Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические эффекты единичных нуклеотидных замен в интроне 6 гена триптофандиоксигеназы человека и мыши

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические эффекты единичных нуклеотидных замен в интроне 6 гена триптофандиоксигеназы человека и мыши"

На правах рукописи УДК: 575.224.22.599.9:616.89

ВАСИЛЬЕВ ГЕННАДИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ИНТРОНЕ 6 ГЕНА ТРИПТОФАНДИОКСИГЕНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК

2004

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

доктор биологических наук Т.Н. Меркулова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

И.К.Захаров

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор медицинских наук М.И. Воевода

Институт терапии СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН г. Новосибирск

Защита диссертации состоится « 24 » марта 2004 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (3832)331278; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Актуальность исследования. Самым распространенным вариантом полиморфизма последовательностей ДНК являются единичные нуклеотидные замены (SNP), особый интерес к изучению которых связан с тем, что они часто оказываются ассоциированы с различными клинически важными признаками. При этом до сих пор основные усилия сосредоточены на выявлении и изучении SNP в кодирующих районах генов и сайтах сплайсинга [Krawszak et al., 2000], поскольку такие SNP приводят к изменению структуры белкового продукта гена, что легко детектируется и интерпретируется. Однако основная масса SNP у человека обнаруживается в других районах генов, в том числе регуляторных, но этим SNP уделяется гораздо меньше внимания. В последнее время начали развиваться работы по выявлению SNP в промоторных районах и изучению их влияния на регуляцию экспрессии генов, но исследования, направленные на, выявление и функциональную интерпретацию потенциальных регуляторных SNP в интронах, до сих пор единичны. В то же время постоянно возрастающий объем работ по поиску SNP в протяжённых районах генов человека, приводящий к накоплению данных об имеющих клинические проявления и не затрагивающих сайты сплайсинга SNP в интронах, требует функционального анализа подобных SNP и установления конкретных механизмов их проявления.

Фермент триптофаноксигеназа (TDO2) является одним из ключевых звеньев в цепи биосинтеза нейромедиатора серотонина. Поэтому ген TDO2 часто рассматривается как один из генов-кандидатов на связь с различными нарушениями поведения. В частности, установлена статистически достоверная ассоциация между двумя SNP в гене TDO2 человека в позициях 663 п.н. и 666 п.н. от начала интрона 6 и такими расстройствами поведения, как синдром Туретта, предрасположенность к наркотической, алкогольной зависимости и патологической склонностью к азартным играм [Comings et al., 1996]. Данные SNP находятся в некодирующем районе гена TDO2, являющемся потенциальным регуляторным районом. Последнее обстоятельство дало нам возможность предположить, что мы имеем дело с так называемыми регуляторными SNP, расположенными в регуляторной зоне гена и влияющими' на его экспрессию за счёт изменения в связывании с данным районом регуляторных ядерных белков.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов влияния SNP в интроне 6 гена TDO2 человека на развитие ряда психических нарушений и изучение адекватности общепринятой экспериментальной модели (мыши линии C57BL), связывающей предрасположенность к алкоголизму с повышенным уровнем экспрессии гена TDO2.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

ад

В ходе выполнения данной работы были решены следующие задачи:

1) изучение возможных молекулярных механизмов влияния ассоциированных с рядом психических расстройств БЫР в интроне 6 гена ГО02 человека (С-»А в позиции 663 п.н. С-»Т1в позиции 666 п.н. относительно начала интрона) на экспрессию этого гена;

2) проверка имеющихся литературных данных о том, что предрасположенность линии мышей C57BL к развитию алкоголизма связана с повышенным по сравнению с другими линиями мышей уровнем активности TDO2 в печени;

3) поиск и сравнительное изучение SNP в районе интрона 6 у .нескольких линий мышей, определение связывающихся с районами

SNP ядерных белков и поиск корреляций между SNP, изменениями спектра связывающихся белков и признаком

предрасположенности/устойчивости к развитию алкоголизма.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что всем трём обнаруженным в популяциях человека аллелям гена Тй02 присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Основной связывающийся с наиболее распространённым аллелем Ж белок идентифицирован как транскрипционный фактор УУ1. Для двух других аллелей обнаружено разрушение сайта связывания фактора УУ1 и появление сайтов связывания одного или двух неидентифицированных нами белков (6->А в позиции 663 п.н.), либо сайта связывания транскрипционного фактора ОДТД6 (С->Т в позиции 666 п.н.), что может оказывать существенное влияние на экспрессию гена Тй02.

В результате определения нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена Тй02 для шести линий мышей обнаружено 5 SNP и одна микроделеция. Обнаружено, что 3 SNP приводят к изменению спектра ядерных белков, связывающихся с этими районами.

Изучена активность TDO2 в печени шести линий мышей. Не установлено связи между уровнем активности TDO2 в печени мышей, распределением SNP в интроне 6 и изменениями спектра связывающихся с этими районами ядерных белков с признаком предрасположенности/устойчивости к развитию алкоголизма. Таким образом, у мышей линии C57BL, в отличие от человека, не обнаружен вклад TDO2 в формирование алкогольной зависимости.

Полученные нами данные вносят вклад в понимание механизма влияния SNP в интронах на экспрессию гена и реализацию фенотипических признаков, а так же уточняют рамки применимости модельных линий животных при изучении генов, оказывающих влияние на поведение человека.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИциГ, на XIII всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Пущино, 2000), и на международных конференциях: «Применение информационных технологий к проблемам биоразнообразия и динамики экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2001); «Genetic and Developmental Psychoneuroendocrinology» (Novosibirsk. 1999); «150-anniversary of Ivan Pavlov International Symposium" (St. Petersburg, 1999).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (184 наименования). Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, и содержит 2 таблицы и 18 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали самцов крыс линии Sprague-Dowley весом 150-180г. и 6-9 - месячные самцов мышей линий C57BL/6J, СВА/Са, DBA/2J, BALB/cJ и CC57BR/Mv разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН.

ДНК-связывающую активность факторов транскрипции в экстрактах ядер оценивали методом задержки ДНК-пробы в геле. Экстракты ядер получали согласно (Gorski et а/., 1986) в модификации (Shapiro et а/., 1988). Содержание факторов транскрипции в них оценивали методом вестерн-блот гибридизации. Для визуализации результатов использовали ECL-систему фирмы "Amersham". Секвенирование ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI-Prism 310. Определение активности ТДО2 проводили по модифицированному методу (Seglen, Jervell, 1969).

Статистическую обработку результатов проводили используя Т-критерий Стьюдента

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ранее Д. Комингсом [Comings et al., 1996] был проведён поиск полиморфных сайтов в гене TDO2 человека, ассоциированных с различными психическими расстройствами. Ни в кодирующей части гена, ни в 5'- и З'-фланкирующих областях не было обнаружено подобных сайтов. Однако, в районе интронов 5 и 6 гена TDO2 человека были обнаружены 4 полиморфных сайта, два из которых, а именно, близкорасположенные мононуклеотидные замены в интроне 6 (G-»A в позиции 663 п.н. и G-+T в позиции 666 п.н. относительно начала

интрона) оказались связанными с психическими расстройствами. Было обнаружено, что аллель А в позиции 663 п.н. позитивно ассоциирован с такими нарушениями психики, как синдром Туретта и тяжёлая депрессия, ведущая к суициду. Аллель Т в позиции 666 п.н. ассоциирован позитивно с синдромом гиперактивности у детей, патологической склонностью к азартным играм и наркоманией. Кроме того, этот же аллель оказался негативно ассоциирован с алкоголизмом [Comings et a/., 1996].

Изучение связывания ядерных белков с различными вариантами района 651 - 680 п.н. интрона 6 гена TDO2 человека.

Для изучения связывания ядерных белков с различными вариантами изучаемого района были использованы олигонуклеотиды, соответствующие трём аллельным состояниям участка от 651 до 680 п.н. относительно начала интрона 6 гена TDO2 человека (олигонуклеотиды WT, М1 и М2, Рис. 1а). Связывание изучали методом задержки ДНК-пробы в геле. Белки экстракта ядер печени образовывали 3 комплекса с олигонуклеотидом, соответствующим наиболее распространенному аплелю (WT) (Рис. 1Ь).

A)

ИТ: 5'-cagtTGCCAAATAATGGCAGATAAGAATAGGGAG-З' Ml: 5'-cagtTGCCAAATAATGACAGATAAGAATAGGGAG-3' М2: 5'-cagtTGCCAAATAATGGCATATAAGAATAGGGAG-3•

B) WT MIM2 WTMIM2 1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 1. А) Последовательности олигонукпеотидов: WT наиболее распространенный в популяции человека вариант. М1 и М2 - аллели, ассоциированные с психическими расстройствами. Точковые мутации подчеркнуты.

В) Связывание белков экстракта ядер клеток печени (А -1мкг белка, Б - 4мкг белка) с данными олигонуклеотидами. 2, 6-WT; 3, 7-М1; 4, 8 - М2; 1, 5 -свободный зонд (олигонукпеотид WГ)

Картина связывания для обоих обнаруженных в популяции человека вариантов М1 и М2 разительно отличалась как от WT, так и друг от друга. Полоса, соответствующая комплексу 3, в случае транзиции G-»A (663) (олигонуклеотид М1) исчезала и появлялась

группа менее подвижных полос ("комплекс 4я). В случае замены С->Т (666) (олигонуклеотид М2) интенсивность указанной полосы сильно снижалась, и также появлялась новая медленно мигрирующая полоса (комплекс 5). Следовательно, всем 3 аллелям присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Важно отметить, что в случае обеих мутаций, ассоциированных с психическими расстройствами, происходит нарушение в связывании одного и того же белка (комплекс 3), являющегося основным фактором, взаимодействующим с "нормальным" аллелем.

Идентификация белков, связывающихся с изучаемым районом.

