Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белки, специфически связывающиеся с регуляторной областью гена триптофаноксигеназы крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белки, специфически связывающиеся с регуляторной областью гена триптофаноксигеназы крысы"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГ6 од

ОКТ №

на правах рукописи

ФЕДОРОВА САРДАНА АРКАДЬЕВНА

БЕЛКИ, СПЕЦ№(ЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С РЕГУЖГОРНОЙ ОБЛАСТЬЮ ГЕНА ТРЮГГОЗАНОКСКГЕНАЗЫ КРЫСЫ

специальность 03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена на кафедре биохимии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель - канд.Оиол. наук, ст.н.с. Г.И.Чихиржина

Официальные оппоненты - докт.биол.наук, ст.н.с. Т.Б.Казакова

канд.биол.наук, ст.н.с. В.М.Седова

Ведущее учреждение - Институт ядерной физики РАН

им.Константинова

Защита состоится " /3" ¿¿¿¿¿^А/_1995 г. в 16 час.

на заседании диссертационного совета К 063.57.09 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9 (ауд.90).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

19д5 г. А.Г.Марков

Автореферат разослан Ученый секретарь совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Значительный прогресс в исследовании молекулярных механизмов, обеспечивающих избирательность экспрессии генов эукариот, был достигнут благодаря изучению белков, взаимодействующих со специфическими последовательностями ДНК. В последние годы стало очевидным, что регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции осуществляется белковыми факторами, узнающими специфические последовательности в регуляторных элементах генов. Одним из условий функционирования этих белков является доступность их сайтов связывания в хроматине регуляторных областей EFelsenfeld, 19923.

Структура хроматина регуляторных областей индуцибельных гормон-зависимых генов устанавливается в процессе развития на стадиях, предшествующих экспрессии, и поддерживается в ходе клеточных генераций. Исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе структурных перестроек хроматина при подготовке генов к транскрипции, носят описательный характер, причинно-следственные отношения между структурными и функциональными изменениями в хроматине не установлены. Известно, что показателем подготовленности гена к ответу на регуляторный сигнал (компетенции к транскрипции) является присутствие в хроматине регуляторных областей специфических участков гиперчувствительности (конститутивных ГЧУ) к различным нуклеазам, появление которых не зависит от действия индуктора (Gross, Garrard, 1988]. В этих участках нуклеосомы либо отсутствуют, либо модифицированы, вследствие чего специфические последовательности ДНК становятся доступными для регуляторных белков. Процессы, происходящие в структуре хроматина гормон-зависимых генов в состоянии компетенции к транскрипции и факторы, обуславливающие это состояние, практически не изучены. В разработке этого направления представляется перспективным поиск и изучение факторов, детерминирующих структурную организацию хроматина гормон-зависимых генов и обуславливающих компетентное к транскрипции состояние этих генов. Одним из подходов к решению этих вопросов, на наш взгляд, является поиск этих факторов среди белков', специфически взаимодействующих с последовательностями ДНК конститутивных гиперчувствительных участков хроматина.

В качестве объекта для исследования ш выбрали гормон-зависимый ген триптофаноксигеназы [К.Ф.1.13.11.113 крысы (ТО). Ген ТО экспрессируется преимущественно в печени под контролем глюкокортикоидных гормонов. В хроматине 5'-фланкирующей области этого гена идентифицированы три конститутивных участка гиперчувствительности к ДНКазе 1, характеризующие компетентное к транскрипции состояние гена [Becker е.а.. 19843. Эти участки формируются в процессе развития и их появление не зависит от действия индуктора. Аналогичные гиперчувствительные участки не обнаружены в тканях, в которых ген ТО не активен.

