Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение и характеристика нового регуляторного элемента гена С-MYC человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение и характеристика нового регуляторного элемента гена С-MYC человека"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

АЛЕКСАНДРОВА Надежда Марковна

ОБНАРУЖЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО РЕГУЛЙТОРНОГО ЭЛЕМЕНТА ГЕНА с-тс ЧЕЛОВЕКА.

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

На правах рукописи

Москва 1990 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онкогене: Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Академ наук СССР, зав. лабораторией проф. Л.Л.Киселев.

Научныя руководитель - доктор Официальные оппоненты - доктор

доктор

биологических наук А.В.Иткес биологических наук Д.А.Крамеров химических наук С.Н.Кочетков

Ведущая организация - НИИ канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР

Зашита состоится " " 1991 г. в /О часов

на заседании ¿легализированного совета Д 002.79.01 при Инстит] молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, Москва,' ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан " 2/Л, ■■ \ggsf Г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР

Ученый секретарь Специализированного совета канд. хим. наук

Характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Контроль клеточной пролиферации представляет собой сложную <стему, в которую включено множество взаимодействующих мезду збой факторов. Известно, что в этом процессе могут участвововать «терфероны, индуцирующие экспрессию интерферон-зависимых генов, другой стороны, нарушение контроля пролиферации является лючевой стадией онкогенеза. В этом процессе участвуют ядерные НК-связывающие онкобелки, продукты онкогенов myc, fos, Jun и р. В связи с этим поиск обших звеньев системы действия нтерферонов и онкогенов является весьма актуальной задачей, анее было показано, что интерферон-зависимые гены, такие ак гены 6-16, ISG-54, 2'-5* олигоА-синтетаэы и др. в своей '-концевой области содержат нуклеотидную последовательность, так азываемую IRS (Interferon Response Sequence >, которая участвует интерферон-зависимой активации транскрипции. Мы обнаружили аку» же последовательность в гене с-тус человека. Выяснилось, то в гене с-тус она выполняет роль негативного регулятора ранскрипции. В то время как в интерферон-зависимых генах RS-последовательность является позитивным регулятором. Такое >азнонаправленное действие IRS-участка в двух разных генах хорош :оррелирует с разнонаправленной экспрессией генов с-тус и 6-16 в ipouecce пролиферации. Мы показали, что существуют ядерные ¡елковые факторы, связывающиеся с IRS-последовательностыо в гене :-шус и в гене 6-16. Таким образом связь регуляторной системы :-мус с системой интерферона и интерферон-зависимых генов может »сушествляться на уровне транскрипционных факторов, )заимодеяствуюших с IRS-подобными последовательностями. 1ель и задачи исследования.

Основная цель настоящей работы состояла в исследовании злияния последовательности IRS, находящейся в регуляторной збласти гена с-тус на его транскрипцию.

Экспериментальные задачи исследования заключались в :ледуюшем:

1. Конструирование плазмид, содержащих различные участки

регуляторной области гена и исследование транскрипции этих конструкций в системе in vitro.

2. Исследование конкурентного эффекта экзогенных IRS-подобных двуспиральных олигонуклеотидов на транскрипцию гена с-шус.

3. Изучение связывания белковых факторов из клеток HeLa с IRS подобным элементом.

4. Сравнение результатов транскрипции в системах in vitro и In vivo.

Научная новизна и практическое значение работы.

В нашей работе впервые показано, что IRS-подобная нуклеотидная последовательность, участвующая в регуляции интерферон-зависимых генов, также принимает участие в негативно* регуляции экспрессии гена с-шус человека. Обнаружено, что существуют по крайней мере два белковых фактора, связывающихся с IRS-подобными последовательностями генов с-шус и 6-16. Определенные нами значения констант связывания соответствующих двуспиралъных олигонуклеотидов с белковыми факторами показывают, что сродство шус-специфического белка к IRS-подобному олигонуклеотиду туе намного выше чем к IRS-подобному олигонуклеотиду 6-16. В то же время "специфический" фактор гена 6-16 имеет одинаковое сродство к фрагментам обоих генов. Этот факт позволяет выделить в данной системе "универсальный" и "специализированный" факторы, существование которых, по-видимом5 расширяет возможности данной регуляторной системы.

