Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Варианты организации ядрышек при гепатоканцерогенезе, вызванном гиперэкспрессией генов-регуляторов клеточного цикла у трансгенных мышей

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Варианты организации ядрышек при гепатоканцерогенезе, вызванном гиперэкспрессией генов-регуляторов клеточного цикла у трансгенных мышей"

003054281

ГОЛЬДИНА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

УДК 576 315-45:616 36-006

ВАРИАНТЫ ОРГАНИЗАЦИИ ЯДРЫШЕК ПРИ ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНЕЗЕ, ВЫЗВАННОМ ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ-РЕГУЛЯТОРОВ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА У ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003054281

Работа выполнена на кафедре клеточной биологии и гистологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В Ломоносова

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Онищенко Галина Евгеньевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Зацепина Ольга Владимировна доктор биологических наук Болтовская Марина Николаевна

Ведущая организация ГУ Российский онкологический

научный центр им. Н КБлохина РАМН

Защита состоится 20 февраля 2007 г. в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. ^

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «/£> еШ^Ь^- 20071

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

«Когда наука достигает какой-либо вершины, с нее открывается обширная перспектива дальнейшего пути к новым вершинам, открываются новые дороги, по которым наука пойдет дальше» СИ ВАВИЛОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Модель трансгенных животных представляет собой один из современных инструментов для изучения размножения и дифференцировки клеток (Clarke, 2000, Calvisi and Thorgeirsson, 2005, Lee et al, 2005). Гиперэкспрессия генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, вызывает каскад изменений в тех внутриклеточных системах, которые вовлечены в сферу активности продуктов экспрессии этих генов Выявление таких изменений в тканях трансгенных животных в конечном итоге позволяет ответить на вопрос о том, как реализуется действие регуляторных систем

Модели животных, в которых трансфецированы гены пролиферативного контроля, вызывает большой интерес еще и потому, что, как правило, в различных тканях таких организмов развиваются опухоли (Factor et al, 1997; Jhappan et al, 1990; Sandgren et al, 1989, Thorgeirsson et al, 2000) Исследования, проводимые с использованием этих моделей, в основном направлены на изучение характера возникающих опухолей и биохимических изменений в тканях таких животных. Показано, что на начальных этапах постнатального развития в печени трансгенных животных ускоряются пролиферация и гибель клеток, наблюдаются гиперплазия и дисплазия ткани органа. В более поздний период онтогенеза развиваются опухоли Характер организации клеток, в том числе структура ядер и ядрышек, в гепатоцитах трансгенных животных до сих пор остаются неизученными. В данной работе на моделях c-myc-, c-myc/TGF-a- и E2F-1-трансгенных мышей исследована структурная организация ядрышка на разных этапах формирования опухоли. Такого рода данные не только позволяют объяснить, как зависит структурно-функциональное ядрышек от уровня экспрессии определенных генов, но и могут иметь прикладное значение и способствовать разработке морфо-функциональных критериев при диагностике опухолей

Имеющиеся в литературе статистические данные, которые характеризуют морфофункциональные типы ядрышек, немногочисленны (Зацепина и др, 1989, Челидзе и др, 1992а). Информация о количественных параметрах ядрышек в процессе гепатоканцерогенеза отсутствует. В настоящем исследовании проведена количественная оценка морфологических изменений ядрышек в гепатоцитах мышей дикого типа и на разных стадиях гепатоканцерогенеза, обусловленного гиперэкспрессией генов-регуляторов клеточного цикла Выявлены закономерности изменений размеров ядрышек, фибриллярных

центров (ФЦ) и стандартных ядрыппсовых вакуолей в различных морфофункциональных типах ядрышек.

При гепатоканцерогенезе, вызванном гиперэкспрессией генов-регуляторов клеточного цикла, на состояние ядрышек могут влиять как гиперэкспрессия генов пролиферативного ответа, так и хромосомный дисбаланс С одной стороны, хромосомный дисбаланс является тем фактором, который может изменять внутреннюю организацию ядра. С другой стороны, хромосомный дисбаланс может затрагивать хромосомы, которые несут ядрышковые организаторы и гены, регулирующие структурно-функциональное состояние ядрышек Ядрышко является динамичной структурой, реагирующей на структурно-функциональное состояние ядра, которое в значительной степени может зависеть от того, в результате какого митоза - нормального или патологического возникла данная клетка

Цели и задачи исследования. Основная цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании морфофункционального состояния ядрышек в течение гепатоканцерогенеза, вызванного гиперэкспрессией различных генов-регуляторов клеточного цикла

Для достижения данной цели в работе были поставлены следующие задачи. На стадии дисплазии и опухолевого роста в печет! с-тус-, с-тус/ТОР-а - и Е2Р-1 -трансгенных мышей:

1 провести количественную оценку уровня митотической активности, содержания патологических митозов и апоптотических клеток в печени,

2 исследовать особенности ультраструктурного строения клеток,

3 определить морфофункциональные типы ядрышек,

4.провести морфометрическую оценку диаметров ядрышка, ФЦ и ядрыппсовых вакуолей Научная новизна работы. В настоящей работе впервые на примере с-тус-, с-тус/ТСЕ-а - и Е2Р-1-трансгенных мышей в клетках печени'

- исследованы ультраструктурные изменения ядрышек на различных стадиях гепатоканцерогенеза;

- показано, что в зависимости от стадии гепатоканцерогенеза и вида экпрессируемого гена соотношение типов ядрышек отличается от характерного для гепатоцитов мышей дикого типа,

- обнаружено, что в опухолевых клетках печени с-тус/ТОР-а- и Е2Р-1-трансгенных мышей формируются ядрышки иных морфофункциональных типов - компактно-нуклеолонемные и сегрегированные, соответственно;

- охарактеризованы новые подтипы ядрышек: нуклеолонемные с признаками сегрегации, компактно-нуклеолонемные вакуолизированные и компактно-нуклеолонемные с централь-

ной вакуолью;

- выявлено, что результаты измерений ФЦ и ядрышковых вакуолей свидетельствуют о сходном уровне функциональной активности ядрышек в пределах морфофункциональных подтипов;

- показано, что увеличение или уменьшение размеров ядрышек не является общим прогностическим критерием формирования и/или развития процессов, связанных с опухолевым ростом.

Практическое значение работы. Полученные результаты могут служить основой для дальнейшего изучения взаимосвязи строения ядрышек и различных стадий канцерогенеза в других органах и организмах. Данные о структурной организации ядрышек в клетках печени при гиперэкспрессии генов-регуляторов клеточного цикла могут иметь прикладное значение и способствовать выработке морфо-функциональных критериев прогноза развития опухоли и разработке диагностических методов исследования.

Кроме того, описания структурных изменений, происходящих в процессе формирования опухолей, могут быть использованы для анализа различных типов опухолей печени В настоящей работе обнаружена неоднородность в ультраструктурном строении диспластических и опухолевых клеток печени c-myc-, c-myc/TGF-a- и E2F-1-трансгенных мышей Выявляемые нами данные могут быть использованы в экспериментальной и медицинской онкологии. Морфофункциональное состояние ядрышек может служить критерием преобладания определенных процессов метаболизма в зависимости от стадии и типа канцерогенеза Результаты морфометрического анализа диаметра ядрышка, ФЦ и ядрышковых вакуолей могут быть использованы при классификации ядрышек в качестве дополнительных параметров

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были изложены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2003), на I съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на VIII Российской медико-биологической конференции молодых ученых «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2005), на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), а также на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ им. М В.Ломоносова. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов-«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы», «Приложения», «Иллюстрации» Работа

изложена на|У( страницах, включает 4 (таблиц,^иллюстраций (из них № гистограмм). В списке литературы приведены^^"1убликаций

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В работе исследовали гепатоциты печени мышей дикого типы (гибриды первого поколения (CD-I х В6СВА), клетки печени при дисплазии ткани и клетки опухоли у c-myc-, c-myc/TGF-альфа- и Е2Р-1-трансгенных мышей. Изучение проводилось на самцах Получение трансгенных животных и фиксация материала проводились в Laboratory of Experimental Carcinogenesis, Division of Basic Science, National Cancer Institute, Bethesda, USA Материалы были любезно предоставлены доктором S.S.Thorgeirsson и доктором V.M Factor c-myc/TGF-a-трансгенные мыши получены в результате скрещивания MT/TGF- a (МТ 42-линия) с Alb/c-myc (168 линия) трансгенными мышами Экспрессия TGF-a находилась под влиянием металлогионин(МТ)-промотора (в питьевую воду добавляли 50 ммоль/л ZnCb). Промоторы генов, ответственных за синтез c-myc и E2F-1, связаны с энхансером гена, кодирующего альбумин; это обуславливает развитие опухоли в печени. В настоящей работе проводилось исследование тканей в определенные сроки гепатоканцерогенеза (табл 1)

Таблица 1. Возраст исследуемых мышей дикого типа, с-тус-, с-тус/ТОР-а- и Е2Р-1-трансгенных мышей.____

дикий тип с-тус-дисплазия с-тус-опухоль с-тус/ TGF-a-дисплазия с-тус/ TGF-a-опухоль E2F-1-дисплазия E2F-1-опухоль

возраст мышей (нед.) 10 19 76 10 21 19 75

Методы исследования.

Световая микроскопия. Кусочки печени фиксировали в 10%-нейтральном формалине при +4°С, затем обезвоживали по стандартной методике и заливали в парапласт Полученный материал окрашивали гематоксилином и эозином Для светооптического анализа также использовали полутонкие эпоновые срезы, приготовленные на пиромитоме и окрашенные в течение нескольких секунд раствором метиленового синего (0,5%) и 1% буры в соотношении 11.

Оценка митотической активности и гибели клеток проводилась на гистологических препаратах с общим увеличением микроскопа 1500х. В зависимости от типа трансгенного животного и стадии гепатоканцерогенеза в работе проанализировано от 20000 до 250000 клеток. Для оценки пролиферативной активности клеток использованы следующие количественные показатели: митотический индекс, метафазно-профазный индекс, относительное число всех патологических митозов и их разновидностей Митотический и

апоптотический индексы рассчитаны на 1000 клеток (%о) Для определения типов патологических митозов использовали классификацию, предложенную Аловым А.И (1972).

Анализ ядрышек на гистологических препаратах проводился в 30 полях зрения с общим увеличением микроскопа 1500х Для оценки числа ядрышек с выраженными ядрышковыми вакуолями подсчитывалось общее число ядрышек и число ядрышек с выраженными ядрышковыми вакуолями

Электронная микроскопия Кусочки печени фиксировали в смеси 2,5% глютарового альдегида («Sigma») и 2% формалина, приготовленной на 0,1М фосфатном буфере (рН 7.274), и дофиксировали 1%-ным раствором OsC>4 на 0,1М фосфатном буфере в течение 2 часов Затем их обезвоживали и заключали в Ероп 812 («Fluka») по стандартной методике. Серийные ультратонхие срезы готовили на ультрамикротоме LKB-1 (с использованием алмазного ножа АВС-НА4024) и дополнительно контрастировали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу. Съёмка производилась на электронных трансмиссионных микроскопах JEM-100B, Jeol-100 СХ, JEM-1011

Ультраструктурная организация ядрышек изучалась на серийных срезах При определении типов ядрышек использовалась морфофункциональная классификация, предложенная П.В. Челидзе и О.В. Зацепиной (1988г) Серийность срезов является обязательным условием определения типа ядрышка В противном случае некоторые компоненты ядрышка могут быть не выявлены

Морфометрический анализ Обсчет параметров ядрышка был произведен с помощью программы Image Pro Plus 3.0 («Media Cybernetics») Для калибровки за основу взят диаметр поперечного сечения центриоли в гепатоцитах, равный 0 2 мкм (Онищенко, Ченцов, 1986) Каждая из исследуемых серий ядрышек представлена разным количеством срезов, проходящих через область ядрышка, отражающую морфофункциональный тип ядрышка (от 1 до 13) На каждом срезе серии проводили измерения следующих параметров ядрышка' диаметр ядрьппка, диаметры всех ФЦ, диаметры всех ядрышковых вакуолей Все измерения следует считать случайными, так как срезы через клетку делались произвольным образом

Ядрышки, ФЦ и ядрыппсовые вакуоли имеют на срезах как округлую, так и овальную (или иную неправильную) форму. Поэтому, фактически, под термином «диаметр» в данном исследовании подразумевается длина максимального поперечного сечения каждой из исследуемых структурных единиц. В случае если ядрышко, ФЦ или ядрьппковая вакуоль на срезе имеют округлую форму, то полученное значение представляет собой истинный диаметр. Выбранное на одном срезе направление измерения длины поперечного сечения ядрышка, на других срезах не менялось. В разных ядрышках на одном срезе было сделано от 1 до 41 измерений диаметров ФЦ и от 1 до 90 измерений диаметров вакуолей

Статистическая обработка данных по диаметрам ядрышек проводилась в двух направлениях' 1) тип трансгенного животного и стадия опухолевого роста; 2) морфофункциональный тип ядрышка В качестве количественной характеристики размера ядрышка был определен максимальный диаметр (из каждой серии выбирался срез, на котором ядрышко имеет наибольший диаметр) Для каждого из исследуемых параметров построены гистограммы частот распределения и определены средние значения диаметров. В таблицах и на гистограммах указано стандартное отклонение

Для статистической обработки результатов применялись программы Microsoft Excel 2003 и STATISTICA 6.0 Для проверки распределений на нормальность использовали следующие критерии: ассиметричность, эксцесс, одновыборочный критерий Колмогорова-Смирнова, критерий Шапиро-Уилки, катетеризированные графики и гистограммы распределения. Большинство распределений, полученных в данной работе, не соответствуют нормальному В связи с этим значимость различий между двумя группами оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни Для сравнения нескольких групп применяли ранговый однофакторный анализ Краскела-Уоллиса. Различия между средними величинами признавались достоверными при р < 0,05 В случае если критерий Краскела-Уоллиса показывал различие нескольких исследуемых выборок, использовался метод непараметрического множественного сравнении - критерий Данна

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ультраструктурное строение клеток печени. В гепатоцитах мышей дикого типа гранулярный эндоплазматический ретикулум (грЭПР) хорошо развит, часто располагается параллельными рядами, образованными 5-25 цистернами значительной протяженности. Комплекс Гольджи представлен диктиосомами, распределенными по всему объему клетки В диктиосоме цистерны, как правило, одинаковой длины, могут быть расширены как на концах, так и в центральной части; содержимое цистерн светлое Центриолярный комплекс выявляется около ядра центриоли не имеют четкой ориентации по отношению друг к другу. На одной центриоли могут встречаться как сателлиты, так и придатки, сателлиты не содержат головок. Промежуточные филаменты (ПФ) образуют вокруг центриолей крупные пучки, расположенные близко к центриолярному цилиндру. В некоторых клетках тонкие и короткие пучки филаментов отходят от центриолярного комплекса на периферию

В диспластических клетках c-myc-, c-myc/TGF-a и Е2Р-1-трансгенных мышей грЭПР встречается во всех областях цитоплазмы, часто формируя параллельные ряды из 3-12 цистерн Однако протяженность цистерн визуально значительно короче по сравнению с

длиной цистерн в гепатоцитах мышей дикого типа. Особенности строения вакуолярной системы позволяют выделить 2 типа клеток. В клетках 1 типа цистерны грЭПР имеют нормальное строение, характерное для гепатоцитов мышей дикого типа. Отдельные небольшие светлые везикулы выявляются около центриолярного комплекса. Область центриолярного комплекса свободна от митохондрий и цистерн грЭПР. В клетках 2 типа цистерны грЭПР несколько раздуты Протяженность таких цистерн визуально схожа с длинами цистерн грЭПР клеток 1 типа, однако в некоторых клетках выявляются и более короткие цистерны грЭПР. Светлые везикулы содержатся не только в области клеточного центра (где их значительно больше по сравнению с клетками I типа), но и по всей цитоплазме.

Аппарат Гольджи располагается как около ядра, так и вблизи желчных капилляров Каждая диктиосома может быть представлена как короткими, так и длинными расширенными цистернами (особенно выделяются вздутия на концах) В цистернах аппарата Гольджи часто выявляется как электронно-плотное, так и электронно-светлое содержимое. Большая часть цистерн аппарата Гольджи в диспластических клетках с-тус/ТОР-а-трансгенных мышей заполнена светлым содержимым.

Центриоли формируют комплекс, имеющий околоядерную локализацию В диспластических клетках с-тус- и с-тус/ТСР-а-трансгенных мышей ПФ располагаются вокруг центриолей, где они образуют пучки (как тонкие, так и более мощные), расположенные в непосредственной близости от центриолей Кроме того, пучки различной толщины отходят от клеточного центра на периферию

Яркими отличительными особенностями обладают опухолевые клетки с-тус-, с-тусАГОР-а и Е2Р-1-трансгенных мышей Опухолевые клетки печени с-тус-трансгенных мышей в целом имеют схожее с диспластическими клетками строение Однако, цистерны аппарата Гольджи опухолевых клетках короткие, могут бьггь как уплощены, так и несколько вздуты; в расширенных цистернах выявляется светлое содержимое ПФ выражены слабо, тонкие и короткие пучки выявляются в области клеточного центра В части клеток в большом количестве обнаруживаются липидные включения различного размера

В опухолевых клетках печени с-тус/ТСР-а-трансгенных мышей признаки злокачественного фенотипа выражены наиболее полно. Основная часть цитоплазмы заполнена веществом с низкой электронной плотностью, не известной на данной момент природы. Органеллы клетки располагаются в меньшей ее части Цистерны грЭПР расширены; в одной клетке может встречаться 2 типа цистерн протяженные и короткие. Короткие цистерны по сравнению с длинными раздуты в бблыней степени и имеют электронно-светлое содержимое. В цитоплазме встречается много свободных полисом

Цистерны аппарата Гольджи тонкие, с вздутиями на концах, содержимое цистерн светлое Центриолярный комплекс, как правило, располагается в области между ядром и плазматической мембраной; в связи с этим аппарат Гольджи часто выявляется около желчных капилляров. Центриолярный комплекс образован 1-4 центриолями. ПФ практически отсутствуют. В цитоплазме выявляются липидные гранулы.