Дели и задачи исследования. Предлагаемая работа посвящена поиску и идентификации белковых факторов гена триптофаноксигеназы, специфически связывающихся с фрагментами регу-ляторной области , содержащими последовательности, гиперчувствительные к ДНКазе 1 в хроматине печет крыс. С этой целью мы выбрали фрагменты от -466-го до -292-го и от -292-го до -178-го нуклеотида 5'-фланкирующей области гена, содержащие последовательности отдельных гиперчувствительных к ДНКазе 1 участков в хроматине печени (рис.1). Были поставлены следующие задачи:

1. Выявить в ядерных экстрактах печени белки, специфически связывающиеся с фрагментами от -466-го до -292-го и от -292-го до -178-го нуклеотида 5'-фланкирующей области гена ТО.

2. Провести очистку выявленных белков.

3. Сопоставить обнаруженные белковые факторы с известными транскрипционными факторами, описанными для генов, зкс-прессирующихся в печени.

Научная новизна и теоретическая ценность работы. В работе представлены новые данные о белках, специфически взаимодействующих с регуляторной областью (от -465-го до -178-го нуклеотида) гена ТО. Впервые показано, что белки, относящиеся к семейству ядерных факторов 1 (NF1), образуют специфические комплексы с фрагментами этой области гена.

Проведенное исследование носит фундаментальный характер. Полученные нами данные развивает имеющиеся представления о структурно-функциональной организации индущЛельных гормон-зависимых генов и белковых фактора?'., участвующих в спе-

пифической организации хроматина регуляторных областей этих генов в компетентном 1: транскрипции состоянии. Наши результаты подтверждают имеющиеся данные о том, что транскрипционные факторы семейства Ш являются компонентом регуляторной системы многих эукариотических генов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах лаборатории химии белка и кафедры биохимии Санкт-Петербургского государственного университета, на 13-м европейском совещании "Клеточное ядро" (Венгрия. 1993), на X и XI Всероссийском симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Гродно. 1990; Санкт-Петербург. 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения. обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 22 рисунка и 3 таблицы, список литературы включает 163 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Плазмиды. Фрагменты 5'-фланкирующей области гена ТО выделяли из плазмиды рТ0(Е-3,7), включающей в себя 466 п.н. фланкирующей и примерно 3,2 т.п.н. структурной области гена, и плазмиды рТ0(НР-0,6), полученной субклонированием фрагмента от -292-го до +317-го нуклеотида гена ТО из плазмиды рТ0(Е-3,7) в вектор риС19.

Фрагмент ДНК, содержащий синтетический идеальный участок взаимодействия для белков из семейства МП. длиной 319 п.н., выделяли из плазмиды рэВ51, любезно предоставленной Р.Раппом и А.Сиппелем [Кленова и др., 19893. Фрагмент ДНК из длинного концевого повтора вируса опухоли молочной железы мыши, длиной 276 п.н., содержащей последовательности для связывания глюкокортикокдного рецептора и №1, выделяли из плазмиды, любезно предоставленной М.Беато [НупеБ е, а.., 1983].

Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методом СВ1гпЬо1ш, Оо1у. 19793 с последующей очисткой в градиенте плотности хлористого цезия в присутствии бромистого этидия.

Субклонирование фрагмента ДНК из плазмиды рТ0(Е-3,7) в вектор pUCl9 проводили с использованием ДНК-лиг азы бактериофага Т4 [Маниатис, 1984].

Секвенирование ДНК проводили по методу, предложенному А.Максамом и У.Гилбертом [Максам, Гилберт, 19863.

Выделение и фракционирование белков из ядерных экстрактов печени крыс. Ядра из клеток печени выделяли с использованием 0.1% раствора неионного детергента Х-100. Белки экстрагировали из ядер раствором, содержащим 0.4 М NaCl, и фракционировали на ДЕАЕ-целлюлозе (Biorad), используя ступенчатый градиент концентрации NaCl (0.3 М; 0.6 М; 1 М NaCl). Фракцию, злюируемую 0,3 М NaCl, осаждали добавлением сульфата аммония (47,2 г на 100 мл раствора) и после диализа разделяли хроматографией на гепарин-сефарозе (Pharmacia), используя ступенчатый градиент концентрации NaCl ( 0,2 М, 0,6 М и 1,0 М NaCl). Выход белков с колонок контролировали спектрофотометрически tWhltaker, Grenum, 1980]. Содержание белка в пробах оценивали по методу Лоури [Lowry, 1951]. Белки хранили при -70°С в течение года.