Для определения белков, взаимодействующих с изучаемыми олигонуклеотидами, в их последовательностях был проведен поиск участков гомологии с известными сайтами связывания различных транскрипционных факторов с помощью пакета программ TESS, однако такой поиск дал черезмерно широкий набор белков-кандидатов. Тем не менее, мы решили использовать олигонуклеотиды, соответствующие части предсказанных регуляторных элементов, в дальнейшем экспериментальном анализе. Эти олигонуклеотиды были использованы в качестве конкурентов в экспериментах по задержке ДНК пробы в геле. Из всех олигонуклеотидов с Ж конкурировал только SRE (Рис. 2) из промотора гена с-О мыши (-318 -289). При добавлении 40-кратного избытка SRE исчезала основная полоса задержки (комплекс 3). Ни один из использованных в качестве конкурентов олигонуклеотидов не влиял на поведение двух других более подвижных полос (комплексы 1 и 2), которые являются общими для всех трёх вариантов.

Рис. 2. Конкуренция различных олигонуклеотидов c WT.

1 - свободный зонд; 2 -связывание WT с экстрактом ядер печени крысы; 3-12 - то же в присутствии 40-кратного избытка немеченых

олигонуклеотидов: 3 - WT; 4 -Ml; 5 - М2; 6 - АР1;7 - HNF1; 8 - GATA; 9 - SRE; 10 - ANF; И -Spl;12-HNF3.

Так как известно, что с SRE гена c-fos взаимодействуют факторы транскрипции SRF, YY1 и NF-IL6, можно было предполагать

связывание любого из этих белков с исследуемым районом. Для того, чтобы уменьшить число предполагаемых белков-кандидатов на связывание с исследуемым районом, М.П. Пономаренко (ИЦиГ СО РАН, лаб. теоретической генетики) был проведён подробный теоретический анализ с использованием метода усреднения частот нуклеотидов и динуклеотидов во всех позициях данного района [Ponomarenko в1 а!., 1999]. Оказалось, что обе мутации локализованы в пределах потенциального сайта ^1. Присутствие сайтов связывания транскрипционных факторов SRF и NF-IL6 в исследуемом районе в результате данного анализа не было подтверждено.

Для окончательной идентификации белка, образующего комплекс 3, были выполнены эксперименты с использованием антител против . Они полностью подтвердили результаты теоретического анализа. В результате добавления антител к ядерному экстракту происходило исчезновение комплекса 3 (Рис. 3), и, в случае олигонуклеотида Ж, появлялась менее подвижная полоса которая соответствует

тройному комплексу олигонуклеотид - транскрипционный фактор -антитело. Таким образом, в данном случае наблюдался классический «супершифт». При использовании олигонуклеотида М2 комплекс 3 также исчезал, однако в этом случае «супершифт» не наблюдался, так как соответствующая ему полоса совпадает по подвижности с одной из полос исходной картины.

Рис. 3. Связывание белков экстракта ядер клеток печени с олигонуклеотидами WT (дор. 1-3) и М2 (дор. 5-7) в присутствии антител против УУ1. 1, 5 -свободный зонд; 2, 6 -связывание с экстрактом ядер печени крысы; 3, 7 - связывание с ядерным экстрактом, обработанным антителами

против транскрипционного

фактора УУ1. ^ высокомолекулярный комплекс, содержащий антитела к УУ1 (supershift).

Для доказательства того, что наблюдаемые в экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле эффекты обусловлены полноразмерным транскрипционным фактором УУ1, был выполнен Вестерн-блот-анализ с последующей ECL-детекцией. Для нанесения на SDS-ПААГ брали б мкл. экстракта ядер печени крысы, содержащие 2.5 мкг. суммарного

белка. Использовались разведения вторичных антител 1:8000 и 1:10000. Из-за особенностей структуры белка YY1, чей молекулярный вес соответствует 44 KDa, на SDS-гелях мигрирует как белок 65-68 KDa [Shi et a/., 1997]. На Рис. 4. показано присутствие полноразмерного YY1 в качестве доминирующей компоненты сигнала. Таким* образом, наблюдаемый нами в экспериментах по гель-ретардации комплекс 3 обусловлен взаимодействием исследуемых олигонуклеотидов с полноразмерным транскрипционным фактором YY1.

1 2

Рис. 4. Результат Вестерн- __

блот-анализа экстракта ядер печени крысы на транскрипционный фактор YY1. 1, 2, 3 - экстракт ядер, 2.5 мкг. суммарного белка, 4 - маркёр молекулярных весов Sigma protein test mixture №4. 1,2- результат yyi-»-*«-. чи» ECL-детекции, разведение

вторичных антител 1:10000. 3, 4 -окрашивание нитроцеллюлозной мембраны красителем Ferry-dye. Полоса, соответствующая YY1 отмечена стрелкой.

Минорные комплексы (1 и 2, Рис. 1), присутствующие в случае

всех трёх олигонуклеотидов Wt, М1 и М2, в отличие от менее подвижных полос задержки, не являются тканеспецифичными и, вероятно, вызваны связыванием с белками из группы HMG-белков. В то же время комплексы 4 и 5 (Рис. 1), характерные для олигонуклеотидов М1 и М2 соответственно, являются тканеспецифичными и обнаруживаются в экспериментах по связыванию только если в качестве источника транскрипционных факторов берётся экстракт ядер клеток печени. В случае олигонуклеотида М1 (замена G->A) не удалось получить дополнительных данных, позволяющих делать предположения о белках, образующих специфический для данного олигонуклеотида комплекс. Ни один из конкурентных олигонуклеотидов (кроме самого М1) не устранял полностью образование комплекса 4. При связывании белков экстракта ядер с олигонуклеотидом М2 (замена G->T) наиболее выраженным является медленно мигрирующий комплекс 5. За связывание с белками, образующими этот комплекс, конкурировали олигонуклеотиды, соответствующие сайтам связывания транскрипционных факторов HNF3 и GATA. Проведённый М.

Пономаренко с помощью системы rSNP_Guide [Ponomarenko et al., 2002] теоретический анализ предсказал наличие в М2 сайта связывания транскрипционных факторов семейства GATA и не подтвердил присутствие сайта HNF3. Для окончательной идентификации связывающегося с М2 белка были проведены эксперименты с использованием антител против транскрипционного фактора GATA6, которые подтвердили присутствие этого белка в комплексе 5.

+N/S +GATA +АВ

Рис. 5. Связывание белков экстракта ядер клеток печени с олигонуклеотидом М2 в присутствии антител против GATA6 и конкурентных олигонуклеотидов. 1 - свободный зонд; 2 - связывание с экстрактом ядер печени крысы; 3 - то же в присутствии 80х избытка олигонуклеотида АР1; 4 - то же в присутствии 80х избытка олигонуклеотида GATA; 5 -связывание с ядерным экстрактом, обработанным

антителами против транскрипционного фактора GATA6.

Для всех изученных аллелей общим является связывание с ними HMG-подобных белков, которые являются обычным и важным компонентом композиционных регуляторных элементов и участков с нарушенной нуклеосомной укладкой. В случае наиболее распространённого в популяции человека аллеля WT происходит связывание с данным районом транскрипционного фактора YY1, являющегося либо репрессором, либо активатором транскрипции в зависимости от транскрипционного контекста и взаимодействующих с нам кофакторов. В случае замены G-»A в позиции 663 п.н., ассоциированной с синдромом Туретта и склонностью к тяжёлой депрессии, мы обнаружили разрушение сайта связывания фактора YY1 и появление сайта связывания одного или двух неидентифицированных белков. Замена G->T в позиции 666 п.н. приводит к резкому ослаблению связывания YY1 и появлению сильного сайта связывания другого транскрипционного фактора -GATA6. Подобные изменения в спектре связывающихся транскрипционных факторов (замена потенциального репрессора на активатор) могут существенно сказываться на экспрессии гена TDO2 и, как следствие, на содержании триптофана в плазме крови и пути синтеза нейромедиатора серотонина в мозге.

Определение_базального_уровня_активности

триптофаноксигеназы у полярных по моделям поведения линий мышей.

В связи с полученными на гене Тй02 человека данными об ассоциации между некоторыми расстройствами поведения и изменениями в спектре связывания регуляторных белков представляло большой интерес провести поиск мутаций и сравнительное изучение того же района гена Тй02 у нескольких линий мышей, контрастных по типу поведения. Линия мышей C57BL является известной экспериментальной моделью предрасположенности к алкоголизму Мыши этой линии также характеризуются наличием других нарушений поведения. Ранее предполагалось, что повышенный уровень активности TDO2 у C57BL связан с повышенной стессируемостью мышей этой линии и является основным фактором, обусловливающим предрасположенность этой линии мышей к алкоголизму. В связи с этим мы определили активность фермента TDO2 в печени у мышей C57BL в условиях, исключающих стресс и при глюкокортикоидной индукции. В качестве известного контроля по признаку предпочтения алкоголя были взяты линии мышей СВА и DBA/2. Оказалось, что базальная активность TDO2 в печени мышей предрасположенной к алкоголизму линии C57BL была достоверно выше, чем у контрольных по этому признаку линий СВА и DBA/2 (Табл.1).

Таблица 1. Активность ферментов триптофаноксигеназы (TD02) и тирозинаминотрансферазы (TAT) у линий мышей C57BL, СВА и DBA/2.

Линия Активность TD02 (нмоль/мг белка/час) Активность ТАТ (мчоль/г белка /час)

контроль глюкокорти- ковдвая индукция контроль глюкокорти- коидная индукция

C57BL 21,9±2,3 62,5±5,3 4,50±0,37 11,70±0,79

СВА 13,6±1Д* 56,2±3,1 4,60±0,21 16,90±0,90

DBA/2 15,5±0,6** 44,3±4,5 5,00±0,38 14,30±0,51

Достоверность межлинейных различий: C57BL/CBA р<0,05; C57BL/DBA р<Я,01

Таким образом, повышенная активность TDO2 и связанное с этим снижение уровня серотонина в мозге является конститутивной особенностью линии C57BL, а не вызывается условиями хронического стресса, как описывалось ранее. Для сравнения приведены данные по активности в тех же образцах фермента тирозинаминотрансферазы,

который также является печень-специфичным и находится под глюкокортикоидным контролемПоскольку ранее было показано отсутствие межлинейных различий в аминокислотной последовательности триптофаноксигеназы у трёх данных линий, то наиболее вероятным объяснением наблюдаемых линейных характеристик являлся повышенный базальный уровень экспрессии гена Тй02 у мышей линии С57В1_ Это заключение сделало весьма перспективным поиск и анализ БЫР в регуляторных районах гена Тй02 указанных линий мышей.

