизирупцего Ееактивированную форму рецептора (комплекс его с белками теплового шока), последовательно пропускали через фосфоцеллюлозу Р-1ИП и процион-целлшозу (Прошюн голубой МХ-й, иммобилизованный на целлюлозе Р-11). После отделения Иа^оОд и эндогенных низкомолекулярных ингибиторов активации на сефадексе ГлРК активировали нагрев анкем и наносили

на колонку с ДНК-целлюлозой. Последней стадией очистки рецептора была хроматография на колонке с фссфэцеллюлозой Р-11 (II).

В результате был получен очищенный в £000 раз препарат

глгкокортикоидного рецептора с молекулярным весом 94кДа (рисЛ), что соответствует недеградированному белку [Wränge et al., 19793. Полученный препарат обладал высокой степенью избирательности при связывании с фрагментами ДНК, содержащими GEEs, относительно не содержащих их. Предложенная нами процедура отличалась хорошей воспроизводимостью и меньшим, по сравнению с известными, расходом всех используемых в ходе выделения материалов и реактивов.

Рис. I. Электрофореграмма белков (10% ПААГ, 0,01 DS-Na, окраска серебром) фракций, соответствующих максимальному содержанию ГлРК, после хроматографии на ДНК-целяю-лоэе (1) и фосфоцеллшозе р-11 II (2).

(3) - маркеры молекулярной массы: фосфорилаза Б - 97кДа, бычий сывороточный альбумин - 68кДа яичный альбумин - 45кДа, карбоангидраза - 29кДа Стрелкой отмечена белковая полоса, соответствующая рецептору.

2. Выявление участка связывания рецептора глккоксртикоидов внутри транскршцконноа единица гена триптофаяоксигеназы крысы.

Рааее в лаборатории Г.Шютца была определена нуклеотидная последовательность участка гена триптофаноксигеназы (ТО) крысы от -1320 до +300 п.н. Авторы обнаружили два сайта связывания рецептора глккокортикоидов, расположенных на расстоянии - 450 п.н. и - 1,2 т.п.н. от точки инициации транскрипции, и показали, что эти сайты функционально активны in vitro, обеспечивая глюкокортикоидную регуляцию репортерного гена хлорамфениколацэтилтрансферазы [Danesh et al., 1987].

I 3 2 3

Рис 2. Связывание ГлРК с EcoRI-фрагментами xTOg.

А

й-

II III

L

wvt-Ir.n.H.

I

2 П wHijj»

Н Ш 5 R

с

ABC

в 2

D Е F G

V^ <

A. Схематическое изображение ДНК хТ02: закрашенные прямоугольники - экзонн гена ТО; стрелка обозначает старт транскрипции; R.L - правое и левое плечи вектора; закрашенные кружки - сайты рестрикции EcoRl: I-V - фрагменты рестрикции ДНК xTOg в порядке возрастания их электрофоретической подвижности; белый прямоугольник - секвенированкый Дэнеш и сотр. участок гена их- выявленные ими GREs; указаны сайты рестрикции SalGI и Xhol, использованные при конструировании плазмидн pTOSX.

Б. РадиЪвтаграф геля после электрофореза EcoRI-фрагментов хто2 в 0.6$ агарозе (1 - исходная ДНК, 2 - фрагменты ДНК, извлеченные из комплекса ДНК-рецептор-антититело на инакти-вированном Staphilococeus aureus).

B. Радиоавтограф геля после электрофореза в агарозе очищенных фрагментов II и III, смытых с нитроцеллшозных фильтров (1 - фрагменты, задержавшиеся на нитроцеллюлозных фильтрах после инкубации с рецептором, 2 - то же в отсутствие рецептора. 3 - исходная ДНК)