Белки, злшруемые с гепарин-сефарозы 0.6 М NaCl, фракционировали на синтезированном нами аффинном сорбенте, содержащем в качестве специфического лиганда EcoRI-Taql-фрагмент (от -466-го до -178-го нуклеотида) регуляторной области гена ТО с помощью двухступенчатого градиента концентрации NaCl (1 М и 2 М).

Синтез аффинного сорбента проводили по методу, предложенному Кадонагой и Тджианом [Kadonaga,TJlan, 1986]. Концентрацию иммобилизованного лиганда оценивали радиоактивным методом.

Реакцию специфического связывания белок-ДНК проводили при комнатной температуре, используя в качестве неспецифического конкурента ДНК бактериофага А. Инкубационная среда содержала 20 ММ трис-HCl. pH 7.9. 7,5MMMgCl2. ЮО мМ NaCl, 0.5 мм ДТТ. 0.1% тритон Х-100, 10 мМ ЭДТА. 10% глицерин CShl е.а.. 1986; Schneider. 1986]. Изучаемые фрагменты ДНК метили по одному из 5'-концов с помощью полинуклеотидки-назы. фага Т4 и ATP [Максам. Гилберт. 1986]. Образо-

вание специфических ДНК-белковых комплексов контролировали

методом "торможения в геле" [Strauss, Varsbavsky, 1984]. Гели высушивали и радиавтографировали при -70°С.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В хроматине 5'-фланкирующей области гена ТО в печени крыс идентифицированы три конститутивных участка гиперчувствительности к ДНКазе 1 в положении -130/-180, - 210/-280, -420/-470 относительно стартовой точки транскрипции (рис.1) [Becker е.а., 1086], характеризующие компетентное к транскрипции состояние гена. Исходя из поставленных задач, для работы была выбрана плазмида рТ0(Е-3,7), содержащая Есо-RI-фрагмент гена ТО от -466-го примерно до +3200-го нуклео-тида .

В качестве зонда для выявления белковых факторов, специфически связывающихся с 5'-фланкирующей областью гена ТО, мы

Рис.1. Рестрикционная карта EcoRI-PstI-фрагмента гена ТО крысы ISchmld е.а., 19823. ГЧУ к ДНКазе 1, идентифицированные в хроматине печени [Becker е.а., 1984], показаны в виде белых прямоугольников. Сайты связывания белковых факторов указаны овалами. Для рецептора глюкокортикоидов (GR) и САССС-фактора (САССС) места связывания определены методом футпринтинга In vitro [Danesch е.а., 1987; Schule е.а., 19883. возможные сайты связывания для ядерного фактора 1 (NF1) определены нами с помощью компьютерного анализа.

выбрали фрагмент Есо{?1-Тач1 (от -466-го до -178-го нуклеоти-да), содержащий последовательности двух участков гиперчувствительности к ДНКазе 1. идентифицированных в хроматине.

Белки выделяли из ядер печени крыс методом солевой экстракции, обрабатывая осадок ядер раствором, содержащим 0.4 М ИаС!. Полученный экстракт наносили на колонку с ДЕАЕ-целлю-лозой. Профиль разделения ядерных белков на колонке с ДЕ-

- б -

. о,»

о, г

12 3 4 5

О(Леи здавнта (г100. 1и)

Рис.2. (А) - Профиль элюции белков, экстрагируемых из ядер печени 0,4 М ИаСл, с ДЕАЕ-целлюлозы.