Для поиска БЫР нами было проведено определение нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена Тй02 мышей линий С57В_, СВА и ЭВА/2. Была выделена геномная ДНК четырёх животных каждой линии мышей, пригодная для амплификации длинных фрагментов ДНК. Поскольку экзон-интронная структура генов у близких видов обладает высокой консервативностью, мы предположили, что экзоны Р и О гена Тй02 мыши имеют последовательность, в основном гомологичную экзонам Р и О гена Тй02 крысы. Далее по известной последовательности кДНК Тй02 мыши были определены вероятные границы экзонов Р и О гена Тй02. Для амплификации последовательностей интрона 6 гена Тй02 мыши в средней части экзонов Р и О были выбраны олигонуклеотидные праймеры. Оптимальные условия ПЦР были подобраны путём варьирования температуры отжига праймеров, концентрации МдСТе от 1,5 мМ до 4 мМ и концентрации глицерина от 5 до 10%. После ПЦР проводилась очистка наработанной ДНК интрона б от неспецифических фрагментов ДНК электрофорезом в 1% агарозном геле. Длина полученного фрагмента составила приблизительно 1 т.п.н. Амплифицированные с помощью ПЦР фрагменты были выделены после солюбилизации агарозного геля 8М ЫаСЮ4 методом сорбции на стекловолокне в количествах, достаточных для последующего секвенирования на автоматическом секвенаторе. Для каждого образца было наработано 2-4 мкг очищенного фрагмента. Полученные фрагменты были проанализированы с использованием автоматического секвенатора ДВ1-Рп2т 310. Так как продукт амплификации имел длину около 1 т.п.н., то для надёжной идентификации выявленных различий по результатам первоначального секвенирования с исходными праймерами были выбраны четыре дополнительных праймера для секвенирования так, что каждый участок был прочитан как минимум дважды в разных направлениях. Длина интрона б составила 993 п.н. для линий СВА, ОВД/2 и 992 п.н. для линии С57В_ Ни у одной из исследованных линий не было обнаружено внутрилинейного полиморфизма последовательностей ДНК интрона 6. Наибольшие различия были обнаружены у мышей СВА и С57В_ Они отличались по шести позициям: одной микроделеции (отсутствие А в позиции 417 п.н.

от начала интрона 6) и пяти мононуклеотидным заменам: С/Т в позиции 15 п.н. от начала интрона 6; Т/А в позиции 364; Q/T в позиции 629; A/G в позиции 912; G/A в позиции 974. Линия СВА отличалась от DBA/2 по двум позициям: G^ в позиции 629 и G/A в позиции 974, и эти замены были идентичны у линий C57BL и DBA/2. Таким образом, наблюдался определённый параллелизм между наличием полиморфных сайтов, ассоциированных с алкоголизмом и психическими нарушениями в гене TDO2 человека и присутствием подобных полиморфных сайтов в последовательностях интрона 6 гена TDO2 у линий мышей, различающихся по склонности к алкоголизму и другим нарушениям поведения. Кроме того, параллелизм наблюдался и в том, что максимальные отличия в последовательности ДНК интрона 6 гена TDO2 мы видим между линиями C57BL и СВА, что совпадает с их отличием по базальному уровню активности фермента триптофаноксигеназы. В связи с этим мы сделали предположение о том, что данные мутации затрагивают имеющиеся в интроне 6 гена TDO2 мыши сайты связывания регуляторных белков, ответственных за изменения в экспрессии этого гена и развитие нарушений поведения, аналогично тому, что было ранее показано нами в отношении мутаций внутри интрона 6 гена TDO2 человека.

Идентификация белков, связывающихся с SNP в интроне 6 гена TDO2 мыши.

В качестве первого этапа был проведён теоретический анализ районов обнаруженных полиморфных сайтов. Для всех полиморфных сайтов (кроме случая делеции А) хотя бы для одного из вариантов были предсказаны сайты связывания транскрипционных факторов YY1 (слабые) или GATA, поэтому для всех этих вариантов были синтезированы соответствующие олигонуклеотиды, которые далее были использованы в экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле. Эти олигонуклеотиды были названы по первой букве названия линий и позиции полиморфизма например В364 - олигонуклеотид, соответствующий последовательности интрона 6 гена TDO2 мышей линии C57BL в районе SNP в позиции 364 от начала интрона 6.

Очень слабая гомология с консенсусом сайта связывания YY1 была обнаружена для двух районов точкового полиморфизма. После теоретического анализа данных районов полиморфизма, проведённого М.П. Пономаренко (лаб. теоретической генетики, ИЦиГ), для варианта Т/А в позиции 364 в случае линии СВА (вариант А) был предсказан очень слабый, на границе со случайной последовательностью, сайт связывания YY1. Аналогичные крайне слабые сайты были предсказаны и для обоих вариантов полиморфизма A/G в позиции 912. В экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле вариант В364 не дал никакого связывания с белками ядерного экстракта, три остальных олигонуклеотида (CD364, В912, CD912) дали сходную картину весьма

слабого связывания, при этом подвижность данных полос немного отличается от комплексов олигонуклеотидов той же длины с YY1. Эксперименты с использованием антител к транскрипционному фактору YY1 подтвердили, что эти очень слабые полосы задержки не обусловлены данным белком, и никаких полос супершифта обнаружено не было. Таким образом, районы точковых полиморфизмов Т/А (364) и A/G (912) не связывают сколько-нибудь значительно белки ядерного экстракта и, соответственно, не могут оказывать заметное влияние на экспрессию гена TDO2.

В случае полиморфизмов G/T в позиции 629 и G/A в позиции 974 были теоретически предсказаны сайты связывания транскрипционного фактора GATA для вариантов полиморфизма, характерных для линии СВА. Эксперименты с олигонуклеотидами, соответствующими данным районам, полностью подтвердили эти предположения. В экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле олигонуклеотид С629 давал интенсивную полосу задержки, сходную по подвижности с комплексом олигонуклеотид/фактор GATA6. В случае же олигонуклеотида BD629, соответствующего аллелям, характерным для линий C57BL и DBA/2, никаких чётко выраженных полос не наблюдалось . Вариант С974 давал аналогичную интенсивную полосу задержки, в случае варианта BD974 интенсивность связывания значительно ослабевала, хотя и не исчезала совсем. Эксперименты по задержке ДНК-пробы в геле в присутствии различных конкурентных олигонуклеотидов и в присутствии антител к транскрипционному фактору GATA6 позволили идентифицировать белок, связывающийся с олигонуклеотидами С629, С974 и BD974. В присутствии антител против транскрипционного фактора GATA6 наблюдается значительное ослабление комплексов олигонуклеотид/белок. Это доказывает, что именно транскрипционный фактор GATA6 является главным компонентом комплексов связывания с перечисленными олигонуклеотидами. В случае полиморфных сайтов в позициях 629 и 974 п.н. от начала интрона 6 у линии СВА имеются хорошие сайты связывания транскрипционного фактора GATA6. У линии C57BL этот сайт либо полностью разрушен (G/Г в позиции 629), либо существенно ослаблен (G/A в позиции 974). Замена С—»Т в позиции 15 п.н. у линии C57BL создаёт сильный сайт связывания какого-то не идентифицированного нами белка.

Таким образом, мы видим, что в случае трёх из шести полиморфизмов в интроне 6 гена TDO2, отличающих линии СВА и C57BL, наблюдается резкое изменение спектра связывающихся с данными районами ядерных белков. Однако у линии мышей DBA/2 SNP в позициях 629 и 974 п.н. (и, соответственно, спектр связывающихся с данным районом белков аналогичны таковым у

линии C57BL, при этом предрасположенности к алкоголизму у линии DBA не наблюдается.

Это вызвало сомнения в связи уровня активности ТДО2 в печени и предрасположенности к алкоголизму на модели мышей C57BL и, чтобы их разрешить, было выполнено исследование предрасположенности к употреблению алкоголя, активности фермента

ITD02 и нуклеотидной последовательности района интрона 6 гена TD02 у линии мышей CC57BR, полученной от скрещивания мышей BALB и C57BL, в сравнении с родительскими линиями.

Мыши линии CC57BR, как оказалось, обладают повышенной склонностью к потреблению алкоголя в условиях свободного выбора в отличие от мышей BALB (Табл. 2), то есть унаследовали этот признак от родительской линии C57BL. При этом базальная активность TDO2 в печени у мышей BALB, избегающих употребления алкоголя, так же высока, как и у предпочитающих алкоголь мышей C57BL и CC57BR, а индуцированная активность TDO2 достоверно выше, чем у CC57BR.

Таблица 2. Уровень потребления алкоголя и активность TD02 в печени мышей линий C57BL, CC57BR и BALB.

Показатель C57BL CC57BR BALB

Потребление раствора этанола, % от общего количества жидкости (п = 10) 49 ±5,7** 42 ± 3,2* 28 ±3,2

Активность Тй02, нмоль/мг белка/час без индукции (п = 4) глкжокортикоидная индукция (п = 7) 23,7±2,4 44,4 ±3,2 25,0 ±1,9 41,8 ±1,5* 24,1 ± 1,6 47,4 ±1,5

Достоверность межлинейных различив: *р <0,05 по сравнению с ВАЬВ; **р<0,01 по сравнению с ВАЬВ; п - число мышей в групп

При исследовании нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена Ю02 мышей линий ВА_В и СС57ВЯ было обнаружено, что эти последовательности (и, соответственно, спектр связывающихся с районами БЫР ядерных белков) оказались полностью идентичными у мышей ВА_В, СС57ВЯ и ЭВА/2, хотя линия СС57ВЯ предрасположена к развитию алкоголизма, а линии ВА_В и ЭВД/2 - нет.

Таким образом, можно сделать вывод, что обнаруженные нами БЫР в интроне 6 у исследованных пяти линий мышей не имеют видимой связи с предрасположенностью/устойчивостью к развитию алкоголизма и уровнем базальной активности фермента Ю02 в печени. Более того, высокий уровень активности Ю02 в печени у мышей С57В_, возможно, не является основным фактором, определяющим предрасположенность этой линии к развитию алкоголизма, хотя ранее

[Badawy et a/., 1989] именно эта причина (повышенный уровень активности TDO2) называлась основной.