Мы исследовали связывание рецептора глгкокортикоидов с геномным' участком ДНК от -8 до +8 т.п.н. относительно старта транскрипции этого гена, клонированным в Хароне 4А в той же лаборатории [Schmid et al., 1982] (ХТ02, рис. 2А). Структурная часть включала 7 экзонов (от а до G) из 12, составляших полный ген ТО. При изучении связывания ГлРК с фрагментами ХТ02, полученными в результате гидролиза рестриктазой EcoRl, с помощью BUGR2 моноклональных антител против глшокортико-идного рецептора мы обнаружили еще один участок, специфически связывакший этот белок in vitro. В состав комплексов ГлРК-ДЯК-антитело наряду с фрагментами I и II, которые содержат выявленные Дэнеш и сотр. сайты связывания глшокорти-коидного рецептора, входит также фрагмент ill (рис. 2Б). Опыты по изучению задержки фрагментов ДНК, связанных с очищенным рецептором, на нитроцеллшозных фильтрах показали, что этот фрагмент связывается с белком даже более интенсивно, чем близкий по длине фрагмент II (рис. 2В).

Таким образом, в структурной части гена триптофаноксиге-назы крысы обнаружен участок специфического связывания рецепторов глюкокортикоидов. С целью дальнейшего изучения данного района было осуществлено определение его первичной структуры.

3. Определение нунлеотидной последовательности фрагмента III гена триптофаномсигеназы крысы и ef> компьютерный анализ.

Первичную структуру фрагмента III определяли по методу Максама м- Гилберта. Общая длина посладовательности составила 3198 п.н. Использованные нами методические приемы оказались пригодными для чтения нуклэотидных последовательностей фрагментов. длиной до 1200 п.н. Нуклеотидаая последовательность фрагмента III представлена на рис.3. Последовательность зарегистрирована в международном банке JMBL/Genebank Data Libraries под номером Х60833.

По данным [Schmid et al,, 1982], полученным в результате электронномикроскопического анализа гетеродуплекса между фрагментом геномной ДНК и мРНК, данный фрагмент содержит экзоны Е, У и G. Место расположения экзонов Е и г в опреде-

- б -

Рис. 3. Нуклеотияная последовательность фрагмента III гена триптофаноксигеназы крысы.

Нитрон 4

1 GAATTCAATTTATTCAAATTCAACTTGCCTTTTGACACAATTGCTGGGTGCTACTATCTC 61 CCTCCTTGAAAGGTGTGJCCITATCAATATTTTTAGCTCCACAACACTCTACCACACCAC 121 TCTACCTGCCCTAAACTrTAGGTGTTCAGTTATATCTGGTCCCTGCTAAACACCCCTGAC 181 TGCCTGCTTGTAGGAGCAACCTCTTTGGTCACTCCACACAAGGTCTCACATGGCTGGTTT 241 CCTTTTCTCTATCAGAAGCATGAT AAACTCTCCCTATCTGCTTGCCTCCAGGGAACCAGA 301 ACTCCCACCCAGCAATTGCTCCATGGCTTCTTTACAGACAGATCAAGAAGAAATTGGGGA 361 ACAGGACCTTAATATCATAACATCCTGTACACCTTCTAGCTGTGTCTCTTTAATTTTCTA 421 CTTTCATTTTITAAAAAATCCAGTTTGTAGTAATCTCTTGCATGTAACTCAAAATTGCTT 481 TTATCTTAAAAlTATTTAIiGGCAAAATTCAGTTCCAAAOLGTCTTTGTTAGATGTTTACACA 541 AGACTGATAGCAATACATCGTTACTCCCAATCTATATCTTCTCTAAATCCAACTGACTAC

ЭК30Н E ValAjr-gAspGluArgA3nMetleuLys 601 TCAGTATrTCAiCCTCCACCATCCCAAAATCAGGTCAGGGATGAGAGGAACATGCTCAAG ValMetThrArgJietHisArgValYalVamePheLysbeuLeuyalGlnGlnPlieSer 661 GTGATGACTCGGATGCACCGTGTGGTGGTCATCTTCAAGCTCOTGCTACAGCAGTTCTCG ValLeuGl-üIhrMefrhrAlaLeuAspPh.eAsnAspPhe Интрон П