(Б) - Анализ специфического связывания белков из различных фракций, полученных при элюции с ДЕАЕ-целлюлозы, с Есо-И-Тач!-фрагментом (от -466-го до -178-го нуклеотида) 5'-флан-кирующей области гена ТО методом "торможения в геле". (1) -меченый ДНК-зонд; связывание ДНК-зонда с белками из фракций ДЕ-0,3 (3), ДЕ-0,6 (4), ДЕ-1,0 (5) и фракцией несвязавшихся с ДЕАЕ-целлюлозой белков (2). „„

Инкубационная среда содержала 5-6 нг меченного [¿-^РЗ фрагмента ДНК, 900-кратный весовой избыток ДНК бактериофага Л и 13-15 мкг белка. Электрофорез в 6% полиакриламвдном геле.

АЕ-целлюлозой представлен на рис.2А. Ранее было показано, что белки, специфически связывающиеся с 5'-фланкирующей областью гена ТО, преимущественно находятся во фракции, злюи-руемой с ДЕАЕ-целлюлозы 0,3 М ИаС1 [СММггМпа. СЬеБПОкОУ, 19903. Действительно, при связывании ЕсоМ-ТачЬзонда с белками из различных фракций, полученных после элюции с ДЕАЕ-целлюлозы, специфические ДНК-белковые комплексы выявлялись во фракции, элюируемой буфером, содержащим 0.3 М МаС1 (фракция ДЕ-0,3) (Рис.2Б, дорожка 3). Наличие факторов, специфически взаимодействующих с меченным Ц-32РЗ зондом, было также показано во фракции белков, не связывающихся с ДЕАЕ-целлюлозой (рис.2Б, дорожка 2).

1.0

Ь

i г з i s

0 30 66 99 120 130 leo

rote« amena (u)

Рис.3. (А) - Профиль элюции с гепарин-сефарозн белков, осажденных (МН4) SO4 ив фракции, элюируемой 0,2 Ч NaCl с ДЕАЕ-цел-люлозы.

(Б) - Анализ специфического связывания белков из различных фракций, полученных при элюции с гепарин-сефарозы, с EcoRí-TaqI-фрагментом ( от -466-го до -178-го нуклеотвда) 5'-фланкирующей области гена ТО методом "торможения в геле". (1) - меченый ДНК-зонд; связывание ДНК зокла с белками из фракций HS-0,2 (3), HS-0,6 (4), HS-1,0 (5) и фракцией несвя-завшихся с гепарин-сефарозой белков (2).

Инкубационная среда содержала 3-5 нг меченного [>- ^РЗ фрагмента ДНК, 900-кратный весовой избыток ДНК бактериофага Л и 5-6 мкг белка. Электрофорез в 6% полиакрилачидном геле.

Для дальнейшей очистки нами была выбрана фракция белков, эдоируемых с ДЕАЕ-целлюлозы 0,3 М ИаС1 . Эту фракцию осаждали сульфатом аммония и разделяли хроматографией на гепа-рин-сефарозе (рис.ЗА). Тестирование белковых фракций, полученных при элюции с гепарин-сефарозы, на связывание с меченным []--32РЗ ЕсоК1-Тад1-фрагментом показало, что специфическая ДНК-связывающая активность обнаруживается во фракции белков, элюируемых 0,6 М ИаСЬ (рис.ЗБ ). При взаимодействии этого фрагмента с белками из других фракций образования специфических ДНК-белковых комплексов не наблюдалось.

На следующем этапе работы была проведена очистка белков, связывающихся с регуляторной областью гена ТО, методом аф-

финной хроматографии. Для этого наш был синтезирован аффинный сорбент, содержащий в качестве специфического лиганда EcoRI-TaqI-фрагмент ( от -466-го до -178-го нуклеотида) 5'-фланкирующей области гена ТО. Синтез аффинного сорбента [Kadonaga, Tjian, 19863 был проведен совместно с Мартюшиным C.B. (Институт ОЧБ, Санкт-Петербург). Эффективность связывания ДНК с матрицей, определенная радиоактивным методом, составляла 40%- 60%. Синтезированный сорбент использовали для дальнейшей очистки фракции ядерных белков, полученных хроматографией на гепарин-сефарозе (фракция HS-0,6).

