Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гиперчувствительность к ДНКазе 1 5*-фланкирующей области гена триптофаноксигеназы в системе in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гиперчувствительность к ДНКазе 1 5*-фланкирующей области гена триптофаноксигеназы в системе in vitro"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

- ГБ ОД

На правах рукописи

РОМАНОВСКАЯ ЕКАТЕРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ДНКазе 1 5'-ФЛАНКИРУЮЩЕЙ ОБЛАСТИ ГЕНА ТРИПТОФАНОКСИГЕНАЗЫ В СИСТЕМЕ IN VITRO

специальность 03.00.04 - Биохимия

ч АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

\

Работа выполнена на кафедре биохимии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель — канд.биол.наук, ст.н.с. Г.И.Чихиржина

Официальные оппоненты - докт.биол.наук, ст.н.с. С.Н.Борхсениус канд.биол.наук, ст.н.с. А.П.Перевозчиков

Ведущее учреждение - Институт ядерной физики РАН

им.Константинова

Защита состоится 11 "__¿-¿¿-СУС-__1994 г. в 16 час.

на заседании Специализированного ученого совета К 063.57.09 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9 (ауд. 90)

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан ¡у^СССЛ 1994 Г.

Ученый секретарь совета А.Г.Марков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблены. Исследование неханизков, с помощью которых в дифференцированных клетках высшего организма обеспечивается избирательное включение генов, является одной из основополагающих проблем молекулярной биологии. Молекулярно-генети-ческий подход к решению проблемы в сочетании с новейшими биохимическими методами позволили описать некоторые неханиэмы регуляции экспрессии генов эукариот. В основе этих процессов лежит взаимодействие транскрипционных факторов со специфическими последовательностями ДНК. При их связывании изменяется структурное состояние хронатина регуляторных областей генов, приводящее к изменению функционального состояния гена.

Для выяснения структурно-функциональной организации хроматина регуляторных областей как транскрибируемых, так и находящихся в компетентней к транскрипции состоянии генов, широко применяется обработка различными нуклеазани. Гиперчувствительные к нуклеазам участки (ГЧУ) являются фундаментальными элементами в организации хроматина, однако особый интерес представляют ГЧУ, локализованные в регуляторных областях генов. Характерной особенностью индуцибельных (в частности, гормон-зависимых) генов является существование в их регуляторных областях специфических ГЧУ вне зависимости от действия индуктора. Присутствие таких конститутивных ГЧУ в 51-фланкирующих областях гормон-зависимых генов [Gross, Garrard, 1988) является показателем подготовленности их к транскрипции (компетенции к транскрипции) .

Молекулярные механизмы возникновения и поддержания "открытой структуры" в конститутивных гиперчувствительных областях гормон-зависимых генов остаются не изученными. Известно, что в участках гиперчувствительности нуклеосоны либо смещены, либо удалены. Существенную роль в этих процессах играет точное расположение нуклеосом на ДНК. В литературе обсуждается вклад различных факторов (транс-действующих белков, последовательности ДНК и ее вторичной структуры) в формирование "открытой структуры" транскрипционно активного хронатина. В настоящее время для решения этих проблем делаются попытки использовать различные системы in vitro [Chasman s.a., 1990; Tsulciyama е.a, 1994),

позволяющие изучать роль каждого фактора в отдельности. Разработка этого направления представляется нам современной и актуальной.

Настоящая работа посвящена изучению in vitro гиперчувствительности к ДНКазе 1 5'-фланкирующей области горнон-зависииого гена триптофанохсигеназы [К.Ф.1.13.1.11} крысы (ТО). В 5'-флан-кирующей области этого гена идентифицированы конститутивные ГЧУ к ДНКазе 1 in vivo [Becker е. а., 1984]. Ген ТО эхспрессируется преимущественно в печени, его активность регулируется стероидными гормонами. Исходя из этих соображений, мы выбрали ген ТО в качестве надели для наших исследований.

Цели и задачи исследования^. Основная цель нашей работы заключалась в том, чтобы изучить гиперчувствительные области к ДНКаэе 1 в регуляторной области горнон-зависимого гена триптофанохсигеназы в составе рекомбинантной ДНК in vitro и проследить судьбу этих участков при реконструкции на ней нуклеосом. в связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) изучить гиперчувствительность к ДНКаэе 1 свободной рекомбинантной ДНК, содержащей 5'-фланкирующую область гена ТО, в суперспирализованной, релаксированной и линейной формах;

2} осуществить реконструкцию нуклеосокных коровых частиц на рекомбинантной ДНК, содержащей ГЧУ к ДНКазе 1 в регуляторной области гена ТОг

3) выяснить, сохраняется ли гиперчувствигельное состояние при образовании нуклеосонных хоровых частиц на рекомбинантной ДНК, содержащей регуляторнуо область гена ТО.