В цитоплазме опухолевых клеток Е2Е-1-трансгенных мышей также обнаруживается содержимое с низкой электронной плотностью Цистерны грЭПР не расширены В большинстве клеток цистерны располагаются отдельно друг от друга Диктиосомы аппарата Гольджи обнаруживаются как в околоядерной области, так и около желчных капилляров. Диктиосомы, как правило, представлены короткими тонкими цистернами с расширениями на концах, в которых выявляется и темное, и светлое содержимое. Цитоплазма содержит полисомы Центриолярный комплекс располагается около ядра. ПФ выявляются в околоцентриолярной области в виде тонких коротких пучков, уходящих на периферию

Таким образом, в гепатоцитах при дисплазии печени и в опухолевых клетках с-шус, с-тус/ГСР-а и Е2Р-1-трансгенных мышей по сравнению с гепатоцитами мышей дикого типа происходят изменения в строении органелл вакуолярной системы (грЭПР и аппарата Гольджи), центросомы и других элементов цитоскелета Наиболее яркими отличительными признаками обладают опухолевые клетки всех трех типов трансгенных мышей В опухолевых клетках печени с-тус/ТОР-а-трансгенных мышей признаки злокачественного фенотипа выражены наиболее полно.

2. Особенности пролиферации и гибели.

При изучении гепатоцитов мышей дикого типа митозов обнаружено не было (рис.1) Митотический индекс в диспластических и опухолевых клетках с-тус-трансгенных мышей практический одинаковый: 3,06%о и 3,29%о соответственно. В печени с-шус/ТСР-а- и Е2Р-1-трансгенных мышей митотический индекс при дисплазии клеток в 7-8 раз меньше по сравнению с данными показателями, характеризующие опухолевые клетки (рис 1)

Патологические митозы обнаружены во всех исследуемых моделях трансгенных мышей Однако четкой корреляции между частотой патологических митозов и стадией опухолевого роста не выявлено (рис.2). Патологические митозы у с-тус-трансгенных мышей в диспластических клетках составляют 38% от общего числа митозов, в опухолевых - 29,5%. При дисплазии печени с-тус/ТйР-а-трансгенных мышей число патологических митозов достигает 42,4%, а в опухоли - 39,1%. В диспластических клетках печени Е2Р-1-трансгенных мышей содержится наименьшее число патологий митоза - 20%, но в опухолевых клетках этот показатель достигает 44,9%

дики» тип е-туо ипуо- с-туаТбР- 0М-

3*сшзня опухоль о- в-опртвль дкегшазня опучоль дмсллззия

■ ,---

ТИККЙ тип с пг.

с-п^с- сгли[- мцс/ДО- КМ' ЙМ-е. о-огципь днсплам итуюпк днсшктя

Рис. 1. Показатели лтпютичеыой Рис. 2. Патологические митозы в клетках

активности и гибели Оля клеток на стадии дисплазии и опухолевого роста печени с-тус-, с-тус ТСА'-а и Е2Р-]~ трансгенных мышей.

печени на стадии дисплазии и опухолевого роста с-тус-, с-тусП'01'-а- и трансгенных мышей. Процент патологических

митозов указан от общего чнаю митожю

В диспластических я опухолевых клетках с-тус-, с-ту с/ТОР-га- и В2Т-1 -трансгенных мышей 17,4-35,5% патологических митозов связано с повреждениями хромосом (1 группа), и 64,5-82,6%, соответственно, приходится на патологии, являющиеся следствием нарушений митотического аппарата (2 группа} {рис.2). Наиболее распространенной патологией митоза является К-мжгш. В клетках печени трансгенных мышей также обнаруживаются: много полюсный митоз, ассиметричиый митоз, рассеивание, полая мета фаз а, отставания хромосом, склеивание хромосом, хромосомные мосты.

Наиболее высокая апоптотическая гибель характерна для печени с-тус-трансгенных мышей и составляет 2,2%о для диопдастаческих клеток и 2,02%о для опухолевых клеток (рис. 1) V с-тус/ТСР-а-трансгенных мышей апоптотический индекс уменьшается более, чем в 2 раза по сравнению с с-тус-трансгенными мышами: при дисплазии этот показатель равен 0,67 %о, а в опухоли 0,76%о. При гиперэкспрессии гена Е2Р-! на стадии дисплазии апоптотический индекс составляет 0,43?™, в опухолях гибель клеток усиливается (1,97%о).

3. Ядрышки на скего-оптическом уровне.

Для оценки состояния ядрышек на свето-оптическом уровне использовали такие параметры как; частота встречаемости ядер с разным содержанием ядрышек, среднее число ядрышек и ядре; относительное число ядрышек, содержащие выраженные ядрышковые вакуоли. В гепатоцитах мышей дикоео типа, в диспяастических и опухолевых клетках с-тус-, с-тус/ГОГ-а- и Е2Р-! -трансгенных мышей преобладают ядра, содержащие I -3 ядрышка. В опухолевых клетках с-тусЛ ОР-а-трансгенных мышей и в диспластических

п

клетках Е2Р-1-трансгенных мышей значительная часть ядер содержит 1 ядрышко В диспластических и опухолевых клетках с-тус-трансгенных мышей и в диспластических клетках с-тус/ТСР-а-трансгенных мышей выявляется ббльшее число ядер с 5-8 ядрышками Среднее число ядрышек в гепатоцитах мышей дикого типа и в клетках печени при дисплазии и опухолевом росте с-тус-, с-тус/ТОР-а- и Е2Р-1-трансгенных мышей варьирует в пределах от 1,32 до 2,43 на 1 ядро (табл.2) Средние числа ядрышек в гепатоцитах мышей дикого типа, диспластических и опухолевых клетках с-тус/ТОР-а-трансгенных мышей достоверно различаются, для других типов значимых отличий не выявлено (р<0,05)

Таблииа 2. Среднее число ядрышек на ядро в гепатоцитах мышей дикого типа, при дисплазии и опухолевом росте клеток печени с-тус-, с-тус/ЮР-а- и Е2Р-1-трансгеных мышей.

дикий тип с-шус-дисплазия с-тус-опухоль с-тус/ТОР-а-дисплазия с-тус/ТОР-а-опухоль Е2Р-1-дисплазия Е2Р-1-опухоль

1,85±0,85 2,13±1,17 2,10±1,34 2,43±1,38 1,32±0,63 1,57±0,83 1,64±0,76

Относительное число ядрышек, содержащих выраженные ядрышковые вакуоли, в диспластических и опухолевых клетках с-тус- и с-тус/ТОР-а-трансгенных мышей составляет 23,76 - 29,41% от общего числа ядрышек, что в 3-3,5 раза больше по сравнению с гепатоцитами мышей дикого типа (табл.3) В гепатоцитах при дисплазии печени Е2Р-1-трангенных мышей число ядрышек в 2 раза выше, чем в гепатоцитах мышей дикого типа. В опухолевых клетках Е2Р-1-трангенных мышей этот показатель уменьшается до 8,59%.

Таблииа 3. Относительное число (%) ядрышек, содержащих выраженные ядрышковые вакуоли, в гепатоцитах мышей дикого типа, при дисплазии и опухолевом росте клеток печени с-тус-, с-тус/ТОР-а- и Е2Р1-трансгеных мышей.___

дикий тип с-тус-дисплазия с-тус-опухоль с-тус/ТСР-а-дисплазия с-тус/ТСР-а-опухоль Е2Р-1-дисплазия Е2Р-1-опухоль

8,33 26,97 23,76 26,52 29,41 15,84 8,59

Полученные в настоящем исследовании результаты о степени вакуолизации ядрышек в гепатоцитах мышей дикого типа, при дисплазии и опухолевом росте клеток печени с-тус-, с-тус/ТОР-а- и Е2Р1-трансгеных мышей, выявленной на светооптическом уровне, в целом соответствуют данным электронной микроскопии

4. Ультраструктура ядрышек.

При электронно-микроскопическом исследовании тонкого строения гепатоцитов мышей дикого типа, диспластических и опухолевых клеток трансгенных мышей проанализировано от 36 до 54 ядрышек (табл. 4, рис. 3).

В гепатоцитах мышей дикого типа преобладают ядрышки нуклеолонемного типа. Гранулярный компонент таких ядрышек развит хорошо; околоядрышковый хроматин часто

Таблииа 4. Морфофункциональные типы ядрышек в гепатоцитах мышей дикого типа, при дисплазии и опухолевом росте клеток печени с-тус-, с-тус/ЮЬ'-а- и Е2Р1-трансгеных мышей.

тип мыши тип ядрышка дикий тип с-гаус-дисплазия с-шус-опухоль c-myc/TGF-a -i дисплазия c-myc/TGF-a -опухоль E2F-1-дисплазия ■ E2F-1-опухоль общее число ядрышек

нуклеолонемное I типа 40 26 26 20 - 21 1 134

нуклеолонемное II типа 7 13 13 16 - 8 - 57

нуклеолонемное III типа 2 9 7 11 - 1 - 30

нуклеолонемное с признаками сегрегации 2 - 4 - - 13 16 35

сегрегированное - - - - - 1 29 30

ретикулярное - - - 3 - - - 3

ретикулярное с центральной вакуолью - - - 4 - - - 4

компактно-нуклеолонемное 1типа - - - - 14 - - 14

компактно-нуклеолонемное II типа - - - - 7 - - 7

компактно-нуклеолонемное III типа - - - - 15 - - 15

иные типы Г - I6 - - - 1" -

общее число ядрышек 52 48 51 54 36 44 47 332

нуклеолонемное с центральной вакуолью и признаками сегрегации ядрышко

образует небольшие блоки ФЦ имеют размеры от 0,07 до 0,54 мкм, ядрышковые вакуоли -от 0,04 до 0,7 мкм. Нуклеолонемно-вакуолизированные ядрышки в гепатоцитах мышей дикого типа имеют типичное нуклеолонемное строение с характерным для него развитием компонентов и степенью вакуолизации. Так, размер ФЦ составляет от 0,1 до 0,57 мкм Однако отличительным признаком нуклеолонемно-вакуолизированных ядрышек является более интенсивное развитие 1-4 вакуолей с диаметром от 0,5 до 1,13 мкм. Таким образом, название этого типа ядрышек полностью отражает их структуру: одна часть ядрышка по своему строению является нуклеолонемной, другая - вакуолизированной

Нуклеолонемно-вакуолизированные ядрышки с центральной вакуолью отличаются наличием одной крупной вакуоли, как правило, занимающей центральное положение. Часто в данных ядрышках выявляются вакуоли размером 0,6-1,2 мкм - аналогичные тем, что составляют вакуолизированную часть нуклеолонемно-вакуолизированных ядрышек. Поэтому термин «вакуолизированные» в название типа был сохранен Появление в термине слов «центральная вакуоль» подчеркивает расположение вакуоли и ее размер (около 1,5 мкм).

Наблюдаемые нами в гепатоцитах мышей дикого типа варианты ядрышек отличаются от уже существующих в литературе данных (Челидзе и др, 1992) Подобное различие в результатах может быть объяснено как неодинаковыми условиями содержания животных, так и различиями в породах мышей. Классифицируя ядрышки, мы ввели ряд новых определений Так, в классификации, предложенной П В. Челидзе и О В Зацепиной (1988), нуклеолонемно-вакуолизированные ядрышки рассматриваются как промежуточный тип нуклеолонемных ядрышек, характеризующийся наряду с элементами нуклеолонемы отчетливо выявляющимися вакуолями, занимающими центральное положение в ядрышке Полученные нами результаты позволяют выделить два отдельных подтипа ядрышек 1) нуклеолонемно-вакуолизированные ядрышки, и 2) нуклеолонемно-вакуолизированные ядрышки с центральной вакуолью, соответствующие нуклеолонемно-вакуолизированным ядрышкам в классификации 1988 Подобные определения наиболее четко отражают степень вакуолизации ядрышек.

Для упрощения изложения материала нуклеолонемные ядрышки нами были названы нуклеолонемными ядрышками I типа, нуклеолонемно-вакуолизированные нуклеолонемными ядрышками II типа и нуклеолонемно-вакуолизированные с центральной вакуолью - нуклеолонемными ядрышками III типа

В гепатоцитах при дисплазии печени с-тус-трансгенных мышей выявляются нуклеолонемные ядрышки 1 типа Такие ядрышки имеют крупные размеры (1,1-3,8 мкм), размер ядрышковых вакуолей - от 0,02 до 0,65 мкм ФЦ хорошо выражены и распределены по всему объему ядрышка (размер ФЦ составляет от 0,05 до 0,41 мкм) Нуклеолонемные ядрышки II типа (размером от 2 до 4 мкм) имеют характерное для соответствующего типа строения, диаметр ФЦ - от 0,05 до 0,4 мкм, диаметр ядрышковых вакуолей - от 0,03 до 0,47 мкм, наиболее крупные вакуоли достигают 1,17 мкм Центральная вакуоль нуклеолонемных ядрышек III типа может быть как эллипсоидной, так и шаровидной формы и достигать в ширину 2,54 мкм Анализ серийных срезов показал взаимосвязь вакуоли с околоядрышковым хроматином ФЦ (размером от 0,04 до 0,5 мкм) нуклеолонемных ядрышек III типа хорошо выражены; околоядрышковый хроматин формирует блоки различной величины

В опухолевых клетках печени с-тус-трансгенных мышей наиболее часто встречающимися ядрышками являются нуклеолонемные ядрышки I, II и III типов (рис.3). Каждый из этих типов обладает всеми выше перечисленными признаками строения Однако на данной стадии гепатоканцерогенеза происходит укрупнение размеров ядрышек 1,8-4,2 мкм в нуклеолонемных ядрышках I и II типа, 2-6 мкм в нуклеолонемных ядрышках III типа ФЦ во всех трех типах ядрышек имеют различную форму и диаметр от 0,04 до 0,55 мкм Крупные вакуоли нуклеолонемных ядрышек II типа имеют размеры от 0,55 до 0,9 мкм,

Рис. 3. Ультраструктура ядрышех в диспластических и опухолевых клетках печени c-myc-, с-myc/TGF-a- и Е217-1 -гране ген пых мышей,

а - в н опухолевых клетках с-тус-трансгслиых мышей: а - нуклеолонемное I типа, б - нуклеолонемное II типа, в нуклеолонемное Ш типа; г - в диепластичсских клетках с-gSyc/TGF-a-Tpan с генных мышеи: ретикулярное с централ !. ной иакуолью; д-ж - в опухолевых клетках с-тусШЗ£-а-трансгенных мышей: д - кОмпактно-нуклеолонемное i типа, е -комиактно-нуклеолонемное II типа, ж - компактно-нуклеолонемное fГ1 типа; з - и дис пластических клетках E2F-) -трансгенных мышеи: нуклеолонемное с признаками сегрегации; и - в опухоленых клетках E2F-1 -трансгенных мышей: сегрегированное

центральные вакуоли нуклеолонемных ядрышек Ш типа - от 1,5 до 2,7 мкм.

Наряду с этим, в некоторых случаях в нуклеолонемных ядрышках на данной стадии гепатоканцерогенеза с-шус-трансгенных мышей обнаруживаются первые признаки сегрегации. Такие ядрышки значительно уменьшены в размерах (от 0,8 до 1,5 мкм). Околоядрышковый хроматин развит хорошо, часто образует компактные зоны в виде «шапочек», которые по размеру иногда превосходят само ядрышко. ФЦ (размер 0,03-0,23 мкм) четко выделяются на срезах и сдвигаются к периферии Вакуолярный компонент значительно уменьшен, большая часть вакуолей имеет диаметр 0,1-0,15 мкм Эти признаки соответствуют характеристике сегрегированных ядрышек, но в данном типе ядрышек полной сегрегации не происходит, поэтому такие ядрышки и были названы нуклеолонемными с признаками сегрегации

В печени c-myc/TGF-a-трансгенных мышей при дисплазии паренхимы ткани обнаруживаются нуклеолонемные ядрышки 1, II и III типов, ретикулярные и ретикулярные с центральной вакуолью ядрышки (рис 3) Размер ретикулярных ядрышек не превышает 3 мкм, а размер вакуолей - 0,9 мкм. Вакуолярная система ретикулярных ядрышек в отличие от нуклеолонемных имеет высокую степень развития и обуславливает типичную для данного типа трабекулярную структуру. Околоядрышковый хроматин образует крупные блоки. ФЦ хорошо выражены и равномерно распределены по объему ядрышка (размер 0,06-0,33 мкм) Внутриядрьппковый хроматин развит незначительно Размер ретикулярных с центральной вакуолью ядрышек достигает 4,7 мкм (рис.3) ФЦ и ядрышковые вакуоли имеют схожие с ретикулярными ядрышками диаметры Отличительной особенностью является наличие центральной вакуоли (диаметром до 2,6 мкм). Некоторые авторы рассматривают термины ретикулярное и нуклеолонемное как синонимы (Hernandez-Verdun, 1986) Но мы поддерживаем тех исследователей, которые выделяют ретикулярные ядрышки как отдельный тип (Челидзе, Зацепина, 1988; Show and Jordan, 1995), в котором степень развития вакуолярного компонента выше, чем в нуклеолонемных.