Тестирование фракций, полученных алюцией с аффинного сорбента, на наличие ДНК-связывающей активности показало, что белки , специфически взаимодействующие с 5'-фланкирующей областью гена ТО, содержатся во фракции , злюируемой 1 M NaCl. Однако количество белков, полученных после очистки аффинной хроматографией было недостаточным для предполагаемых исследований. Поэтому в дальнейшей работе при изучении связывания белков с фрагментами из 5'-фланкирующей области гена ТО мы анализировали фракцию, элюируемую с гепарин-сефарозы 0,6 M NaCl (HS-0,6).

Для изучения специфичес. -ого связывания ядерных белков в регуляторной области гена ТО мы выбрали фрагменты EcoRI-HindIII (от -466-го до -292-го нуклеотида) и HindiII-TaqI (от -292-го до -178-го нуклеотида), содержащие последовательности отдельных участков гиперчувствительности, идентифицированных в хроматине (рис.1).

Выделение фрагмента HindJII-TaqI из плазмиды рТ0(Е-3,7) представлялось затруднительным из-за множественности участков расщепления для обеих рестриктаз в векторе и во вставке. Поэтому нами было проведено субклонирование меньшего по размерам фрагмента (от -292-го до +317-го нуклеотида) из плазмиды рТ0(Е-3,7) в вектор pUC19 и проведен рестриктазный анализ полученной плазмиды рТ0(НР-0,6). Частичное секвенирова-ние выделенного из этой плазмиды HindiII-TaqI-фрагмента показало, что определенная нами последовательность полностью соответствует данным литературы. В дальнейших экспериментах плазмида рТО(НР-О.б) была использована нами как источник для выделения фрагмента HindiII-TagI.

_ о

1 2 3 4 5 6 7

Рис.5 Анализ специфического связывания ядерных белков фракции НБ-О.б с Н1пс!111-ТадI (от -292-го до -1?8-го нуклео-тида) 5'-фланкирующей области гена ТО методом "торможения в геле". (1) и (7) - меченый ДНК-ЗОНД ; (2). (3). (4), (5) и (6) - связывание в присутствии 0-, 100-, 300-, 600-, 900- кратного весового избытка ДНК фага А соответственно.

Инкубационная смесь содержала 1-3 нг меченого фрагмента ДНК и 5-6 мкг белков из фракции НБ-О.б. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле.

Рис.4. Анализ специфического связывания ядерных белков ракции Н2-0,б с ЕсоИ-ШпсПП-рагментом (от -466-го до -292-го нуклеотида) 5'-фланкирующей области гена ТО методом "торможения в геле". (1) и (7) - меченый ДНК-сопд ; (2). (3), (4). (5) и (6) - связывание в присутствии 900-, 700-, 500-, 300-, 100- кратного весового избытка ДНК бактериофага Л соответственно.

.1 г з * 5 в

Результаты по связыванию ядерных белков фракции HS-0,6 с фрагментами EcoRI-HlndlII и Hindlll-Taql регуляторной области гена ТО в условиях увеличивающегося содержания ДНК фага представлены на рис.4 и 5. Специфическое ДНК-белковое взаимодействие было выявлено при связывании белков, выделенных из ядер печени крысы и очищенных хроматографией на гепа-рин-сефарозе (фракция HS-0,6) с обоими фрагментами гена.

Было изучено влияние ионной силы на образование выявленных специфичных ДНК-белковых комплексов. Наибольшая интенсивность комплексов наблюдается при концентрации NaCl в инкубационной среде 100 мМ. Повышение концентрации NaCl до 200 мМ значительно снижает образование специфических ДНК-белковых комплексов, а дальнейшее увеличение ионной силы приводит к их полному разрушению.