Научная новизна и теоретическая ценность работы^ В нашей работе впервые обнаружены ГЧУ к ДНКаэе 1 в суперспирализованной рекомбинантной ДНК, содержащей фрагмент регуляторной области гена ТО и показано, что их локализация коррелирует с локализацией ГЧУ в хроматине печени крыс in vivo. Выявлена зависимость гиперчувствительного состояния 5'-фланкирующей области геца то в рекомбинантной плаэмиде от наличия упругого напряжения в ДНК. Показано, что при реконструкции хроматина в присутствии гомологичных коровых гистонов фрагменты гена ТО из структурной и регуляторной областей вовлекаются в нуклеосомную организацию, вследствие чего снимается гиперчувствительное состояние в ДНК

регуляторных областях гена ТО. Полученные нами результаты представляет интерес в связи с тем, что, используя рекомбинант-ную ДНК, содержащую 51-фланкирующую область гена ТО, можно моделировать в системе in vitro события, происходящие в ядре на уровне хроматина. В частности, можно изучать действие транс-действующих белковых факторов на с-руктурнуо "организацию хроматина регуляторной области гормон-зависимого гена ТО в процессе реконструкции на ней хроматина.

Работа носит фундаментальный характер. Полученные результаты по локализации ГЧУ на суперспирализованной рекомбинантной ДНК развивает представления о роли в индукции гиперчувствительного состояния ДНК нуклеотидной последовательности ДНК, ее вторичной структуры и подтверждают имеющиеся данные о том, что для возникновения гиперчувствительных областей в хроматине необходимы дополнительные факторы. Полученные нами данные расширяют имеющиеся представления о структурных изменениях хроматина регуляторных областей гормон-зависимых генов в компетентном к транскрипции состоянии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах лаборатории химии белка и кафедры биохимии Санкт-Петербургского государственного университета, на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), на 13-м европейском совещании "Клеточное ядро" (Венгрия, 1993), на XI Всероссийском симпозиуме "структура и функция клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993).

Публикации. По тема диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит иэ введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 131 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков, список литературы включает 133 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гиперчувствительные к нуклеазам участки (ГЧУ) изучали в Pst I - Eco RI-фрагменте гена в составе плаэкиды рТО(Е-3,7), содержащей 466 п.н. фланкирующей и примерно 3,2 т.п.н. струк-

турной области гена ТО. ГЧУ тестировали с использованием метода непряного концевого мечения [Nedospasov, Georgiev, 1980].

Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методом с последующей очисткой центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия в присутствии бромистого этидия.

Реконструкцию нуклеосом проводили [Margot, Hardison, 1985] на суперспирализоваиной и линейной ДНК плаэмиды рТО(Е-3,7) в присутствии полиглютаминовой кислоты как фактора сборки нуклео-сои и коровых гистонов печени крыс. Каровые гистоны и полиглю-таминовую кислоту в соотношении 1:2 инкубировали в буфере для реконструкции в течение 45 мин при комнатной температуре, затеи в инкубационную смесь добавляли плаэмидную ДНК и инкубацию продолжали еще 2 ч при комнатной температуре. Соотношение гис-тон:ДНК составляло 1,5:1 (по весу).

Фрагментацию микрококковой нуклеаэой реконструированных комплексов осуществляли в буфере для реконструкции в присутствии 5 вм СаС1^ при 37°С в течение 30 сек - 2 мин. После остановки реакции ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформ и разделяли электрофорезом в 6% полиакриламидном геле.

Действие ДНКаэы 1 на свободную ДНК и реконструированные комплексы анализировали в буфер*» для реконструкции в присутствии 5 иМ НдС14 при 0°С в течение 2 мин, после чего пробы обрабатывали протеиназой "К", ДНК экстрагировали смесью фе-иол-хлороформ, расщепляли рестриктазой Pst X, осаждали этанолом и разделяли электрофорезом в 2% агароэном гече.