721 GTTCTGGAAACAATGACIGCCXTGGACTTCAATGACTTCAGGTGTGTGCTXCTCAGTATC 781 TCAICCAGGTTCTGIAAAAGAAGAACATGTGTGGGATGAAAGAAGTCCTTCTACl'AGCAT 841 CTGAGGGAAACTTGGAGCATTGATCACAAATACTTCAGAAGTGGTTAAAAACATTCCATG 901 ACTTATTTTTAGATTCAAAACTAGTTGAACAACTAATTTCAGTTTATCATCATGTGTCCT 961 CTTITTCATAGCAAAGCTTATTAGATGTGAAATGGCTTAAATAAGCTTATGATATAAAAA 1021TATGAGAAATATCAGTAATATATAAATAAAAATGACAACTAAAATATCAGTATTCATTAT 1081ATGCTGTCAATTTTAGCTTTAACCTCCTAAGC ACACAAAGCCACCTGTATAT'GTCTGTGT 1141 GTTCATATGTACAXCTGAATATGGTCTTACATCTrTAAAATCCACACATGCAAGAATTTT 1201TTTCTAAAGTTAAATAAGAAAATTTCTCAATTTAAAATTAATTTAAAAGGAATCTATCAT 1261ACTGTATAATAGGCAAAACTTCAAATAAGATTCATAGXAAAAAAATGAAGTTGAATTATT

- 7 -

1321TGTGGTAGTGGCTAAGAAATTAAAATCTCAACATCACIIAGGGGATTTAGAAGATATAAG 1381AGTTTÏGATGGTTÎAGÎAACAÎCTCÎGGTCATGTÎGACTGGGTCTGGCAGÎATÏTCAGTG 1441TTTGTAGTTGTTTTATCTCACTGACACCGATCTAGGTAGGAGGTTAAATGATGACATTCA 1501TGATTAGAATGGGTAGGTAGGATTAAAAAATATCTGTATAAAATCATTTGACACTGTGGA 1561AMCACAATTTCCTAATAMCACCAGTCTTTMCTTAGGAAGAAAAAGTGATACATAAAT 1621GCATACTATTATTTATGTG!TATATTTAATCAATGTTTTCTAGTGGGAAGTTATATATTAT 1681GTCTATAAATCAATACATTCTACAATATATTATATATTAAAATATATGACATTTCATAAC 1741TATCGAAAGTTCTAACCAACTTCAAATTGGTCCACAGTGACAATGATGTTTAAATAATTC 1801ATITTTCTTATTTATATAAGAAGTTTCTCATGTAGAGTCCAGTTGCCTGTCTGCCCCTGA 1861CAGATATÏCTGACAAACCAÏTTTTTTTAGAAGAAACCATACAATGATTAAAAAAAAAATC

ÖK30H F ArgGluIyrLeuSerProAlaSerG 1921TCATCTTTTCAAACrTGCTTTTTTCTTCCCMCTCAGAGAGTACCTGTCTCCAGCATCAG lyPheGlnSerleuGlnPheArgl^xiLeuGluAsriLysIleGlyValLeuGlnSerLexiA 1981GCTTCCAGAGTCTTCAGTTCCGGCIGCTAGAAAATAAGATAGGTGTTCTTCAGAGCTTGA rgValProT^AanAr^ysHisTyrArgAepAsnPheGluGlyAspTyrAsnGluLeuL 2041GAGTCCCTTACAACAGGAAACACTATCGTGATAACTTTGAAGGAGACTACAATGAGCTGC

euXeuLysSerGluGlnGluGXnThrl^iiLeuGlnLeuYalGluVAL Интрон 6 21о1tgctg.uatcggagcaggagcagacgctatxgcagciggtggaggTaagagcacatgaac 2161agcctctcaagtagcactccaacctacttgtaggatagtgtttgttgtattagaagtcta

2221ACACTCITATCAAAATGGTGTTGCTTTCATGArAAACAAAGACAGATAAAAAACCTACTA

2281gacttctaattgagctxactgaaacatttaaaatattaagaatcttactctgaaattcag

2341CAAGATTTATATAATTGTATTTCATTATCTAAGAACTACATCATGTCATTAAATTATTCT

2401atcaaatattcctattgagaaatatacaattagctgatttcttgccttgattatgtttga

2461TTATTCAATCAACTTTGGTTCTCTGAAATATAACATAATTGAAAAATTGTACTGAGAATT 2521TTCATTAATTAAACÇACCGGAATGTTCTTGTCATGATAATTCCCTTCTTATTCAAATTTT 2581CTGGGAATTTATAAAGTGTTTATGGATGGTTAATTÎGATTTÎTTATGATCGTATAArAGA 2641AGAATTGTCTTGATTTTTATCACTAAACTTTACTCTTAGAAATTAAAATTTCTCTCGAGT 2701GAATTAGGATTCCTTTAATGTGCTGAGTGTTGTGTGAATTTAGGCTACTATTGTCTACAT