Известно, что в изучаемом фрагменте EcoRI-HlndlII содержится сайт связывания глюкокортикоидного рецептора [ Danesch е.а., 1987]. Поэтому в качестве специфической конкурентной ДНК мы выбрали фрагмент из длинного концевого повтора вируса опухоли молочной железы мыши (LTR MMTV). содержащий сайты связывания для рецептора глюкокортикоидных гормонов и транскрипционных факторов семейства NF1. Оказалось, что незначительное возрастание количества специфической конкурентной ДНК в инкубационной среде (до 20-кратного весового избытка по отношению к ДНК зонда) (Рис.6.дорожки 7-9),приводило к резкому уменьшению содержания комплексов. "Вытеснение" меченой ДНК из комплексов в присутствии незначительного количества (по сравнению с ДНК фага А) специфического конкурента указывает на то, что белки, образующие эти комплексы, имеют сайты связывания в специфической конкурентной ДНК.

Чтобы выяснить, относятся ли эти белки к семейству NF1, в качестве специфического конкурента мы добавляли в реакционную среду PvuII-фрагмент, содержащий синтетический идеальный участок взаимодействия для факторов из этого семейства -(5'-6ATCCTT6GCAGCTTGCCAAG-3'). Результаты связывания EcoRI-HindIII-фрагмента с ядерными белками в присутствии этого конкурента представлены на рис.6 (дорожки 4-6). Как видно, добавление в среду ДНК с канонической последовательностью

1 Z 3 456789 10

Рис.6. Анализ специфического связывания ядерных белков фракции Н5~0,б с ЕсоК1-Н1псП 11-фрагментом (от -46б-го до -292-го нуклеотида) 5'-фланкирующей области гена ТО в присутствии фрагментов ДНК, содержащих последовательности узнавания для ИП и рецептора глюкокортикоидных гормонов, метолом "торможения в геле". (1) и (10) - меченый ДНК-зонд ; (2) и (3) -связывание в присутствии 300- и 900- кратного весового избытка ДНК фага соответственно; (4), (5), (6) - то же, что на дорожке (2), но с добавлением 5-, 15-, 20- кратного весового избытка РуиП-фрагмента , содержащего синтетический идеальный участок узнавания для МП соответственно; (7), (8). (9) - то же, что на дорожке (2), но с добавлением 5-, 15-, 20- кратного весового избытка ЕсоШ-ВатШ-фрагмента, содержащего последовательность узнавания для ЫП и глюкокортикоидного рецептора,,^

Инкубационная смесь содержала 3-5 нг меченного ЛР] фрагмента ДНК и 5-6 мкг белка т Фракции Н5-0.6. Электрофорез в 57. полиакриламидном геле.

для связывания белков семейства NF1 препятствует образованию всех специфических комплексов.

При постановке аналогичных опытов с HindiII-TaqI -фрагментом в качестве специфического конкурента использовали также PvuII-фрагмент, содержащий сайт узнавания факторов семейства NF1 и немеченый тестируемый фрагмент. Результаты опытов представлены на рис.7. При сопоставлении результатов, полученных при связывании ядерных белков с HindiII-Ta-qI-фрагментом в присутствии "потенциального" и "истинного" конкурентов видно, что в обоих случаях специфическая ДНК

2 3 45е 788

Рис.?. Анализ специфического связывания ядерных белков фракции HS-0,6 с Hindi II-TaqI-фрагментом (от -292-го до -178-го нуклеотида) 5'-фланкирующей области гена ТО в присутствии фрагмента ДНК, содержащего последовательность узнавания для NFI методом "торможения в геле". (1) - меченый ДНК-зонд ; (2) и (3) - связывание в присутствии 300- и 900- кратного весового иэбытка ДНК фага А соответственно; (4), (5), (6) -то же , что на дорожке (2), но с добавлением 5-, 15-, 20-кратного весового избытка Pvul¡-фрагмента , содержащего синтетический идеальный участок узнавания для NF1 соответственно; (7), (8), (9) - то же, что на дорожке (2), но с добавлением 5-, 15-, 20- кратного весового избытка немеченого Hindi I I-Taql-фрагмента.