Полученные результаты вносят определенный вклад в изучение механизмов регуляции экспрессии онкогенов и, в частности, онкогена с-шус, что весьма важно для понимания природы канцерогенеза и поиска путей возвращения клетки в нормальное пролиферативное состояние. Кроме того полученные в работе данные могут иметь применение в экспериментальной медицине, например п{ изучении происхождения лимфоидных опухолей. Так, обнаружение новых стартов инициации транскрипции в 1 интроне гена с-шус мож« дать ключ к пониманию возникновения аналогичных точек инициации транскрипции в лимфомах Беркитта, в которых 5'-регуляторная область гена с-шуС повреждена в результате транслокаций.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы, 1 работа принята в печать.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 109 страницах машинописного текста. Она включает: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы (всего 122 названия, из них 3 на русской языке). Диссертация содержит 20 рисунков и 2 таблицы, помещенные в тексте.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом ( Blrnbolm & Doly 1963), а затем очищали в градиенте плотности хлористого цезия. Все манипуляции с ДНК проводили в соответствии с протоколами, приведенными в руководстве (Маниатис и др., 1986). РНК, полученную в результате транскрипции in vitro выделяли, как описано (Chomczynski г. Sacci, 1987). Электрофорез полученных препаратов РНК проводили в присутствии глиоксаля (McMaster & Carmichael, 1977). Реакции танскрипции In vitro и торможения в геле, а также получение ядерного и клеточного экстрактов осуществляли в соответствии с методиками, описанными в руководстве "Транскрипция и трансляция" (Хепмс и Хиггинс, 1987). Трансфекцию плазмид в эмбриональные клетки человека 293 осуществляли с помощью кальций-фосфатного метода (Graham & van der Eb, 1973). Поиск генов, содержащих IRS-подобную нуклеотидную последовательность проводили в банках данных EMBL и "Генэкспресс".

Результаты и обсуждение.

Ранее (Friedman ь Stark, 1985), что в 5'-регуляторной области некоторых интерферон-зависимых генов содержится интерферон-зависимый позитивный регуляторный элемент (IRS). В таблице 1 приведены последовательности IRS в различных интерферон-зависимых генах.

Таблица 1.

1RS последовательности интерферон-зависимых генов.

Нуклеотидная

Ген человека последовательность Источник

(дана одна цепь)

F/S консенсус GAJA GGA GAAA CTG (Friedman & Stark 1985)

ISG15 GGAAA CC- GAAA CT (Reich et al., 1987)

ISG54 GGAAA GT- GAAA CT (Reich et al., 1987)

ISG56

IP-10 GGAAA GT- GAAA CT (Laster & Ravetch,1987)

6-16 GGAAA AT- GAAA CT (Porter et al., 1968)

2'-5' олигоА GGAAA C— GAAA CC (Rutherford et al., 1968)

-синтетаэа

P-IFN GGAAA ACT GAAA G (Goodbourn et al., 1985)

Консенсус .._______... , и GGAAA N<1- ,3 ,GAAA

Эти 13- или 14-членные нуклеотидные 1RS последовательности высоко гомологичны мелщу собой. Промоторные фрагменты, содержащие их, связывают In vitro IFN-индуцированные факторы (510, Porter et al.,1966).

Мы осуществили компьютерный поиск* последовательностей , содержащих консенсус 1RS, приведенный в табл.1, для того, чтобы найти гены, содержащие 1RS последовательность .в 5'-регуляторной области. Такие последовательности были обнаружены в ряде генов и, . в том числе, в гене с-шус человека.

Консенсус 1RS в гене с-шус человека расположен в 5'-к^нцевой нетранскрибируемой области в положении -76/-67 по

"работа с банком данных "Генэкспресс" проводилась в информационном центре Института Молекулярной генетики АН СССР. Работа с банком данных EMBL проводилась совместно с Н.К.Ульяновым (ИМБ АН СССР). f

отношению к точке начала синтеза РНК - Pj. Структура э.того участка гена следующая:

ген с-тус человека ~e0TGGGGGAAAAGAAAAAAGATC~60

IRS-консенсус GGAAANGAAA

Кроме этого участка, подобная последовательность встречается трижды в транскрибируемой области гена:

