Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОЛЕКУЛЯРНО ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ИНТРОНЕ 6 ГЕНА ТРИПТОФАНДИОКСИГЕНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "МОЛЕКУЛЯРНО ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ИНТРОНЕ 6 ГЕНА ТРИПТОФАНДИОКСИГЕНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ"



На правах рукописи УДК: 575.224.22.599.9:616.89

ВАСИЛЬЕВ ГЕННАДИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ИНТРОНЕ 6 ГЕНА ТРИПТОФАНДИОКСИГЕНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 2004

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Т. И. Меркулова

Официальные оппоненты; доктор биологических наук, профессор

И.К. Захаров

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор медицинских наук М.И. Воевода

Институт т^ралии СО РАМН, г Н шч"-чфск

Ведущее учреждение:

Институт химической биологии и фунх лг ' меди г шы СО ґ

г. Новосибирск

Защита диссертации состоится « 24 » мар т 2004 г, на утр"1 ании

диссертационного совета по защите диссертаций на соискг

степени доктора наук (Д-003.11.01) в Институте цитолог 'О

РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. '

Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (3832)33"

dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в бибяж чт .. -,

цитологии н генетики СО РАН.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного со нега, доктор биологических наук

Груздев АД.

Актуальность исследования. Самым распространенным вариантом полиморфизма последовательностей ДНК являются единичные нукпеотидные замены (SNP), особый интерес к изучению которых связан с тем, что они часто оказываются ассоциированы с различными клинически важными признаками. При этом до сих пор основные усилия сосредоточены на выявлении и изучении SNP в кодирующих районах генов и сайтах сплайсинга [Krawszak et а/., 2000], поскольку такие SNP приводят к изменению структуры белкового продукта гена, что легко детектируется и интерпретируется. Однако основная масса SNF у человека обнаруживается в других районах генов, в том числе регуляторных, но этим SNP уделяется гораздо меньше внимания. 6 последнее время начали развиваться работы по выявлению SNP в промоторных районах и изучению их влияния на регуляцию экспрессии генов, но исследования, направленные на выявление и функциональную интерпретацию потенциальных регуляторных SNP в интронах, до сих пор единичны. В то же время постоянно возрастающий объем работ по поиску SNP в протяжённых районах генов человека, приводящий к накоплению данных об имеющих клинические проявления и не затрагивающих сайты сплайсинга SNP в интронах, требует функционального анализа подобных SNP и установления конкретных механизмов их проявления.

Фермент триптофаноксигеназа (TD02) является одним из ключевых звеньев в цепи биосинтеза нейромедиатора серотонина. Поэтому ген TD02 часто рассматривается как один из генов-кандидатов на связь с различными нарушениями поведения. 5 частности, установлена статистически достоверная ассоциация между двумя SNP в гене TD02 человека в позициях 663 п.н. и 666 п.н, от начала интрона 6 и такими расстройствами поведения, как синдром Туретта, предрасположенность к наркотической, алкогольной зависимости и патологической склонностью к азартным играм [Comings et а/., 1996]. Данные SNP находятся в некодирующем районе гена TD02, являющемся потенциальным регуляторным районом. Последнее обстоятельство дало нам возможность предположить, что мы имеем дело с так называемыми регуляторными SNP, расположенными в регуляторной зоне гена и влияющими на его экспрессию за счёт изменения в связывании с данным районом регуляторных ядерных белков.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов влияния SNP в интроне 6 гена TD02 человека на развитие ряда психических нарушений и изучение адекватности общепринятой экспериментальной модели (мыши линии C57BL), связывающей предрасположенность к алкоголизму с повышенным уровнем экспрессии гена TD02.

В ходе выполнения данной работы были решены следующие задачи:

1) изучение возможных молекулярных механизмов влияния ассоциированных с рядом психических расстройств в интроне 6 гена Т002 человека (Э-^А в позиции 663 п.н. и в-Л" в позиции 666 п.н. относительно начала интрона) на экспрессию этого гена;

2) проверка имеющихся литературных данных о том, что предрасположенность линии мышей С57В1. к развитию алкоголизма связана с повышенным по сравнению с другими линиями мышей уровнем активности Ю02 в печени;

3) поиск и сравнительное изучение ЭЫР в районе интрона 6 у нескольких линий мышей, определение связывающихся с районами ЭЫР ядерных белков и поиск корреляций между ЭЫР, изменениями спектра связывающихся белков и признаком предрасположенности/устойчивости к развитию алкоголизма.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что всем трём обнаруженным в популяциях человека аллелям гена Т002 присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Основной связывающийся с наиболее распространённым аллелем У\ГГ белок идентифицирован как транскрипционный фактор УУ1. Для двух других аллелей обнаружено разрушение сайта связывания фактора УУ1 и появление сайтов связывания одного или двух неидентифицированных нами белков (С-»А в позиции 663 п.н.), либо сайта связывания транскрипционного фактора вАТАб (в^-Т в позиции 666 п.н,), что может оказывать существенное влияние на экспрессию гена 7*002.