Капиллярный перенос ДНК с геля на нейлоновые мембраны (Z-probe) осуществляли в 0,4 н NaOH. Гибридизацию с меченными Р фрагментами ДНК проводили в присутствии формамида при 42 С. ДНК метили [32 рj-dHTP в реакции с фрагментом Кленова ДНК-поли-неразы 1 по выступающему 5'-концу.

Ядра из клеток печени крыс получали с использованием 1%-го раствора неионного детергента Тритона Х-100. Ядерные белки из семейства ядерных факторов 1 (UF 1) экстрагировали раствором, содержащим 0,4 М NaCl и фракционировали на DEAE-целлплоэе ступенчатым градиентом NaCl. Фракцию, элюируемую 0,3 М NaCl, осаждали 40%-ным раствором сульфатом аммония и разделяли уроматог-рафией на гепарин-сефарозе с помощью ступенчатого градиента

NaCl. Для реконструкции нуклеосомных коровых частиц использовали фракцию, элюируемуго 0,6 M NaCl, в которой выявлялась ДНК-связывающая активность.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Было проведено субхлонирование Урп X - Sal 1-фрагмеита размером примерно 5,3 т.п.н. из 5'-фланкирующей области гена ТО, клонированной в векторе Харон-4А, в вектор pUC 19 и проведен рестрикционный анализ полученной плаэмиды pTO(KS-5,3), а также плаэмиды рТ0(Е-8,5), содержащей примерно 8 т.п.н. регуяя-торной области гена ТО. В результате были уточнены сайты рестрикции для Sal I, Baa HI и Pst I, обнаружены новые сайты для рестриктаэ Hind III и Pvu II.

Исходя из поставленных задач, в работе использовали рекок-бинантную плаэмиду рТ0(Е-3,7), содержащую Eco RI-фрагмент гена ТО от -466-го до примерно 3200-го нуклеотида. Этот фрагмент несет две полные последовательности, гиперчувствительные к ДНКаэе

I в ядрах (от -250-го до -210-го и от -180- го до -130-го нуклеотида). Последовательность, гиперчувствительная in vivo в области от -470-го до -420-го нуклеотида, представлена в плазмиде не полностью.

На первом этапе работы изучали действие ДНКазы 1 на ДНК плазмиды рТ0(Е-3,7), находящейся в суперспиралиэованной, релак-сированной и линейной формах. ГЧУ исследовали в Eco RI - Pst I-фрагиенте, в качестве гибридизационного зонда использовали Hinc

II - Pst I-фрагменты гена (рис.1). При действии увеличивающихся количеств ДНКазы 1 на сулерспирализованную плаэмидную ДНК в интервале от о.Зб'Ю"-3 до 6 -ю"5 ед.активности на 1 мкг ДНК на радиоавтографе выязляются три дополнительные полосы, обладающие более высокой электрофоретической подвижностью, чей тестируемый фрагмент (рис.2). Эти полосы соответствуют трем участкам гиперчувствительности, два из которых являются доминирующими, а один минорным.

Локализация этих участков была оценена с использованием в качестве стандарта фрагментов ДНК фага Я после рестрикции ферментами Eco RI и Hind III. Они были определены в положении

I 11

-(3—т^нЩ^йь

■mm ■

EcoRI Hindlll. Taql

-414 -292 —178

I-1

■I—I-F

Hqal

Pstl

J17

H

Рис.1. Рестрикционная карта Eco РТ - Pst T-фрагмонта гена ТО крысы [Becker, 198<i, Schmid, 1982]. ГЧУ к ДНКаэе 1 в хроматине [Becker, 1984] показаны в виде прямоугольников, ГЧУ на су-перспирализованной рекомбинантной ДНК, идонтифициропанныс нами, показаны вертикальными стрелками и штриховкой, а - Hind III Taq I-фрагмент, b - Pst I - Hinc Ii-фрагмент, используемые в качестве гибридизационных зондов. Звездочкой показана локализация потенциальной шпильки.

Рис.2. Радиоавтограф суперспиралиэованной ДНК плазмиды рТО (Е-з,7), обработанной ДНКазой 1 с активностью о (1), 0,35 (2), 0, 7 (3), 1, 8 (4), 2,5 (5), 3,5 (6) и 6 .10"э ед. (7), с последующей рестрикцией Pst I; (8) - ДНК фага / , рестрицированная Eco RI и Hind III. Идентификация фрагментов проведена гибридизацией с [згР] Pst I - Hinc II-фрагменто!;. Цифрами указаны размеры стандартных фрагментов в п.н., стрелками показаны фрагменты, образующиеся в результате расщепления ДНКазой 1, звездочкой отмечен Eco RI - Pst I-фрагмент гена ТО, тестируемый и„ наличие ГЧУ.