В опухолевых клетках печени c-myc/TGF-a-трансгенных мышей выявляются нехарактерные для диспластических клеток типы ядрышек (рис.3) Компактно-нуклеолонемные ядрышки сочетают в себе как признаки нуклеолонемных, так и компактных ядрышек. Они отличаются крупными размерами (2,4-8,5 мкм) и высокой степенью развития гранулярного компонента Нуклеолонемная часть этих ядрышек обладает всеми признаками нуклеолонемных ядрышек; вакуолярный компонент сосредоточен только в области нуклеолонемы. Компактно-нуклеолонемные вакуолизированные ядрышки (диаметр от 4,6 до 8,6 мкм) отличаются более интенсивным развитием вакуолярной системы По аналогии с нуклеолонемно-вакуолизированными ядрышками данному типу и было дано

соответствующее название Основная часть крупных вакуолей имеет диаметр от 0,6 до 1,6 мкм Диаметр остальных вакуолей колеблется от 0,05 до 0,6 мкм, ФЦ отличаются ббльшими размерами - до 0,88 мкм Компактно-нуклеолонемные ядрышки с центральной вакуолью обладают всеми выше перечисленными признаками компактно-нуклеолонемных ядрышек и, кроме того, в области нуклеолонемы имеют одну сильно развитую ядрышковую вакуоль (1,83,35 мкм), занимающую центральное положение в ядрышке.

Присутствие выраженного гранулярного компонента в ядрышках данных подтипов, с одной стороны, и обедненность цитоплазмы органеллами белкового синтеза, с другой стороны, могут свидетельствовать о нарушении процессов транспорта прерибосомных частиц в опухолевых клетках печени c-myc/TGF-альфа-трансгенных мышей Особенностью всех типов ядрышек в опухолевых клетках печени у c-myc/TGF-a-трансгенных мышей является наличие внутриядрышкового хроматина, как правило, равномерно распределенного по объему ядрышка Компактно-нуклеолонемные ядрышки в дальнейшем мы будем называть компактно-нуклеолонемными ядрышками I типа, компактно-нуклеолонемные вакуолизированные - компактно-нуклеолонемными ядрышками П типа, компактно-нуклеолонемные с центральной вакуолью - компактно-нуклеолонемными III типа Следует особо подчеркнуть: компактно-нуклеолонемные П и III типа - это новые подтипы ядрышек.

Таким образом, соэкспрессия с-тус и TGF-a выявляет синергический эффект действия этих генов (Factor et al, 1997), который, как показывают наши данные, может приводить к образованию ядрышек компактно-нуклеолонемного типа.

Для гепатоцитов при дисплазии ткани E2F-1-трансгенных мышей характерны нуклеолонемные ядрышки I, П типов (размер от 1,3 до 2,8 мкм) и нуклеолонемные ядрышки с признаками сегрегации (рис.3). В опухолевых клетках печени Е2Р-1-трансгенных мышей обнаруживаются нуклеолонемные с признаками сегрегации и сегрегированные ядрышки (рис.3). Для сегрегированных ядрышек (диаметр от 0,6 до 1,7 мкм) характерно пространственное разделение структурных компонентов (ФЦ и гранулярного компонента). Фибриллярные центры (часто один) увеличены в размерах (до 0,84 мкм) и локализуются на периферии или в центре ядрышка Околоядрышковый хроматин образует компактные зоны, вакуоли практически отсутствуют (0,05-0,25 мкм, в единичных случаях - до 0,5 мкм)

Наличие нуклеолонемных с признаками сегрегации и сегрегированных ядрышек может свидетельствовать об уменьшении процессов белкового синтеза данных клеток Так, сегрегированные ядрышки встречается при действии ингибиторов синтеза рРНК, а также в процессе дифференцировки ряда клеток (Ченцов, Поляков, 1974; Мантейфель, Челидзе, 1986) Известно, что E2F-1 стимулирует экспрессию опухолевого супрессора ARF (Zhu et al, 1999). Возможно, что гиперэкспрессия фактора транскрипции E2F-1 в трансгенных мышах

приводит к повышенной экспрессии ARF. Выявлено, что ARF ингибирует синтез рРНК, влияя на этапы процессинга (Sugimoto et al, 2003) Непосредственное ингибирование синтеза рРНК осуществляет и белок pRb, который участвует в регуляции E2F-1 (Voit et al, 1997) Описанные выше молекулярные механизмы могут лежать в основе процессов сегрегации ядрышек в клетках E2F-1-трансгенных мышей. Однако, основываясь на данных о пролиферации, можно сделать вывод, что интенсивность процессов белкового синтеза в клетках Е2Р-1-трансгенных мышах достаточна для их деления

Преобладающим типом ядрышек как в гепатоцитах печени мышей дикого типа, так и при дисплазии печени c-myc-, c-myc/TGF-альфа- и E2F-1-трансгенных мышей являются нуклеолонемные ядрышки. Ядрышки данного типа встречаются в активно синтезирующих клетках (Челидзе, Зацепина, 1988) Преобразования в структуре, приводящие к их формированию, свидетельствуют о повышении активности синтеза рРНК. Известно, что с-тус взаимодействует с рДНК, регулирует деятельность РНК-полимеразы I и процессы созревания рРНК, индуцирует синтез ядрышковых бежов; при гиперэкспрессии c-myc способен накапливаться в ядрышке (Greasley et al, 2000; Arabi et al, 2003; Schlosser et al, 2003; Arabi et al, 2005, Grewal et al, 2005; Oskarsson, Trumpp, 2005) Следовательно, c-myc может играть важную роль в процессах регуляции биогенеза рибосом и белкового синтеза, вызывая преобразования в структурной организации ядрышка

В геноме c-myc/TGF-a-трансгенных мышей были выявлены значительные изменения в хромосомах: 1, 4, 5, 6, 7, 12, 14, 19 и X (Sargent et al, 1996, 1999). Можно предположить, что мутации могут затрагивать как район ядрышковых организаторов (12 и 19 хромосомы, Челидзе, 1985), так и области, ответственные за синтез ядрышковых регуляторных белков, а также рибосомных белков Вариабельность структурной организации ядрышек в зависимости от стадии гепатоканцерогенеза и типа трансгенных мышей указывает на то, что в каждом конкретном случае мы имеем дело с клетками, обладающими разным уровнем синтеза белков В последнее время значительное число публикаций посвящено неканоническим функциям ядрышек. Так, предполагается, что ядрышку принадлежит некоторая роль в синтезе SRP, а также в транспорте и/или деградации мРНК (Malatesta et al, 2000, Politz et al, 2002). Кроме того, в ядрышках обнаруживаются белки, имеющих временную ядрышковую локализацию (Leung et al, 2003). Вероятно, морфология ядрышек может отражать не только уровень белкового синтеза, но и иные физиологические процессы клетки

5. Морфомстрический анализ ядрышек. Морфометрический анализ диаметров ядрышек по типам трансгенных мышей. Во всех исследованных клетках было измерено 1234 диаметра ядрышек и определены средние значения максимальных диаметров ядрышек в зависимости от типа трансгенных мышей и

стадии гепатокаицерогенеза (рис 4, данные объединены независимо от

морфофункционального типа ядрышка). В гепатоцитах мышей дикого типа средняя величина

максимальных диаметров ядрышек равна 2,02 мкм Для ядрышек диспластических клеток у

c-myc-, c-myc/TGF-a- и E2F-1-трансгенных мышей значимых изменений по сравнению с

гепатоцитами мышей дикого типа не выявлено (р<0,05). Опухолевые клетки c-myc-, с-

myc/TGF-a- и E2F-1 -трансгенных мышей достоверно отличаются по данному показателю от

гепатоцитов мышей дикого типа (р<0,05) Средние значения максимальных размеров

ядрышек коррелируют с соответствующими наибольшими величинами диаметров ядрышек

Рис. 4. Средние значения максимальных диаметров и наибольшая величина диаметров ядрышек в гепатоцитах печени мышей дикого типа, в клетках печени при дисплазии и опухолевом росте c-myc-, c-myc/TGF-a-и E2F-1-трансгенных мышей.

Таким образом, гиперэкспресиия генов пролиферативного ответа может сопровождаться как увеличением, так и уменьшением размеров ядрышка Наиболее крупные ядрышки характерны для опухолевых клеток c-myc- и c-myc/TGF-альфа-трансгенных мышей, а наиболее мелкие - для диспластических и опухолевых клеток печени E2F-1-трансгенных мышей. Согласно данным литературы, увеличение размеров ядрышек отмечается в популяциях клеток, характеризующихся повышенной пролиферативной активностью клеток (Челидзе и др., 1992а, 1993, Маршак идр,1994, Deltour and de Barsy, 1985). В литературе также существует представление о том, что формирование злокачественного фенотипа сопровождается увеличением размеров ядрышек (Trere et al, 2003) Нами показано, что увеличение или уменьшение размеров ядрышек не является общим прогностическим критерием формирования и/или развития процессов, связанных с опухолевым ростом

Морфометричестй анализ диаметров ядрышек по морфофункциопальным типам ядрышек Данные по максимальным диаметрам ядрышка объединяли в пределах выявленных морфофункциональных типов ядрышек, независимо от стадии опухолевого роста и варианта трансгенного животного С ростом вакуолярного компонента в группе нуклеолонемных ядрышек отмечается достоверное увеличение средних размеров ядрышка' от 2,02 мкм в ядрышках I типа до 2,99 мкм в ядрышках П1 типа (р<0,05, рис 5). Различия в

IS орадний максимальный

диаметр Ш наибольшая валичика диаметра

шяя

ш т 1 ж ш

дикий тип o-fnyo- o-mye- c-fnyo/TGF' o-fnyo/TGF- E2F-1- E2F-1-диоплазия опухоль о- о-олухоль диоплаэия опухоль

диоплазия

s

Рис. 5. Средние значения максимальных диаметров ядрышек и наибольшая величина диаметров ядрышек разных морфофункцио-нальных типов.

НЯ1 НЯН НЯ III НЯс ся типа типа типа ПС

РЯ РЯс КНЯ1 КНЯИ КНЯ III ЦВ типа типа типа

Условные обозначения к рис.5,6 Морфофункдиональные типы ядрышек.

НЯ I типа - нуклеолонемные I типа, НЯ П типа - нуклеолонемные II типа, НЯ III типа -нуклеолонемные III типа, НЯ с ПС - нуклеолонемные с признаками сегрегации, СЯ -сегрегированные, РЯ - ретикулярные, РЯ с ЦВ - ретикулярные с центральной вакуолью, КНЯ I типа

- компактно-нуклеолонемные I типа, КНЯ II типа - компактно-нуклеолонемные II типа, КНЯ III типа

- компактно-нуклеолонемные Ш типа

размерах ядрышек могут быть связаны именно с изменениями объема вакуолярного компонента (Moreno-Diaz et al, 1980; Deltour and de Barsy, 1985, Челидзе и др., 1992a)

Уменьшение размеров по сравнению с нуклеолонемными характерно для сегрегированных и нуклеолонемных с признаками сегрегации ядрышек (р<0,05) Сегрегация ядрышек всегда сопровождается уменьшением вакуолярного и гранулярного компонентов (Челидзе, Зацепина, 1988). Компактно-нуклеолонемные ядрышки I, II и III типов отличаются наиболее крупными размерами, причиной подобного роста может быть интенсивное развитие гранулярного компонента в ядрышках данной группы. Таким образом, увеличение размеров ядрышка может быть связано с избирательным повышением объема структурных компонентов ядрышка, например, вакуолярного и/или гранулярного, а уменьшение - за счет обратного процесса, затрагивающего оба компонента.

Средние диаметры ретикулярных и ретикулярных с центральной вакуолью ядрышек не представлены в связи с небольшими выборками. Различия морфофункциональных типов ядрышек по наибольшим величинам диаметров носят в целом тот же характер, что и по средним максимальным величинам (рис 5).

Морфометрический анализ диаметров ФЦ. В разных типах ядрышек было сделано от 77 до 3307 измерений диаметров ФЦ (суммарно - 8951). Нуклеолонемные ядрышки I, II и III типов имеют достоверно одинаковые величины средних диаметров ФЦ - 0,15 мкм (р<0,05; рис 6). Более крупные ФЦ характерны для нуклеолонемных с признаками сегрегации (0,18 мкм) и сегрегированных (0,29 мкм) ядрышек (р<0,05). В ретикулярных и ретикулярных с центральной вакуолью типах ядрышек средние значения диаметров ФЦ значимо не

Рис. б. Средние значения диаметров фибриллярных центров и стандартных ядрышковых вакуолей в ядрышках разных

морфофунщиональн ых типов. Условные обозначения см. рис.5

различимы и равны 0,17 мкм (р<0,05). Относительное увеличение размеров ФЦ происходит в компакгно-нуклеолонемных ядрышках: средний диаметр ядрышек I типа равен 0,18 мкм, И типа - 0,21 мкм, а П1 типа - 0,19 мкм (р<0,05) Нами выявлено, что в группах как нуклеолонемных, так и ретикулярных с различной степенью вакуолизации ядрышки имеют схожие значения среднего диаметра ФЦ Эти данные свидетельствуют о сходном уровне функциональной активности ядрышек в пределах каждой группы.

Увеличение размеров ФЦ является показателем уменьшения функциональной активности ядрышка (Челидзе и др, 1984, Зацепина и др, 1989) При этом обнаружено, что Б2Р-1 -опосредованный гепатоканцерогенез характеризуется изменениями липидного метаболизма, в то время как на стадии дисплазии с-тус-трансгенных мышей выявлена активация генов, ответственных за белковый синтез (Сои1оиагп е1 а1, 2006) Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в опухолевых клетках печени у с-тус- и с-тусЛЧЗР-альфа-трансгенных мышей идет активная экспрессия рибосомных генов, в то время как в опухолевых клетках печени Е2Р-1-трансгенных мышей экспрессия рибосомных генов резко подавлена Состояние цитоплазмы, в частности эндоплазматического ретикулума, подтверждают результаты, полученные при изучении ядрышек.

Таким образом, гепатоканцерогенез, обусловленный гиперэкспрессией генов пролиферативного ответа, связан не только с активацией пролиферации клеток, но и с изменением метаболических процессов, сопровождающихся повышением или понижением активности органелл, участвующих в белковом синтезе

Морфометрический анализ диаметров стандартных ядрышковых вакуолей. Ядрышковые вакуоли были объединены нами в 3 группы. Первую группу составляют стандартные вакуоли они формируют вакуолярный компонент нуклеолонемных и ретикулярных ядрышек и имеют размеры, как правило, не более 0,5 мкм (в редких случаях -0,6-0,7 мкм). Ко второй группе относятся крупные вакуоли (диаметр 0,5 -1 мкм), образующие

вакуолизированную часть в таких типах ядрышек, как. нуклеолонемные II типа, компакгно-нуклеолонемные II типа и собственно вакуолизированные Часто крупные вакуоли формируют вакуолизированную часть нуклеолонемных и компактно-нуклеолонемных III типа ядрышек. Третью группу образуют центральные вакуоли - вакуоли, достигающие нескольких микронов в диаметре и занимающие центральное положение в ядрышке, наличие таких вакуолей отражается в названии морфофункционального типа ядрышка

В настоящем исследовании проводился анализ только стандартных ядрышковых вакуолей. В разных морфофункциональных типах ядрышек было сделано от 133 до 5227 измерений (суммарно- 15558) Нуклеолонемные ядрышки I и II типов, а также I и III типов имеют статистически значимые схожие величины средних диаметров ядрышковых вакуолей (р<0,05; рис.6) Нуклеолонемные с признаками сегрегации и сегрегированные ядрышки характеризуются достоверно наименьшими средними размерами стандартных вакуолей -0,12 мкм в каждом из типов ядрышек (р<0,05). В ретикулярных и ретикулярных с центральной вакуолью ядрышках стандартные вакуоли (достоверно по сравнению с другими типами) достигают максимального диаметра (р<0,05). Относительное увеличение размеров стандартных ядрышковых вакуолей выявлено в классе компактно-нуклеолонемных ядрышек (р<0,05) Полученные результаты являются еще одним доказательством сходства соответствующих морфофункциональных подклассов ядрышек.