Тем не менее, полученные нами на нескольких линиях мышей результаты не ставят под сомнение данные о том, что ген TDO2 является одним из важных кандидатных генов в генетике поведения человека в целом и развитии предрасположенности к алкоголизму в частности, и свидетельствуют о том, что у линии мышей C57BL, ранее считавшейся весьма удачной моделью предрасположенности к алкоголизму, связанной с изменением уровня экспрессии TDO2, эта предрасположенность реализуется несколько иными путями.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что всем трём обнаруженным в популяциях человека аллелям гена TD02 (основной аллель WT - G, 663 п.н. относительно начала интрона 6, G 666 п.н.; варианты M1 (G->A в позиции 663 п.н.) и М2 (G-»T в позиции 666 п.н.) присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Показано, что в случае обеих мутаций, которые ассоциированы с психическими расстройствами, происходит нарушение в связывании одного и того же белка, являющегося основным фактором, взаимодействующим с "нормальным" аллелем.

2. Установлено, что основной белок, связывающийся с наиболее распространённым аллелем WT, представляет собой транскрипционный фактор YY1.

3. Обнаружено, что в случае мононуклеотидной замены G-*A в позиции 663 п.н., ассоциированной с синдромом Туретта и склонностью к тяжёлой депрессии, происходит разрушение сайта связывания фактора YY1 и появление сайтов связывания одного или двух неидентифицированных белков. Замена G->T в позиции 666 п.н., негативно ассоциированная с алкоголизмом, приводит к резкому ослаблению связывания YY1 и появлению сильного сайта связывания другого транскрипционного фактора - GATA6, что может оказывать существенное влияние на экспрессию гена TDO2.

4. Определены нуклеотидные последовательности интрона 6 гена TDO2 для линий мышей DBA, CBA, C57BL, BALB и CC57BR; обнаружено пять мононуклеотидных замен (SNP) и одна микроделеция. Из них три SNP (в позициях 15, 629 и 974 п.н. от начала интрона 6) приводят к изменению спектра ядерных белков, связывающихся с этими районами.

5. Оценена базальная активность фермента TDO2 в печени мышей предрасположенных к алкоголизму линий C57BL и CC57BR, которая была выше, чем у контрольных по этому признаку линий СВА и DBA, но не выше, чем у линии BALB, так же устойчивой к развитию алкоголизма. Не выявлено связи между тремя характеристиками: распределением SNP в интроне 6, изменениями спектра связывающихся с этими районами ядерных белков у исследованных пяти линий мышей и признаком предрасположенности/устойчивости к возникновению алкоголизма. Таким образом, не обнаружен вклад TDO2 в формирование алкогольной зависимости у линии мышей C57BI, что ограничивает рамки использования данной модели для изучения механизмов формирования алкогольной зависимости у человека.

Основные результаты диссертации содержатся в следующих публикациях:

1. Каледин В.И., Климова Н.В., Васильев Г.В., Иванова Е.А., Васильева Е.Д., Ильницкая СИ. Изучение предрасположенности к алкоголизму, активности триптофаноксигеназы и структуры интрона 6 соответствующего гена у мышей линий C57BL/6J, CC57BR/MV и BALB/cJ // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2003. Т.136. С.435-437.

2. Ponomarenko J.V., Orlova G.V., Merkulova T.I., Gorshkova E.V., Fokin O.N., Vasiliev G.V., Frolov A.S., Ponomarenko M.P. rSNP_Guide: an integrated database-tools system for studying SNPs and site-directed mutations in transcription factor binding sites // Human Mut. 2002. V.20. P.239-248.

3. Ponomarenko J.V., Merkulova T.I., Vasiliev G.V., Levashova Z.B., Orlova G.V., Lavrushev S.V., Fokin O.N., Ponomarenko, M.P., Frolov A.S., Sarai A. rSNP_Guide, a database system for analysis of transcription factor binding to target sequences: application to SNPs and site-directed mutations // Nucl. Acids Res. 2001. V.29. P.312-316.

4. Vasiliev G.V., Klimova N.V., Vasilieva E.D. Single nucleotide polymorphism in intron 6 of the mouse tryptophan 2,3-dioxygenase related to behavioral disorders // Proceedings of the first workshop on information technologies application to problems of biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia. 2001. Novosibirsk. Russia. P.222.

5. Васильева Е.Д., Яковлева Т.В., Васильев Г.В. Повышенный базальный уровень активности триптофаноксигеназы у предпочитающих алкоголь мышей линии C57BL // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. Т. 129. С.408-410.

6. Меркулова Т.И., Васильев Г.В., Меркулов В.М., Кобзев В.Ф., Горшкова Е.В. Точковые мутации в интроне 6 гена триптофаноксигеназы человека, ассоциированные с рядом психических расстройств, разрушают сайт связывания транскрипционного фактора YY1 // Тезисы докладов и сообщений на XIII всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» Цитология. 2000. т.42. С.270.

7. Васильев Г.В., Меркулов В.М., Кобзев В.Ф., Меркулова Т.И., Пономаренко М.П., Подколодная О.А., Пономаренко Ю.В., Колчанов Н.А. Точковые мутации в районе 663-666 п.н. интрона 6 гена триптофаноксигеназы, связанные с рядом психических расстройств, разрушают сайт связывания фактора транскрипции YY1 // Молекулярная Биология. 2000. V.34. Р.214-222.

8. Vasiliev G.V., Merkulov V.M., Kobzev V.F., Merkulova T.I., Ponomarenko M.P., Kolchanov N.A. Point mutations within 663-666 bp of intron 6 of the human TDO2 gene, associated with a number of psychiatric disorders, damage the YY-1 transcription factor binding site // FEBS Letters. 1999. V. 462. P.85-88.

9. Vasiliev G.V., Merkulov V.M., Kobzev V.F., Ponomarenko M.P., Levashova Z.B., Merkulova T.I. Assotiated with psychical disorders, point mutations in intron 6 of the tryptophane oxygenaze damage the binding site of regulatory protein YY1 // Abstracts of 150-anniversary of Ivan Pavlov International Symposium. St. Petersburg. 1999. P.77-78.

10. Merkulova T.I., Vasiliev G.V., Merkulov V.M., Gorshkova E.V., Kobzev V.F. Point mutations within 663-666 bp of intron 6 of the human TDO2 gene, associated with a number of psychiatric disorders, change the spectrum of nuclear proteins bound to the region. // Genetic and Developmental Psychoneuroendocrinology. Novosibirsk. 1999. P.66.

11. Васильев Г.В., Меркулов B.M., Кобзев В.Ф. Энхансероподобная зона в 6-м интроне гена триптофаноксигеназы крысы // Труды д£. Съезда Биохимического общества РАН. 1997 Пущино. С. 139.

12. Merkulov V.M., Merkulova T.I., Kobylyanskaya O.V., Vasiliev G.V. Regulatory elements located within rat tryptophan oxygenase gene // Франко-российский симпозиум "Regulation of Gene Expression" 1995. Новосибирск С.25.

Подписано к печати 9/П 2004 г.

Формат бумаги 60x90. Печ.л. 1. Уч. изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 21.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак.Лаврентьева, 10.

349*

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильев, Геннадий Владимирович

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Фермент триптофаноксигеназа 9 1.1.1. Структура гена TD02 и регуляция его экспрессии

1.2. Роль триптофаноксигеназы в развитии психических расстройств

1.2.1. Ассоциация между развитием определённых психических расстройств и полиморфизмом гена TD

1.3. Полиморфизм генов в популяции человека

1.3.1. SNP в кодирующих последовательностях генов человека

1.3.2. SNP в некодирующих последовательностях генов человека

1.3.3. Неслучайный характер фиксации SNP в некодирующих районах генов

1.4. Транскрипционные факторы YY1 и GATA

1.5. Транскрипционный фактор YY1 36 1.4.2. Транскрипционный фактор GATA

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.2. Олигонуклеотиды

2.3. Линии животных

2.4. Приготовление экстракта ядер клеток печени

2.5. Метод торможения ДНК-пробы в геле

2.6. Вестерн-блот анализ

2.7. Окраска белков красителем "Ferry-Dye"

2.8. Определение активности триптофаноксигеназы и 49 тирозинаминотрансферазы

2.9. Выделение геномной ДНК

2.10. ПЦР

2.11. Выделение продуктов ПЦР из агарозных гелей

2.12. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК

3. Результаты

3.1. Изучение связывания транскрипционных факторов с различными вариантами района 651 - 680 п.о. интрона 6 гена TD02 человека

3.2. Идентификация белков, связывающихся с изучаемым районом

3.3. Определение базального уровня активности триптофаноксигеназы у полярных по моделям поведения линий мышей

3.4. Обнаружение SNP в районе интрона 6 гена TD02 у контрастных по моделям поведения линий мышей

3.5. Идентификация белков, связывающихся с SNP в интроне гена TD02 мыши

4. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические эффекты единичных нуклеотидных замен в интроне 6 гена триптофандиоксигеназы человека и мыши"

Актуальность темы.

После завершения проекта «Геном человека» началось стремительное накопление данных по полиморфизму последовательностей ДНК в популяциях человека. Самым распространенным вариантом полиморфизма являются единичные нуклеотидные замены (SNP, single nucleotide polymorphism), особый интерес к изучению которых связан с тем, что они часто оказываются ассоциированы с различными клинически важными признаками — заболеваниями, наследственной предрасположенностью к возникновению различных расстройств или индивидуальной чувствительностью к лекарственным препаратам и прочим химическим веществам. При этом до сих пор основные усилия сосредоточены на выявлении и изучении SNP в кодирующих районах генов и сайтах сплайсинга [Krawszak et al., 2000а], поскольку такие SNP приводят к изменению структуры белкового продукта гена, что легко детектируется и интерпретируется. Однако основная масса SNP у человека обнаруживается в других (некодирующих) районах генов, в том числе регуляторных, но этим SNP уделяется гораздо меньше внимания [Krawszak et ah, 2000а]. В последнее время начали развиваться работы по выявлению SNP в промоторных районах и изучению их влияния на регуляцию экспрессии генов, но исследования, направленные на выявление и функциональную интерпретацию потенциальных регуляторных SNP в интронах, до сих пор единичны [Vasiliev et ah, 1999; Ozaki et ah, 2002; Prokunina et ah, 2002].