-350/-210 (сайт I), -160/-80 (сайт II) и +80. При сопоставлении локализации ГЧУ в рекомбинантной ДНК и в хроматине (Becker е.а., 1984] оказалось, что их расположение в основной совпадает. Участок I охватывает гиперчувствительную в хроматине область в положении -250 /-210 и область примерно в 100 п. н. вверх по течению от нее. Участок II также занимает более широкую область по сравнению с той, которая (в положении -1В0/ -130) была обнаружена Беккером и соавторами в хроматине. Минорный участок, выявленный нами в системе in vitro в структурной области гена, в ядрах не идентифицирован.

Иногда наблюдали более дискретные участки о повышенной чувствительностью к ДНКаэе 1, локализованные в этих же областях. На рис.1 приведена схема расположения ГЧУ, обнаруживаемых нами in vitro на рекомбинантной ДНК и идентифицированных Беккером и соавторами [Becker o.a., 1984] в хроматине. Расширение и частичное смещение областей с повышенной чувствительностью к нуклеаэной атаке в системе in vitro по сравнению с хроматином отмечали и другие исследователи [Weintraub, 1983; Finer е.а., 1984]. Возножно, в хроматине более тонкая локализация ГЧУ осуществляется благодаря связыванию регуляторных белков с соседними областями ДНК. ГЧУ в положении -470/-420, обнаруженный в хроматине, не выявляется на рекомбинантной ДНК. Возможно, это связано с тем, что его последовательность представлена в плаэ-миде не полностью.

Известно, что гиперчувствительное состояние зависит от существования упругого напряжения в ДНК. При релаксации плазниды рТ0(Е—3,7) с помощью топоизомеразы 1 или линеаризации ее рест-риктаэой Ваш HI ГЧУ к ДНКазе 1 не выявлялись (рис.3. А, Б).

Одной из вероятных причин гиперчувствительного состояния на свободной ДНК уогут Сыть искажения в ее структуре. Такими искажениями могут быть как появление на ДНК неканонических структур (крестообразные структуры, Z- и Н-формы ДНК), так и изменения в ширине бороздки и угла наклона оснований к оси молекулы. Для оценки потенциальной возможности ДНК образовывать неканонические структуры мы провели компьютерный анализ последовательности гена ТО от -500-го до -120-го нуклеотида по программе "Sequence Analysis Software Package". Оказалось, что на

тиц

"fe fH-Ч'}

fu\*m

Рис.3. Анализ гиперчувствительности к ДНКа-зе 1 релаксированной (А) и линейной (Б) ДНК плаз-миды рТО(Е-3,7). Радиоавтограф плаэмидной ДНК, обработанной ДНКазой 1 с активностью 0(1), 0,3 (2), 0,7 (3), 1,0 (4), 1,4 (5) И 2,4-10-ЗцД.(6), с последующей рестрикцией Pst I. Звездочкой указан Eco RI - Pst I-фраг-мент гена ТО, тестируемый на наличие ГНУ.

' ' ' 4 » » I 1 3 « 5

участке от -231-го до -207- го нуклеотида (расположенного в гиперчувствительной к ДНКаэе 1 In vivo и in vitro области) возможно образование шпильки, содержащей 15 неспаренных оснований.

Благодаря наблюдаемой нами корреляции в локализации ГЧУ в 51-фланкирующей области гена ТО на свободной суперспирализован-ной ДНК и в хроматине, мы получили возможность иоделировать в системе in vitro события, происходящие в ядре на уровне хроматина. С этой целью мы проводили реконструкцию нуклеосом на ре-хонбинантной ДНК, содержащей ГЧУ к ДККазе 1 in vitro, в присутствии гомологичных хоровых гистонов. В качестве фактора, облегчающего сборку нуклеосон, мы использовали полиглютаминовую кислоту. Образующиеся нуклеосомы выявляли при фрагментации реконструированных комплексов микрококковой нуклеазой.