К настоящему моменту нет однозначного ответа на вопрос о функциональной активности ядрышек, характеризующихся повышенной степенью вакуолизации (Челидзе, Туманшвили, 1979, Moreno-Diaz et al, 1980; Olszewska et al, 1984) Полученные нами результаты показывают, что вакуолизация ядрышек не связана непосредственно с транскрипционной активностью рДНК Подтверждением этому выводу являются схожие размеры ФЦ и разный объем вакуолярного компонента в нуклеолонемных ядрышках I, II и III типов Тот факт, что вакуолярный компонент развит в группе компактно-нуклеолонемных ядрышек (характеризирующихся возможным нарушением транспорта прерибосомных частиц) подвергает сомнению гипотезу Deltour и de Barsy (1985) об образовании вакуолей вследствие активного выхода синтезированного продукта из ядра. Уменьшение вакуолярного компонента в ядрышках, характеризирующихся сегрегацией компонентов, вероятно, означает, что функционально неактивные ядрышки не нуждаются в вакуолярном компоненте Основываясь на наших данных, можно предположить, что состояние вакуолярного компонента ядрышка отражает определенные этапы биогенеза рибосом, например, процессинга прерибосомальных частиц и/или их накопления их в ядрышке

Таким образом, каждый вариант трансгенных мышей на разных стадиях канцерогенеза характеризуется наличием в клетках печени не только определенного набора

морфофункциональных типов ядрышек, но и различными количественными показателями структурных компонентов этих ядрышек. Гепатоканцерогенез, обусловленный гиперэкспрессией генов пролиферативного ответа, связан не только с активацией пролиферации клеток, но и с изменением специфических процессов метаболизма

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ежегодно в мире заболевает и умирает от рака печени более миллиона человек (Колосов, Журавлев, 2002). Диагностика и лечение злокачественных опухолей печени на данный момент представляют большие трудности В дальнейшем интересно было бы определить особенности ультраструктурного строения клеток и морфофункциональные типы ядрышек в различных анатомических формах гепатоклеточной карциномы, в иных опухолях печени (включая холангиоклеточную карциному), в печени послеоперационных больных, при возникновении метастазов в печень и рецидивах Эти данные могут быть положены в основу прогностических критериев опухолевого роста и, возможно, выработке методов лечения не только для рака печени, но и для опухолей иных тканей и органов

Результаты настоящего исследования важны для понимания основ гепатоканцерогенеза. К сожалению, большинство сведений в этой области на данный момент имеют отрывочный характер Необходимо последовательное, разностороннее и комплексное исследование процессов гепатоканцерогенеза. Оптимизация техник и создание алгоритма диагностики с использованием данных о протеомике ядрышек могут быть достигнуты молекулярными и иммуногистохимическими методами.

ВЫВОДЫ

1 При дисплазии ткани и в опухолях печени с-тус-, с-тус/ТОР-а - и Е2Р-1 -трансгенных мышей трансгенных мышей обнаруживается

■ повышение уровня митотической активности и апоптотической гибели клеток, появление патологических митозов,

• ультраструктурные изменения компонентов вакуолярной системы - гранулярного эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи,

■ вариабельность структурной организации ядрышек в зависимости от стадии гепатоканцерогенеза и типа трансгенных мышей

2. С помощью морфометрического анализа установлено

■ ядрышки достигают наибольшего размера в опухолевых клетках печени у с-тус- и с-тус/ТСР-а-трансгенных мышей и наименьшего (по сравнению с гепатоцитами мышей дикого типа) - при дисплазии и опухолевом росте в печени Е2Р-1-трансгенных мышей;

■ нуклеолонемные, нуклеолонемно-вакуолизированные и нуклеолонемно-вакуолизированные с центральной вакуолью ядрышки имеют ФЦ наименьшего диаметра и развитую вакуолярную систему;

• сегрегированные ядрышки обладают наиболее крупными ФЦ и самыми мелкими стандартными вакуолями;

• ретикулярные ядрышки имеют самые крупные стандартные ядрышковые вакуоли.

3. Совокупность структурных изменений отражает разнообразие функциональных состояний ядрышек в процессе гепатоканцерогенеза, обусловленного гиперэкспрессией разных генов пролиферативного ответа

4. Различия в тонком строении ядрышек могут быть связаны как с активацией пролиферации клеток, так и с нарушениями процессов метаболизма.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гольдина ТА Признаки атипичности гепатоцитов при дисплазии печени ТОРальфа/с-юус-трансгенных мышей // X международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»' Тез.докл.- М, 2003

2. Гольдина Т.А , Сысоева В.Ю., Оншценко Г Б. Изменения состояния клеточного центра и аппарата Гольджи при дисплазии и опухолевом росте в печени TGFanwJ>a/c-myc-трансгенных мышей // Цитология. - 2003. - № 45. _ т.9. _ С.863-864.

3. Гольдина Т.А Фенотипические изменения ядрышка при дисплазии и опухолевом росте в печени мышей при гиперэкспрессии генов пролиферативного ответа VIII Всероссийская медико-биологическая конференция молодых ученых «Человек и его здоровье»: Тез.докл -С -П., 2005.

4. Т.А Гольдина, Г.Е. Онищенко Фенотипические изменения ядрышка при дисплазии опухолевом росте в печени мышей при гиперэкспрессии генов пролиферативного ответа // Цитология -2005 -№47 - т.9.-С.804-805

5 Coulouarn С, Gomez-Quiroz L.E , Lee J.-S., Kaposi-Novak P , Conner E A., Goldma T.A, Onishchenko GE, Factor V.M. and Thorgeirsson S.S. Oncogene-specific gene expression signatures at preneoplastic stage in mice define distinct mechanisms of hepatocarcinogenesis // Journal of Hepatology. - 2006 -№44 -P.1003-1011.

Подписано в печать 17.01.2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 п.л. Тираж 75 экз. Заказ № 595 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гольдина, Татьяна Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Гены-регуляторы клеточного цикла

1 1 TGF-a - Transforming Growth Factor a

1 2 c-myc

1 3 E2F

2 Модели c-myc, c-myc/TGF-a и E2F-1 -трансгенных м ышей

2 1 Модели c-myc- и c-myc/TGF-a-трансгенных мышей

2 2 Модель E2F-1-трансгенных мышей

3 Гепатоклеточная карцинома

3 1 Модели изучения гепатоклеточной карциномы 23 3 2 Гепатоклеточная карцинома Общая характеристика

3 3 Молекулярные основы рака печени

4 Ядрышко

4 1 Функции ядрышка 27 4 2 Ультраструктурная организация ядрышка

4 2 1 Фибриллярный центр 28 4 2 2 Плотный фибриллярный компонент Гранулярный компонент

4 2 3 Вакуолярный компонент

4 2 4 Ядрышковый хроматин

4 3 Связь структуры и функций ядрышка

4 4 Морфофункциональная классификация ядрышек

4 4 1 Компактные ядрышки

4 4 2 Нуклеолонемные ядрышки

4 4 3 Ретикулярные ядрышки

4 4 4 Вакуолизированные ядрышки

4 4 5 Сегрегированные ядрышки

4 4 6 Кольцевидные ядрышки

4 5 Белки ядрышка

4 6 Морфометрический метод в изучении ядрышка

4 7 Ядрышко в клетках печени

4 8 Ядрышко и опухолевый рост

4 9 Ядрышко, с-тус, Е2Р

4 9 1 Ядрышко и с-тус

4 9 2 Ядрышко и Е2¥

ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1 Объект исследования

2 Методы исследования

2 1 Световая микроскопия

Оценка митотической активности и I ибели клеток

Анализ ядрышек на светооптическом уровне

2 2 Электронная микроскопия

Реконструкция ткани

Ультраструктура ядрышек

2 3 Морфометрический анализ

2 4 Статистическая обработка данных

2 4 1 Основные правила статистической обработки данных

2 4 2 Проверка распределений на нормальность

2 4 3 Выбор критерия

ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ

1 Ультраструктурное строение клеток паренхимы печени

1 I Гепатоциты мышей дикого типа

1 2 Гепатоциты при дисшшии печени с-шус-трансгенных мышей

I 3 Опухолевые клетки печени с-тус-трансгенных мышей 59 1 4 Гепатоциты при дисплазии печени c-myc/TGF-a-трансгенных мышей

15 Опухолевые клетки печени c-myc/TGF-a-трансгенных мышей

16 Гепатоциты при дисплазии печени E2F-1-трансгенных мышей

17 Опухолевые клетки печени Е2Р-1-трансгенных мышей

2 Особенности пролиферации и гибели клеток

2 1 Митотический индекс

2 2 Метафазно-профазный индекс

2 3 Патологические митозы

2 4 Апоптотический индекс

3 Ядрышки на светооптическом уровне

3 1 Число ядрышек в ядре

3 2 Оценка содержания ядрышек, имеющих выраженные ядрышковые вакуоли

4 Ультраструктура ядрышек

4 1 Ультраструктура ядрышек в гепатоцитах мышей дикого типа 76 4 2 Ультраструктура ядрышек в гепатоцитах при дисплазии печени с-тус-трансгенных мышей 79 4 3 Ультраструктура ядрышек в опухолевых клетках печени с-тус-трансгенных мышей 79 4 4 Ультраструктура ядрышек в гепатоцитах при дисплазии печени c-myc/TGFa-трансгенных мышей

4 5 Ультраструктура ядрышек в опухолевых клетках печени с-тус/ТОР-атрансгенных мышей 81 4 6 Ультраструктура ядрышек в гепатоцитах при дисплазии печени Е2Р-1трансгенных мышей

4 7 Ультраструктура ядрышек в опухолевых клетках печени Е2Р-1 -трансгенных мышей

5 Морфометрический анализ ядрышек

5 1 Морфометрический анализ диаметров ядрышек

5 1 1 По типам трансгенных мышей

5 1 2 По морфофункциональным типам ядрышек

5 2 Морфометрический анализ диаметров фибриллярных центров

5 3 Морфометрический анализ вакуолярного компонента

ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ

1 Ультраструктурное строение клеток паренхимы печени

1 1 Вакуолярная система

1 2 Центриолярный комплекс

1 3 Промежуточные филаменты

2 Особенности пролиферации и гибели клеток

3 Ядрышки на светооптическом уровне

4 Ультраструктура ядрышек

5 Морфометрический анализ ядрышка

5 1 Морфометрический анализ диаметров ядрышек

5 1 1 По типам трансгенных мышей

5 12 По морфофункциональным типам ядрышек

5 2 Морфометрический анализ диаметров фибриллярных центров

5 3 Морфометрический анализ вакуолярного компонента

Введение Диссертация по биологии, на тему "Варианты организации ядрышек при гепатоканцерогенезе, вызванном гиперэкспрессией генов-регуляторов клеточного цикла у трансгенных мышей"

Модель трансгенных животных представляет собой один из современных инструментов для изучения размножения и дифференцировки клеток (Clarke,2000, Lee et al, 2005) Гиперэкспрессия генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, вызывает каскад изменений в тех внутриклеточных системах, которые вовлечены в сферу активности продуктов экспрессии этих генов Выявление таких изменений в тканях трансгенных животных в конечном итоге позволяет ответить на вопрос о том, как реализуется действие регуляторных систем

Модель животных, в которых трансфецированы гены пролиферативного контроля, вызывает большой интерес еще и потому, что, как правило, в различных тканях таких организмов развиваются опухоли (Factor et al, 1997, Jhappan et al, 1990, Sandgren et al, 1989, Thorgeirsson et al, 2000) Исследования, проводимые с использованием этих моделей, направлены в основном на изучение характера возникающих опухолей и биохимических изменений в тканях таких животных В большинстве этих исследований применяют методы молекулярной биологии В работах, проводимых на тканевом и клеточном уровнях, изучают строение ткани, ее клеточный состав, уровень пролиферации и гибели клеток В результате таких исследований показано, что на начальных этапах постнатального развития в печени трансгенных животных ускоряется пролиферация клеток и апоптоз, наблюдаются гиперплазия и дисплазия ткани органа В более поздний период онтогенеза в печени развиваются опухоли

Характер организации клеток, в том числе структура ядер и ядрышек, в гепатоцитах трансгенных животных до сих пор остаются неизученными В данной работе на моделях c-myc-, c-myc/TGF-a - и E2F-1-трансгенных мышей исследована структурная организация ядрышка на разных этапах формирования опухоли при гиперэкспрессии генов-регуляторов клеточного цикла Такого рода данные не только позволяют объяснить, как зависит структурно-функциональное состояние ядрышек от уровня экспрессии определенных 1енов, но и могут иметь прикладное значение, способствуя разработке морфо-функциональных критериев при диагностике опухолей

Имеющиеся в литературе статистические данные, которые характеризуют морфофункциональные типы ядрышек, немногочисленны (Челидзе и др, 1992а) Информация о количественных параметрах ядрышек в процессе гепатоканцерогенеза отсутствует В настоящем исследовании проведена количественная оценка морфологических изменений ядрышек в ¡епатоцитах мышей дикого типа и на разных стадиях гепатоканцерогенеза, обусловленного гиперэкспрессией генов-регуляторов клеточного цикла Используемые в работе различные модели трансгенных мышей позволили выявить закономерности изменений размеров ядрышек, фибриллярных центров (ФЦ) и стандартных ядрышковых вакуолей в различных морфофункциональных типах ядрышек

При гепатоканцерогенезе, вызванном гиперэкспрессией генов-регуляторов клеточного цикла, на состояние ядрышек могут влиять два фактора с одной стороны гиперэкспрессия генов пролиферативного ответа, с другой - хромосомный дисбаланс Хромосомный дисбаланс является тем фактором, который может изменять как внутреннюю организацию ядра, так и затрагивать хромосомы, которые несут ядрышковые организаторы и гены, регулирующие структурно-функциональное состояние ядрышек Ядрышко является динамичной структурой, реширующей на структурно-функциональное состояние ядра

Основная цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании морфофункционального состояния ядрышек в процессе гепатоканцерогенеза, вызванного гиперэкспрессией различных генов-регуляторов клеточного цикла Исследование проводилось на моделях гепатоканцерогенеза у с-шус-, с-шус/1 ОР-а- и Е2Р-1-трансгенных мышей

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Гольдина, Татьяна Александровна

выводы.

1 При дисплазии ткани и в опухолях печени с-шус-, с-тус/ТОР-а - и Е2Р-1-трансгенных мышей трансгенных мышей обнаруживается

• повышение уровня митотической активности и апоптотической гибели клеток, появление патологических митозов, ультраструктурные изменения компонентов вакуолярной системы гранулярного эндоплазма!ического ретикулума и аппарата Гольджи, вариабельность структурной организации ядрышек в зависимости от стадии гепатоканцерогенеза и типа трансгенных мышей

2 С помощью морфометрического анализа установлено ядрышки достигают наибольшего размера в опухолевых клетках печени у с-шус- и с-тус/ТСР-а-трансгенных мышей и наименьшего (по сравнению с гепатоцитами мышей дикого типа) - при дисплазии и опухолевом росте в печени Е2Р-1-трансгенных мышей, нуклеолонемные, нуклеолонемно-вакуолизированные и нуклеолонемно-вакуолизированные с центральной вакуолью ядрышки имеют ФЦ наименьшего диаметра и развитую вакуолярную систему,

• сегрегированные ядрышки обладают наиболее крупными ФЦ и наиболее мелкими стандартными вакуолями, ретикулярные ядрышки имеют самые крупные стандартные ядрышковые вакуоли

3 Совокупность структурных изменений отражает разнообразие функциональных состояний ядрышек в процессе гепатоканцерогенеза, обусловленного гиперэкспрессией разных генов пролиферативного ответа

4 Различия в тонком строении ядрышек могут быть связаны как с активацией пролиферации клеток, так и с нарушениями процессов метаболизма

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ежегодно в мире заболевает и умирает от рака печени более миллиона человек (Колосов, Журавлев, 2002) Диагностика и лечение злокачественных опухолей печени на данный момент представляют большие трудности Так, первичный рак печени нередко возникает на фоне цирроза и имеет сходные с ним клинические признаки (Borzio et al, 1998, Tang, 2001) Кроме того, различные авторы показывают значительную вариабельность продолжительности жизни пациентов после хирургического удаления части печени (Колосов, Журавлев, 2002) Предполагается, что это связано с отсутствием единого прогностического обоснования выбора метода операции и комбинации методов лечения Именно поэтому так важны исследования, направленные на изучение механизмов развития и особенностей гепатоканцерогенеза

В течение последних нескольких десятилетий важным прогностическим параметром опухоли принято считать митотический режим Основываясь на наших данных и результатах, полученных другими учеными (Abdel-Moneim et al, 2000, Kerr et al, 1994, Konstantmidou et al, 2002, Lipponen, 1999), можно предположить, что клеточная 1ибель, в частности, апоптоз и такая его характеристика как апоптотический индекс, могут также стать хорошим диагностическим признаком опухолевого роста С этой целью следует провести дополнительные исследования (в том числе с использованием иммуногистохимических методов) ткани не только на разных стадиях гепатоканцерогенеза, но и в различных типах опухоли Интересно было бы получить аналогичные данные о некротических изменениях в гепатокарциномах человека и других организмов, в печени после удаления новообразования, при рецидивах и метастазировании

В настоящей работе обнаружено разнообразие в ультраструктурном строении диспластических и опухолевых клеток печени c-myc-, c-myc/TGF-tx- и E2F-1-трансгенных мышей Подобные описания структурных изменений, происходящих в процессе формирования опухолей, могут быть использованы для анализа различных типов опухолей печени Данные о строении органелл вакуолярной системы, наличии/отсутствии липидных включений, строении ядрышек позволяют сделать вывод, что гиперэкспрессия генов в изучаемых моделях мышей приводит не только к опухолевому росту, но и к различным изменениям клеточного метаболизма Схожие результаты получены методами молекулярной биологии для диспластических клеток с-тус- и Е2Р-1-трансгенных мышей (Сои1оигагп е! а1, 2006) Представляется интересным определить ультраструктурные особенности строения, характеризующие различные типы опухоли печени, анатомические формы гепатоклеточной карциномы, метастатические клетки и опухолевые клетки рецидивов Преобладание определенных типов метаболических процессов может быть положено в основу прогностических критериев опухолевого роста и, возможно, выработке методов лечения не только для рака печени, но и для опухолей иных тканей и органов При этом следует учитывать такие ткане-специфичные особенности, как экспрессию генов и доминирование различных процессов метаболизма