В результате определения нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена Т002 для шести линий мышей обнаружено 5 ЭЫР и одна микроделеция. Обнаружено, что 3 ЭЫР приводят к изменению спектра ядерных белков, связывающихся с этими районами.

Изучена активность Т002 в печени шести линий мышей. Не установлено связи между уровнем активности ТЭ02 в печени мышей, распределением вЫР в интроне б и изменениями спектра связывающихся с этими районами ядерных белков с признаком предрасположенности/устойчивости к развитию алкоголизма. Таким образом, у мышей линии С57ВЦ в отличие от человека, не обнаружен вклад ТО02 в формирование алкогольной зависимости.

Полученные нами данные вносят вклад в понимание механизма влияния ЭЫР в интронах на экспрессию гена и реализацию фенотипических признаков, а так же уточняют рамки применимости модельных линий животных при изучении генов, оказывающих влияние на поведение человека.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИциГ, на ХШ всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Пущино, 2000), и на международных конференциях: «Применение информационных технологий к проблемам биоразнообразия и динамики экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2001); «Genetic and Developmental Psycho neuroendocrtnology» (Novosibirsk. 1999); «150-anniversary of Ivan Pavlov International Symposium" (St. Petersburg, 1999).

Публикации no теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (184 наименования). Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, и содержит 2 таблицы и 16 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали самцов крыс линии Sprague-Dowley весом 150-180г. и 6-9 - месячные самцов мышей линий C57BL/6J, СВА/Са, DBA/2J, BALB/cJ и CC57BR/Mv разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН.

ДНК-связыеающую активность факторов транскрипции в экстрактах ядер оценивали методом задержки ДНК-пробы в геле. Экстракты ядер получали согласно (Gorskj et al., 1086) в модификации (Shapiro et at., 1988). Содержание факторов транскрипции в них оценивали методом вестерн-блот гибридизации. Для визуализации результатов использовали ECL-систему фирмы "Amersham". Секвенирование ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI-Prism 310, Определение активности ТД02 проводили по модифицированному методу (Seglen, Jervell, 1969).

Статистическую обработку результатов проводили используя Т-критерий Стьюдента

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ранее Д. Комингсом [Comings et at., 1996] был проведён поиск полиморфных сайтов в гене TD02 человека, ассоциированных с различными психическими расстройствами. Ни в кодирующей части гена, ни в 5'- и З'-фланкирующих областях не было обнаружено подобных сайтов. Однако, в районе нитронов 5 и 6 гена TD02 человека были обнаружены 4 полиморфных сайта, два из которых, а именно, близкорасположенные мононуклеотидные замены в интроне 6 (G->A в позиции 663 п.н. и G->T в позиции 666 п.н. относительно начала

интрона) оказались связанными с психическими расстройствами. Было обнаружено, что аллель А в позиции 663 п.н. позитивно ассоциирован с такими нарушениями психики, как синдром Туретта и тяжёлая депрессия, ведущая к суициду. Аллель Т в позиции 666 п.н. ассоциирован позитивно с синдромом гиперактивности у детей, патологической склонностью к азартным играм и наркоманией. Кроме того, этот же аллель оказался негативно ассоциирован с алкоголизмом [Comings etat., 1996}.

Изучение связывания ядерных белков с различными вариантами района 651 - 680 п.н. интрона в гена TDQ2 человека.

Для изучения связывания ядерных белков с различными вариантами изучаемого района были использованы олигонуклеотиды, соответствующие трём алпельным состояниям участка от 651 до 680 п.н. относительно начала интрона 6 гена TD02 человека (олигонуклеотиды WT, М1 и М2, Рис. 1а). Связывание изучали методом задержки ДНК-пробы в геле. Белки экстракта ядер печени образовывали 3 комплекса с олигонуклеотидом, соответствующим наиболее распространенному аллелю (WT) (Рис. 1Ь).

A)

wt: ь'-саgtтGCCAAATAATGGCAGATAAGAATAGGGAG-3' ml: S'-cagtTGCCAAATAATGÄCAGATAAGAATAGGGAG-3• M2: 51 -СagtTGCCAAATAATGGCATATAAGAATAGGGAG-3'

B) WT MI M2 WT MI M3 1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 1. А) Последовательности олигонуклеотидов: WT наиболее распространенный в популяции человека вариант. М1 и М2 - аллели, ассоциированные с психическими расстройствами. Точковые мутации подчеркнуты.