Активно проводимые работы по поиску SNP в протяжённых районах генов человека, приводящие к накоплению данных об имеющих клинические проявления и не затрагивающих сайты сплайсинга SNP в интронах, требуют функционального анализа подобных SNP и установления конкретных механизмов их проявления.

При изучении влияния SNP на функции гена наиболее благоприятными являются две ситуации: 1) SNP существенно изменяет структуру белкового продукта и 2) исследуемый ген является мажорным, то есть практически полностью определяет фенотипический признак. Примером совпадения обеих ситуаций является группа SNP, вызывающих заболевание фенилкетонурия [Смагулова, 2000]. Соответственно, распространённость и механизмы действия таких SNP изучены очень подробно. Противоположный полюс представляют ситуации, когда либо исследуемый признак является полигенным, либо изучаемый SNP не изменяет радикально функции белкового продукта (например, находится в регуляторном районе гена). Поскольку SNP в регуляторном районе не влияет на структуру белка, то установить прямую связь между таким SNP и конкретным признаком невозможно, и их взаимозависимость обнаруживается путём статистического анализа обширного материала. Такой анализ зачастую осложняется большим количеством генов, вовлечённых в формирование признака, явлением гетерозиса у гетерозигот или низкой пенетрантностью признака, что часто наблюдается в случае предрасположенности к определённым нарушениям. Поэтому важность изучения конкретных молекулярных механизмов влияния регуляторных SNP в подобных ситуациях нельзя переоценить.

Если продукты экспрессии генов (структурные белки, ферменты, пептиды, гормоны, рецепторы) могут хотя бы потенциально участвовать в физиологических или патологических процессах, то эти гены называют генами-кандидатами [Чистяков и др., 1998]. Фермент триптофаноксигеназа человека (TD02) является одним из ключевых звеньев в цепи биосинтеза нейромедиатора серотонина. Поэтому ген TD02 часто рассматривается как один из генов-кандидатов на связь с различными нарушениями поведения — предрасположенностью к шизофрении и алкоголизму [Le Marquand et al., 1994], различными фобиями [Brown, van Praag, 1990] синдромом Туретта

Comings, 1990] и многими другими. В частности, установлена статистически достоверная ассоциация между двумя SNP в гене TD02 человека в позициях 663 п.н. и 666 п.н. от начала интрона 6 и такими расстройствами поведения, как синдром Туретта, предрасположенность к наркотической, алкогольной зависимости и патологической склонностью к азартным играм. Данные SNP являются примером вдвойне сложной для изучения ситуации, поскольку влияют на развитие полигенного признака [Propping et al., 1993] и находятся в некодирующем районе гена TD02 [Comings et al., 1996], являющемся потенциальным регуляторным районом [Merkulov et al., 1995]. Последнее обстоятельство дало нам возможность предположить, что мы имеем дело с так называемыми регуляторными SNP, расположенными в регуляторной зоне гена и влияющими на его экспрессию за счёт изменения в связывании с данным районом регуляторных ядерных белков.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов влияния SNP в интроне 6 гена TD02 человека на развитие психических нарушений и изучение адекватности общепринятой экспериментальной модели (мыши линии C57BL), связывающей предрасположенность к алкоголизму с повышенным уровнем экспрессии гена TD02.

В ходе выполнения данной работы были решены следующие задачи:

1) изучение возможных молекулярных механизмов влияния ассоциированных с рядом психических расстройств SNP в интроне 6 гена TD02 человека (G—>А в позиции 663 п.н. и G—>Т в позиции 666 п.н. относительно начала интрона) на экспрессию этого гена;

2) проверка имеющихся литературных данных о том, что предрасположенность линии мышей C57BL к развитию алкоголизма связана с повышенным по сравнению с другими линиями мышей уровнем активности TD02 в печени;

3) поиск и сравнительное изучение SNP в районе интрона 6 у нескольких линий мышей, определение связывающихся с районами SNP ядерных белков и поиск корреляций между SNP, изменениями спектра связывающихся белков и признаком предрасположенности/устойчивости к развитию алкоголизма.

В ходе выполнения данной работы были получены следующие результаты:

1) Показано, что всем трём обнаруженным в популяциях человека аллелям гена TD02 присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом.

2) Основной связывающийся с наиболее распространённым аллелем WT белок идентифицирован как транскрипционный фактор YY1.

3) Обнаружено, что в случае мононуклеотидной замены G-»A в позиции 663 п.н. происходит разрушение сайта связывания фактора YY1 и появление сайтов связывания одного или двух неидентифицированных нами белков. Замена G-»T в позиции 666 п.н., негативно ассоциированная с алкоголизмом, приводит к резкому ослаблению связывания YY1 и появлению сильного сайта связывания другого транскрипционного фактора — GATA6, что может оказывать существенное влияние на экспрессию гена TD02.

4) В результате определения нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена TD02 для шести линий мышей обнаружено пять SNP и одна микроделеция. Из них три SNP приводят к изменению спектра ядерных белков, связывающихся с этими районами.

5) Изучена активность TD02 в печени шести линий мышей. Не установлено связи между уровнем активности TD02 в печени мышей и признаком предрасположенности/устойчивости к развитию алкоголизма. Распределение SNP в интроне 6 и изменения спектра связывающихся с этими районами ядерных белков у исследованных пяти линий мышей также не коррелировали с признаком предрасположенности/ устойчивости к возникновению алкоголизма. Таким образом, в отличие от человека, не обнаружен вклад TD02 в формирование алкогольной зависимости у линии мышей C57BL. Апробация работы

Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИциГ, на XIII всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Пущино, 2000), и на международных конференциях: «Применение информационных технологий к проблемам биоразнообразия и динамики экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 1999); «Second international conference on bioinformatics of genome regulation and structure» (Novosibirsk, 2000); «Genetic and Developmental Psychoneuroendocrinology» (Novosibirsk. 1999); «150-anniversary of Ivan Pavlov International Symposium" (St. Petersburg, 1999). По теме диссертации опубликовано 7 статей.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ФЕРМЕНТ ТРИПТОФАНОКСИГЕНАЗА

Триптофан-2,3-диоксигеназа (триптофаноксигеназа; триптофанпирролаза; триптофаназа; триптамин 2,3-диоксигеназа; ЕС 1.13.11.11, далее - TD02) является ключевым ферментом в цепи катаболической деградации аминокислоты триптофана (схема катаболической деградации триптофана приведена на Рис. 1). TD02 является гомотетрамером, связывающим две молекулы гема в качестве кофермента. У человека TD02 обеспечивает окисление около 90% триптофана, подвергающегося катаболической деградации [Hayaishi, 1976]. Поэтому TD02 является основным ферментом, регулирующим уровень этой аминокислоты в плазме крови.

TD02 считается примером строго тканеспецифичного фермента — активность её обнаружена только в зрелых паренхимальных клетках печени. Активность фермента в печени крыс обнаруживается через 2 недели после рождения, и достигает уровня, характерного для взрослых животных, через 4-5 недель. Однако, на уровне отдельных клеток экспрессия TD02 регистрируется в ряде полностью дифференцированных гепатоцитов уже на следующий день после рождения [Nakamura et al., 1987]. Экспрессия TD02 обнаруживается в культуре первичных гепатоцитов, хотя быстро снижается при длительном культивировании [Nakamura et al., 1987], при этом она не выявлена ни в одной из известных линий гепатом, даже высокодифференцированных [Kaltschmidt et al., 1994].

Однако, в работе Хабера [Haber et al., 1993] методом РТ-ПЦР было показано, что мРНК гена TD02 кроме печени присутствует в мозге грызунов. мРНК TD02 была детектирована в коре, мозжечке, гипоталамусе. Ранее наличие ферментативной активности TD02 в мозге, о которой сообщалось в работе Гала [Gal, 1974], было сочтено ошибочным, поскольку применённая им методика не позволяла разделить активности ферментов TD02 и индолиламин 2,3-диоксигеназы [Haber et al, 1993]. Тем не менее, в свете новых данных кажется весьма вероятным заключение, что TD02, кроме печени, экспрессируется также в мозге.

Экспрессия TD02 находится под гормональным контролем: TD02 индуцируется глюкокортикоидами, катехоламинами, глюкагоном и подавляется инсулином [Nakamura et al., 1987].

2.1.1. СТРУКТУРА ГЕНА TD02 И РЕГУЛЯЦИЯ ЕГО ЭКСПРЕССИИ.

Ген TD02 локализован на хромосоме 4q31 у человека, 2q33 у крысы и у на хромосоме 3 мыши. Как у крысы [Schmid et al., 1982], так и у i i

5-Гидрокситриптофан Триптамин N-Форм и лкн курении

5-1 идрокситриптамин Индолилухсусная кислота Кинуренин (Серого ни н) I

5- Г и д ро кс н и н д ол ил -уксусная кислота

Анграииловая кислота

З-Гидро кси ки нуре н ин I

З-Гидро кси антран иловая кислота I

Никотиновая кислота

Никотин амвд

N-Метилн икотинамни

Рис.1. Схема катаболической деградации триптофана. Синим цветом показаны метаболиты, выводимые с мочой, красной стрелкой — катализируемая триптофандиоксигеназой реакция превращения триптофана в N-формилкинуренин. человека [Comings et al., 1991] ген TD02 содержит 12 экзонов (A-L) и И интронов (1-И), экзон-интронная структура гена TD02 мыши до сих пор не определена, хотя, скорее всего, является аналогичной. Длина мРНК TD02 крысы составляет -2000 п.н. [Schmid et al., 1982].

В гене TD02 выявлено несколько регуляторных районов. Лучше всего изучены участки, отвечающие за глюкокортикоидную регуляцию экспрессии гена TD02 крысы. В промоторном районе данного гена в позициях —1275 и — 440 от старта транскрипции расположены два сайта связывания глюкокортикоидного рецептора, что доказано in vitro экспериментами по футпринтингу и трансфекциями САТ-конструкций (Schule et al., 1988). Кроме того, методом связывания очищенного рецептора глюкокортикоидов с протяжёнными участками ДНК in vitro показано, что район 5-6 интронов связывает рецептор с большей интенсивностью, чем район промотора [Merkulov, Merkulova, 1992]. В промоторном районе гена TD02 человека участки связывания рецептора пококортикоидов разрушены вставкой ~1000 п.н., однако глюкокортикоидная регуляция гена полностью сохраняется [Comings et al., 1995]. Дополнительным аргументом в пользу важности для регуляции гена района 5-6 интронов является то, что в этом районе методом связывания ДНК-пробы в геле обнаружено несколько реальных сайтов связывания различных транскрипционных факторов [Merkulov et al., 1995].