Морфофункциональное состояние ядрышек может служить критерием преобладания определенных процессов метаболизма в зависимости от стадии и типа канцерогенеза Исследования молекулярных механизмов, сопровождающих опухолевый рост, в частности, позволят ответить на вопрос о том, чем могут быть вызваны выявляемые различия в размерах и ультраструктурном строении ядрышек Полученные результаты предоставляют возможности для дальнейшего изучения взаимосвязи строения ядрышек и различных стадий канцерогенеза в других органах и организмах Данные о структурной организации ядрышек в клетках печени при гиперэкспрессии генов-регуляторов клеточного цикла могут иметь прикладное значение и способствовать выработке морфо-функциональных критериев прогноза развития опухоли и разработке диагностических методов исследования

Нами обнаружено, что в зависимости от стадии гепатоканцерогенеза и вида экпрессируемого гена соотношение типов ядрышек отличается от характерного для гепатоцитов дикого типа Возможно, что при трансфецировании иных /енов, в том числе и генов пролиферативного ответа, могут быть выявлены схожие или иные типы ядрышек Сравнение морфофункциональных типов ядрышек, характерных для различных опухолей разнообразных вариантов трансгенных животных и опухолей человека, может способствовать пониманию основ канцерогенеза

Вызывает также интерес, каким образом модифицируются ядрышки в течение гепатоканцерогенеза человека, в том числе в процессе формирования холангиоцеллюлярной карциномы В работе высказано предположение о том, что при гепатоканцерогенезе, вызванном гиперэкспрессией генов-регуляторов клеточного цикла, на состояние ядрышек могут влиять два фактора с одной стороны гиперэкспрессия генов пролиферативного ответа, с другой - хромосомный дисбаланс В дальнейшем интересно было бы определить, какие из названных факторов вносят наибольший вклад в создание тех структурно-функциональных вариантов ядрышек, которые возникают при гепатоканцерогенезе у транс! енных мышей

В настоящей работе впервые на примере с-шус-, с-тус/ТСР-а- и Е2Р-1-трансгенных мышей в клетках печени определены названия новых подтипов ядрышек нуклеолонемные с признаками сегрегации, компактно-нуклеолонемные вакуолизированные и компактно-нуклеолонемные с центральной вакуолью Наши результаты и многочисленные данные литературы об ультраструктуре ядрышек в различных типах клеток и тканей, позволяют прийти к выводу о необходимости обновления существующей классификации ядрышек

Результаты морфометрического анализа диаметра ядрышка, фибриллярных центров и ядрышковых вакуолей могут быть использованы при классификации ядрышек в качестве дополнительных параметров Так, данные о размерах фибриллярных центров и стандартных ядрышковых вакуолей свидетельствуют о сходном уровне функциональной активности ядрышек в пределах таких групп ядрышек как нуклеолонемные и компактно-нуклеолонемные Кроме того, полученные результаты подтверждают и различия между основными морфофункциональными типами ядрышек Использование иммуногистохимических методов, возможно, позволит определить иные критерии отличий различных типов ядрышек

В работе впервые показано, что увеличение или уменьшение размеров ядрышек не является общим прогностическим критерием формирования и/или развития процессов, связанных с опухолевым ростом Это означает, что данный признак не может быть положен в основу диагностики опухоли

Кроме тою, в работе было также показано, что в опухолевых клетках с-тус/ТСР-а-трансгенных мышей формируются ядрышки компактно-нуклеолонемные ядрышки, отличающиеся интенсивным развитием гранулярного компонента Как обсуждалось ранее, подобные изменения могут быть обусловлены как интенсивным синтезом рРНК, так и нарушением процессов транспорта прерибосомных частиц В дальнейшем было бы интересным исследовать интенсивность синтеза рРНК в данных клетках и процессы экспорта через комплексы ядерных пор

Таким образом, полученные нами данные могут быть использованы как в экспериментальной, так и в медицинской онкологии Результаты настоящего исследования важны для понимания основ гепатоканцерогенеза К сожалению, большинство сведений в этой области на данный момент имеют отрывочный характер Необходимо последовательное, разностороннее и комплексное исследование процессов гепатоканцерогенеза Оптимизация техник и создание алгоритма диагностики с использованием данных о протеомике ядрышек могут быть достигнуты молекулярными и иммуногистохимическими методами

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гольдина, Татьяна Александровна, Москва

1. Алов И А «Цитофизиология и патология митоза» Москва «Медицина» 1972

2. Алов И А, Брауде А И, Асгшз М Е «Основы функциональной морфологии клетки» Москва "Медицина" 1966

3. Бродский В Я, Урываева И В «Клеточная полиплоидия, полиферация и дифференцировка» Москва, Наука, 1981

4. Васильев «Биология злокачественного роста» Москва, Наука, 1965

5. Гланц С «Медико-биологическая статистика» Москва, «Практика» 1999 459 стр

6. Дмитриев Е А «Математическая статистика в почвоведении» Москва Издательство Московского Университета 1995 320 стр

7. Епифанова О И «Лекции о клеточном цикле» Москва, 1997,144с

8. Зацепина О В, Челидзе П В , Ченцов Ю С 1989 Изменение числа и размеров фибриллярных центров при инактивации ядрышек в процессе эритропоэза Онтогенез, т 20(1) 40-44

9. Казанцева И А «Патология митоза в опухолях человека» Новосибирск, «Наука» 1981 144с

10. Колосов АЕ, Журавлев В А «Рак печени и прогноз для больных» Санкт-Петербург Киров, 2002 144с

11. Копнин 2000 Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза Ьиохшшя, т 65 (1) 5-33

12. Кудрявцев Б H Клеточные механизмы нормального и репаративного роста печени млекопитающих 1991 Автореф дис. д.б.н, Санкг-Петербург

13. Мантейфель ВМ, Челидзе ПВ 1986 Изменение тонкой организации неактивных кольцевидных ядрышек зрелых лимфоцитов крыс на ранних стадиях бласттрансформации Моч биоюгия, т20 (2) 564-572

14. Мантейфель ВМ, Челидзе ПВ, Зеленин А В 1987 Перестройки ядрышек в стимулированных к пролиферации гепатоцитах и усиление их транскрипционной функции Моч. биология, т 21 (2) 403-413

15. Маршак TJT, Делоне Г В и Урываева ИВ 1997 Особенности органищации ядрышкового аппарата в диплоидных и полиплоидных ядрах новообразованных гепатоцитов при дипиновом канцерогенезе Онтогенез, том 28 (6) 451-457

16. Маршак ТЛ, Дунгенова РЕ, Седкова НА, Бродский В Я 1994 Синтез рибосомной РНК, число и тип ядрышек в гепатоцитах крысы Циточогия, т36 (3) 252-259

17. Миронов А А , Комиссарчик Я Ю, Миронов А А, мл , Снигиревская Е С, Луини А 1998 Современные представления о структуре и функции пластинчатого комплекса Циточогия, т 40(6)483-496

18. Москвин-Тараханов МИ, Онищенко ГЕ 1978 Центриоли в мегакариоцитах костного мозга мыши Цитоюгия, т 20 (12) 1436-1438

19. Онищенко ГЕ 1989 Взаимосвязь между хромосомным и центриолярным циклами при изменении плоидности клетки Автореф дис д б н , Москва

20. Онищенко ГЕ 1993 «Центриолярный и центросомный циклы при дифференцировке и патологии» Москва, Наука

21. Онищенко Г Е 2000 Преобразования клеточного центра при дифференцировке клеток Онтогенез, т 31 (6) 445-456

22. Онищенко Г Е, Ченцов ЮС 1986 Строение центриолярного комплекса в гепатоцитах интактной и регенерирующей печени мыши Цитология, т27 (4) 403407

23. Пальцын А А , Бадикова А К , Боуманов К В , Рубецкой JJ С 1978 Электронно-авторадиографическое исследование ядер печеночных клеток при хроническом патологическом процессе Архив паточогии, т 40, выпуск 8 42-50

24. Сысоева В Ю, Онищенко Г Е 2003 Изменения строения аппарата Гольджи гепатоцитов мыши в клеточном цикле Биологические мембраны, т 20 (4) 284-296

25. Туманшвили Г Д, Челидзе П В 1983 Ультраструктура и функции кольцевидных ядрышек, фибриллярных центров и ядрышковых вакуолей Циточогия, т 25 863882

26. Урываева И В Клеточное размножение и полиплоидия печени 1987, Автореф дис д б н , Москва

27. Урываева ИВ, Делоне Г В 1992 Оценка уровня накопленных с возрастом и индуцированных генетических повреждений в клетках печени по продукции микроядер Онтогенез, т 23 (4) 370-377

28. Урываева И В , Фактор В М 1975 Фракция роста печени, ее состав по плоидности клеток и изменение при старении Онтогенез, т 6(5) 458-465

29. Урываева ИВ, Фактор ВМ 1982 Образование аберрантных полиплоидных гепатоцитов при действии алкилирующего препарата дипина и стимуляции пролиферации Цито чогия, т 24(8) 911-918

30. Фактор В М,РадаеваСА 1991 Стволовой резерв печени Онтогенез, т22 (2) 181-189

31. Челидзе ПВ 1982 Фибриллярные центры в ядрышках клеток культуры СГ1ЭВ после действия актиномицина D Циточогия, т 24(2) 137-143

32. Челидзе ПВ 1985 Ультраструктура и функции ядрышка интерфазной клетки Юшиси- «Мецниереба» 118с.

33. Челидзе ПВ 1990 Ультраструктура и трехмерная реконструкция ядрышек на разных этапах клеточной дифференцировки и опухолевого роста Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

34. Челидзе II В, Джинджолия Ш Р 1981 Фибриллярные центры и кольцевидные ядрышки в клетках различных тканей 11-суточных куриных зародышей Циточогия, т 23 №7 753-759

35. Челидзе П В , Зацепина О В 1988 Морфофункциональная классификация ядрышек Успехи современной биологии, т 105 (2) 252-268

36. Челидзе ПВ, Лариони JIK, Агладзе АГ, Джинджолия ШР 1984 Ультраструктура и поведение ядрышек и фибриллярных центров в процессе клеточной дифференцировки на примере эритробластов печени 12-суточных эмбрионов мыши Циточогия, т 26 (8) • 878 885.

37. Челидзе ПВ, Мантейфель ВМ 1989 Ультраструктура и возможная роль вакуолярного компонента ядрышек гепатоцитов Циточогия, т 31(1) 23-29

38. Челидзе П В, ПухаеваРГ, Туманишвили ГД 1988 Трехмерная организация ядрышка и ядрышкообразующих районов дифференцированных клеток I Кольцевидные ядрышки эндотелиоцитов, гладкомышечных клеток и фибробластов мыши Цитология, т 30 (2) 133-141

39. Челидзе ПВ, Туманишвили ГД 1979 Фибриллярные центры и кольцевидные ядрышки в гепатоцитах куриных зародышей Цитоюгия,т 21(2) 123-131

40. Ченцов ЮС, Поляков ВЮ 1974 Ультраструктура клеточного ядра Москва, Наука, 232 с

41. Чумаков ПМ 2000 Функция гена р53 выбор между жизнью и смертью Биохимия, т 65 (1) 34-37

42. Штейн Г И, Кудрявцева М В , Кудрявцев Б Н 1999 Изменение морфометрических параметров окрашенных серебром ядрышек гепатоцитов крыс при циррозе печени и в процессе ее реабилитации Цитоюгия, т 41 (7) 574-579

43. Abdel-Moneim I, Melamed M R, Darzynkievvicz Z , Corczyca W 2000 Proliferation and apoptosis in solid tumors Analisis by laser scanning cytometry Anal. Quant Cytol. Histol., vol 22(5) 393-397

44. Abe M and Oshima R G 1990 A single human keratin 18 gene is expressed in diverse epithelial cells of transgenic nice J. Cell Biol., vol 111 1197-1206

45. AbelevG J 1971 Alpha-phetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors Adv. Cancer Research, vol 14 295-358

46. Al-Jamal R T, Makitie T and Kivela T 2003 Nucleolar diameter and microvascular factors as independent predictors of mortality from malignant melanoma of the choroid and ciliary body Invest. Ophthalmology and Visual Science, vol 44(6) 2381-2389

47. Amundadottir LT, Nass SJ, Berchem GJ, Johnson MD, Dickson RB 1996 Cooperation of TGF-a and c-myc in mouse mammaiy tumorigenesis coordinated stimulation of growth and suppression of apoptosis Oncogene, vol 13 757-765

48. Amundadottir L T, Leder Ph 1998 Signal transduction pathways activated and required for mammaiy carcinogenesis in response to specific oncogenes Oncogene, 16,737 ± 746

49. Andersen, J S, Lam, Y W, Leung, A K L, Ong, S E, Lyon, C E , Lamond, A 1 and Mann, M 2005 Nucleolar proteome dynamics Nature, vol 433 77-78

50. Andersen, J S, Lyon C E, Fox A H, Leung A K, Lam Y W, Steen H, Mann M and Lamond A I 2002 Directed proteomic analysis of the human nucleolus Curr. Biol, vol 12 1-11

51. Anilkumar T V, Golding M , Edwards R J, Lalani E -N , Sarraf E and Alison M R 1995 The resistant hepatocyte model of carcinogenesis in the rat the apparent independent of oval cell proliferation and early nodules Carcinogenesis, vol 16(4) 845853

52. Arabi A, Rustum C , Hallberg E and Wright A P H 2003 Accumulation of c-myc and proteasomes at the nucleoli of cells containing elevated c-Myc protein levels ./ Cell Set, vol 116 1707-1717

53. Bai M, Agnantis N J, Kamina S, Demou A, Zagorianakou P, Katsaraki A and Kanavaros P 2001 In vivo cell kinetics in breast carcinogenesis Breast Cancer Res., vol 3 276-283

54. Baribault H, Price J, Miyai K , Oshima R G 1993 Mid-gestation lethality in mice lacking keratin 8 Genes and Develop., vol 7 1191-1202

55. Battey J, Moulding C, Taub R, Murphy W, Stewart T, Potter H, Lenoir G and Leder P 1983 The human c-myc oncogene structural consequences of translocation into the IgH locus in Burkitt lymphoma Cell, vol 34 779-787

56. Bertwistle D, Sugimoto M and Sherr C J 2004 Physical and functional interactions of the Arf tumor suppressor protein with nucleophosmin/B23 Mol Cell. Biol, vol 24 (3) 985-996

57. Blackwood EM, Eisenman RN 1991 Max a helix-loop-helix zipper protein that forms a sequence-specific DNA-binding complex with Myc Science, vol 251 12111217

58. Block T M, Mehta A S , Fimmel C J and Jordan R 2003 Molecular viral oncology of hepatocellular carcinoma Oncogene, vol 22 5093-5107

59. Bomsel M and Mostov K 1991 Sorting of plasma membrane proteins in epithelial cells Curr. Opin. Cell Biol., \ol 3 647-653

60. Bond VC and Wold B 1993 Nucleolar localization of myc transcripts Mol. Cell. Biol, vol 13 (6) 3221-3230

61. Bouvet P, Diaz J-J , Kmdbeiter K, Madjar J-J andAmalricF 1998 Nucleolin interacts with several nbosomal proteins through its RGG domain J. Biol Chem, vol 273 (30) 19025-19029

62. Braun K M and Sandgren E P 2000 Cellular origin of regenerating parenchyma in a mouse model of severe hepatic injury Am J. Pathology, vol 157 (2) 561-569

63. Bringman T S , Lindquist P B and Derynck R 1987 Different transforming growth factor-a species are derived from a glycosylated and palmitoylated transmembrane precursor Cell, vol 48 429-440

64. Bystrevskaya V B , Lichkun V V , Krushmsky A V and Smirnov V N 1992 Centnole modification in human aortic endothelial cells ,J Struct. Biol., vol 109 1-11

65. Calvisi D F, F<actor V M, Loi R and Thorgeirsson S S 2001 Activation of p-catenin during hepatocarcinogenesis in transgenic mouse models relationship to phenotype and tumor grade Cancer Res, vol 61 2085-2091

66. Calvisi DF, Ladu S, Conner EA, Factor VM and Thorgeirsson SS 2004a Deregulation of E-cadhenn in transgenic mouse models of liver cancer Lab Invest., vol 84 1137-1147

67. Calvisi D F , Ladu S , Hironaka K , Factor V M and Thorgeirsson S S 20046 Vitamin E down-modulates iNOS and NADPH oxidase in c-Myc/TGF-a transgenic mouse model of liver cancer ./. Hepatology, vol 41 815-822

68. Calvisi D F and Thorgeirsson S S 2005 Molecular mechanisms of hepatocarcinogenesis in transgenic mouse models of liver cancer loxicologic Pathology, vol 33 181 -184

69. Cameron R G 1989 Identification of the putative first cellular step of chemical hepatocarcinogenesis Cancer Letter, vol 49 163-167