Результаты, полученные при реконструкции на суперспирали-зованной ДНК рТ0(Е-3,7), приведены на рис. 4, А. При окрашивании образующихся после деградации иикрококковой нуклеазой фрагментов ДНК бромистым этидием отчетливо выявляются зоны, соответствующие moho-, ди- и тринуклеосоман. Размер нононуклео-сокы составлял от 135 до 165 п. и. (соответственно динуклеосомы - от 280 до 320 П.н. и тринухлеосомы - от 400 до 470 п.н.).

Для того, чтобы выяснить, участвует Ли ДНК гена ТО в процессе образования нуклеосом, фрагменты ДНК, образующиеся при

-ад

¥ г-: •

«f к<; '

; Co;

Г.. bi

. •4 H

3

ИгнО-Г.

1

1 2 »

Рис.4. Реконструкция нуклеосомных коровьи частиц на суперспиралиэованной плазииде рТО (Е-3,7) с гистонами в присутствии полигяютаниновой кислоты.

(А) - электрофоретичесхий спектр фрагментов ДНК реконструированных комплексов фраг-кентированкых кихрококковой нухлеаэой в точение 30 сек (1), 1 мин (2) и 2 МИН (3); (4) -ДНК плазмиды pBR 322, рестрицированной Alu I. Окракивание брояистын этидиен.

(Б) - радиоавтограф ДНК реконструированных кокплексов, фрагментированных михрокок-хсвой нуклеазой в течение 30 сек (1), 1 иин (2) и 2 мин (3) после гибридизации с [32Р] Pst I - Hinc II-фрагиентом из кодирующей области и (В) - посла гибридизации с [згР] Hind III - Taq I-фрагментом из регуляторной области гена.

Электрофорез в 6% полиахриламиднок геле, цифрами указаны размеры стандартных фрагментов в п.н. Коно-, ди- и три- - днк ионо-, ди- и тринуклеосом соответственно.

переваривании реконструированных комплексов нихрококковой нук-

32

леааой, гибридиэовали с Р Pst X - Hinc II-фрагиентои из структурной области гена. После гибридизации выявлялась, как правило, одна фракция ДНК, соответствующая по положению ДНК мо-лонуклеосом (рис.4, Б). Таким образом, изучаемый фрагмент гена ТО вовлекается в нухлеосомную организацию.

Очевидно, что наибольший интерес представляло поведение в процессе сборхи куклеосон области ДНК, гиперчувствительной к ДНКаэе 1 в упруго напряженном состоянии in vitro и в ядрах. Поэтому в следующей серии опытов тестировали распределение одного из таких фрагментов, а именно Hind III - Taq I-фрагмента от -292 - го до -178-го нуьлеотида, содержащего область с высокой чувствительностью к ДНКазе 1 in vivo и in vitro, в материале после фрагментации реконструированных комплексов .микрококковой нуклеазой. Этот фрагмент содержит также палиндромную последовательность, способную к образованию шпилечной структуры. При реконструкции нухлеосом на суперспирализованной ДНК плазмиды рТО(£-3,7> фрагменты ДНК, гибридиэующиеся с меченым Р Hind III - Taq I-фрагментом, распределяются в виде фракций, соответствующих нуклеосонным и динуклеосомныи размерам (рис. 4, В). Полученные результаты показали, что ДНК, содержащая гиперчувс-твителыше к ДНКаэе 1 in vivo и in vitro последовательности, участвует в образовании куклеосон.

После того, как было показано, что в наших условиях наблюдается образование нуклеосои на рекомбинантной ДНК, стало возможный получить ответ на основной интересующий нас вопрос: сохраняется ли предсуществующее гиперчувствительное состояние в ДНК регуляторных элементов гена ТО при реконструкции хроматина ма рехоибинантной ДНК. При постановке этих опытов рассчитывали выяснить, сохраняются ли ГЧУ х ДНКаэе 1 на суперспирализованной ДНК поело реконструкции на ней нуклеосои. Исходя из общих положений, ложно ожидать, что вовлечение упруго напряженной ДНК в нухлеосомную организацию приведет к подавлению гиперчувствительного состояния в ней, так как при образован» нуклеосои происходит снятие упругого напряжения. Однако имеющиеся в литературе данные противоречивы. Так, показано, что гиперчувствитель-няе сайты на упруго напряженной ДНК, содержащей регуляторные

элененть» /Л-глсбинопого гена цыпленка, сохраняются при реконструкции на ней нуклеосом [Weintraub, 1983; Larsen, Weintraub, 1982]. В то же время для fil- глобинового гена кролика было обнаружено, что ГЧУ на упруго напряженной ДНК исчезают при образовании нуклеосом на ней [Margot, Hardison, 1985].