2761ACTATAAAAC.AACTTATTAAGATGGAGAAAAAAATGAATAAAAAGCTGATTTCAAAACTA

2821TATGCATGTTAAGAAACAAACAATAGGTGTGTATAAAGTCAGTTTGATTTCTATGCTTCA

2881AGGTCATTTGCAATGTTAGAATGATTGTAGGAAGGGGTCCAGAGATGGCTAAGTGGTTAA

2941AAGAACTTACATCTTTCCATGGTTAATAATTTAGTAAAACAGTAAAATAGTAGACAAAGA

3001ATATTTGTGTTTTTCTAAATTAACACAATGAAGGAGAAAAAGGTTTACAAGTAAGCTAAC

ЭК30Н G TrpLeuGluArgThrProGluT.euGluProHisGlyPheAsnP

3061ATGTTTCTTAAAATTAATGGCTGGAACGCACACCTGGCTTAGAGCCACATGGATTCAATT

heTrpGlybysPheGluXysAsnlleLeuLysGlyLeuGluGluGluPheLeulysIleG

3121TCTGGGGAAAGTTTGAAAAAAATATCTTGAAGGGTCTGGAAGAGGAGTTCCTAAAGATTA

IhA Интрон 7

3181AGGTAACTATGAATTC

Жирннм шрифтом в позиции 2147 выделена замена цитозина [Maezono et al., 1990] на тимин, приводящая к замене Ala на Val в позиции 207 аминокислотной последователь-

ZIOCTH.

Участки гомологии с консенсусом GPE подчеркнуты.

ленной нам'л нуклеотидной последовательности было установлено с помощью комплексного метода, включахтего поиск сайтов сплайсинга по консенсусу и с помощью частотных матриц, поиск терминирующих кодонов и анализ частот встречаемости moho-, ли—, ^ри- и гексануклеотидов, характерных для 5' и 3'-фланкирующих районов, экзонов и интронов, разработанного В.В. Соловьевым (Теоретический отдел, Институт - цитологии и генетики СО РАН). Сопоставление полученной нами первичной структура с нуклеотидной последовательностью кДНК гена трип-тофаноксигеназы крысы, определенной Маезоно и сотр., [Maezono et al., 1990] подтвердило правильность локализации этих экзонов, а также позволило установить границы экзона G. Единственное различие в первичной структуре экзонной части фрагмента III и данной кДНК, состоит в том, что в конце экзона F в нашем случае находится тимин, а у Маезоно и сотр. -цитозин, что в позиции 207 аминокислотной последовательности кодирует, соответственно, остаток валина или аланина. По- 9 -

скольку обе эти аминокислоты содержат алифатичиские углеводородные группы, минимально отличалциеся по длине, такая замена аминокислотных остатков, по-видимому, существенно не скажется на свойствах белка. Поэтому представляется весьма вероятным, что обнаруженное различие в нуклеотидной последовательности связано с существованием аллельного варианта гена ТО.

Для выявления вероятных сайтов связывания глтокортккоид-ного рецептора во фрагменте III был использован метод поиска функциональных сайтов по гомологии с консенсусом (программа "Site" [Solovyev et al., 1992]). Было обнаружено 4 участка, гомологичных консенсусной последовательности ГР-связываетцих сайтов GGÏACANNNÎGÏYCÎ [ Beato et al., 1989] (подчеркнуты на рис 3; 8/12, 7/12, 6/12 и 7/12 совпадающих с консенсусом нуклеотидных пар соответственно).