70. Campanero M R, Arnstrong MI and Flemington E K 2000 CpG methylation as a mechanism for the regulation of E2F activity Proc. Natl Acad. Sci. USA, vol 97 (12) 6481-6486

71. Casanova L , Bravo A, Were F, Ramirez A, Jorcano J J and Vidal M 1995 Tissue-specific and efficient expression of the human simple epithelial keratin 8 gene in transgenic mice J. Cell Sci, vol 108 811-820

72. Caulin C , Ware C F, Magin T M and Oshima R G 2000 Keratin-dependent, Epithelial Resistance to Tumor Necrosis Factor-induced Apoptosis J. Cell Biol., vol 149 17-22

73. Chang J H and Olson M 0 1989 A single gene codes for two forms of rat nucleolar protein B23 mRNA ./. Biol. Chem , vol 264 11732-11737

74. Chelidze P V , Dzidzigun D V and Tumanishvili G D 1998 Increased functional load on mouse kidney proximal tubule epithelial cells causes changes in nucleolar 3-D architecture Cell I issue Res, vol 292 411-426

75. Cheutin T, O'Donohue M -F , Beorchia A, Vandelaer M, Kaplan H, Defever B , Ploton D and Thiry M 2002 Three-dimensional organization of active rRNA genes within the nucleolus J. CellSci, vol 115 3297-3307

76. Claassen G F and Hann S R 2000 A role for transcriptional repression of p21c!P1 by c-Myc in overcoming transforming growth factor ^-induced cell-cycle arrest Proc. Natl. Acad Sci USA , vol 97 (17) 9498-9503

77. Clarke A R 2000 Manipulating the germline its impact on the study of carcinogenesis Carcinogenesis, vol 21 (3) 435-441

78. Cmarko D, Verschure P J, Rothblum LI, Hernandez-Verdun D, Amalnc F, van Driel R and Fakan S 2000 Ultrastructural analysis of nucleolar transcription in calls microinjected with 5-bromo-UTP Histochem Cell Biol, vol 113 181-187

79. Cole N B and Lippincott-Schwartz J 1995 Organization of organelles and membrane traffic by microtubules Curr Opin Cell Biol., vol 7(1) 55-64

80. Colombo E, Bonetti P, Denchi L E ,Martinelli P, Zamponi R, Marine J -C , Helm K , Falini B and Pelicci PG 2005 Nucleophosmin is required for DNA integrity and pl9Arf protein stability Mol. Cell Biol., vol 25 (20) 8874-8886

81. Colombo, E, J C Marine, D Danovi, B Falini, and P G Pelicci 2002 Nucleophosmin regulates the stability and transcriptional activity of p53 Nat Cell Biol ol 4 529-533

82. Conner E A , Lemmer E R, Omori M , Wirth P J, Factor V M and Thorgeirson S S 2000 Dual functions of E2F1 in a transgenic mouse model of liver carcinogenesis Oncogene, \o\ 19 5054-5062

83. Conner E A , Lemmer E R, Sanchez A, Factor V M and Thorgeirson S S 2003 E2F1 blocks and c-Myc accelerates hepatic ploidy in transgenic mouse models Biochem. and Biophys.Res Commun , vol 302 114-120

84. Cui J , Dong B -W , Liang P, Yu X -L and Yu D -J 2004 Effect of c-myc, Ki-67, MMP-2 and VEGF expression on prognosis of hepatocellular carcinoma patients undergoing tumor resection World J Gastroenterology, vol 10(10) 1533-1536

85. Daly N, Meleady P, Walsh D and Clynes M 1998 Regulation of keratin and integrin gene expression in cancer and drug resistance Cytotechnology, vol 27 321 -344

86. Dang C V 1999 c-Myc target genes involved in cell growth, apoptosis, and metabolism Mol Cell. Biol, vol 19(1) 1-11

87. Daniely Y, Dimitrova DD and Borowiec J A 2002 Stress-dependent nucleolin mobilization mediated by p53-nucleolin complex formation Mol. Cell. Biol., vol 22 (16) 6014-6022

88. Darlington G J 1999 Molecular mechanisms of liver development and differentiation Curr.Opin Cell Biol., vol 11 678-682

89. Datta A, Nag A, Pan W, Hay N, Cartel AL, Colamonici 0, Mori Y and Raychaudhun P 2004 Myc-ARF (Alternate Reading Frame) interaction inhibits the functions of Myc J. Biol Chem., vol 279(35) 36698-36707

90. Datta A, Nag A and Raychaudhun P 2002 Differential regulation of E2F1, DPI and the E2F1/DP1 complex by ARF Mol. ('ell Biol., vol 22 924) 8398-8408

91. DeLarko JE and Todaro GJ 1978 Growth factors from murine sarcoma virus-transformed cells. Proc. Natl. Acad. Sci USA., vol 75 4001-4005

92. Deleener A , Castelain Ph, Preat V, de Gerlache J , Alexandre H and Kirsch-Volders M 1987 Changes m nucleolar transcnptional activity and nuclear DNA content during the first step of hepatocarcinogenesis Carcinogenesis, vol 8(2) 195-201

93. Deltour R and De Barsy T 1985 Nucleolar activation and vacuolation in embryo radicle cells during early germination J. Cell Set., vol 76 67-83

94. Deltour R, Mosen H, Bronchart R 1986 Three-dimensional electron microscopy of the internal nucleolus-assotiated chromatin and of the nucleolar vacuoles during early germination ofSinapis alba J. Cell Sci., vol 82 53-71

95. Denchi E L, Attwooll C, Pasim D and Helm K 2005 Deregulated E2F activity induces hyperplasia and senescence-like features in the mouse pituitary gland Mol. Cell. Biol,vol 25 (7) 2660-2672

96. Derenzini M, Ceccareli C, Santini D, Taffurelli M and Trere D 2004 The prognostic value of the AgNOR parameter in human breast cancer depends on the pRb and p53 status J Clinic Path , vo\ 57 755-761

97. Derenzini M, There D, Oliveri F, David E, Colombatto P, Bonino F and Brunetto MR 1993 Is high AgNOR quantity in hepatocytes associated with increased nsk of hepatocellular carcinoma in chronic liver diseased J. Clinic. Path., vol 46 727-729

98. Derynck R 1988 Transforming Growth Factor Alfa ('ell, vol 54 593-595

99. Derynck R , Roberts A B , Winkley M E, Chen E Y , Goedel D V 1984 Human Transforming Growth Factor Alfa precursors structure and expression in E coll Cell, vol 38 287-297

100. Dragan Y P, Hully J R, Nakamura J , Mass M J, Swenberg J A and Pitot H C 1994 Biochemical events during initiation of rat hepatocarcinogenesis Carcinogenesis, vol 15 (7) 1451-1458

101. Duensing S and Munger K 2002 Human papillomaviruses and centrosome duplication errors modeling the origins of genomic instability Oncogene, vol 21 6241-6248

102. Dyson N 1998 The regulation of E2F by Rb-family proteins Genes Dev, vol 12 2245-2262

103. Elder JT, Fisher GJ, Lindquist PB, Dennet GL, Pittekow MR, Coffey RJ, EllingsworthJr L, Derynck R, Voorhees J J 1989 Overexpression of TGF-u in prostatic epidermis Science, vol 243 811-814

104. Facchim LM and Penn LZ 1998 The molecular role of Myc in growth and transformation recent discoveries lead to new insights The FASEB J., vol 12 633-651

105. I-actor V M , Kao C -Y, Santoni-Rugiu E, Woituch J T, Jensen MR and! horgeirson S S 19976 Constitutive expression of mature transforming growth factor pi in the liver accelerates hepatocarcinogenesis in transgenic mice Cancer Res, vol 57 2089-2095

106. Factor V M , Kiss A , Woituch J T, Wirth P J, Thorgeirson S S 1998 Disruption of redox homeostasis in the Transforming Growth Factor-a/c-myc transgenic mouse model of accelerated hepatocarcinogenesis J. Biolog. Chem, vol 273 (25) 15846-15853

107. Factor V M, Laskowska D, Jensen M R , Woitach J T, Popescu N C , I horgeirson S S2000 Vitamin E reduces chromosomal damage and inhibits hepatic tumor formation in a transgenic mouse model Proc Nail Acad.Sci. USA, vol 97 (5) 2196-2201

108. Robin Fahraeus, Soma Lam, Kathryn L Ball and David P Lane 1998 Characterization of the cyclin-dependent kinase inhibitory domain of theINK4 family as a model for a synthetic tumour suppressor molecule Oncogene, 16,587 ± 596

109. Farber E and Sarma D S R 1987 Hepatocarcinogenesis a dynamic cellular perspective Lab Invest ol 56(1)4-21

110. Fausto N, Laird A D and Webber E M 1995 Role of growth factors and cytokines in hepatic regeneration IhebAShBJ ,\ ol 9 1527-1536

111. Pausto N and Mead JE 1989 Biology of disease Regulation of liver growth protooncogenes and transforming growth factors / ab. Invest., vol 60(1) 4-12

112. Fernandez P C , Frank S R, Wang L , Schroeder M, Liu S , Greene J, Cocito A , Amati B 2003 Genomic targets of the human c-Myc protein Genes Dev, vol 17(9) 1115-29

113. Fischer A H 2002 The evolution of tumor biology seeking a balance between gene expression profiling and morphology studies J. ofMolecular Diagnostics, vol 4(1) 65

114. Fisher F, Crouch DH, Jayaraman PS, Clark W, Gillespie DA, Goding CR 1993 Transcription activation by Myc and Max flanking sequences target activation to a subset of CACGTG motifs in vivo EMBOJ., vol 12(13) 5075-5082

115. Flaks B 1968 Unusual aspects of ultrastructural differentiation in rat hepatoma cells J. Cell Biol., vol 38(1) 230-238

116. Folkman J 2001 Can mosaic tumor vessels facilitate molecular diagnosis of cancel Proc Natl Acad. Sci. USA, vol 98 (2) 398-400

117. Franke W W, Denk H , Kalt R and Schmid E 1981 Biochemical and immunological identification of cytokeratin proteins present in hepatocytes of mammalian liver tissue Exp Cell Res, vol 131 299-318

118. Gartel A L , Ye X, Goufman E, Shianov P , Hay N, Najmabadi F and Tyner A L 2001 Myc represses the p2ilWAH/ulM) promoter and interacts with Spl/Sp3 Proc. Natl. Acad Sci USA,vo\ 98(8) 4510-4515

119. Gartel A L, Radhaknshnan S K 2005 Lost in Transcription p21 Repression, Mechanisms, and Consequences Cancer Res vol 65(10)

120. Gilbert S , Loranger A , Daigle N and Marceau N 2001 Simlpe epithelium keratins 8 and 18 provide resistance to Fas-mediated apoptosis The protection occurs through a receptor-targeting modulation J. Cell Biol., \ol 154(4) 763-773

121. Ginisty II, Amalnc F and Bouvet P 1998 Nucleolin functions in the first step of nbosomal RNA processing The EMBOJ, vol 17 (5) 1476-1486

122. Ginisty H , Sicard H , Roger B and Bouvet P 1999 Structure and functions of nucleolin J. Cell Sci, vol 112 761-772

123. Ginsberg D 2002 E2F1 pathways to apoptosis LEBS Letters, vol 529 122-125

124. GoepfertTM and Bnnkley B R 2000 The centrosome-associated Aurora/Ipl-like kinase family Curr. Iopics in Develop. Biol., vol 49 333-341

125. Goessens G 1976 High resolution autoradiographic studies of Ehrlich tumour cell nucleoli Nucleolar labeling after (3H) actinomycin D binding to DNA or after (3H) thimidine or (3H) undine incorporation in nucleic acids Exp Cell Res, vol 100 88-95

126. Goldman R D, Goldman A E, Green K J , Jones J C R, Jones S M and Yang H -Y 1986 Intermediate filaments network organization and possible functions of a diverse group of cytoskeletal elements J. Cell Su., vol 5 69-97

127. Gonzalez-Melendi, P, B Wells, AF Beven, and PJ Shaw 2001 Single nbosomal transcription units are linear, compacted Christmas trees in plant nucleoli Plant J., vol 27 223-233

128. Gordon G J, Coleman W B , Hixson D C , Gnsham J W 2000 Liver regeneration in rat with retrorsine-induced hepatocellular injury proceeds through a novel cellular response Am J Pathology, vol 156(2) 607-619

129. Grady WM 2004 Genomic instability and colon cancer Cancer and Metastasis Reviews, vol 23 11-27

130. Grandon C , Gomez-Roman N , Felton-Edkins Z A , Ngouenet C , Galloway D A , Eisenman R N and White R J 2005 c-myc binds to human nbosomal DNA andstimulates transcription of rRNA genes by RNA polymerase 1 Nat. Cell Bwl, vol 7 (3) 311-318

131. Greasley P J, Bonnard C and Amati B 2000 Myc induced the nucleolin and BN51 genes possible implications in nbosome biogenesis Nucl. Acids Res, vol 28 (2) 446453

132. Grewal S S , Li L, Onan A, Eisenman R N and Edgar B A 2005 Myc-dependent regulation of nbosomal RNA synthesis during Drosophila development Nat. Cell Biol., vol 7(3) 295-302

133. Habel O, Bertario 1, Andreola S , Sirizzotti G and Marian B 2002 Tissue localization of TGFa and apoptosis are inversely related in colorectal tumors Histochem. Cell Biol, vol 117 235-241

134. Hadjiolov A 1985 Nucleolus and nbosome biogenesis Wien, New York Spnnger-Verlag, 268 p

135. HalabanR 1999 Melanoma cell autonomous growth the Rb/E2F pathway Cancer and Metastasis Reviews, vol 18 333-343

136. Halper J, Jung C , Perry A, Suliman H, Hill M P and Scheithauer B 1999 Expression of TGFa in meningiomas ./. N euro-Oncology, vol 45 127-134

137. HanahanD and Weinberg R A 2000 The hallmarks of cancer Cell, vol 100 57-70

138. Hernandez-Verdun D 1986 Structural organization of the nucleolus in mammalian cells Meth Achiev.hxp Pathol, vol 12 25-37

139. Hesse M, Franz T , Tamai Y , Taketo M M and Magin T M 2000 Targeted deletion of keratins 18 and 19 leads to trophoblast fragility and early embryonic lethality J he EMBO J, vol 19(19) 5060-5070.

140. Hesse M , Magin T M and Weber K 2001 Genes for intermediate filament protein and the draft sequence of the human genome novel keratin genes and a surprisingly highnumber of pseudogenes related to keratin genes 8 and 18 J. Cell Sci, vol 114 25692575

141. Hinchcliffe EH and Sluder G 2001 "It takes two to tango" understanding how centrosome duplication is regulated throughout the cell cycle Genes and Dev, vol 15 1167-1181

142. Ho WC, Storrie B, Pepperkok R, Ansorge W, Karecla P, Kreis TE 1990 Movement of interphase Golgi apparatus in fused mammalian cells and its relationship to cytoskeletal elements and rearrangement of nuclei Eur. J.Cell Biol., vol 52 315-327

143. Huang N, Negi S, Szebeni A and Olson M 0 J 2005 Protein NPM23 interacts with the multifunctional nucleolar protein B23/nucleophosmin and inhibits ribosome biogenesis J. Biol. Chem., vol 280(7) 5496-5502

144. Huang R ,Wu T, Xu L, Liu A , Ji Y and Hu G 2002 Upstream binding factor up-regulated in hepatocellular carcinoma is related to the survival and cisplatmsensitivity of cancer cells I<ASEBJ.,\ol 16 293-301

145. Huang S 2002 Building an efficient factory where is pre-rRNA synthesized in the nucleolus? J of Cell Biology, vol 157(5) 739-741

146. Intani B M and Eisenman R N 1999 c-Myc enhances protein synthesis and cell size during B lymphocyte development Proc Natl. Acad. Set. USA, vol 96 (23) 13180— 13185

147. Jakubowski A , Ambrose C, Parr M , Lincecum J M , Wang M Z , Zheng T S , Browning B , Michaelson J S , Baestcher M, Wang B , Bissell D M and Burkly L C 2005 TWEAK induces liver progenitor cell proliferation J. Clinic. Invest, vol 115 (9) 23302340

148. Jhappan C , Stahle C , Harkins R N, Fausto N, Smith G H , Merlino G T 1990 TGF-u overexpression in transgenic mice induces liver neoplasia and abnormal development of the mammary gland and pancreas Cell, vol 61 1137-1146

149. Jiang Y 1 , Yang L H and Hu J Q 2000 Recurrence or metastasis of HCC predictors, early detection and experimental antiangiogemc therapy World./. of Gastroenterology, vol 6(1) 61-65

150. Johnson D G , Cress W D, Jakoi L and Nevins J R 1994 Oncogenic capacity of the E2F1 gene Proc. Natl Acad. Sci. USA, vol 91 12823-12827

151. Joshi H 1994 Microtubule organizing centers and y-tubulin Curr. Opin Cell Biol, vol 6 55-62

152. Juan G and Cordon-Cardo C 2001 Intranuclear compartmentalization of cyclin E during the cell cycle disruption of the nucleoplasm-nucleolar shuttling of cyclin E in Bladder cancer Cancer Res, vol 61 1220-1226