100GGGAAAAAGAACU0 GGAAANgGAAA

760GCAGAGGGAAAACGGGAATGG780 GGAAANNNGAAA

1570CGAGAGAAAGAAGAAAAGCTG1590 GGAAAN,GAAA

Таким образом, в гене c-myc человека содержатся IRS-подобные >лементы. Для того,чтобы выяснить, влияет ли IRS участок -76/-67I на транскрипцию гена с-тус, мы исследовали транскрипцию олного гена с-юус, а также транскрипцию двух химерных плазыид, одержащих часть гена с-шус (см. рис. 1) с различной длиной '-регуляторной области и ген CAT (бактериальной хлорамфеникол-цетил-трансфераэы) в векторе pUSVLCAT, производном от плаэмиды UC19. Кроме того, мы использовали в качестве матрицы фрагмент лазмиды pUMCl, лишенный IRS участка (pUMCI, Xhol). При онструировании плазмид большая часть регуляторной области ила удалена, т.к. в ней находится несколько сильных позитивных и эгативных регуляторов транскрипции, и на фоне их действия было л трудно наблюдать эффект IRS последовательности, чазмида pUMCl содержит участок гена с-шус от -101 до -1185 3maI-XbaI), считая от точки начала транскрипции для Pj эомотора. Плаэмида pUMC2 содержит участок гена с-шус от -293 до 165 tScal-Pstl). В обоих плазмидах содержится IRS >следовательность. (см. рис. 1). Участки 100/110 и 766/776 'кожи на IRS, но отличаются от принятого нами консенсуса на один клеотид.

А. Плазмида pUMCl (c-myc от -101 до -1185, Smal-Xbal) 1 экэон с-пус > 1 интрон c-myc CAT

Smal -101

Xhol 10О/ 71 110

766/ Xbal EcoRI 776 1165

-76/ -67

1 экэон c-myc

Seal Smal -293 -101

Xhol 100/ 71 110

1 интрон c-myc CAT

766/ Xbal PstI 776 1165 2308

EcoRI

Рис.1 Схема плазмидных конструкций pUMCl и pUMC2. Черным вертикальным прямоугольником обозначен IRS-подобный участок -76/-67. Заштрихованными вертикальными прямоугольникам обозначен IRS-подобные участки 100/110 и 766/776. Пустой горизонтальный прямоугольник - первый экэон гена c-myc. Зачерненный горизонтальный прямоугольник - ген CAT (фрагмент вектора pUSVLCAT). Тонкие линии обозначают первый интрон гена c-myc и 5'-регуляторную область.

Эти конструкции, а также полный ген c-myc мы использовали качестве матриц для транскрипции in vitro, расщепляя их с помощ р^стриктаз для получения линейной формы.

Транскрипция полного гена c-myc происходила с точки инициации для наиболее сильного промотора Pj (Рис.2, дорожка 1) Плазмида pUMC2 не транскрибировалась вообще (рис.5, дорожка 2). Плазмида pUMCl не давала регулярных продуктов транскрипции (рис.ЗБ, дорожка^.}). Матрица, лишенная участка гена с 5'- конца

до +71 нуклеотида транскрибировалась с новой точки инициации Ij (рис. 4Б, дорожка 3). Это свидетельствует о нахождении негативного регуляторного элемента в участке -293/+71. Возникает вопрос, влияет ли IRS (-76/-671, находящийся в этом участке, на транскрипцию гена с-тус, т.е. обусловлено ли негативное действие этого участка присутствием IRS-последовательности?

Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы добавляли в систему транскрипции In vitro молярный избыток немеченного двуспирального IRS-олигонуклеотида и следили за транскрипцией матрицы, содержащей ген с-тус. Транскрипция полного с-тус гена происходила с нормальной точки инициации для промотора Pj. Добавление олигонуклеотида-конкурента не влияло на результаты транскрипции (Рис.2>.

Как видно из рис. ЗБ, в отсутствие олигонуклеотидов транскрипция плазмиды pUMCl (-101/1185) просходит случайно по всей длине плазмиды. В присутствии 10-кратного молярного избытка олигонуклеотида, содержащего IRS последовательность (GGAAAATGAAACT) , плазмида puMCl дает два старта транскрипции Ij и 12, находящиеся в первом интроне гена с-тус (в случае полного с-тус гена точки инициации транскрипции находятся в начале первого экзона). 100-кратный избыток олигонуклеотида вызывает большее усиление транскрипции чем 10-кратный, а использование олигонуклеотида с одной заменой (GGGAAATGACACT) дает существенно меньший эффект. Эти результаты можно объяснить тем, что при добавлении олигонуклеотида-конкурента фактор, связанный с IRS-участком, вытесняется с матрицы и таким образом "разрешает" транскрипцию.