5'-фланкирующий район гена TD02 крысы в клетках печени содержит 8 сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I, которые соответствуют участкам с нарушенной нуклеосомной укладкой хроматина и часто оказываются связаны с активными регуляторными районами гена. Из них первые три расположены кластером на расстоянии -0.2 т.п.н. от старта транскрипции, остальные - -8, -8.5, -11.6, -17.4, и -19.5 т.п.н. Ни транскрибируемый район, ни 3 '-фланкирующая часть гена не содержат хорошо выраженных сайтов гиперчувствительности [Kaltschmidt et al., 1994]. Следует отметать тот факт, что паттерн сайтов гиперчувствительности у крысят полностью формируется вскоре после рождения, в то время как экспрессия гена TD02 детектируется не ранее чем в двухнедельном возрасте. Это позволило сделать предположение, что экспрессия гена TD02 регулируется не идентифицированным до сих пор печень-специфичным транскрипционным фактором или комплексом факторов, характерным только для полностью дифференцированных гепатоцитов [Kaltschmidt et al., 1994]. Эксперименты на трансгенных животных с искусственными САТ-конструкциями, содержащими район сайтов гиперчувствительности -8 и -8.5 т.п.н. показали, что этот район содержит комплекс, отвечающий за тканеспецифичность экспрессии гена TD02, поскольку у данных трансгенных животных временной и тканевой паттерн экспрессии САТ-конструкции полностью совпадал с паттерном экспрессии TD02 у нормальных мышей [Kaltschmidt et al., 1994]. Следует отметить, что глубокое изучение регуляции тканевой и временной специфичности экспрессии гена TD02 крайне осложнено тем фактом, что этот ген не экспрессируется ни в одной из известных клеточных линий.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Васильев, Геннадий Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Показано, что всем трём обнаруженным в популяциях человека аллелям гена TD02 (основной аллель WT - G (663 п.н. относительно начала интрона 6), G (666 п.н.); варианты Ml (G->A в позиции 663 п.н.) и М2 (G->T в позиции 666 п.н.) присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Показано, что в случае обеих мутаций, которые ассоциированы с психическими расстройствами, происходит нарушение в связывании одного и того же белка, являющегося основным фактором, взаимодействующим с "нормальным" аллелем.

2. Установлено, что основной белок, связывающийся с наиболее распространённым аллелем WT, представляет собой транскрипционный фактор YY1.

3. Обнаружено, что в случае мононуклеотидной замены G->A в позиции 663 п.н., ассоциированной с синдромом Туретта и склонностью к тяжёлой депрессии, происходит разрушение сайта связывания фактора YY1 и появление сайтов связывания одного или двух неидентифицированных белков. Замена G->T в позиции 666 п.н., негативно ассоциированная с алкоголизмом, приводит к резкому ослаблению связывания YY1 и появлению сильного сайта связывания другого транскрипционного фактора — GATA6, что может оказывать существенное влияние на экспрессию гена TD02.

4. Определены нуклеотидные последовательности интрона 6 гена TD02 для линий мышей DBA, СВА, C57BL, BALB и CC57BR, обнаружено пять SNP и одна микроделеция. Из них три SNP (в позициях 15, 629 и 974 п.н. от начала интрона 6) приводят к изменению спектра ядерных белков, связывающихся с этими районами.

5. Оценена базальная активность фермента TD02 в печени мышей предрасположенных к алкоголизму линий C57BL и CC57BR, которая была выше, чем у контрольных по этому признаку линий СВА и DBA, но не выше, чем у линии BALB, так же устойчивой к развитию алкоголизма. Не выявлено связи между тремя характеристиками: распределением SNP в интроне 6, изменениями спектра связывающихся с этими районами ядерных белков у исследованных пяти линий мышей и признаком предрасположенности/устойчивости к возникновению алкоголизма. Таким образом, не обнаружен вклад TD02 в формирование алкогольной зависимости у линии мышей С57В1, что ограничивает рамки использования данной модели для изучения механизмов формирования алкогольной зависимости у человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильев, Геннадий Владимирович, Новосибирск

1. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко A.M., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. М.: Наука. 1983. 190 с.

2. Васильева Е.Д., Яковлева Т.В., Васильев Г.В. Повышенный базальный уровень активности триптофаноксигеназы у предпочитающих алкоголь мышей линии C57BL // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. Т. 129. С.408-410.

3. Морозов И. В. Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы: дисс. канд. биол. наук. Новосибирск: Новосибирский институт биоорганической химии, 1998.

4. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультроцентрифугирование. М.: Наука, 1981, 286 с.

5. Пузырев В.П., Степанов В.А. Патологическая анатомия генома человека. Новосибирск.: Наука. 1997. 223 с.

6. Смагулова Ф.А. Молекулярная природа фенилкетонурии в Новосибирской области: дисс. канд. биол. наук. Новосибирск, 2000 г.

7. Сьяксте Н.И., Сьяксте Т.Г. Факторы транскрипции и ядерный матрикс // Мол. Биология. 2001. Т.35. С.739-749.

8. Addess К.J., Basilion J.P., Klausher R.D., Rouault Т.A., Pardi A. Structure and dynamics of the iron responsive element RNA: implications for binding of the RNA by iron regulatory binding proteins. // J. Mol. Biol. 1997. V.274. P.72-83.

9. Adrian G.S., Seto E., Fischbach K.S., Rivera E.V., Adrian E.K., Herbert D.C., Walter C.A., Weaker F.J., Bowman B.H. YY1 and Spl transcription factors bind the human transferrin gene in an age-related manner // J. Gerontol. 1996. V.51. P.66-75.

10. Ammendola R., Gounari F., Piaggio G., De Simone V., Cortese R. Transcription of the promoter of the rat NF-1 gene depends on the integrity of an Spl recognition site //Mol. Cell. Biol. 1990. V.10. P.387-390.

11. Arceci R.J., King A.A., Simon M.C., Orkin S.H., Wilson D.B. Mouse GATA-4: a retinoic acid-inducible GATA-binding transcription factor expressed in endodermally derived tissues and heart // Mol. Cel. Biol. 1993. V.13. P.2235-2246.

12. Asherson P., Mant R., Holmans P., Williams J., Cardino А., Murphy К., Jones L., Collier D., Mcguffin P., Owen M.J. Linkage, association and mutational analysis of the dopamine D3 receptor gene in schizophrenia // Molec. Psychiatr. 1996. V.l. P.125-132.

13. Austen M., Cerini C., Luscher-Firzlaff J.M., Luscher B. YY can inhibit c-Myc function through a mehanizm requiring DNA binding of YY1 but neither its transactivation domain nor direct interaction with c-Myc // Oncogene. 1998. V.l7. P.511-520.

14. Ayala F.J., Escalante A., O'Huigin C., Klein J. Molecular genetics of speciation and human origin // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P.6787-6794.

15. Badawy A.A., Morgan C.J., Lane L., Dhaliwal K., Bradley D.M. Liver triptophan pirrolase — a major determinant of lower brain 5-hydroxytriptamine concentration in alcohol-preferring C57BL mice // Biochem. J. 1989. V.264. P.597-599.

16. Badawy A. A., Morgan С J., Thomas R. Tryptophan and 5-hydroxytryptamine metabolism in alcoholism // Alcohol Alcoholism Suppl. 1993. V.2. P. 231-235.

17. Barbato G.F., Kruzelock R.P. Heterosis for concentrations of dopamine, norepinephrine, their metabolites, and epinephrine in the chick hyperstriatum ventrale, hypothalamus, and optic tectum // Behav. Genet. 1992. V.22. P.381-398.

18. Becker K.G., Jedlicka P., Templeton N.S., Liotta L., Ozato K. Characterization of hUCRBP (YY1, NF-E1, delta): a transcription factor that binds the regulatory regions of many viral and cellular genes // Gene. 1994. V. 150. P.259-266.

19. Bidwell J., van Wijnen A., Banerjee C., Fey E., Merriman H., Penman S., Stein J., Lian J., Stein G. Parathyroid-responsive modifications in the nuclear matrix of ROS 17/2.8 rat osteosarcoma cells // Endocrynology. 1994. V.34. P. 1738-1744.

20. Blum K., Noble E.P., Sheridan P.J., Montgomery A., Ritchie Т., Jadadeeswaran P., Nogami H., Briggs A.H., Cohn J.B. Allelic association of human dopamine D2 receptor gene in alcoholism // J. Am. Med. Assn. 1990. V.263. P.2055-2059.

21. Bossard P., Zaret K.S. GATA transcription factors as potentiators of gut endoderm differentiation // Development. 1998. V.125. P.4909-4917.

22. Branchley L., Branchley M., Shaw S., Lieber C. Depression, suicide and agression in alcoholics and their relationship to plasma amino acids // Psychiatry Res. 1984. V.12. P.219-226.

23. Brown S-L., van Praag H.M. The role of serotonin in psychiatric disorders. New-York: Bruner/Mazel, 1990. P. 1-348.

24. Bruno M.D., Korfhagen T.R., Liu C., Morrisey E.E., Whitsett J.A. GATA-6 activates transcription of surfactant protein A // J. Biol. Chem. 2000. V.275. P. 1043-1049.

25. Bulaj Z.J., Griften L.M., Jorde L.B., Edwards C.Q., Kushner J.P. Clinical and biochemical abnormalities in people heterozygous for hemochromatosis // N. Engl. J. Med. 1996. V.335. P.1799-1805.

26. Bushmeyer S., Park K., Atchisom M. Characterization of functional domains within the multifunctional transcription factor YY1 // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.30213-30220.

27. Cereghini S. Liver-enriched transcription factors and hepatocyte differentiation // FASEB J. 1996. V.10. P.267-282.

28. Cereghini S., Raymondjean M., Carranca A., Herbomel P., Yaniv M. Factors involved in control of tissue-specific expression of albumin gene // Cell. 1987. V.50. P.627-638.