В) Связывание белков экстракта ядер клеток печени (А -1 ми" белка. Б - 4мкг белка) с данными олигонуклеотидами. 2, 6 - WT; 3, 7 - М1; 4, 8 - М2; 1, 5-свободный зонд (опигонуклеотид WT)

Картина связывания для обоих обнаруженных в популяции человека вариантов М1 и М2 разительно отличала«) как от WT, так и друг от друга. Полоса, соответствующая комплексу 3, в случае транзиции G->A (663) (олигонукпеотид М1) исчезала и появлялась

группа менее подвижных полос ("комплекс 4"). В случае замены G-»T (666} (олигонуклеотид М2) интенсивность указанной полосы сильно снижалась, и также появлялась новая медленно мигрирующая полоса (комплекс 5). Следовательно, всем 3 аллелям присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Важно отметить, что в случае обеих мутаций, ассоциированных с психическими расстройствами, происходит нарушение в связывании одного и того же белка (комплекс 3), являющегося основным фактором, взаимодействующим с "нормальным" аллелем.

Идентификация белков, связывающихся с изучаемым районом.

Для определения белков, взаимодействующих с изучаемыми олигонуклеотидами, в их последовательностях был проведен поиск участков гомологии с известными сайтами связывания различных транскрипционных факторов с помощью пакета программ TESS, однако такой поиск дал черезмерно широкий набор белков-кандидатов. Тем не менее, мы решили использовать олигонуклеотиды, соответствующие части предсказанных регуляторных элементов, в дальнейшем экспериментальном анализе. Эти олигонуклеотиды были использованы в качестве конкурентов в экспериментах по задержке ДНК пробы в геле. Из всех олигонукпеотидов с WT конкурировал только SRE (Рис. 2) из промотора гена c-fos мыши (-318 -289). При добавлении 40-кратного избытка SRE исчезала основная полоса задержки (комплекс 3). Ни один из использованных в качестве конкурентов о л иго н у кл еотидов не влиял на поведение двух других более подвижных полос (комплексы 1 и 2), которые являются общими для всех трёх вариантов.

+WT +SRE

Рис. 2. Конкуренция 1 2 3 4 ^ 6 7 8 9 10 11 12

различных олигонуклеотидое с WT.

1 - свободный зонд; 2 - ; ■

связывание WT с экстрактом ядер печени крысы; 3-12 - то же s присутствии 40-кратного избытка немеченых

олигонуклеотидое: 3 - WT; 4 -Ml; 5 - М2; б - АР1;7 - HNF1;S * GATA; 9 - SRE; 10 - ANF; 11-Spl; 12 - HNF3.

Так как известно, что с SRE гена c-fos взаимодействуют факторы транскрипции SRF, YY1 и NF-IL6, можно было предполагать

связывание любого из этих белков с исследуемым районом. Для того, чтобы уменьшить число предполагаемых белков-кандидатов на связывание с исследуемым районом, М.П. Пономаренко (ИЦиГ СО РАН, лаб. теоретической генетики) был проведён подробный теоретический анализ с использованием метода усреднения частот нуклеотадов и дмнуклеотидов во всех позициях данного района [Ропотагепко е( а/., 1999]. Оказалось, что обе мутации локализованы в пределах потенциального сайта УУ1. Присутствие сайтов связывания транскрипционных факторов БР^ и ЫР-Иб в исследуемом районе в результате данного анализа не было подтверждено.

Для окончательной идентификации белка, образующего комплекс 3, были выполнены эксперименты с использованием антител против УУ1. Они полностью подтвердили результаты теоретического анализа. В результате добавления антител к ядерному экстракту происходило исчезновение комплекса 3 (Рис. 3), и, в случае олигонуклеотида УУТ, появлялась менее подвижная полоса (5), которая соответствует тройному комплексу олигонуклеотид - транскрипционный фактор УУ1 -антитело. Таким образом, в данном случае наблюдался классический «супершифт». При использовании олигонуклеотида М2 комплекс 3 также исчезал, однако в этом случае «супершифт» не наблюдался, так как соответствующая ему полоса совпадает по подвижности с одной из полос исходной картины.

Ш М2

Рис. 3. Связывание белков 12 3 4 5 6 экстракта ядер клеток печени с олигонуклеотидами \ДГГ (дор. 1-3) и М2 (дор. 5-7) в присутствии антител против УУ1.1,5-свободный зонд; 2, 6 -связывание с экстрактом ядер М

печени крысы; 3, 7 - связывание с ядерным экстрактом, обработанным антителами против транскрипционного фактора (Э

высокомолекулярный комплекс, содержащий антитела к УУ1 (еирегэЩ).

Для доказательства того, что наблюдаемые в экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле эффекты обусловлены полноразмерным транскрипционным фактором УУ1, был выполнен Вестерн-блот-анапиз с последующей Е С Ь детекцией. Для нанесения на ЭОв-ПААГ брали 6 мкл. экстракта ядер печени крысы, содержащие 2.5 мкг. суммарного

белка. Использовались разведения вторичных антител 1:8000 и 1:10000, Из-за особенностей структуры белка YY1, чей молекулярный вес соответствует 44 кОа, на SDS-гелях мигрирует как белок 65-68 KDa [Shi et а/., 1997]. На Рис. 4. показано присутствие полноразмерного YY1 в качестве доминирующей компоненты сигнала. Таким образом, наблюдаемый нами в экспериментах по гель-ретардации комплекс 3 обусловлен взаимодействием исследуемых олигонуклеотидов с полноразмерным транскрипционным фактором YY1.