153. Izawa I, Nishizawa M, Ohtakara K, Ohtsuka K, Inada H and Inagaki M 2000 Identification of Mrj, a DnaJ/Hsp40 family protein, as a keratin 8/18 filament regulatory protein J. Biol. Chem , vol 275 (44) 34521-34527

154. Kalkuhl A, Kaestner K , Buchmann A and Schwarz M 1996 Expression of hepatocyte-ennched nuclear transcription factors in mouse liver tumors Carcinogenesis, vol 17 (3) 609-612

155. Kao C-Y, Factor V M, Thorgeirsson SS 1996 Reduced growth capacity of hepatocytes from c-myc and c-myc/TGF-transgenic mice in primary culture Biochem and Biophys Res Communic ol 222 64-70

156. Karcher R L , Deacon S W and Gelfand VI 2002 Motor-cargo interactions the key to transport specificity TRbNDSin Cell Biol, vol 12(1) 21-27

157. Karn J, Watson J V, Lowe A D, Green S M and Vedeckis W 1989 Regulation of cell cycle duration by c-myc levels Oncogene, vol 4 (6) 773-787

158. Kerkhoff E, Bister K, Klempnauer KH 1991 Sequence-specific DNA binding by Myc proteins Proc Natl AcadSu US A., vol 88(10) 4323-4327

159. Kerr, J F R , Winterford, C M, Harmon, B V 1994 Apoptosis its significance in cancer and cancer therapy Cancer, vol 73 2013-2026

160. Kim S, Li Q, Dang C V and Lee LA 2000 Induction of nbosomal genes and hepatocyte hypertrophy by adenovirus-mediated expression of c-Myc in vivo Proc. Natl. Acad. Sci. USA , vol 97 (21) 11198-11202

161. Klymkowsky MW 1995 Intermediate filaments new protein, some answers, more questions Curr. Opin Cell Biol., vol 7 45-64

162. Klymkowsky MW, Bachant JB, Domingo A 1989 Functions of Intermediate Filaments Cell motility and the Cytoskeleton, vol, 14 309-331

163. Koen H, Pugh T D, Nychka D and Goldfarb S 1983 Presence of a-fetoprotein-positive cells in hepatocellular foci and nicrocarcinomas induced by single injections of diethylnitrosamine in infant mice Cancer Res, vol 43 702-708

164. Kondoh N, Wakatsuki T, Ryo A , Hada A, Aihara T , Horiuchi S , Goseki N, Matsubara O , Takenaka K, Shuda M andYamamotoM 1999 Identification and characterizationof genes associated with human hepatocellular carcinogenesis Cancer Res, vol 59 4990-4996

165. Konstantinidou A -E , Korkolopoulou P and Patsouris E 2002 Apoptotic markers for tumor recurrence ammireview Apoptosis, vol 7 461-470

166. Kopecny V, Flecton J E , Camous S and Fulka J 1989 Nucleogenesis and the onset of transcription in the eight-cell bovine embno fine-structural autoradiographic study Mol Reprod. Develop, vol 1 79-90

167. Korgaonkar C , Hagen J , Tompkins V, Frazier A A , Allamargot C , Quelle F W and Quelle DE 2005 Nucleophosmin (B23) targets ARF to nucleoli and inhibits its function Mol. Cell. Biol., \ol 25 (4) 1258-1271

168. Knudsen KE, Booth D, Naderl S, Sever-Chroneos Z, Fnbourg AF, Hanton IC, Feramisco J R , Wang J Y and Knudsen E S 2000 RB-dependent S-phase response to DNA damage Mol. Cell Biol., vol 20 (20) 7751-7763

169. Knudsen E S,WangYJ 1997 Dual mechanisms fort he inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation Mol. Cell Biol., vol 17 (10)

170. Kramer A and Ho A D 2001 Centrosome aberrations and cancer. Onkologie, vol 24 538-544

171. Kreis T E, Allan V J , Matteom R and Ho W C 1988 Interaction of elements of the Golgi apparatus with microtubules Proioplasma, vol 145 153-159

172. Ku N -O, Gish R, Wright T L and Omary MB 2001 Keratin 8 mutations in Patients with cryptogenic liver disease N Lngl ./ Med, vol 344(21) 1580-1587

173. Ku N -O, Michie SA, Resurrección EZ, Broome RL and Omary MB 2002 Keratin binding to 14-3-3 proteins modulates keratin filaments and hepatocyte mitotic progression Prat Natl. Acad. Set. USA, vol 99 (7) 4373-4378

174. Ku N-0, Michie S A, Soetikno R M , Resurrección E Z , Broome R L and Omary MB 1998 Mutation of a major keratin phosphorylation site predisposes to hepatotoxic injury in transgenic mice ./. Cell Biol., vol 143 (7) 2023-2032

175. Ku N-0 and Omary MB 2000 Keratins turn over by ubiquitination in a phosphorylation-modulated fashion J. Cell Biol., vol 149(3) 547-552

176. Ku N -O, Znou X , Toivola D M and Omary M B 1999 1 he cytoskeleton of digestive epithelia in health and disease Am. J. Physiology, \ol 277 G1108-G1137

177. Kulesh D A and Oshima R G 1989 Complete structure of the gene for humane keratin 18 Genomics, vol 4 339-347

178. Lai Y -S , Thung S N , Gerber M A , Chen M -L and Schaffner F 1989 Expression of cytokeratins in normal and diseased livers and in primary liver carcinomas Arch. Pathol. Lab. Med, vol 113 134-138

179. Lam Y W, Tnnkle-Mulcahy L and Lamond A I 2005 The nucleolus J. Cell Sci., vol 118 1335-1337

180. Lamond A J andEamshovvW C 1998 Structure and function in the nucleus Science, vol 280(24) 547.553

181. Lee J -S , Gnsham J W and 1 horgeirsson S S 2005 Comparative functional genomics for identifying models of human cancer Carcinogenesis, vol 26(6) 1013-1020

182. Lee G-H, Merlino G, Fausto N 1992 Development of liver tumor in transforming growth factor a transgenic mice Cancer Res ,\o\ 52 5162-5170

183. LengauerC 2001 How do tumors make ends meet"? Proc. Natl Acad Sci USA, vol 98(22) 12331 I2333I

184. Leung A K L , Andersen J S , Mann M and Lamond A I 2003 Bioinformatic analysis of the nucleolus J. Biochemistry, vol 376 553-569

185. Li F, Wang Y, Zeller K 1, Potter J J , Wonsey D R , O'Donnell K A , Kim J -W, Yustein J T, Lee LA and Dang C V 2005 Myc stimulates nuclearly encoded mitochondrial genes and mitochondrial biogenesis Mol. Cell. Biol., vol 25 (14) 62256234

186. Liao J, Ku N-O and Omary MB 1997 Stress, apoptosis and mitosis induce phosphorylation of human keratin 8 at Ser-73 in tissues and cultured cells J.Biol Chem, vol 272(28) 17565-17573

187. Lingle W L , Barret S L , Negron V C , Assoro A B D, Boeneman K , Liu W, Whitehead C M, Reynolds C and Salisburi J L 2002 Centrosome amplification drives chromosomal instability in breast tumor development Proc. Natl Acad. Sci USA, vol 99(4) 1978-1983

188. Lingle WL, Lutz WH, Ingle J N, Maihle N J,Salisburi JL 1998 Centrosome hypertrophy in human breast tumors implication for genomic stability and cell polarity Proc. Natl Acad Sci USA, vol 95 2950-2955

189. Lingle WLand Salisburi J L 1999 Altered centrosome structure is associated with abnormal mitoses in human breast tumors Am. J. Pathology, vol 155(6) 1941-1951

190. Lingle W L and Salisburi J L 2000 The role of the centrosome in the development of malignant tumors Current topics in developmental biology, vol 49 313-329

191. Lipponen P 1999 Apoptosis in breast cancer relationship with other pathological parameters hndocr Relat Cancer, vol 6(1) 13-16

192. Liu B and Preisig P 1999 I GF-bl-mediated hypertrophy involves inhibiting pRB phosphorylation by blocking activation of cyclin E kinase Am J. Physiol, vol 277 F186-F194

193. Lowe S W, Cepero E and Evan G 2004 Intrinsic tumour supression Nature, vol 432 307-315

194. Lowes K N , Brennan B A , Yeoh G C and Olynyk J K 1999 Oval cell numbers in human chronic liver diseases are directly related to disease severity Am J. Pathology, vol 154 537-541

195. Luetteke N C , Michalopoulos G K , Teixido J , Gilmore R , Massaque J, Lee D C 1988 Characterization of high molecular weight Transforming Growth Factor-a produced by rat hepatocellular carcinoma cells Biochemistry, vol 27 6487-6494

196. Lundberg A S and Weinberg R A 1998 Functional inactivation of the retinoblastoma protein requires sequential modification by at least two distinct cyclin-cdk complexes Mol Cell Biol, vol 18(2) 753-761

197. MacleodK 1999 pRb and E2f-1 in mouse development and tumongenesis Curr. Opm. Genet Dev., vol 9(1) 31-39

198. Maggi Jr L B and Weber J D 2005 Nucleolar adaptation in human cancer Cancer Invest, vol 23 (7) 599-608

199. Malatesta M , Gazzanelh G, Battistelh S, Martin I' E , Amalric I' and Fakan S 2000 Nucleoli undergo structural and molecular modifications during hibernation Chromosoma,vo\ 109 506-513

200. Manchester K L 1995 Theodor Boveri and the origin of malignant tumours IRLNDS in Cell Biol., vol 5 384-387

201. Marshall WF 2001 Centriole takes center stage Current Biology, \o\ \\ R487-R496

202. Martelli F, Hamilton T, Silver D P, Sharpless N E, Barddeesy N , Rokas M , DePihno R A , Livingston D M and Grossman S R 2001 pl9ARF targets certain E2F species for degradation Proc. Natl Acad. Sci. USA, vol 98 (8) 4455-4460

203. MassagueJ 2004 G1 cell cycle control and cancer Nature, vol 432 298-306

204. Matsui Y, Halter SA, Holt JT,Hogan BLM, Coffey RJ 1990 Development of mammary hyperplasia in MMTV-TGF-a transgenic mice Cell, vol 61 1147-1155

205. Mayer C and Grummt I 2005 Cellular stress and nucleolar function Cell Cycle, vol 4-8 1036-1038

206. Mays RW, Beck KA and Nelson WJ 1994 Organization and Function of the cytoskeleton in polarized epithelial cells a component of the protein sorting machinery Curr.Opin Cell Biol., vol 6 16-24

207. Mazumder S , DuPree E L and Almasan A 2004 A dual role of cyclin E in cell proliferation and apoptosis may provide a target for cancer therapy Curr. Cancer Drug Pargets, vol 4(1) 65-75

208. Michalopoulos G K 1990 Liver regeneration molecular mechanisms of growth control. I he FASEB J, vol 4 176-187

209. MironovAA Weidman P and Luim A 1997 Variations on the intracellular transport theme maturing cisternae and trafficking tubules J. Cell Biol., vol 138(3) 481-484

210. Mirre C and Stahl A 1981 Ultrasructural organization, sites of transcription and distribution of fibrillar centres in the nucleolus of the mouse oocyte J. Cell Sci, vol 48 105-126

211. Moll U M and Petrenko O 2003 The MDM2-p53 interaction Mol. Cancer Res, vol 1 1001-1008

212. Morello D , Fitzgerald M J, Babinet C and Fausto N 1990 C-myc, c-fos and c-jun regulation in the regenerating livers of normal and H-2K/c-myc transgenic mice Mol. Cell Biol., vol 10(6) 3185-3193

213. Moreno-Diaz S de la Espina, Medina F J , Risueño MC 1980 Correlation of nucleoli activity and nucleolar vacuolation in plant cells Eur. J. Cell Biol., vol 22 724-729

214. Nagy P, Evarts R P , Marsden E, Roach J , Thorgeisson S S 1988 Cellular distribution of c-myc transcript during chemical hepatocarcinogenesis in rats Cancer Res., vol 48 5522-5527

215. Nakamoto Y, Suda T, Momoi T and Kaneko S 2004 Different procarcinogenic potentials of lymphocyte subsets in a transgenic mouse model of chronic hepatitis B Cancer Res, vol 64 3326-3333

216. Nelsen C J , Hansen L K, Rickheim D G , Chen C , Stanley M W, Krek W and Albrecht J H 2001 Induction of hepatocyte proliferation and liver hyperplasia by the targeted expression of cyclin E and skp2 Oncogene, vol 20 1825-1831

217. Nishimura Y , Ohkubo T, Furuchi Y and Umekawa H 2002 Tryptophans 286 and 288 in the C-terminal region of protein B23 1 are important for its nucleolar localization Bioíci Biotechnoi. Biochem , vol 66(10) 2239-2242

218. NovikoffPM and Yam A 1998 Stem cells and rat liver carcinogenesis contributions of confocal and electron microscopy J. Histochemistry and Cytochemistry, vol 46 (5) 613-626

219. Nowell P C 1983 Tumor progression and clonal evolution the role of genetic instability Chromosome mutation and Neoplasia 413-432

220. Nowell PC 1986 Mechanisms of tumor progression Cancer Res, vol 46 2203-2207

221. Obaya AJ, Kotenko I, Cole MD, Sedivy JM 2002 The proto-oncogene c-myc acts through the cychn-dependent kinase (Cdk) inhibitor p27 (Kipl) to facilitate the activation of Cdk4/6 and early G(l) phase progression J. Biol Chem, vol 277 (34) 31263-31269

222. Ogg S C and Lamond A I 2002 Cajal bodies and coilin moving towards function J. of Cell Biology, vol 159(1) 17-21

223. Ohgaki H, Sanderson N D, Ton P, Thorgeirsson S S 1996 Molecular analyses of liver tumors in c-myc transgenic mice and c-myc and TGF-cx double transgenic mice Cancer letters, vol 106 43-49

224. Olmedilla A, Testiilano PS, Vicente O, Delseny M and Risueño MC 1993 Ultrastructural rRNA localization in plant cell nucleoli RNA/ RNA in situ hybridization, autoradiography and cytochemistry J. Cell Sci., \o\ 106 1333-1346

225. Olson M O J 2004 Sensing cellular stress another new function for the nucleolus'' Science's STKh, vol 224 1-3

226. Olszewska MJ, Damsz B, Kuran H, Murcimak K 1984 Enhanced rRNA transport from nucleoli into cytoplasma at Gl/S, S/G2 and G2/M transitory points of the cell cycle in root menstem of Helianthus annuus I Eur. J. Cell Biol., vol 33 1-6

227. Oshima R G , Abrans L , Kulesh D 1990 Activation of an intron enhancer within the keratin 18 gene by expression of c-fos and c-jun in undiflfenntiated F9 embryonal carcinoma cells Genes and Develop, vol 4 835-848

228. Oskarsson I and I'rumpp A 2005 The Myc trilogy lord of RNA polymerases Nat. Cell Biol., vol 7(3) 215-217

229. Pankov R, Ume/awa A, Maki R, Der CJ, Hauser CA and Oshima RG 1994 Oncogene activation of human keratin 18 transcription via the Ras signal transduction pathway Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol 91 873-877

230. Papakynakou P, Tzardi M, Valatas V, Kanavaros P, Karydi E, Notas G, Xidakis C and Kouroumalis E 2002 Apoptosis and apoptosis related proteins in chronic viral liver disease Apoptosis,\o\ 1 133-141

231. Pederson T 2002 Proteomics of the nucleolus more proteins, more functions? I RENDS in Biochemical Sciences, vol 27 (3) 111-112

232. PelhamHRB 1991 Recycling of proteins between the endoplasmic reticulum and Golgi complex Curr.Opin. Cell Biol, \ol 3 585-591

233. Pendle A F, Clark G P, Boon R, Lewandowska D, Lam Y W, Andersen J, Mann M , Lamond AI, Brown J W S and Shaw P J 2005 Proteomic analysis of the Arabidobsis nucleolus suggests novel nucleolar functions Mol. Biol. Cell, vol 16 260-269

234. Persson H, Hennighausen L, Taub R , DE Grado W, Leder P 1984 Antibodies to human c-myc oncogene product evidence of an evolutionary conserved protein induced during cell proliferation Science, vol 225 687-693

235. Pierce A M , Gimenez-Conti IB , Schneider-Broussard R, Martinez L A , Conti C J and Johnson DG 1998 Increased E2F1 activity induces skin tumors in mice heterozygous and nullizygous for p53 Proc. Natl. Acad. Su. USA, vol 95 8858-8863

236. Pierce A M, Schneider-Broussard R , Gimenez-Conti I B , Russell J L, Conti C J and Johnson DG 1999 E2F1 has both oncogenic and tumor-supressive properties in a transgenic model Mol Cell Biol ,\ol 19(9) 6408-6414

237. Pierce R H , Vail M E , Ralph L , Campbell J S and Fausto N 2002 Bcl-2 expression inhibits liver carcinogenesis and delays the development of proliferation foci Am J of Pathology, vol 160(5) 1555-1560

238. Pihan G A, Purohit A , Wallace J, Knecht H, Woda B, Quesenberiy P, Doxsey S J 1998 Centrosome defect and genetic instability in malignant tumors Cancer Res, vol 58 3974-3985

239. Pistoi S and Morello D 1996 Prometheus myth revisted transgenic mice as a powerful tool to study liver regeneration I'ASEB J., vol 10 819-828