С помощью этой не программы был предпринят поиск потенциальных участков связывания для других факторов транскрипции в нуклеотидной последовательности фрагмента III. Наиболее интересным результатом этого анализа оказалось выявление кластера консенсуеных последовательностей, включавшего сссас-и СААТТ-боксй, DRE и потенциальный NF1 -связываний сайт, расположенного в четвертом интроне. В непосредственной близости от этого кластера был найден еще один СААТТ-бокс» на небольшом расстоянии от которого находится наиболее близкий к консенсусу потенциальный сайт связывания ГР (рис.4А).

Поскольку такие скопления консенсусных последовательностей сайтов связывания различных трансактивирующих факторов обычно наблюдаются в регуляторных районах генов (знхансерах, сайлен-серах, промоторах) было выдвинуто предположение о функциональной значимости этого участка и с помощью метода тормо&е-ния в геле -изучено связывание с ним белков экстракта ядер клеток печени крыс.

4. Связывание белков экстракта ядер клеток печени с фрагментами ДНК энхансероподобной зоны 4-го интрона гена триптофан-оксигеназы крысы.

Экстракт ядер клеток печени крыс получали согласно [Gorski

- Ю -

Рис 4. Локализация участков связывания белков экстракта ядер клеток печени в 4-м интроне гена ТО крысы.

А

ФРАГМЕНТ 1

субфрагмент 1а САССС-ьоя t

288 CCAGGGAACCAGAAGTCCCACCCAGCAATIGGTCCATGGCTTCTTTACAGACAGAT

DR2 СААТТ-Ъох

субфрагмент 1 б

CAAGAACAAAÏÎGGGGAACAGGACCTTAATATCATAACATCCTGTACACCTTCTAG

GAATT-box GRE 399

ФРАГМЕНТ 2

400 CTGTGTCIGTITMTTTTCTACTTTCATTITTTAAAAAATCCAGTTTGTAGTAATC TCTTGCATGTAACTCAAAATTGCTTTTATCTTAAAAT 492 ФРАГМЕНТ 3

493 ATTTATGGCAAAATTCAGTTCCAAATGTCTTTGTTAGATGTTTACACAAGACTGAT AGCAATACATCGTTACTCCCAATCTATATCTTCTCTAAATCCAACTGACTACTCAG TATTTCATCCTCCACCATCCCAAAATCAggtcagggatgagaggaacatgctcaag gtgatgactßggatgcaccgtgtggtggtcatcttcaagctcctgg 708

Б 1 2 3 7 8 6

Î 2 3 4 5 6 •»'■Wsw.Wi

А. Фрагменты ДНК конца 4-го интрона гена ТО крысы, использовавшиеся в эксперименте. Стрелкой указана граница между субфрагменами 1а и 16; строчными буквами - начало экзона Е.

Б. Радиоавтограф геля после электрофореза фрагментов в 5% ПААГ. I- ДНК-проба (фрагмент 1), 2-ДНК-проба после инкубации с белками ядерного экстракта; 3-8 - то же в присутствии 50 кратного избытка конкурентной ДНК: 3 - фрагмент 1, 4-фрагмент 2, 5 - фрагмент 3, 6 - 98 п.н. фрагмент из риС18, 7 - фрагмент 16, 8 - фрагмент 1а.

et а1., 1986]. В экспериментах по выявлению участков связы вания белков экстракта ядер с помощью метода задержки ДНК-пробы в геле использовали 3 фрагмента 4-го интрона гена ТО (рис. 4А). Оказалось, что фрагмент 1, последовательность которого содержит выявленную компьютерным методом энхансе-роподобную зону, действительно является местом специфического связывания некого белка(ков) ядерного экстракта (Рис. 4Б). Сайт связывания этого же белка(ков) находится и во фрагменте 3.

Для уточнения места расположения участка, опознаваемого белком(ми) ядерного экстракта, фрагмент 1 был разделен на субфрагменты 1а и 16. Результаты экспериментов, представленные на рис. 4Б, позволили локализовать этот участок в субфрагменте 1а, содержащем кластер консенсусных последовательностей регуляторных элементов.

Эти результаты, вместе с полученными ранее данными о специфическом связывании глкжокортикоидного рецептора, свидетельствуют о возможном участии внутренних районов гена ТО в регуляции его экспрессии.

5. Влияние топологии ДНК на взаимодействие рецептора глвко-кортикоидов с фрагментом гена триптофаноксигеназы крысы.