Рис. 4. Результат Вестерн- J 2

блот-анализа экстракта ядер печени крысы на транскрипционный фактор YY1, 1, 2, 3 - экстракт ядер, 2.5 мкг. суммарного белка, 4 - маркёр .,„. ....

молекулярных весов Sigma protein test mixture №4. 1, 2 - результат yyi— «■»>■ ECL-детекции, разведение

вторичных антител 1:10000. 3, 4 -окрашивание нитроцеллюлозной мембраны красителем Ferry-dye. Полоса, соответствующая YY1 отмечена стрелкой.

Минорные комплексы (1 и 2, Рис. 1), присутствующие в случае всех трёх олигонуклеотидов Wt, М1 и М2, в отличие от менее подвижных полос задержки, не являются тканеспецифичными и, вероятно, вызваны связыванием с белками из группы HMG-белков. В то же время комплексы 4 и 5 (Рис. 1 ), характерные для олигонуклеотидов М1 и М2 соответственно, являются тканеспецифичными и обнаруживаются в экспериментах по связыванию только если в качестве источника транскрипционных факторов берётся экстракт ядер клеток печени. В случае олигонуклеотида Ш (замена G-»A) не удалось получить дополнительных данных, позволяющих делать предположения о белках, образующих специфический для данного олигонуклеотида комплекс. Ни один из конкурентных олигонуклеотидов (кроме самого М1) не устранял полностью образование комплекса 4. При связывании белков экстракта ядер с олигонуклеотидом М2 (замена G->T) наиболее выраженным является медленно мигрирующий комплекс 5. За связывание с белками, образующими этот комплекс, конкурировали олигонуклеотиды, соответствующие сайтам связывания транскрипционных факторов HNF3 и GATA. Проведённый М,

3 4

—92kENi Î7kD»

•Ju

■î9kDa

Пономарекко с помощью системы rSNP_Guide [Ponomarenko et al., 2002] теоретический анализ предсказал наличие в М2 сайта связывания транскрипционных факторов семейства GATA и не подтвердил присутствие сайта HNF3. Для окончательной идентификации связывающегося с М2 белка были проведены эксперименты с использованием антител против транскрипционного фактора GATA6, которые подтвердили присутствие этого белка в комплексе 5.

+ws +gata +ав

Рис. 5. Связывание белков экстракта ядер клеток печени с олигонуклео гидом М2 в присутствии антител против GATA6 и конкурентных олигонуклеотидов. 1 - свободный зонд; 2 - связывание с экстрактом ядер печени крысы; 3 - то же в присутствии 60х избытка оли гонуклеотцца АР1; 4 - то же в присутствии 80х избытка оли гону клеотида GATA; 5 -связывание с ядерным экстрактом. обработанным

антителами против транскрипционного фактора GATA6,

Для всех изученных аллелей общим является связывание с ними HMG-подобных белков, которые являются обычным и важным компонентом композиционных регуляторных элементов и участков с нарушенной нуклеосомной укладкой. В случае наиболее распространённого в популяции человека аплеля WT происходит связывание с данным районом транскрипционного фактора YY1, являющегося либо репрессором, либо активатором транскрипции в зависимости от транскрипционного контекста и взаимодействующих с нам кофакторов. В случае замены G->A в позиции 663 п.н., ассоциированной с синдромом Туретта и склонностью к тяжёлой депрессии, мы обнаружили разрушение сайта связывания фактора YY1 и появление сайта связывания одного или двух неидентифицированных белков. Замена G-»T в позиции 666 п.н. приводит к резкому ослаблению связывания YY1 и появлению сильного сайта связывания другого транскрипционного фактора -GATA6. Подобные изменения в спектре связывающихся транскрипционных факторов (замена потенциального репрессора на активатор) могут существенно сказываться на экспрессии гена TD02 и, как следствие, на содержании триптофана в плазме крови и пути синтеза нейромедиатора серотонина в мозге.

1 2 3 4 S

-—gatas

l^jj

Определение_базального_уровня_активности

триптофаноксигеназы у полярных по моделям поведения пиний мышей.

В связи с полученными на гене Т002 человека данными об ассоциации между некоторыми расстройствами поведения и изменениями в спектре связывания регуляторных белков представляло большой интерес провести поиск мутаций и сравнительное изучение того же района гена 7002 у нескольких линий мышей, контрастных по типу поведения. Линия мышей С57В1. является известной экспериментальной моделью предрасположенности к алкоголизму Мыши этой линии также характеризуются наличием других нарушений поведения. Ранее предполагалось, что повышенный уровень активности ТО02 у С57В1. связан с повышенной сгессируемостью мышей этой линии и является основным фактором, обусловливающим предрасположенность этой линии мышей к алкоголизму. В связи с этим мы определили активность фермента Т002 в печени у мышей С57В1. 8 условиях, исключающих стресс и при глюкокортикоидной индукции. В качестве известного контроля по признаку предпочтения алкоголя были взяты линии мышей СВА и ОВА/2. Оказалось, что базальная активность ТО02 в печени мышей предрасположенной к алкоголизму линии С57В1. была достоверно выше, чем у контрольных по этому признаку линий СВА и ОВА/2 (Табл.1).