Инкубационная смесь содержала 3-5 нг меченого С -32РЗ фрагмента ДНК и 5-6 мкг белка из фракции HS-0,6. Электрофорез в 6% полиакриламидном геле.

препятствует образованию всех ДНК-белковых комплексов. Полное вытеснение меченого фрагмента из комплексов наблюдается уже при 5-кратном весовом избытке специфического конкурента.

Исходя из этих результатов можно заключить, что фрагменты из 5'-фланкирующей области гена ТО, содержащие последовательности конститутивных Г ЧУ , специфически связывают белковые фактор(ы), относящиеся к семейству ЫП.

Чтобы проверить, присутствуют ли белки из этого семейства во фракции белков, элюируемых с гепарин-сефарозы 0,6 М N801, мы исследовали взаимодействие меченного [¿-Э2р] Руи-

I¡-фрагмента, содержащего синтетический идеальный участок

узнавания для №1. с белками из этой фракции (рис.8). При связывании этого фрагмента с белками из фракции НБ-0,6 образуются множественные специфические ДНК-белковые комплексы. Тестирование различных белковых фракций, полученных при элюции с ДЕАЕ-целлюлозы и гёпарин-сефарозы,';:на''связываниё: с мё-ченным [¿-32Р] РуиП-фрагментом показало, что ДНК-связываю-щая активность обнаруживается в тех же'фракциях,"'"в "которых

1 2 3 v

Рис.8. Анализ специфического связывания ядерных белков фракции HS-0,6 с Pvu-II-фрагментом, содержащим- синтетическую идеальную -последовательность , узнавания для NF1, методом "торможения в геле". (1) -меченый ДНК-зонд; (2), (3), (4) - связывание в присутствии 0-, 300-, 600- кратного весового избытка ДНК бактериофага л

соответственно. ......'---- - - - -

Инкубационная смесь содержала 3-5 нг меченного Р] фрагмента и 5-6 мкг

белков из фракции HS-0,6. Электрофорез в 6Z полиакриламидном геле.

наблюдалось связывание с ЕсойЫадЬфрагментом.

Проведенный нами компьютерный анализ 5'-фланкирующей области гена ТО (от -1320-го до +300-го нуклеотида) по программе "0НА313" показал наличие двух возможных участков-взаи-модействия с факторами семейства №1 (Рис.1) в изучаемой области. Они локализованы в положении -405/-388 и -194/-190 относительно стартовой точки''транскрипции. '

Наиболыпий интерес," ка наш-взгляд, представляют данные, показывающие образование множественны* Комплексов •щзк'Г!Шзй-вании белков из семейства Ш с фрагментами регуляторной области гена ТО (рис.4' и 5). мы полагаем, что-множественность выявляемых нами комплексов объясняется способностью факторов из этого семейства образовывать олигомеры за счет белок-белковых взаимодействий. Исследователями' отмечалась'ГКленова -й др., 19893 способность белков семейства №1 к образованию мультимеров. - :

Наши исследования также показали, что в регуляторной области гормон-индуцибельного гена ТО присутствуют по крайней мере два участка, с которыми взаимодействуют транскрипционные факторы семейства ЫП. Наличие нескольких сайтов связывания для факторов этого семейства в регуляторной области обнаружено и для других гормон-зависимых генов. Такие участки выявлены в генах тирозинаминотрансферазы [Кленова и др., 1989] и лизоцима [Вогдшеуег е.а., 19843.

Создается впечатление, что транскрипционные факторы семейства МР1 являются обязательным компонентом регуляторной системы генов, контролируемых гормонами. Можно предположить, что функция этих факторов состоит в поддержании структуры конститутивных участков гиперчувствительности в хроматине этих генов, что делает возможным восприятие регуляторного сигнала. Множественность участков узнавания для факторов семейства МП в регуляторных участках гормон-индуцибельных генов, а также способность белков из этого 'семейства к образованию мультимеров, позволяет предположить, что эти факторы могут обеспечивать "сближение" участков ДНК и, таким образом, способствовать передаче регуляторного сигнала к транскрипционному аппарату■РНК-полимеразы II за счет белок-белковых взаимодействий.