Существование регуляторных областей, расположенных на расстоянии до нескольких тысяч пар нуклеотидов как справа, так и слева от промотора эукариотического гена предполагает существание механизма, обеспечивающего влияние далеко расположенных регуляторных элементов на транскрипцию. Таким механизмом может быть либо непосредственный контакт белков, связанных с отстоящими далеко друг от друга регуляторными районами, путем образования петли лежащей между ними ДНК, либо передача конфирмационного изменения, вызванного связыванием регуляторного белка с ДНК, вдоль ее молекулы. В обоих случаях будут происходить изменения в топологии ДНК.

По-видимому, изменения топологии ДНК должны сказываться на конформации регуляторных элементов и в связи с этим сродство глюкокортикоидного рецептора к ДНК, находящейся в различных топологических формах, может быть различным. Для

проверки этого предположения была сконструирована плазмида рТОЗХ путем встраивания в плазмидный вектор рис 19 фрагмента За1С1-ЗОю1 из ХТО^ (рис. 2А). Исследовалось связывание ГлРК с суперспирализованной, кольцевой и линейной формами ДНК. Сродство глзскокортикоидного рецептора к исследуемой ДНК оценивали по ее способности конкурировать с ДНК-целлюлозой за связывание ГлРК.

Оказалось, что только ДНК плазмиды рТО^БХ, находящейся в суперспирализованной форме, эффективно конкурирует с ДНК-целлюлозой за связывание с гормон-рецепторным комплексом; такая же плазмидная ДНК, но в релаксированной форме, уже не отличается по способности связываться с ГлРК от не содержащих СтЕЕз ДНК (рис. 5). Наблюдаемое отсутствие различий в конкурентной способности между линейными молекулами ДНК, включающими специфические сайты связывания ГлРК (рТО^Х, *ТОг>, ДНК селезенки) и не имеющими таких сайтов (рВЮ22, х), не удивительно, так как для успешной конкуренции в таких

р : <г / с л.чк,м!С1

Рис. 5. Конкуренция ДНК-целлюлозы с различными ДНК за ®Н-ГлРК цитозоля. I - суперспирализованная ДНК рТО^Х, 2 - суперспиралиэова-ная ДНК рвпзгг, 3 - линейная ДНК рТО^Х, 4 - линейная ДНК РВИ322, 5 - кольцевая х?с>2, 6 - кольцевая - х, 7 - высоко-полимешая ДН1-С селезенки крупного рогатого скота.

о

% связывания - отношение Н-ГлРК, связанного с ДНК-

о

целлюлозой в присутствии исследуемой ДНК к Н-ГлРК, связавшемуся с ДНК-целлюлозой в ее отсутствие, выраженное в %.

опытах необходима гораздо большая концентрация специфических сайтов связывания на единицу массы ДНК [Pfahl 1982, Mulvi-hill et al., 1982].

Полученные наш данные, следовательно, указывают на резкое повышение сродства рецептора глюкокортикоидов к ДНК pTOgSX, содержащей специфические сайты его связывания, в том случае, когда она находится в суперспирализованной форме.

Причины этого явления пока остаются неясными. Можно предполагать, что под действием торзионного напряжения изменяется конформация ДНК в районах GREs, способствуя повышению сродства рецептора глюкокортикоидов к этим участкам.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый метод счистки рецептора глюкокортикоидов, позволяющий с высокой воспроизводимостью получать очищенный более чем в 5000 раз препарат рецепторного белка.

2. В структурной части гена триптофаноксигеназы крысы обнаружен участок, специфически связывающий рецептор глюкокортикоидов in vitro.

3. Определена нуклеотидная последовательность содержащего этот участок фрагмента ДНК длиной 3,2 т.п.н. Последовательность зарегистрирована в EMBL/Genebank Data Libraries под номером Х60833. В результате анализа последовательности:

а) установлены границы экзонов Е, Р и G, содержащихся в данном фрагменте,

б) выявлено единственное несовпадение в первичной структуре фрагмента в сравнениии с определенной Маезоно и и сотр. нуклеотидной последовательностью кДНК, указы-вашее на возможность существования аллельного варианта гена триптофаноксигеназы крысы с заменой AlagQ7 на Val2Q7,

в) найдено четыре участка, близких по структуре консен-сусной последовательности сайтов связывания гликокор-тикоидного рецептора,

г) в 4-м интроне обнаружено характерное для энхансерных районов скопление консенсусных последовательностей ряда регуляторных элементов.