Таблица 1. Активность ферментов триптофаноксигеназы (Т002) и тирозинаминотрансферазы (ТАТ) у линий мышей С57В1-, СВА и ОВА/2.

Лнная Активность ТОО! (ниолъ/мг белка/чм) Активность ТАТ (ммолъ/г белке /час)

коетроль глюкокортя- ко>дя*я янаукпня контроль глюкокортн-копяная ВНД)КПНЯ

С57ВЬ 21,9±2,3 62,5±5,3 4,50±0,37 11,70*0,79

СВА 13,6±1,2* 56,2±3,1 4,60±0,21 16,9010,90

ОВА/2 15,5±0,б** 44,3±4,5 5,00±0,38 14,30±0,51

Достоверность межлинейных различий: С57ВЬ/СВА р<0,05; С57В1Л>ВА р<0,01

Таким образом, повышенная активность ТО02 и связанное с этим снижение уровня серотонина в мозге является конститутивной особенностью линии С57В1-, а не вызывается условиями хронического стресса, как описывалось ранее. Для сравнения приведены данные по активности в тех же образцах фермента тирозинаминотрансферазы,

который также является печень-специфичным и находится под глюкокортикоидным контролемПоскольку ранее было показано отсутствие межлинейных различий в аминокислотной последовательности триптофаноксигеназы у трёх данных линий, то наиболее вероятным объяснением наблюдаемых линейных характеристик являлся повышенный базальный уровень экспрессии гена 7002 у мышей линии С57В1_. Это заключение сделало весьма перспективным поиск и анализ ЭЫР в регуляторных районах гена 7002 указанных линий мышей.

Для поиска вЫР нами было проведено определение нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена 7002 мышей линий С57В!_, СВА и йВА/2. Была выделена геномная ДНК четырёх животных каждой линии мышей, пригодная для амплификации длинных фрагментов ДНК. Поскольку экзон-штронная структура генов у близких видов обладает высокой консервативностью, мы предположили, что экзоны Р и О гена 7*002 мыши имеют последовательность, в основном гомологичную экзонам Р и в гена 7002 крысы. Далее по известной последовательности |ДНК 7002 мыши были определены вероятные границы экзонов Р и в гена 7002. Для амплификации последовательностей интрона 6 гена 7002 мыши в средней части экзонов Р и в были выбраны олигонуклеотидные праймеры. Оптимальные условия ПЦР были подобраны путём варьирования температуры отжига праймеров, концентрации МдСЬ от 1,5 мМ до 4 мМ и концентрации глицерина от 5 до 10%. После ПЦР проводилась очистка наработанной ДНК интрона б от неспецифических фрагментов ДНК электрофорезом в 1% агарозном геле. Длина полученного фрагмента составила приблизительно 1 т.п.н. Амплифицированные с помощью ПЦР фрагменты были выделены после солюбилизации агарозного геля 8М ЫаСЮ4 методом сорбции на стекловолокне в количествах, достаточных для последующего секвенирования на автоматическом секвенаторе. Для каждого образца было наработано 2-4 мкг очищенного фрагмента. Полученные фрагменты были проанализированы с использованием автоматического секвенатора АВ!-Рп2гп 310. Так как продукт амплификации имел длину около 1 т.п.н., то для надёжной идентификации выявленных различий по результатам первоначального секвенирования с исходными праймерами были выбраны четыре дополнительных праймера для секвенирования так, что каждый участок был прочитан как минимум дважды в разных направлениях. Длина интрона 6 составила 993 п.н. для линий СВА, йВА/2 и 992 п.н. для линии С57В1-. Ни у одной из исследованных линий не было обнаружено внутрилинейного полиморфизма последовательностей ДНК интрона 6. Наибольшие различия были обнаружены у мышей СВА и С57В1_, Они отличались по шести позициям: одной микроделеции (отсутствие А в позиции 417 п.н.