Реконструированные на суперспирализованной рекокбинантной ДНК в присутствии коровых гистонов и полиглютаминовой кислоты нуклеосокы подвергали действию ДНКазы 1 в тех же условиях, что и в опытах на свободной ДНК, только концентрация ДНКазы 1 была увеличена примерно в 4 00 раз. На наличие ГЧУ тестировали тот же Pst I-фрагмент. Как видно из данных, приведенных на рис. 5, ГЧУ не сохраняются после реконструкции хроматина.

Рис.5, радиоавтограф ДНК реконструированных нуклеосом-них керовых частиц на суперспирализованной плазмиде рТ0(Е -3, 7), обработанной ДНКаэой 1 с активностью 0 (1), 1¿0 (2), 200 (3), 420 (4), 560 (5) и 700 *10 ед.(6), с последующей рестрикцией Pst I. Идентификацию фрагментов осуществляли гибридизацией с [321>] Pst I - Hinc Ii-фрагментом. Звездочкой отмечен Eco RI - Pst I-фрагиент гена ТО, тестируемый на наличие ГЧУ.

I 2 3 4 5 6

Таким образом, мы пришли к заключению о том, что образование нуклеосом на упруго напряженной ДНК 5'-фланкирующей области гена ТО в составе рекомбинантной плазмиды приводит к подавлению гиперчувствительного к ДНКазе 1 состояния. По-видимому, для того, чтобы индуцировать гиперчувствительное состояние ДНК в хроматине, необходимы не только факторы, его вызывающие, но и факторы, стабилизирующие это состояние. Известно, что в клетке эту роль могут выполнять транс-действующие факторы, взаимодействующие со специфическими последовательностями ДНК. В ядрах печени

крыс были обнаружены белки, специфически связывающиеся с фрагментами от -466-й до -292-Й и от -292-й до -178-й п.н., содержащими ГЧУ к ДНКаэе 1 in vivo и in vitro [Chihirzhina, Chesnokov, 1990]. Было показано, что эти сайт-специфические белки относятся к семейству ядерных факторов 1 (NF 1) [Федорова, Чихиржина, 1992]. Мы решили проверить, смогут ли эти белки каким-либо образом влиять на гиперчувствительное состояние су-перспиралиэованной рекомбинантной ДНК в реконструированном хроматине .

Частично очищенный белковый экстракт добавляли в систему реконструкции перед добавлением гистонов. Эффект ДНКазы 1 исследовали в тех же условиях, что и в случае тестирования гиперчувствительности ДНК в нуклеосомах, реконструированных без белковых экстрактов. После гибридизации материала с меченный Р Hinc II - Pst I-фрагиентом нам не удалось выявить наличие ГЧУ к ДНКазе 1. Таким образом, добавление ядерных белков из семейства ядерных факторов 1 (BF 1) в процессе реконструкции нухлеосомных хоровых частиц не приводят ни к стабилизации, ни к индукции ГЧУ к ДНКазе 1 в регуляторной области гена ТО, выявляемые на су-пгрспиралиэованной рекомбинантной плазмиде.

ВЫВОДЫ

1.Выявлены участки гиперчувствительности к ДНКаэе 1, расположенные от -350-го до -210-го и от -160-го до -90-го нук-леотида в 5'-фланкирующей области гена то в составе суперспира-лизованной рекомбинантной плазмиды. Эти ГЧУ охватывают гиперчувствительные * ДНКаге 1 последовательности в хроматине печени крыс и часть последовательности вверх и вниз по течению от этих участков. Компьютерный анализ по программе "Sequence Analysis Software Package" показал, что на границе одного из этих ГЧУ, локализованного в положении -350/-210, возможно образование шпилечной структуры с 15 неспаренннми основаниями.

2. Гиперчувствительное состояние 5'-фланкирующей области в рекомбинантной плазмиде зависит от упругого напряжения в ДНК. При релаксации плазмидной ДНК топоизоиеразой 1 или линеаризации ее рестриктаэой Вага HI гиперчувствительные к ДНКаэе 1 области

полностью исчезают.