4. Выявлено два участка специфического связывания белков экстракта ядер клеток печени: один из них локализован внутри 52 п.н. фрагмента ДНК, находящегося в районе расположения энхансероподобной зоны, второй находится на расстоянии около 200 п.н. вправо от первого.

5. Впервые показано, что взаимодействие глюкокортшсоидного рецептора с ДНК, содержащей элементы глпкокортикоидной регуляции, мояйт зависеть от ее топологии.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. Плисов С,Ю., Соловьев В.В., Колчанов Н.А., Меркулова Т.И., Баранова Л.В., Меркулов В.М., Салгзник Р.И. Выявление участков ДНК, специфичных для регуляторных районов контролируемых гдхкокортикоидами генов методом компьютерного анализа //Биополимеры и клетка. 1986. Т.2, С.93-101

2. Плисов С.Ю., Меркулова Т.И., Баранова Л.В., Кумарев В.П. Меркулов В.М., Соловьев В.В., Соколенко А.А,, Салга-ник Р.И. Нуклеотидная последовательность промоторов глкжокортикоид-регулируемых генов, взаимодействующая

с глхкокортикоид - рецепторным комплексом. IX Всесоюзный симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", 1987, Черноголовка.

3. Меркулов В.М., Меркулова Т.И., Салганик Р.И. Влияние конформациг ДНК на взаимодействие глхжокортикоид-рецеп торного комплекса с глкжокортикоид-регулируемым геном// ДАН СССР. 1989. Т.306, С. 489-491.

4. Меркулова Т.И., .Меркулов В.М., Плисов С.Ю., Соловьев В.В., Селздцов И.А., Салганик Р.И. Выявление последовательностей ДНК, ответственных за связывание гля-кокортккоид-рецепторных комплексов и влияние конформации на эффективность связывания. VI Советско-итальянский симпозиум "Макромолекулы в функционирующей клетке" 1989, Ленинград.

5. Меркулов В.М., Меркулова Т.И. Выявление участка связывания глюкокортикоид-рецепторных комплексов в центральной части гена триптофаноксигеназы крысы. Влияние кон-формации ДНК на эффективность связывания. Всесоюзный симпозиум "Биохимия рецепторных систем". 1990, Таллин. С.52.

6. Плисов С.Ю., Меркулова Т.И., Баранова Л.В., Кумарев В.П., Меркулов В.М., Соколенко А.А., Кайкина И.И. Салганик Р.И. Идентификация сайта связывания рецептора глюкокортикоидов в 5'-фланкирующей области гена МП мыши: влияние нуклео-тидных замен на эффективность связывания// Молекулярная биология. 1990. Т.24, С.1109-1116.

7. Меркулов В.М., Меркулова Т.И. "Выявление участка свя-вания глюкокортикоид-рецепторных комплексов в центральной части гена триптофаноксигеназы крысы// Биополимеры и клетка. 1990. Т.6, С. 80-83.

8. Меркулова Т.И., Плисов С.Ю., Соловьев В.В., Селедцов И.А., Меркулов В.М. Идентификация и исследование нуклео-тидных последовательностей, ответственных за связывание глюкокортикоид-рецепторных комплексов и за регуляцию транскрипции. II Всесоюзн.конф.'Теном человека", I9PI, Переяславль-Залесский, C.I65.

9. Merkulov V.M., Merkulova T.I. Nucleotide sequence of a fragment of the rat tryptophan oxygenase gene showing high affinity to glucocorticoid receptor in vitro// Biochimica et Biophysica Acta. 1992. V. 1132, P. 100-102.

10. Merkulov V.M, Merkulova T.I., Mitina R.L., Kobylyans-kaya O.V., Vasilyev G.V. Regulatory elements located within rat tryptophan oxygenase gene. French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression. Novosibirsk, 1995, P. 25a.