Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ трансгенных мышей, свиней и рыб, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ трансгенных мышей, свиней и рыб, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Е К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УДК

Слеаингер Михаил Станиславович

ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСГЕНШХ МЫШЕЙ, СВИНЕЯ И РЫБ, СОДЕРЖАЩИХ ГЕН ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В ЧЕЛОВЕКА С 03.00.15 - генетика )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА, 1992

Работа выполнена в лаборатории гистогенеза Института биологии развития им. Е К. Кольцова Российской Академии Наук.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, академик АН. СССР а Г. Зфущэв доктор биологическихх наук Б. А. Кузин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ; доктор биологических наук А. И. Иванов доктор биологических наук Е Е Конюхов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: кафедра эмбриологии Мэсковского государственного университета им. Ы. В. Ломоносова

Защита состоится "¡0" г.

на заседании специализированного совета А 002.85"^при Институте биологии развития им. К К. Кольцова РАН по адресу: Мэсква, ул. Вавилова, д. 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ин-стктута биологии развития им. Е К. Кольцова РАН

Автореферат разослан " ^¿¿.¿¿-^ 1992 г

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Е. ы. Протопопова

:;"," "I

1'1 Актуальность проблемы. Значительные успехи, достигнутые в .1 роследние годы в области генетической трансформации соматических "•VI половых клеток животных, стали возможными благодаря развитию генно-инженерной технологии.

В значительной степени интерес к генетической трансформации половых клеток вызван тем, что в случае успеха можно ожидать изменения фенотипа на уровне целого организма и - наследоования признака, определяемого экспрессией интегрированного гена.

Применение этого метода возможно как для изучения влияния различных регуляторных элементов на уровень и тканеспецифичность экспрессии генов, их активации во время диф£еренцировки клеток, влияния различных факторов /метилирования ДНК, положения гена в хромосоме и т.д./, - так и для выяснения влияния экспрессии различных генов на организм животного. Кроме того, обнаруженная способность трансгенных животных секретировать различные кодируемые чужеродными генами белки в кровь, шло га и другие биологические жидкости навела на мысль о возможном использовании таких животных в качестве продуцентов технологически и фармакологически важных белков, синтез которых в других биологических системах невозможен или связан с огромными трудностями.

В этом смысле особый интерес представляет генетическая трансформация сельскохозяйственных животных и рыб. В большой степени возможности использования трансгенкых животных в качестве биопродуцентов определяются сочетанием регуляторных последовательностей, под влиянием которых протекает экспрессия чужеродного гена

В связи с этим выяснение возможности использования определенных нуклеотидных последовательностей в качестве факторов, регулирующих экспрессию гена поверхностного антигена вируса гепатита В человека (НВзАг) и секрецию его белкового продукта в кровь различных животных является актуальной биотехнологической задачей.

1

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение и анализ трансгенных мышей, свиней и рыб, несущих в с - ем геноме рекомбкнантнуга конструкцию, содержащую НВзА<*, а

также исследование экспрессии данного гена и секреции его белкового продукта в кровь.

В задачи исследования входило:

- Получение в качестве модели трансгенных мышей, несущих в своем геноме рекомбинантную конструкцию, содержащую ген НВзАе.

- Проверка способности этой генной конструкции экспресси-роваться и секретировать'НВэАг в кровяное русло.

- Получение трансгенных свиней и рыб, несущих ту же конструкцию, содержащую ген НВБАе, и анализ их на наличие экспрессии.

В качестве инъецируемого чужеродного генетического материала использована рекобинантная ДНК, содержащая НВБАд под контролем регуляторных элементов ыеталлотионеина. Ожидалось получить животных, экспрэссирующих НВзА£. ,Причиной выбора этой конструкции является медицинское значение, которое могут тлеть продукты экспрессии этого гена.

Получение Ш&Ае необходимо для создания чувствите льнах тест-систем для детсад;:: анти-НВэАг антител в крови пациентов, для создания эффективной вакцины против вируса гепатита В человека. Использование бактериальных и дрожжевых культур с целью получения полноценного НВвАе затруднено по причине отсутствия в бактериях и дрожзах посттрансляционной модификации НВбА£.

Научная новизна и практическая ценность работа

Данное исследование представляет собой одну из первых в стране работ, связанных с получением трансгенных сельскохозяйственных животных и рыб. В результате экспериментов были получены и проанализированы трансгенные мыли ( в качестве модели ), а так же трансгенные свиньи и карпы.

Интеграция гена НВэАг была доказана методами блот-гибридизации по Саузерну и реакции цепной полимеризации.