3. Проведена реконструкция нуклеосомных коровых частиц на рекомбинантной ДНК в присутствии коровых гистонов печени крыс и полиглютаминовой кислоты. Размер минимальной частицы, образующейся при фрагментации реконструированных комплексов микрококковой нуклеазой, составляет примерно 150 п.н.

4.При реконструкции нуклеосомных коровых частиц in vitro фрагнент гена ТО из структурной области (от +175-Г0 до + 317-го нуклеотида) вовлекается в нуклеосонную организацию. Фрагмент из регуляторной области гена ТО (от -292-го до -178 -го нуклеотида), содержащий гиперчувствительный к ДНКазе 1 in vivo и in vitro участок, также участвует в образовании нуклеосомы.

Образование нуклеосомных коровых частиц на суперспирали-зованной рекомбинантной ДНК снимает гиперчувствительное состояние, выявляемое на свободной суперспирализованиой ДНК плазмиды рТО(Е-3,7).

5. Добавление частично очищенных белков из семейства ядерных факторов NF 1 печени крысы в процессе реконструкции нуклеосонных коровых частиц на рекомбинантной ДНК не вызывает индукции или стабилизации предсуществующего гиперчувствительного состояния регуляторной области гена ТО.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чихиржина Г.И. , Ронановская Е.В., Чесноков И.Н. Ядерные белки печени крыс, участвующие в регуляции экспрессии гена триптофаноксигенаэы // Тез. докл. X Объединенного симпозиума биохинических обществ СССР - ГДР, Ташкент, 1989.-С.92.

2. Чесноков И.Н., Романовская Е.В., Чихиржина Г.И. Трансдействующие белковые факторы, участвующие в регуляции тканеспе-цифической экспрессии гена триптофаноксигенаэы крысы //Тез. докл. VII Всесоюзн. симп. "Молек. механизмы генетич. процессов". М., 1990.-С.67 - 68.

3. Чихиржина Г.И., Романовская Е.В., Шварцман А.Л., Гайц-хоки B.C. Чувствительность и гиперчувствительность к ДНКазам хроматина церулоплазминового гена с разными уровнями транскрипционной активности // Тез. докл. VII Всесоюзн. симп. "Молек.

механизмы генетич. процессов". Н., 1990.-С.67 - 68.

4. Романовская Е.В., Федорова С.А., Чихиржина Г.И. Влияние различных факторов на гиперчувствительное состояние регуля-торной области гена триптофаноксигеназы в системе in vitro // Тез. докл. X Всесоюзн. симп. "Структура и функции клеточного ядра". Гродно, 1990.-С.65.

5. Ронановская Е.В., Чихиржина Г.И. Изучение in vitro гиперчувствительного к днказе 1 состояния регуляторной области гена триптофаноксигеназы крысы //Вестн. ЛГУ. Сер.З. 1991, вып.4.-С.67 - 73.

6. Chihirzhina G.I., Fedorova S.A., Romanovskaya E.V. The effect of proteins iron the NF 1 family on chromatin structure organisation of the 5'-flanking region of the tryptophan oxygenase gene // In: "13th European Workshop on the Cell Nucleus". Hungary, 1993.-P.16.

7. Федорова С.А., Романовская E.B., Чихиржина Г.И. Гиперчувствительное состояние в хроматине регуляторной области гена триптофаноксигеназы и белки на семейства ядерных факторов ИГ 1 // XI Всеросс. симп. "Структура и функция клеточного ядра". Санкт-Петербург, 1993. Цитология.-1993.-Т.35, N.10.-С.99.

8. Е.В.Ронановская, Г.И.Чихиржина. реконструкция хроматина на рекомбинднтной ДНК, содержащей 5'-флан:<ирующую область гена триптофаноксигеназы крысы // Вестн. СПбГУ. -Сер.З.- 1993, вып.1.-С.80 - 85.

9. Чихиржина Г.И., Романовская Е.В. Гиперчувствительность к ДНКаэе 1 5'-фланкирующей области гена триптофаноксигеназы в рекомбинантной ДНК и реконструированном на ней хроматине // Мо-лек.бИ0Я.-1993.-Т.27, вып.1.-С.132 - 142.

10. Чихиржина Г.И., Федорова С.А., Чесноков И.Н., Ронановская Е.В. Ядерные белки, специфически связывающиеся с регуляторной областью гена областью гена триптофаноксигеназы // Биохимия .-1993 .-Т. 58, ВЫП.3.-С.392 - 398.