от начала нитрона 6) и пяти мононуклеотидным заменам: С/Т в позиции 15 п.н. от начала интрона 6; Т/А в позиции 364; G Л" в позиции 629; A/G в позиции 912; G/A в позиции 974. Линия СВА отличалась от DBA/2 по двум позициям: GfT в позиции 629 и G/A в позиции 974, и эти замены были идентичны у линий C57BL и DBA/2, Таким образом, наблюдался определённый параллелизм между наличием полиморфных сайтов, ассоциированных с алкоголизмом и психическими нарушениями в гене TD02 человека и присутствием подобных полиморфных сайтов в последовательностях интрона 6 гена TD02 у линий мышей, различающихся по склонности к алкоголизму и другим нарушениям поведения. Кроме того, параллелизм наблюдался и в том, что максимальные отличия в последовательности ДНК интрона 6 гена ТОО2 мы видим между линиями C57BL и СВА, что совпадает с их отличием по базальному уровню активности фермента триптофаноксигеназы. В связи с этим мы сделали предположение о том, что данные мутации затрагивают имеющиеся в интроне 6 гена TD02 мыши сайты связывания регуляторных белков, ответственных за изменения в экспрессии этого гена и развитие нарушений поведения, аналогично тому, что было ранее показано нами в отношении мутаций внутри интрона 6 гена TD02 человека.

Идентификация белков, связывающихся с SNP в интроне 6 гена TDQ2 мыши.

В качестве первого этапа был проведён теоретический анализ районов обнаруженных полиморфных сайтов. Для всех полиморфных сайтов (кроме случая делеции А) хотя бы для одного из вариантов были предсказаны сайты связывания транскрипционных факторов YY1 (слабые) или GATA, поэтому для всех этих вариантов были синтезированы соответствующие олигонуклеотиды, которые далее были использованы в экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле. Эти олигонуклеотиды были названы по первой букве названия линий и позиции полиморфизма например В364 - олигонуклеотид, соответствующий последовательности интрона 6 гена TD02 мышей линии C57BL в районе SNP в позиции 364 от начала интрона 6.

Очень слабая гомология с консенсусом сайта связывания YY1 была обнаружена для двух районов точкового полиморфизма. После теоретического анализа данных районов полиморфизма, проведённого М.П. Пономаренко (лаб. теоретической генетики, ЙЦиГ), для варианта Т/А в позиции 364 в случае линии СВА (вариант А) был предсказан очень слабый, на границе со случайной последовательностью, сайт связывания YY1. Аналогичные крайне слабые сайты были предсказаны и для обоих вариантов полиморфизма A/G в позиции 912. В экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле вариант В364 не дал никакого связывания с белками ядерного экстракта, три остальных олигонукпеотида (CD364, В912, CD912) дали сходную картину весьма

слабого связывания, при этом подвижность данных полос немного отличается от комплексов опигонуклеотидов той же длины с YY1, Эксперименты с использованием антител к транскрипционному фактору YY1 подтвердили, что эти очень слабые полосы задержки не обусловлены данным белком, и никаких полос супершифта обнаружено не было. Таким образом, районы точковых полиморфизмов Т/А (364) и A/G (912) не связывают сколько-нибудь значительно белки ядерного экстракта и, соответственно, не могут оказывать заметное влияние на экспрессию гена TD02.

В случае полиморфизмов G ft в позиции 629 и G/А в позиции 974 были теоретически предсказаны сайты связывания транскрипционного фактора GATA для вариантов полиморфизма, характерных для линии СБА, Эксперименты с олигонуклеотидами, соответствующими данным районам, полностью подтвердили эти предположения, В экспериментах по задержке ДНК-пробы в геле олигонуклеотид С629 давал интенсивную полосу задержки, сходную по подвижности с комплексом олигонуклеотид/фактор GATA6. В случае же олигонуклеотида BD629, соответствующего аллелям, характерным для линий C57BL и DBA/2, никаких чётко выраженных полос не наблюдалось . Вариант 0974 давал аналогичную интенсивную полосу задержки, в случае варианта BD974 интенсивность связывания значительно ослабевала, хотя и не исчезала совсем. Эксперименты по задержке ДНК-пробы в геле в присутствии различных конкурентных олигонуклеотидов и в присутствии антител к транскрипционному фактору GATA6 позволили идентифицировать белок, связывающийся с олигонуклеотидами С629, С974 и BD974, В присутствии антител против транскрипционного фактора GATA6 наблюдается значительное ослабление комплексов олигонукпеотид/белок. Это доказывает, что именно транскрипционный фактор GATA6 является главным компонентом комплексов связывания с перечисленными олигонуклеотидами. В случае полиморфных сайтов в позициях 629 и 974 п.н. от начала интрона 6 у линии СВА имеются хорошие сайты связывания транскрипционного фактора GATA6. У линии C57BL этот сайт либо полностью разрушен (G/T в лозиции 629), либо существенно ослаблен (G/A в позиции 974). Замена С-*Т в позиции 15 п.н. у линии C57BL. создаёт сильный сайт связывания какого-то не (идентифицированного нами белка.

Таким образом, мы видим, что в случае трёх из шести полиморфизмов в интроне 6 гена TD02, отличающих линии СВА и C57BL, наблюдается резкое изменение спектра связывающихся с данными районами ядерных белков. Однако у линии мышей DBA/2 SNP в позициях 629 и 974 п.н. (и, соответственно, спектр связывающихся с данным районом белков аналогичны таковым у

линии C57BL, при этом предрасположенности к алкоголизму у линии DBA не наблюдается.