Если это верно, то при удалении области, содержащей IRS-последовательность, транскрипция должна была бы происходить независимо от присутствия конкурирующих олигонуклеотидов.

*

Олигонуклеотиды были синтезированы д.х.н. Б.К.Черновым.

<ЕЭ до

1

Рис. 2 Транскрипция in vitro клонированного гена c-myc (XbaD

1. контроль (без добавления олигонуклеотида).

2. 100 избыток нормального олигонуклеотида.

-101 +1 М:

н

1185

410 -"300

.1904 /1584 ZX/1330 983 931 622 52 7

309

12 3 4 5

г

Рис.3 Транскрипция in vitro плазмиды pUMCl, линеаризованной с помошью рестриктазы Xbal.

А.'-Схема транскрибируемой ДНК и получающихся РНК-продуктов. Черный прямоугольник обозначает IRS-подобный участок, стрелками обозначены получающиеся РНК.

Б. Электрофорез РНК (1.5Х агароза), синтезированной в системе транскрипции in vitro в присутствии 4ц1 экстракта клеток HeLa S3 >.

1. 10 избыток нормального олигонуклеотида.

2. 100 избыток нормального олигонуклеотида.

3. ко^роль (без добавления олгонуклеотида)

4. 10 избыток мутантного олигонуклеотида.

+71

3-

G>

,C AT

-СП

•660

К}

1 2 3 /, 5

Рис.4 Транскрипция in vitro фрагмента конструкции pUMC-I •(XhoI-EcoRI)A. Схема транскрибируемой ДНК и получающихся РНК-продуктов. Б. Электрофорез РНК (1,5% агароза), синтезированной в системе транскрипции in vitro в присутствии экстракта клеток HeLa S3).

4(il

1 2.

3.

4.

5.

10 избыток нормального олигонуклеотида. 100 избыток нормального олигонуклеотида, контроль (без добавления олигонуклеотида). 10 избыток мутантного олигонуклеотида. 100 избыток мутантного олигонуклеотида.

б ~

т293

у)31 ! ; =¿527

3 —доз

^309

1 2

Рис.5 Транскрипция in vitro конструкции pUMC-2 (Xbal).

1. 100 избыток олигонуклеотида, соответствующего IRS-подобному фрагменту гена с-таус, pUMC2. ■2. Контроль (без добавления олигонуклеотидов), pUMC2.

Чтобы проверить это предположение, мы удаляли из плазмиды pUMCl IRS-участок -76/-67 с помошью рестриктазы Xhol и использовали фрагмент, начинающийся с +71 нуклеотида, в качестве матрицы. Такая матрица действительно транскрибировалась как в присутствии так и в отсутствие олигонуклеотидов. Транскрипция осуществлялась только с точки Ij (рис. 4Б). При добавлении олигонуклеотидов происходило заметное усиление транскрипции, но существенно меньшее, чем это было в случае конструкций, содержащих IRS. Мы объясняем это тем, что в районах +100/+110 и +766/+777, как уже упоминалось, обнаружены похожие на IRS последовательности. Возможно, что они также могут связывать предполагаемый белковый фактор. Однако налицо эффект, который можно связать только с IRS, находящейся в участке -76/-67, Так как при удалении этого участка транскрипция становится конститутивной, т.е. наблюдается и в присутствии, и в отсутствие олигонуклеотидов. Усиление транскрипции происходит существенно в меньшей степени, а реакция на мутацию в одной точке олигонуклеотида-конкурента практически не сказывается. Все это позволяет сделать вывод о том, что участок -76/-67, содержащий ■последовательность IRS, действительно функционирует как негативный регуляторный элемент. При этом IRS-подобные участки, расположенные ниже, возможно, также оказывают некоторое влияние.

При использовании в качестве матрицы плазмиды pUMC2 (-293/2306) транскрипция не происходит ни в присутствии ни в отсутстие олигонуклеотидов. Из этого следует, что присутствия участка -293/-101 достаточно для того чтобы блокировать возникновение новых точек инициации транскрипции Ij и 12 (рис, 5

Ранее показано (см. обзор), что появление новых точек инициации транскрипции в первом интроне гена с-шус человека характерно для лимфом Беркитта, в которых транслокации затрагивают 5'-область гена. Например, для лимфомы BL-16 и Manca известно 2, а для BL-67 - 3 новых старта транскрипции в первом интроне гена. В этом смысле наши опыты in vitro, по существу, моделируют процессы, происходящие in vivo в лимфомах Беркитта.