29. Chalepakis G., Schauer M., Cao X.A., Beato M. Efficient binding of glucocorticoid receptor to its responsive element requires a dimer and DNA flanking sequences. // DNA Cell Biol. 1990. V.9. P.355-68.

30. Charron F., Paradis P., Bronchain O., Nemer G., Nemer M. Cooperative interaction between GATA-4 and GATA-6 regulates myocardial gene expression // Mol. Cel. Biol. 1999. V.19. P.4355-4365.

31. Clifford R., Edmonson M., Hu Y., Nguen C., Scherpbier Т., Buetow K. Expression-based genetic/physical Maps of single nucleotide polymorphisms identified by the Cancer Genome Anatomy progect // Genome Res. 2000. V. !0. P.1259-1265.

32. Cloninger C.R. Neurogenetic adaptive mechanisms in alcogolism // Science. 1987. V.236. P.410-416.

33. Collins F.S., Guyer M.S., Chakaravati A. Variations on a theme: cataloging human DNA sequence variations // Science. 1997. V.278. P.l580-1581.

34. Comings D.E. Blood serotonin and tryptophan in Tourette syndrome. // Amer. J. Med. Genetics. 1990. V.36. P.418-430.

35. Comings D.E., Muhleman D., Dietz G., Donlon T. Human tryptophan oxygenase localized at to 4qp31: Possible implications for human behavioral disorders//Genomics. 1991. V.9. P.301-308.

36. Comings D.E. The genetics of Human behavior — Lessons for two societies //Presidential Address. 1993. P.452-460.

37. Comings D.E., Muhleman G., Dietz G. Association between Tourette's syndrome and homozygosity at the dopamine -D3 receptor gene // Lancet. 1993. V.341. P.906.

38. Comings D.E., Muhleman D., Dietz G.W., Sherman M., Forest G. Sequence of human tryptophan 2,3-dioxygenase (TD02): Presence of glucocorticoid response-like element composed of GTT repeat and an intronic CCCCT repeat // Genomics. 1995. V.29. P.390-396.

39. Comings D.E., Gade R., Wu S. Studies of the potential role of the dopamine D1 receptor gene in addictive behaviors // Mol. Psychiatiy. 1997. V.2. P.44-56.

40. Comings D.E. Why different rules are required for polygenic inheritance: Lessons from studies of the DRD2 Gene // Alcohol. 1998. V. 16. P.61-70.

41. Costa P.T.J., McCrae R.R. The Revised NEO Personality Inventory (NEO-PI-R) // New York: Plenum. 1996.

42. D'Alfonso S., Richardi P.M., A polimorphic variation in a putative regulation box of the TNFA promoter region // Immunogenetics. 1994. V.39. P. 150-154.

43. Davis D.L., Burch J.B. The chicken vitellogenin II gene is flanked by a GATA factor-dependent estrogen response unit // Mol. Endocrinol. 1996. V.8. P.937-944.

44. Ebato H., Seyfried T.N., Yu R.K. Biochemical study of heterosis for brain myelin content in mice // J. Neurochem. 1983. V.40. P.440-446.

45. Espinas M.L., Roux J., Ghysdael J., Pictet R., Grange T. Participation of Ets transcription factors in the glucocorticoid response of the rat tyrosine aminotransferase gene //Mol. Cell. Biol., 1994. V.14. P.4116-25.

46. Freimer M., KanM., Kranzler H., Satel S., Lacobelle J., Skipsey K., Charney D.S., Gelernter J. No association between D3 dophamine receptor (DRD3) allele and cocaine dependence // Addict. Biol. V.l. P.281-287.

47. Gal E.M. Cerebral tryptophan-2-3-dioxygenase (pyrrolase) and its induction in rat brain // J. Neurochem. 1974. V.22. P.862-863.

48. Galvin K.M., Shi Y. Multiple mechanisms of transcriptional repression by YY1 //Mol. Cel. Biol. 1997. V.17. P.37-23-3732.

49. Gelernter J., Goldman D., Risch N. The Al allele at the D2 dopamine receptor gene and alcoholism // Am. Med. Assn. 1993. V.269. P. 1673—1677.

50. Ginns E.I. Jean P. Philibert R.A., et al. A genome-wide search for chromosomal loci linked to mental health wellness in relatives at high risk for bipolar affective disorder among the Old Order Amish // Proc. Natl Acad. Sci. 1998. V.95. P. 15531-15536.

51. Goldman P.S., Trans V.K., Goodman R.H. The multifunctional role of the co-activator СВР in transcriptional regulation // Recent Progr. Horm. Research. 1997. V.52. P.103-119.

52. Goodnow C.C. Pathways for self-tolerance and the treatment of autoimmune diseases // Lancet. 2001. V.357. P.2115-2121.

53. Gorski K., Carnero M., Schibler U. Tissue-specific in vitro transcription from the mouse albumin promoter // Cell. 1986. V. 47. P. 767-776.

54. Granner D.K., Tomkins G.M. Tryptophan oxygenase // Methods in Enzymology. 1970. V.XVII A. P.633-637.

55. Gualberto A., LePage D., Pons G. Malder S.L., Park K., Atchison M.L., Walsh K. Functional antagonism between YY1 and the serum response factor // Mol. Cell. Biol. 1992. V.12. P.4209-4214.

56. Haber R., Bessette D., Hulihan-Giblin В., Durcan M.J., Goldman D. Identification of tryptophan 2,3-dioxygenase RNA in rodent brain // J. Neurochem. 1993. V. 3. P. 1159-1162.

57. Halushka M.K., Fan J.B., Bentley K., Hsie L., Shen N., Weder A., Cooper R., Lipshutz R., Chakravarti A. Patterns of single-nucleotide polymorphismsin candidate genes for blood-pressure homeostasis // Nat Genet. 1999. V.22. P.239-247.

58. Hamblin M.T., Thompson E.E., Di Rienzo A. Complex Signatures of Natural Selection at the Duffy Blood Group Locus // Am. J. Hum. Genet. 2002. V.70. P.369-383.

59. Hansen J.C., Tse C., Wolffe A.P. Structure and function of the core histone N-termini: more than meets the eye // Biochemistry. 1998. V.37. P.17637-17641.

60. Harding F.J., Clegg J.B., Boyce A.J. Why are some genetic diseases common? Distinguishing selection from other processes by molecular analysis of globin gene variants // Hum. Genet. 1993. V.91 P.91-117.

61. Hariharan N., Kelley D.E., Perry R.P. Delta, a transcription factor that binds to downstream elements in several polymerase П promoters, is a functionally versatile zinc finger protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.9799-9803.

62. Hayaishi O. Properties and function of indoleamine 2,3-dioxygenase // J. Biochem. 1976. V.79. P. 13-21.

63. Hofinan J.F., Laroche Т., Brand A., Gasser S.M. RAP-1 factor is necessary for DNA loop formation in vitro at the silent mating type locus HML // Cell. 1981. V.57. P.725-737.

64. Holmes M., Turner J., Fox A., Chisholm O., Crossley M., Chong B. hFOG-2, a novel zinc finger protein, binds the co-repressor mCtBP2 and modulates GATA-mediated activation // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.23491-23498.

65. Huggon I.C., Davies A., Gove C., Moscoso G., Moniz C., Foss Y., Farzaneh F., Towner P. Molecular cloning of human GATA-6 DNA binding protein:high levels of expression in heart and gut // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V.1353. P.98-102.

66. Ikeya K., Jaiswal A.K., Owens R.A., Jones J.E., Nebert D.W., Kimura S. Human CYP1A2: sequence, gene structure, comparison with the mouse and rat orthologous gene, and differences in liver 1A2 mRNA expression // Mol. Endocrinol. 1989. V3. P. 1399-408.

67. Jonat C., Rahmsdorf H., Park K., Cato A.C., Gebel S., Ponta H., Herrlich K.-K. Antitumor promotion and antiinflammation: down-modulation of AP-1 (Fos/Jun) activity by glucocorticoid hormone // Cell. 1990. V.62. P.1189-1204.

68. Kaltschmidt C., Muller M., Brem G., Renkawitz R. DNAse I hypersensitive sites far upstream of the rat tryptophan oxygenase gene direct developmentally regulated transcription in livers of transgenic mice // Mech. Development. 1994. V.45. P.203-210.

69. Kimura M., Evolutionary rate at the molecular level // Nature. 1968. V.217. V.624-626.

70. Kimura M. Rare variant alleles in the light of the neutral theory II Mol. Biol. Evol. 1983 V.l. P.84—93.

71. Kimura M. Neutral theory of molecular evolution // Cambrige University Press. 1985. Cambrige. UK.

72. Knight J.C., Udalova I., Hill A., Greenwood B.M., Peshu N., Marsh K., Kwiatkowski D. A polymorphism that affects OCT-1 binding to the TNF promoter region is associated with severe malaria // Nature Genetics. 1999. V.22. P.145-150.

73. Koutsourakis M., Langeveld A., Patient R., Beddington R., Grosveld F. The transcription factor GATA6 is essential for early extraembryonic development //Development. 1999. V.126. P.723-732.

74. Krawczak M., Ball E.V., Fenton I., Stenson P., Abeysinghe S., Thomas N., Cooper D.N. Human gene mutation database a biomedical information and research resource // Hum. Mutat. 2000. V.15. P.45-51.

75. Krawczak M, Chuzhanova NA, Stenson PD, Johansen BN, Ball EV, Cooper DN. Changes in primary DNA sequence complexity influence the phenotypic consequences of mutations in human gene regulatory regions // Hum Genet. 2000. V. 107. P.362-365.

76. Lai E., Prezioso V.R., Smith E., Litvin O., Costa R.H., Darnell J.E. HNF-3A, a hepatocyte-enriched transcription factor of novel structure is regulated transcriptionally // Genes Dev., 1990. V.4. P. 1427-1438.

77. Laverriere A.C., MacNeill С., Mueller С., Poelmann R.E., Burch J.B., Evans T. GATA-4/5/6, a subfamily of three transcription factors transcribed in developing heart and gut // J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.23177-23184.

78. Lee T.C., Shi Y., Schwartz R.J. Displacement of BrdUrd-induced YY1 by serum response factor activates skeletal alpha-actin transcription in embryonic myoblasts // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. V.89. V.9814-9818.