Это вызвало сомнения в связи уровня активности ТД02 в печени и предрасположенности к алкоголизму на модели мышей C57BL и, чтобы их разрешить, было выполнено исследование предрасположенности к употреблению алкоголя, активности фермента TD02 и нуклеотидной последовательности района интрона 6 гена TD02 у пинии мышей CC57BR, полученной от скрещивания мышей BALB и C57BL, в сравнении с родительскими линиями.

Мыши линии CC57BR, как оказалось, обладают повышенной склонностью к потреблению алкоголя в условиях свободного выбора в отличие от мышей BALB (Табл. 2), то есть унаследовали этот признак от родительской линии C57BL. При этом базальная активность TD02 в печени у мышей BALB, избегающих употребления алкоголя, так же высока, как и у предпочитающих алкоголь мышей C57BL и CC57BR, а индуцированная активность TD02 достоверно выше, чем у CC57BR.

Таблица 2. Уровень потребления алкоголя и активность TD02 в печени мышей линий C57BL, CC578R и BALB,

Показатель C57BL CC57BR BALB

Потребление раствора этанола, % от общего количества жидкости (п = 10) 49 ±5,7»* 42 ± 3,2* 28 ± 3,2

Активность Т002, нмоль/мг белка/час без индукция (п = 4) глтококортнкоидная индукция (п - 7) 23,7±2,4 44,4 ± 3,2 25,0 ±1,9 41,8 ± 1,5* 24,1 ± 1,6 47,4 ± 1,5

Достоверность межлинейных рамичнй: *р <0,05 по сравнению с BALB; •*p<0fOl по сравнению с BALB; п- число мышей в групп

При исследовании нуклеотидных последовательностей интрона 6 гена TD02 мышей линий BALB и CC57BR было обнаружено, что эти последовательности (и, соответственно, спектр связывающихся с районами SNP ядерных белков) оказались полностью идентичными у мышей BALS, CC57BR и DBA/2, хотя линия CC57BR предрасположена к развитию алкоголизма, а линии BALB и DBA/2 - нет.

Таким образом, можно сделать вывод, что обнаруженные нами SNP в интроне 6 у исследованных пяти линий мышей не имеют видимой связи с предрасположенностью/устойчивостью к развитию алкоголизма и уровнем базальной активности фермента TD02 в печени. Более того, высокий уровень активности TD02 в печени у мышей C57BL, возможно, не является основным фактором, определяющим предрасположенность этой линии к развитию алкоголизма, хотя ранее

[Badawy ef al., 1969] именно эта причина (повышенный уровень активности TD02) называлась основной,

Тем не менее, полученные нами на нескольких пиниях мышей результаты не ставят под сомнение данные о том, что ген TD02 является одним из важных кандидатных генов в генетике поведения человека в целом и развитии предрасположенности к алкоголизму в частности, и свидетельствуют о том, что у линии мышей C57BL, ранее считавшейся весьма удачной моделью предрасположенности к алкоголизму, связанной с изменением уровня экспрессии TD02, эта предрасположенность реализуется несколько иными путями.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что всем трём обнаруженным в популяциях человека аллелям гена TD02 (основной аллель WT - G, 663 п.н. относительно начала интрона 6, G 666 п.н.; варианты M1 (G-»A в позиции 663 п.н.) и М2 (G-»T в позиции 666 п.н.) присущи индивидуальные наборы белковых факторов, взаимодействующих с исследуемым районом. Показано, что в случае обеих мутаций, которые ассоциированы с психическими расстройствами, происходит нарушение в связывании одного и того же белка, являющегося основным фактором, взаимодействующим с "нормальным" аллелем.

2. Установлено, что основной белок, связывающийся с наиболее распространённым аллелем WT, представляет собой транскрипционный фактор YY1.

3. Обнаружено, что в случае мононуклеотидной замены G-»A в позиции 663 п,н., ассоциированной с синдромом Туретта и склонностью к тяжёлой депрессии, происходит разрушение сайта связывания фактора YY1 и появление сайтов связывания одного или двух нендектифицированных белков. Замена G-*T в позиции 666 п.н., негативно ассоциированная с алкоголизмом, приводит к резкому ослаблению связывания YY1 и появлению сильного сайта связывания другого транскрипционного фактора - GATA6, что может оказывать существенное влияние на экспрессию гена TD02.

4. Определены нуклеотидные последовательности интрона 6 гена TD02 для линий мышей DBA, СБА, C57BL, BALB и CC57BR; обнаружено пять мононуклеотидных замен (SNP) и одна микроделеция. Из них три SNP (в позициях 15, 629 и 974 п.н. от начала интрона 6) приводят к изменению спектра ядерных белков, связывающихся с этими районами.