Мы подтвердили наши данные , полученные в системе in vitro

и

также в системе In vivo при трансфекции тех же плазмид в эмбриональные клетки человека. При этом в присутствии двуспирального IRS-содержашего олигонуклеотида наблюдалось 2,5-кратное усиление транскрипции с плазмиды pUMCl, тестируемое по активности гена CAT (см. Табл.: 2). Транскрипция с плазмиды pUMC2 не происходила ни в присутствии, ни в отсутствии олигонуклеотида. Эти данные хорошо согласуются с результатами • опытов in vitro.

Таким образом, показано, что в гене с-шус человека существует негативный регулятор, последовательность которого сходна с последовательность» позитивного регулятора интерферон-зависимых генов. Это поставило перед нами вопрос о том, существует ли белковый фактор, связывающийся с IRS-подобной последовательностью гена с-тус. Для решения этой задачи мы Использовали технику торможения в геле. При этом меченый олигонуклеотид, взаимодействующий с белком, при электрофорезе движется медленнее свободного олигонуклеотида, что позволяет обнаруживать комплекс белок/олигонуклеотид. В этих опытах мы использовали два IRS-содержаших олигонуклеотида - один из них точно соответствовал IRS-последовательности интерферон-зависимого гена 6-16 (см. табл.1), а другой IRS-участку -76/-Q7 гена с-шус человека.

6-16 GGAAAATGAAACT

c-myc GGGAAAAGAAAAAA Консенсус GtíAAANNNGAAA

"опыты по трансфекции проводились совместно с к.б.н. Н.Ф.Гриненко

Таблица 2. Анализ транскрипционной активности плазмид pUMCl и pUMC2, содержащих участки гена с-тус человека и ген CAT, при трансфекции в эмбриональные клетки человека 293. Активность CAT - бактериальной хлорамфеникол-ацетил-трансферазы выражена в условных единицах. Эти величины получены в результате сканирования радиоавтографов и определения высоты пиков, соответствующих моноацетилированным производным хлорамфеникола. Измерения проводились в стандартных условиях (см. Материалы и методы). Параллельно определялась активность Р-галактозидазы в тех же лиэатах. Она также выражена в условных единицах.

Плазмида Олигонукле- Активность Активность

отид соответ- &-галакто- CAT (Бактериальной

ствующий зидазы хлорамфеникол-ацетил-

фрагменту в условных трансферазы

гена с-тус единицах

в условных . нормировано

единицах к активности

1 В-галактозидаз

pUMCl 0,494 0,09 ' 0,182

pUMCl + 0,402 0,18 0,447

pUMC2 - 0,432 0 0

pUMC2 $ + 0,417 0 7 0

Контроль 1 , 0,213 1 4,7

Контроль 2 - 0,251 0 0

Контроль 1 - клетки, трансформированные плазмидой НБУСАТ, Контроль 2 - клетки, трансформированные только плазмидой, содержащей р-галактозидазу.

12 3 4

Рис.6 Электрофоретический анализ по сдвигу полосы связывания белков клеточного экстракта НеЬа БЗ с олигонуклеотидом СССААААСАААААА (туе) или с олигонуклеотидом ШЗААААТСАААСТ (6-16).

1,2 - олигонуклеотид 6-16. 3,4 - олигонуклеотид туе. <1,3 - 100, избыток ДНК фага А. 2,4 - 100 избыток ро!у(I):ро!у(С).

Рис.7 Электрофоретический анализ по сдвигу полосы связывания белков клеточного экстракта Не1а БЗ с олигонуклеотидом СССААААСАААААА Iтуе) при различных концентрациях последнего.

-20 -10 0 10 20 '30 '40

1/С, 1/М«1СГ

8ег1еа 1, 6-16 беПев 2, туо К 6-16 ■ 400 пМ Кятус - 55 пМ

Эвг1в8 1, туо —ЗеПез 2. е-1в

К, туе «= 200 пМ К,6-16 • 500 пМ Рис.9 Определение констант связывания оелковых факторов экстракта клеток НеЬа БЭ с олигонуклеотидными фрагментами генов с-мус и 6-16; график в координатах Диксона.