240. Politz J C, Lewandowski L B and Pederson F 2002 Signal recognition particle RNA localization within the nucleolus differs from the classical sites of ribosome synthesis ,/. Cell Biol,\ ol 159(3) 41 Ml 8

241. Pusapati R V, Rounbehler R G , Hong S K, Powers J T, Yan M , Kiguchi K, McArthur M J, Wong P K and Johnson D G 2006 ATM promotes apoptosis and suppresses tumorigenesis in response to Myc Proc Natl. Acad Sci USA, vol 103 (5) 1446-1451

242. Qian J F, Lazar-Wesley E, Breugnot C , May E 1993 Human transforming growth factor alpha sequence analysis of the 4,5-kb and 1,6-kb mRNA species Gene, vol 132 291-296

243. Qiang F X and Guo Y J 2001 Apoptosis in oncology Cell Res., vol 11 (1) 1-7

244. Qin L -X and Tang Z -Y 2002 The prognostic significance of clinical and pathological features m hepatocellular carcinoma World,}, of Gastroenterology, vol 8 (2) 193-199

245. Rajagopalan H and Lengauer C 2004 Aneuploidy and cancer Nature, vol 432 338341

246. Rios R M and Bornens M 2003 I he Golgi apparatus at the cell centre Curr. Opin Cell Biol., vol 15(1) 60-66

247. RogalskiAA and Singer S J 1984 Associations of elements of the Golgi apparatus with microtubules J. Cell Biol., vol 99 1092-1100

248. Rounbehler R J , Rogers P M , Conti C J and Johnson D G 2002 Inactivation of E2fl enhances tumongenesis in a Myc transgenic model Cancer Res, vol 11 3276-3281

249. Rothmann C, Barshack I, Kopolovic J and Malik Z 1998 Spectrally resolved morphometry of the nucleus in hepatocytes stained by histological methods Histochemical J, vol 30 539-547

250. Rubbi C P and Milner J 2003 Disruption of the nucleolus mediates stabilization of p53 in response to DNA damage and other stresses The I MBO.l., vol 22(22) 6068-6077

251. Ruifrok ACC, Weil MM, Mason KA and Thames HD 1998 Induction of Transforming Growth Factor Alpha in irradiated mouse jejunum Inter. J. Radiation Oncology Biol Rhys., vol 42(5) 1137-1146

252. Russell J L, Powers J T, Rounbehler R J , Rogers P M , Conti C J and Johnson D G 2002 ARF differentially modulates apoptosis induced by E2F1 and Myc Mol. Cell. Biol., vol 22 (5) 1360-1368

253. Saavedra H L, Wu L , de Bruin A , Timmers C , Rosol T J , Wemstein M , Robinson ML and Leone G 2002 Specificity of E2F1, E2F2 and E2P3 in mediating phenotypes induced by loss of Rb Cell Growth and Differ., vol 13 215-225

254. Sanders S and Thorgeirsson S S 1999 Phénobarbital promotes liver growth in c-myc/TGF-a transgenic mice by inducing hypertrophy and inhibiting apoptosis Carcinogenesis,\o\ 20(1) 41-49

255. Sandgren EP, Luetteke NC, Palmiter RD, Bnnster RL, Lee DC 1990 Overexpression of IGF-a in transgenic mice induction of epithelial hyperplasia, pancreatic metaplasia, and carcinoma of the breast ( 'ell, vol 61 1121-1136

256. Sandgren E P , Luetteke N C, Qiu F H , Palmiter R D, Brinster R L and Lee D C 1993 Transforming growth factor-a dramatically enhances oncogene-induced carcinogenesis in transgenic mouse pancreas and liver Mol Cell. Biol, \ ol 13 320-330

257. Sandgren E P, Quaife G J, Pinkert G A, Palmiter R D, Brinster R L 1989 Oncogene-induced liver neoplasia in transgenic mouse Oncogene, vol 4 715-724

258. Sandgren E P, Quaife C J, Paulovich A G , Palmiter R D and Brinster R L 1991 Pancreatic tumor pathogenesis reflects the causative genetic lesion Proc Natl. Acad. Sci USA, vol 88 93-97

259. Santoni-Rugiu E , Jensen M R and Thorgeirson S S 1998 disruption of the pRb/E2F pathway and inhibition of apoptosis are major oncogenic events in the liver constitutively expressing c-myc and transforming growth factor a Cancer Res., vol 58 123-134

260. Santoni-Rugui E, Nagy P, Jensen MR, Factor VM and Thorgeirsson S S 1996 Evolution of neoplastic development in the liver of transgenic mice co-expressing c-myc and Transforming Growth factor-a Am J Pathology, vol 149(2) 407-428

261. Sato N , Mizumoto K , Nakamura M , Nakamura k , Kusumoto M , Nnyama H, Ogawa T and Tanaka M 1999 Centrosome abnormalities in pancreatic ductal carcinoma Clin Cancer Res., vol 5 963-970

262. Savino T M , Gebrane-Younes J, Mey J D, Sibarita J -B and Hernandez-Verdun D 2001 Nucleolar assembly of the rRNA processing machinery in living cells J. Cell Biol.,\ ol 153 (5) 1097-1110

263. Scales S J, Peperkok R and Kreis T E 1997 Visualization of ER-to-Golgi transport in living cells reveals a sequential mode of action for COPII and COP I Cell,\ol 90 11371148

264. Schlosser I, Holzel M, Murnseer M, Burtscher H , Weidle U H and Eick D 2003 A role for c-myc in the regulation of nbosomal RNA processing Nucleic Acids Research, vol 31(21) 6148-6156

265. Shorter J and Warren G 2002 Golgi architecture and inheritance Annu Rev. Cell Dev. Biol, vol 18 379-420

266. Schuchmann M, Ruckert F, Garcia-Lazaro J F, Karg A , Burg J , Knorr N, Siebler J , Varfolomeev EE, Wallach D, Schreiber W, Lohse AW, Galle P R 2005 MORT1/FADD is involved m liver regeneration World J. Gastroenterol, vol 11(46) 7248-7253

267. Schwarze P E , Pettersen E O, Shoaib M C and Seglen P O 1984 Emergence of a population of small, diploid hepatocytes during hepatocarcinogenesis Carcinogenesis, vol 5 (10) 1267-1275

268. Schwarze P E, Saeter G, Armstrong D, Cameron R G , Laconi E , Sarma D S R, Preat V and Seglen P O 1991 Diploid growth pattern of hepatocellular tumours induced by various carcinogenic treatments Carcinogenesis,vo\ 12 (2) 325-327

269. Schreiber A B , Winkler M E , Derynck R 1986 Transforming Growth Factor a more potent angiogenic mediator that Epidermal Growth Factor Science, vol 232 1250-1253

270. Schuhmacher M , Staege M S , Pajic A , Polack A , Weidle U H , Bornkamm G W, Eick D and Kohihuber F 1999 Control of cell growth by c-Myc in the absence of cell division Current Biology, \ol 9 1255-1258

271. Seno H, Sawada M, Fukuzawa H , Monta Y , Takaishi S , Hiai H and Chiba T 2001 Enhancad Exprssion of Transforming Growth Factor (TGF) a precursor and TGF-Pi during paneth cell regeneration Digestive Disease and Sciences, vol 46(5) 1004-1010

272. Sherr C J 2000 The Pezcoller lecture cancer cell cycles revisited Cancer Res, vol 60 3689-3695

273. Show PJ and Jordan EG 1995 The nucleolus Annu. Rev. Cell Dev. Biol, vol 11 93121

274. Sinn E, Muller W, Pattengale P, Tepler 1, Wallace R, Leder P 1987 Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice synergistic action of oncogenes in vivo Cell, vol 49 465-475

275. Skoutens G G and Schroder C H 1996 C-myc is required for the Go/Gi-S transition of primary hepatocytes stimulated with a deleted form of hepatocyte growth factor Bwchem J, vol 316 879-886

276. Smetana K, Jiraskova 1, Turek P, Chan P K and Busch H 1997 A contribution to the incidence of nucleoli in normal human blood monocytes Haematologica, vol 82 138142

277. SommerviIIe J, Brumwell C L, Joan C Politz R and Pederson T 2005 Signal recognition particle assembly in relation to the function of amplified nucleoli of Xenopusoocytes J Cell Sci, vol 118 1299-1307

278. Soucie E L, Annis M G , Sedivy J, Filmus J, Leber B , Andrews D W and Penn L Z 2001 Myc potentiates apoptosis by stimulating Bax activity at the mitochondria Mol. Cell Biol,\ ol 21 (14) 4725-4736

279. Sreeramaneni R , Chaudhry A , McMahon M , Sherr Ch J, Inouel K 2005 Ras-Raf-Arf Signaling Critically Depends on the DmplTranscnption Factor Mol Cell Biol, Vol 25, No 1, 220-232

280. Stewart T A, Pattengate P K , Leder P 1984 Spontaneus mammary adenocarcinomas in transgenic mice that cany and express Ml V/c-myc fusion genes Cell, vol 38 627637

281. Sugimoto M, Kuop M-L, Roussel MF and Sherr CJ 2003 Nucleolar Arf tumor suppressor inhibits ribosomal RNA processing Molecular Cell, vol 11 415-424

282. Takagi H, Sharp R, Hammermeister C, Goodrow T, Bradley MO, Fausto N and Merlino G 1992 Molecular and genetic analysis of liver oncogenesis in transforming growth factor-a transgenic mice ( ancer lies, vol 52 5171 -5177

283. TangZ-Y 2001 Hepatocellular carcinoma-cause, treatment and metastasis World J. of Gastroenterology, vol 7(4) 445-454

284. Tang P, Steck PA and Yung WKA 1997 The autocrine loop of TGFu/EGFR and brain tumors J Neuro-Oncology,\o\ 35 303-314

285. Taub R 1996 Transcriptional control of liver regeneration ¡he bASKB./., vol 10 413-427

286. Taylor E W 1965 The mechanism of colchicines inhibition of mitosis J. Cell Biol., vol 25 145-160

287. Thiry M 1993 Ultrastructural distribution of DNA and RNA within the nucleolus of human Sertoli cells as seen by molecular lmmunocytochemistiy J Cell Sci, vol 105 3339

288. Thorgeirsson S S 2003 Hunting for tumor suppressor genes in liver cancer Hepatology, vol 37(4) 739-741

289. Thorgeirsson S S , Factor V M, Snyderwine E G 2000 Transgenic mouse models in carcinogenesis research and testing I ox Letters, vol 112-1 13 553-555

290. Ihorgeirsson SS and Gnsham JW 2002 Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma Nat. Genet, \ ol 31 339-346

291. Thorgeirsson S S, Lee J -S and Gnsham J W 2006 Functional genomics of hepatocellular carcinoma Hepatology,\ol 43 S145-S150

292. IhybergJ and Moskalewski S 1985 Microtubules and the organization of the Golgi complex Exp Cell Res ol 159 1-16

293. Toivola D M , Goldman R D, Garrod D R and Eriksson J E 1997 Protein phosphatases maintain the organization and structural interactions of hepatic keratin intermediate filaments J. Cell Su , vol 110 23-33

294. Tokuyama Y , Horn H F, Kawamura K , Tarapore P and Fukasawa K 2001 Specific phosphorylation of nucleophosmin on Thr199 by cyclm-dependent kinase 2-cyclin E and its role m centrosome duplication. J. Biol. Chem., vol 276 924) 21529-21537

295. Tsai R Y L and McKay R D G 2002 A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells Genes andDevel., vol 16 2991-3003

296. Trere D 2000 AgNOR staining and quantification Micron, vol 31 127-131

297. Trere D, Borzio M , Morabito A, Borzio F, Roncalli M and Derenzini M 2003 Nucleolar hypertrophy correlates with hepatocellular carcinoma development in cirrhosis due to HBV infection Hepatology,\ol 37(1) 72-78

298. Trere D, Ceccarelli C , Montanaro L, Tosti E and Derenzini M 2004 Nucleolar size and activity are related to pRb and p53 status in human breast cancer ./. of Histochemistry and Cytochemistry, vol 52(12) 1601-1607

299. Vail EM, Pierce RH and Fausto N 2001 Bcl-2 delays and alters carcinogenesis induced by Transforming Growth Factor a Cancer Res., vol 61 594-601

300. Valera A, Pujol A , Gregon X , Riu E , Visa J and Bosch F 1995 Evidence from transgenic mice that myc regulates hepatic glycolysis FASEBJ,\o\ 9 1067-1078

301. Voit R, Schafer K and Grummt I 1997 Mechanism of repression of RNA polymerase I transcription by the Retinoblastoma protein Mol. Cell. Biol, vol 17 (8) 4320-4237

302. Uryvaeva I V 1981 Biological significance of liver cell polyploidy a hypothesis ,/. Jheoret Biol., vol 89 557-571

303. Wang Y, Guan J, Wang H , Wang Y , Leeper D and lliakis G 2001 Regulation of DNA replication after heat shock by replication protein A-nucleolin interactions J. Biol. Chem,vo\ 276(23) 20579-20588

304. Wang H -L, Kang Y -Q, Zhang C -J, Ma Y and Wang TK 1998 Changes in nuclear ultrastructure during callus development in tissue culture of Allium sativum Biologiu Plantarum, vol 41 (1) 49-55

305. Wang H -P and Rogler C 1988 Deletions in human chromosome arms 1 lp and 13q in primary hepatocellular carcinoma Cytogenet. Cell Genet, vol 48 72-78

306. Weber J D, Kuo M -L, Bothner B , Digiammarino E L, Knwacki R W, Roussel M F and Sherr C J 2000 Cooperative signals governing ARF-Mdm2 interaction and nucleolar localization of the complex Mol. C 'ell. Biol., vol 20 (7) 2517-2528

307. Wang A , Schneider-Broussard R, Kumar A P, MacLeod M C and Johnson D G 2000 Regulation of BRCA1 expression by the Rb-E2F pathways J. Biol. Chem., vol 275 (6) 4532-4536

308. Wang D, Russell J L and Johnson D G 2000 E2F4 and E2F1 have similar proliferative properties but different apoptotic and oncogenic properties in vivo Mol. Cell Biol., vol 20(10) 3417-3424

309. Wanzel M, Herold S and Eilers M 2003 Transcriptional repression by Myc TRENDS in Cell Biol ,vo\ 13(3) 146-150

310. Weber J D , Kuo M -L, Bothner B , Digiammarino E L, Knwacki R W, Roussel M F and Sherr C J 2000 Cooperative signals governing ARF-Mdm2 interaction and nucleolar localization of the complex Mol Cell Biol ol 20(7) 2517-2528

311. Wells J, Graveel CR, Bartley SM, Madore SJ and Farnham PJ 2002 The identification of E2F1-specific target genes Vroc Nail. Acad Sci USA,\o\ 99 (6) 38903895

312. Wong S T, Winchell L F, Mc Cune B K , Earp H S, Teixido J , Massacue J, Herman B , Lee D C 1989 The TGF-a-precursor expressed on the cell surface binds to the EGF-receptor on adjacent cells, leading to signal transduction Cell, vol 56 495-506

313. Wu F, Nishioka M, Fujita J, Murota M, Ohtsuki Y and Kunyama S 2002 Expression of cytokeratin 19 in human hepatocellular carcinoma cell lines Inter. J. Oncology, vol 20(1) 31-37

314. Xu L , Hui L, Wang S, Gong J, Jin Y, Wang Y, Ji Y , Wu X , Han X and Hu G 2001 Expression profiling suggested a regulatory role of liver-enriched transcription factors in human hepatocellular carcinoma Cancer Res., vol 61 3176-3181

315. Yamasaki L 1999 Balancing proliferation and apoptosis in vivo the Golgilocks theory of E2F/DP action Biochimica et Biopphysica Acta, vol 1423 M9-M15

316. Yaswen P, Goyette M , Shank P R and Fausto N 1985 Expression of c-Ki-ras, c-IIa-ras and c-myc in specific cell types during hepatocarcinogenesis Mol. Cell Biol, vol 5 (4) 780-786

317. Yeh S -H , Chem P -J, Lai M -Y , Wang C -C and Chen D -S 1994 I requent genetic alterations at the distal region of chromosome lp in human hepatocellular carcinoma Cancer Res, vol 54 4188-4192

318. Zatsepina OV, Chelidze PV, Chentsov Yu S 1988 Changes in the number and volume of fibrillar centres with the inactivation of nucleoli at eiythropoesis J. Cell Sci, vol 91 439-448

319. Zatsepina 0 V, Rousselet A , Chan P K , Olson M 0 J , Jordan E G and Bornens M 1999 The nucleolar phosphoprotem B23 redistributes in part to the spindle poles during mitosis J. Cell Set., vol 112 455-466

320. Zeller KI, Jegga AG, Aronow BJ, O'Donnell K and Dang C V 2003 An integrated database of genes responsive to the Myc oncogenic transcription factor identification of direct genomic targets Genome Biology, vol 4 R69

321. Zhu J W, DeRyckere D, Li F X , Wan Y Y and DeGregon J 1999 A role for E2F1 m the induction of ARF, p53 and apoptosis during thymic negative selection Cell Growth and Differ, vol 10 829-838

322. Zindy F, Eischen C M, Randle D H, Cleveland J L , Sherr C J and Roussel M F 1998 Myc signaling via the ARF tumor suppressor regulates p53-dependent apoptosis and immortalization Genes and Dev, vol 12 2424-2433