5. Оценена базальная активность фермента TD02 в печени мышей предрасположенных к алкоголизму линий C57BL и CC57BR, которая была выше, чем у контрольных по этому признаку линий ОВД и DBA, но не выше, чем у линии BALB, так же устойчивой к развитию алкоголизма. Не выявлено связи между тремя характеристиками: распределением SNP в интроне 6, изменениями спектра связывающихся с этими районами ядерных белков у исследованных пяти линий мышей и признаком предрасположенности/устойчивости к возникновению алкоголизма. Таким образом, не обнаружен вклад TD02 в формирование алкогольной зависимости у линии мышей 057BI, что ограничивает рамки использования данной модели для изучения механизмов формирования алкогольной зависимости у человека.

Основные результаты диссертации содержатся в следующих публикациях:

1. Каледин В.И,, Климова Н.В., Васильев Г.В., Иванова Е.А., Васильева Е.Д., Ильницкая С.И. Изучение предрасположенности к алкоголизму, активности триптофаноксигеназы и структуры интрона 6 соответствующего гена у мышей линий C57BU6J, CC57BR/mv и BALB/cJ // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2003. Т.136. С.435-437.

2. Ponomarenko J.V., Orlova G.V., Merkulova ТЛ., Gorshkova E.V., Fokin O.N., Vastliev Q.V., Frolov A.S., Ponomarenko MP. rSNP_Gutde: an integrated database-toots system for studying SNPs and site-directed mutations in transcription factor binding sites // Human Mut. 2002. V.20. P.239-248.

3. Ponomarenko J.V., Merkulova T.I., Vasillev G.V., Levas ho va Z.B., Orlova G.V., Lavrushev S.V., Fokin O.N., Ponomarenko, M.P., Frolov A.S., Sarai A. rSNP_Guide, a database system for analysis of transcription factor binding to target sequences: application to SNPs and site-directed mutations H Nucí. Acids Res. 2001. V.29. P.312-316.

4. Vasilfev G.V., Kiimova N.V., Vasilieva E.D. Single nucleotide polymorphism in intron 6 of the mouse tryptophan 2,3-dioxygenase related to behavioral disorders t! Proceedings of the first workshop on information technologies application to problems of biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia. 2001. Novosibirsk. Russia. P.222.

5. Васильева Е.Д., Яковлева T.B., Васильев Г.В. Повышенный базальный уровень активности триптофаноксигеназы у предпочитающих алкоголь мышей линии C57BL I! Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. Т.129, С.408-410.

6. Меркулова Т.И., Васильев Г.В., Меркулов В.М., Кобзев В.Ф., Горшкова Е,В. Точковые мутации в интроне б гена триптофаноксигеназы человека, ассоциированные с рядом психических расстройств, разрушают сайт связывания транскрипционного фактора YY1 // Тезисы докладов и сообщений на ХШ всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» Цитология. 2000. т.42. С.270,

7. Васильев Г.В , Меркулов В.М., Кобзев В.Ф., Меркулова Т.Н., Пономаренко М.П., Подколодная OA, Пономаренко Ю.В., Колчанов Н.А. Точковые мутации в районе 663-666 л.н. интрона 6 гена триптофаноксигеназы, связанные с рядом психических расстройств, разрушают сайт связывания фактора транскрипции YY1 II Молекулярная Биология. 2000. V.34. Р.214-222.

8. Vasiliev G.V., Merkulov V.M., Kobzev V.F., Merkulova T.L Ponomarenko M.P., Kolchanov N.A. Point mutations within 663-666 bp of intron 6 of the human TD02 gene, associated with a number of psychiatric disorders, damage the YY-1 transcription factor binding site U FEBS Letters. 1999. V. 462. P.65-88.

9. Vasiliev G.V„ Merkulov V.M., Kobzev V.F., Ponomarenko M.P., Levashova Z.B., Merkulova T.I. Assotiated with psychical disorders, point mutations in intron 6 of the tryptophane о худела ze damage the binding site of regulatory protein YY1 II Abstracts of 150-anniversary of Ivan Pavlov International Symposium. St, Petersburg. 1999. P.77-78,

10. Merkulova T.I., Vasiliev G.V., Merkulov V.M., Gorshkova E.V., Kobzev V,F. Point mutations within 663-666 bp of intron б of the human TD02 gene, associated with a number of psychiatric disorders, change the spectrum of nuclear proteins bound to the region. If Genetic and Developmental Psychoneuroendocrinology. Novosibirsk, 1999. P.66.

11. Васильев Г.В., Меркулов B.M., Кобзев 8.Ф. Энхансеролодобная зона в 6-м интроне гена триптофаноксигеназы крысы II Труды Д; Съезда Биохимического общества РАН. 1997 Пущино, С.139.

12. Merkulov V.M., Merkulova T.I., Kobylyanskaya O.V., Vasiliev G.V. Regulatory elements located within rat tryptophan oxygenase gene II Франко-российский симпозиум 'Regulation of Gene Expression" 1995. Новосибирск C.25.

Подписано к печати 9/112004 г.

Формат бумаги 60x90. Печл. 1. Уч. изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 21.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акЛаврентьева, 10.

f/íf