Олигонуклеотиды, соответствующие ШБ-подобным фрагментам генов с-таус и 6-16, образуют с белками ядерного экстракта два различных комплекса при использовании для подавления неспецифического связывания нуклеотида ДНК фага К (рис. 4). В случае олигонуклеотида, соответствующего ГИБ-участку гена с-мус, образующийся комплекс имеет меньшую подвижность; он представлен одной электрофоретической полосой (рис.4, дорожка 3). В случае' олигонуклеотида, соответствуюгэго гену 6-16, наблюдается две полосы, имеющие больший молекулярный вес (рис. 4, дорожка 1).

Таким образом,' действительно, существуют белки, взаимодействующие с ШЗ-подобными олигонуклеотидами, причем разные олигонуклеотиды связываются с разными белками. При этом каждый из них может взаимодействовать и с другим белком тоже (см. рис. 6). Неспецифические олигонуклеотиды в этих условиях вообще не образуют комплексов.

Для выяснения взаимного сродства этих олигонуклеотидов к белкам было проведено 4 варианта экспериментов.

1. Немеченый олигонуклеотид с-тус конкурировал за связывание с белками ядерного экстракта с тем же меченым олигонуклеотидом.

2. Немеченый олигонуклеотид 6-16 конкурировал за связывание с белками ядерного экстракта с тем же меченым олигонуклеотидом.

3. Немеченый олигонуклеотид 6-16 конкурировал за связывание с белками ядерного экстракта с меченым олигонуклеотидом с-иус.

4. Немеченый олигонуклеотид с-шус конкурировал за связывание с белками ядерного экстракта с меченным олигонуклеотидом 6-16.

Для определения констант связывания синтетических олигонуклеотидных фрагментов генов с-мус и 6-16 с белковыми факторами мы также использовали технику сдвига электрофоретической полосы. При этом мы допускали, что комплекс олигонуклеотида с белковым фактором достаточно Стабилен, т.е. количество комплекса, регистрируемое после электрофореза, отражает его содержание в равновесных условиях реакционной смеси. С учетом этого допущения мы провели анализ результатов электрофореза по торможение в геле комплексов, образующихся при использовании различных концентраций олигонуклеотида.

Схема типичного электрофореза для таких случаев приведена на рис.7. По результатам сканирования радиоавтографов были построены два вида графиков (рис.6, 9): в двойных обратных координатах (варианты опытов 1 и 2) для определения констант связывания этих белков с соответствующими олигонуклеотидами и в координатах Диксона для определения константы связывания олигонуклеотида 6-16 с с-оус-специфическим белком, и наоборот, олигонуклеотида с-тус с 6-16-специфическим белком (варианты экспериментов 3 и 4). Из этих графиков видно, что сродство двуспирального олигонуклеотида с-.тус к "своему" белку (kg пМ) в 8 раз выше, чем к

6-16-специфическому белку (kg g-ie"400 nMI- в то ^ вРемя олигонуклеотид 6-16 связывается с обоими белками с почти . одинаковым сродством (к£ б_1б=400 и пМ kj e_ig=500. При этом оба олигонуклеотида могут взаимодействовать с обоими белками. Таким образом, можно говорить о том, что существует некий специализированный тус-специфический фактор и фактор более универсальный/связывающийся одинаково хорошо и с олигонуклеотидом с-тус, и с олигонуклеотидом 6-16. Заключение.

В гене с-тус человека существует участок, нуклеотидная последовательность которого подобна последовательности IRS -позитивно;о регулятора интерферон-зависимых генов. IRS-подобный участок в гене с-тус осуществляет негативную регуляцию транскрипции с точек инициации Ij и 12, находящихся в первом интроне. Прй этом происходит связывание регуляторного фактора с IRS-подобной последовательностью.

Транскрипция с точек Ij и 12 возникает в том случае, когда отсутствует большая часть 5'-области гена с-таус. Оказалось, что 'для блокирования возникновения таких новых стартов инициации транскрипции достаточно присутствия участка от -293 до -101 нуклеотида. По-видимому, удаление части регуляторной 5'-области, содержащей другие позитивные и негативные регуляторы, дает возможность проявления действия IRS-подобного регуляторного участка. In vivo возникновение новых точек инициации в 1 интроне гена с-шус наблюдается в лимфомах Беркита с усеченной 5'-областью

(см. лит. обзор). Так что ситуация, которую мы наблюдали в системе In vitro, может моделировать процессы, происходящие в таких лимфомах.