79. LeMarquand D., Rihl R.O., Benkelfat C. Serotonin and alcohol intake, abuse, and dependence: findings of animal studies // Biol. Psychiatry. 1994. V.36 P.326-327.

80. Lercher M.J., Hurst L.D. Human SNP variability and mutation rate are higher in regions of high recombination // Trends Genet. 2002. V.l8. P.337-340.

81. Li W.H., Sadler L.A. Low nucleotide diversity in man // Genetics. 1991. V.l29. P.513-523.

82. Maechler P., Wollheim C.B. Mitochondrial function in normal and diabetic b-cells //Nature. 2001. V.414. P.807-812.

83. Marvit J., DiLella A.G., Brayton K., Ledley F.D., Robson K., Woo S. GT to AT transition at a splice donor site causes skipping of the preceding exon in phenilketonuria //Nucl. Res. Comm. 1987. V.15. P.5613-5628.

84. Merkulov V.M., Merkulova T.T. Nucleotide sequence of a fragment of the rat tryptophan oxygenase gene showing high affinity to glucocorticoid receptor in vitro // Biochem. Biophys. Acta. 1992. V.l 132. P.100-102.

85. Merkulov V.M, Merkulova T.I, Mitina R.L., Kobylyanskaya O.V., Vasilyev G.V. Regulatory elements located within rat tryptophan oxygenase gene // French-Russian Symp. Regulation of Gene Expression. Novosibirsk. 1995. P. 25.

86. Merryweather-Clarke A.T., Pointon J.J., Shearman J.D., Robson K.J. Global prevalence of putative haemochromatosis mutations // J. Med. Genet. 1997. V.34. P.275-278

87. Miskimins R., Ebato H., Seyfried T.N., Yu R.K. Molecular basis for heterosis for myelin basic protein content in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. V.83. P.l 532-1535.

88. Molkentin J.D. The zinc finger-containing transcription factors GATA-4, -5, and -6 II J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.38949-38952.

89. Monroe C.B. Induction of tryptophan oxygenase and tyrosine aminotransferase in mice // Am. J. Physiol. 1968. V.214. P.1410-1414.

90. Morgan С J., Badawy A. A. Alcohol-induced euphoria: exclusion of serotonin// Alcohol Alcoholism. 2001. V.36. P.22-25.

91. Morrisey E.E., Ip H.S., Lu M.M., Parmacek M.S. GATA-6: a zinc finger transcription factor that is expressed in multiple cell lineages derived from lateral mesoderm // Dev. Biol. 1996. V.l77. P.309-322.

92. Neel J.V. The thrifty genotype in 1998 // Nutr. Rev. 1999. V.57. P.2-7.

93. Naranjo C.A., Sellers E.M., Lawrin M.O. Modulation of ethanol intake by serotonin uptake inhibitors // J. Clin. Psychiatry. 1986. V.47 (Suppl.). P. 1622.

94. Nishimura H., Nose M., Hiai H., Minato N., Honjo T. Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-carrying immunoreceptor // Immunity. 1999. V. 11. P. 141 -151.

95. Pizzorno M.C. Nuclear cathepsin B-like protease cleaves transcription factor YY1 in differentiated cells//Biochim. Biophys. Acta. 2001. V.l536. P.31-42.

96. Ponomarenko M.P., Ponomarenko J.V., Frolov A.S., Podkolodnaya O.A., Vorobiev D.G., Kolchanov N.A., Overton G.C. Oligonucleotide frequency matrices addressed to recognizing functional DNA sites // Bioinformatics. 1999. V.l5. No. 7/8. P.631-643.

97. Popova N.K, Kulikov A.V. On the role of brain serotonin in expression of genetic predisposition to catalepsy in animal models // Am. J. Med. Genet. 1995. V.l9. P.214-220.

98. Propping P., Nathen M.M., Fimmers R., Baur M.P. Linkage versus association studies in complex diseases // Psyhiatr. Genetics. 1993. V.3. P.136-138.

99. Raich N., Clegg C.H., Grofti J., Romeo P.-H., Stamatoyannopoulos G. GATA1 and YY1 are developmental repressors of the human epsilon-globin gene //EMBO J. 1995. V.14. P.801-809.

100. Roses A.D. Pharmacogenetics and the practice of medicine // Nature. 2000. V.405. P.857-865.

101. Ross E.D., Hardwidge P.R., Maher L.J. HMG proteins and DNA flexibility in transcription activation // Mol. Cel. Biol. 2001. V.21 P.6598-6605.

102. Rowentree R., Harris A. DNA polymorphisms in potential regulatory elements of the CFTR gene alter transcription factor binding // Hum. Genet. 2002. V. 111. P.66-74.

103. Ryan W.A., Franza B.R., Gilman M.L. Two distinct cellular phosphoproteins bind to the c-fos serum response element // EMBO J. 1989. V.8. P. 1785-1792.

104. Schmid W., Scherer G., Dabtsch H., Patric M., Schutz G. Isolation and characterization of the rat tryptophan oxigenase gene // EMBO J. 1982. V.l. P. 1287-1293.

105. Shen L.X., Basilion J.P., Stanton V.P. Single-nucleotide polymorphisms can cause different structural folds of mRNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V.96. P.7871-7876.

106. Shi Y., Lee J.-S., Galvin K.M. Everything you have ever wanted to know about Yin Yang 1. // Biochem. Biophys. Acta. 1997. V.l332. P.49-66.

107. Shrivastava A., Calame K. An analysys of genes regulated by the multifunctional transcriptional regulator Yin Yang-1 // Nucl. Acid. Res. 1994. V.22. P.5151-5155.

108. Staessen J.A., Kuznetsova Т., Wang J.G., Emelianov D., Vlietinck R., Fagard R. M235T angiotensinogen gene polymorphism and cardiovascular renal risk // J. Hypertens. 1999. V.l7. P.9-17.

109. Struhl K. Histone acetilation and transcriptional regulatory mechanisms. Gene Development. 1998. V.l2. P.599-606.

110. Suzuki N., Peter W., Ciesiolka Т., Gruss P., Schoeler H. R. Mouse Oct-1 contains a composite homeodomain of human Oct-1 and Oct-2. // Nucleic Acids Res. 1993. V.21. P.245-252.

111. Suzuki E., Evans Т., Lowry J., Truong L., Bell D.W., Testa J.R., Walsh K. The human GATA-6 gene: structure, chromosomal location, and regulation of expression by tissue-specific and mitogen-responsive signals // Genomics. 1996. V.38. P.283-290.

112. Teng H., Jorissen M., van Poppel H., Legius E., Cassiman J.J., Cuppens H. Increased proportion of exon 9 alternatively spliced CFTR transcripts in vasdeferens compared with nasal epithelial cells // Hum. Molec. Genet. 1997. V.6. P.85-90.

113. Thomas W., Fullan A., Loeb D.B., McClelland E.E., Bacon B.R., Wolff R.K. //Hum. Genet. 1998. V.102. P.517-525.

114. Thomas J.O. HMG1 and 2: architectural DNA-binding proteins // Biochemical Society Transact. 2001. V.29. P.395-401.

115. Thomas M.J., Seto E. Unlocking the mechanisms of transcription factor YY1: are chromatin modifying enzymes the key? // Gene. 1999. V.236. P.197-208.

116. Thome J., Kornhuber J., Baumer A., Rosier M., Beckmann H., Riederer P. Association between a null mutation in the human chiliary neurotropic factor (CNTF) gene and increased incidence of psychiatric diseases // Neurosci. Lett. 1996. V.203. P.109-110.

117. Treisman R. The serum response element // TIBS. 1992. V. 17. P.423-426.

118. Vedeckis W.V. Limited proteolysis of the mouse liver glucocorticoid receptor // Biochemistry. 1983. V.22. P.1983-1989.

119. Verdel A., Khochbin S. Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases. Coordinate expression of differentiation-dependent chromatin modifiers // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.2440-2445.

120. Volberg R.A. The prevalence and demographics of pathological gamblers: implications for public health // Am. J. Public Health. 1994. V.84 P.237-241.

121. Wada H., Hasegawa K., Morimoto Т., Kakita Т., Yanazume Т., Sasayama S. A p300 protein as a coactivator of GATA-6 in the transcription of the smooth muscle-myosin heavy chain gene // J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.25330-25335.

122. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A. A conserved helical element is essential for internal initiation of translation of hepatitis С virus RNA // J. Virology. 1994. V.68. P.7301-7307.

123. Weill L, Shestakova E, Bonnefoy E. Transcription factor YY1 binds to the murine beta interferon promoter and regulates its transcriptional capacity with a dual activator/repressor role // J. Virol. 2003. V.77. P.2903-2914.

124. Wingender E., Chen X., Hehl R., Karas H., Liebich I., Matys V., Meinhardt Т., Pruss M., Reuter I., Schacherer F. TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. P.316-319.

125. Yahata Т., Shao W., Endoh H., Hur J., Coser K.R., Sun H., Ueda Y., Kato S., Isselbacher K.J., Brown M., Shioda T. Selective coactivation of estrogendependent transcription by CITED 1 CBP/p300-binding protein // Genes Dev. 2001. V.15. P.2598-2612.

126. Yamamoto M., Ко L.J., Leonard M.V., Beug H., Orkin S.H., Engel J. Activity and tissue-specific expression of the transcription factor NF-E1 multigene family // Genes Dev. 1990. V.4. P. 1650-1662.

127. Yang W.M., Inouye C., Zeng Y., Bearss D., Seto E. Transcriptional repression by YY1 is mediated by interaction with a mammalian homolog of the yeast global regulator RPD3 // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. V.93. P. 12845-12850.

128. Yang W.M., Yao Y.L., Sun J.M., Davie J.R., Seto E. Isolation and characterization of cDNAs corresponding to an additional member of the human histone diacetylase gene family // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.28001-28007.

129. Zhou M., Ouyang W. The function role of GATA-3 in Thl and Th2 differentiation//Immunol. Res. 2003. V.28. P.25-37.

130. Zhu W., Lossie A.C., Camper S.A., Gumucio D.L. Chromosomal localization of the transcription factor YY1 in the mouse and human // Mamm. Genome. 1994. V.5. P.234-236.