ВЫВОДЫ

1. Проведена очистка ядерных белков печени, специфически связывающихся в 5'-фланкирующей области (от -466-го до -178-го нуклеотвда) гена ТО хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, гепарин-сефарозе и синтезированном нами аффинном сорбенте, содержащем в качестве специфического лиганда фрагмент 5'-фланкирующей области гена (от -466-го до -178-го нуклеотвда) .

2. Методом "торможения в геле" показано, что ядерные белки печени образуют специфические комплексы при взаимодействии с фрагментами 5'-фланкирующей области (от -466-го до -292-го и от -292-го до -178-го нуклеотвда) гена ТО.

3. При образовании комплексов обнаружена специфическая конкуренция фрагментов 5'-фланкирующей области (от -4бб-го

до -292-го и от -292-го до -178-го нуклеотида) гена ТО с фрагментом, содержащим синтетическую последовательность (5'-GATCCTTGGCA6CTTGCCAA6-3'), узнаваемую белками из семейства ядерных факторов l( NF1). Во фракции ядерных белков печени, очищенных хроматографией на гепарин-сефарозе, методом "торможения в геле" выявлены белки, специфически связывающиеся с фрагментом, содержащим указанную синтетическую последовательность . Компьютерный анализ по программе "DNAS1S" показал, что изучаемые фрагменты гена ТО содержат специфи-'-icCiiii^ узнавс^^лые Солками из семейства

NF1 в положении -405/-388 и -194/-190 относительно стартовой точки транскрипции.

Эти факты позволяют заключить, что белки, ответственные за образование специфических комплексов с фрагментами регу-ляторной области гена ТО, относятся к семейству ядерных факторов 1 (NF1).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДйССЕРТАП©'

1. Романовская Е.В., Федорова С.А., Чихиржина Г.И. Влияние различных факторов на гиперчувствителънзе состояние ре-гуляторнсй области гена триптофаноксигеназы в системе in vllro // Тез.докл. X Всесоюзн. симп. "Структура и функции клеточного ядра". Гродно, 1990. - С.65.

2. Федорова С.А., Чихиржина Г.И. Идентификация ядерных белковых факторов, специфически связывающихся la vitro с Фрагментом 5'-фланкирующей области гена ТО крысы // Вестник СПбГУ. Сер.3. 1992, вып.4. - С.66-69.

3. Chihirzhlna G. 1.. Fedorova S. А., Romanovskaya E.V. The effect of proteins from the NF1 family on chromatin structure organisation of- the 5'-flanking region of the tryptophan oxygenase gene 1/ In: "13th European Workshop on the Cell Nucleus". Hungary, 1993. -P.16.

4. Федорова С. A., Романовская Е.В., Чихиркина Г.И. Ги-перчувствителыюе состояние в хроматине регуляторной области гена триптофаноксигеназы и белки из семейства факторов NF1 // XI Всеросс. симп. "Структура и функция клеточного ядра". Санкт-Петербург, 1993. Литология. - 1993. - Т.35, N.10,-

С. 99.

5. Чихирлздна Г.И., Федорова С. А., Чесноков И.Н., Романовская Е.В. Ядерные белки, специфически связывающиеся с ре-гуляторной областью гена триптофаноксигеназы // Биохимия. -

1993. - Т.58, ВЫП.З. - С.392-398.

6. Чихиржина Г.И., Романовская Е.В., Федорова С.А. Гиперчувствительное к ДНКазе 1 состояние регуляторной области гена ТО в системе in vitro . Влияние факторов транскрипции из семейства NF1 // В кн.: Биология, экология, биотехнология и почвоведение / под ред. Тихонова и др. - М.: Изд-во МГУ. -

1994. - С.148-156.