При исследовании связывания 'экстракта клеток HeLa с IRS-подобными нуклеотидами выяснилось, что в этом экстракте существует белок, преимущественно связывающийся с IRS-подобным олигонуклеотидом, соответствуют*м фрагменту гена с-тус, и белок(и), преимущественно связывающийся с IRS-подобным олигонуклеотидом интерферон-зависимого гена 6-16. При этом оба этих белка могут связываться и с "несвоим" олигонуклеотидом.

Если регуляция транскрипции интерферон-зависимых генов и гена с-тус действительно осуществляется с помощью факторов, способных перекрестно связываться с регуляторными участками этих генов, то таким образом может осуществляться связь систем действия с-тус гена и интерферон-зависимых генов. Противоположное действие IRS-подобного участка в гене с-тус и в гене 6-16 соответствует разнонаправленности физиологических функций продуктов этих генов в процессе пролиферации.

Выводы.

1. В гене с-тус человека обнаружены нуклеотидные последовательности, сходные с консенсусом (IRS) интерферон-зависимых генов.

2. 14-членные двуспиральные олигонуклеотиды, соответствующие IRS-подобным участкам генов с-тус и интерферон-зависимого гена 6-16, конкурируют с обоими этими генами за связывание, белковых факторов транскрипции. Удаление факторов транскрипции с IRS-подобного участка гена с-тус приводит к активации транскрипции in vitro.

3. В ядерном экстракте клеток HeLa обнаружено как минимум два фактора, связывающихся преимущественно либо с IRS-подобным элементом гена с-тус , либо с аналогичным элементом гена 6-16. При этом каждый из этих факторов связывает с меньшим сродством и IRS-пояобный элемент другого гена. Определены кинетические параметры связывания белковых факторов с двуспиральными злигонуклеотидами. соответствующими IRS фрагментам генов с-тус и

6-16.

4. Обнаружены новые точки инициации транскрипции Ij и 12, расположенные в первом интроне гена с-шус человека. Это характерно для фрагментов гена, частично лишенных 5'-концевой регуляторной области: участок гена>-293/-101 блокирует инициацию в Ij и 12.

Новые Точки инициации Ij и 12 расположены в области, где происходит инициация транскрипции в клетках лимфом Беркитта человека и плаэмацитом мыши, в которых в результате хромосомных перестроек ген с~тус укорочен с 5' конца. Высказана гипотеза, что в этих клетках уменьшен или уничтожен негативный контроль транскрипции с точек Ij и 12, позитивный же контроль осуществляется за счет взаимодействия регуляторных факторов с участком IRS гена с-шус.

5. Совокупность полученных в работе результатов свидетельствует о том что у функционально существенно различных генов (с-шус и интерферон-зависимых генов) есть весьма похожие по структуре регуляторные элементы действующие противоположным образом (позитивные и негативные). Благодаря этому, а также одновременному присутствию в участках белковых факторов, обладающих разным сродством к этим элементам, может быть достигнут координированный контроль активности генов, принадлежащих к генным семействам с0 физиологически разными функциями.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. N.M.Alexandrova, A.V.Itkes, B.K.Chernov, E.M.Tulchlnsky, N.B.Ulyanov and L.L.Kisselev. Human c-myc gene contains a regulatory site similar to consensus of interferon response sequence tIRSJ. FEBS.Lett., 1990, V.265, No. 1,2, p.67-70.

2. K.T. Turpaev, A.V.Itkes, N.M.Alexandrova, 0.V.Pokrovsk&ya, L.R.Ioamova, B.K.Chernov end L.L.Kisselev >

Binding of Proteins of HeLa 33 Cell Extract to Oligonucleotides Containing Consensus IRS (Interferon-Response Sequence) and to IRS-Containing Fragment of Human c-myc Gene. EJB, принята в

печать.

3. А.В.Иткес, Н.М.Александрова. Л.Р.Имаыова.

Экспрессия протоонкогенов щс м fos человека. Тез. 8-ого симп. СССР-ФРГ, Иркутск, 1969.

4. A.V.Itkes, N.M.Alexandrova, D. Bajarsaikhan, L.R.Imamova, N.B.Ulyanov, B.K.Chernov, L.L.Kisselev.

Transcription in vitro of hucan шус protooncôgene: functional role of certain sites of 5'-terminal regulatory region of the gene. Second Bilateral Sump. USSR-USA "Structure of eukaryotlc genome", Tbilissi, Oct.1969, p. 52. !