Экспрессия введенного генетического материиала подтверждалась иммунофермзнтными исследованиями. Высокая экспресся НВзАд , обнаруженная у трансгекных свиней и карпов позволяет использовать их в качестве продуцентов этого белка.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на двустороннем советско-германском симпозиуме по биотехнологии /Дубровицы, 1991/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Объем диссертации. Диссертация излозкэна на 84 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения и выводов и включает в себя 11 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы насчитывает 87 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Проверка рекомбингнтной конструкциям в опытах с тран-сгенньми мышами

Эффективность экспрессии гена ИВбА^ в трансгенных животных-в большой степени обеспечивается конструктивными особенностями экспрессирущего фактора и, в первую очередь, регуля-торными элементами. Созданная Г. Е Ениколоповым С лаборатория нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии АН СССР) рекомбинанткая генная конструкция (Рис. 1)включала:

1. Вд:1 II - фрагмент (координаты 1986 - 2833) по карте (баНЬэгЬ Р. еЬ а1. ,1979), содержащий участок, кодирующий зре-

лый белок НВзАе, а также область ргеБ2 белка

2. промоторную область гена МИ мыши длиной около 650 пар нуклеотидов (участок включает энхансер, собственно промотор, участок кэпирования мРНК и 5'-концевую нетранслируемую область РНК.

3. участки сплайсинга и полиаденилирования мРНК из ранней области генома вируса 5У40, влияющие на стабильность мРНК в клетках трансгенных животных.

Рис.1. Физическая карта плазмиды рКЕНСЭ »содержащей ген НВзАг.

Шследние элементы были использованы несмотря на то, что ген поверхностного антигена вируса гепатита В не содержит инт-ронов и биосинтез соответствующей мРНК происходит без сплайсинга РНК, так как в многочисленных экспериментах показано влияние сплайсинга на стабильность мРНК в клетках живот-

МТ 5У40

ных (Hairer D.H. .Leder Р. , 1979). Необходимо отметить, что этот эффект особенно выражен в организме трансгенных .тавотных.

Регуляторные элементы гена металлотионеина выбраны вследствие их изученности и эффективности в экспериментах с различными видами животных. Важным основанием для их использования является,- возможность коррекции транскрипционной активности контролируемого ими гена изменением концентрации солей тяжелых металлов в рационе животных и глюкокортикоидов в крови.

Опытам с эмбрионами свиней и рыб предшествовали инъекции .рекомбинантной конструкции в пронуклеусы яйцеклеток мышей. Это диктовалось необходимостью быстрой проверки способности продуктов трансляции созданной конструкции, содержащей ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека, секретироваться в кровяное русло. С этой целью ДНК линеализированного вектора инъецировали в пронуклеусы 320 оплодотворенных яйцеклеток мыши. Посла их трансплантации в яйцеводы мышей-реципиентов родилось 33 мышат, у четырех из которых по результатам иммунофер-ментного анализа обнаружны продукты экспрессии гена поверхностного антигена вируса гепатита В человека. В крови двух животных антиген обнаружен в количестве 4 нг/мл, у третьего - 10 нг/мд, у четвертого - 22 нг/мл. Однако, ген HBsAg, интегрированный в ДНК, выделенную из хвостов этих мышей, обнаружить не удалось.

От. мыши, содержавшей 22 нг/мл антигена в крови, получено и проанализировано потомство из 6 особей. При анализе ДНК, выде-

ЧХг.

^ I 2 3 4 5 6 7 8 9 Ю-П

3

~ «V» * » ■

4'?

- ь ^ „ с ^

Г

.х-: - '

.4"».,V." - ■

Рис. 2. Гибридвзационный анализ интеграции гена .позерхност-ного антигена вируса гепатита В человека в хромосомную ДНК трансгенной мьпли

1. ДНК плазмиды рМ5НС9, обработанная рестриктазой в количестве, соответствующем 3 копиям на геном

2. То ке, одна копия на геном

3. То же, 0,3 копии на геном

4-10. Хромосомная ДНК нетрансгенных ыьшей, обработанная рестриктазой Р5и

11. Хромосомная ДНК трансгенной шеи, обработанная рестриктазой геи

ленной из хвостоз потомства, в составе генома одной из особей обнаружена рекомбинантная конструкция, содержащая ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека (рис. 2).

Отсутствие интегрированного чужеродного гена в ДНК, выделенной из хвостов мышей, зкспрессировавших в кровяное русло НВзА^, можно объяснить тем, что эти животные являлись мозаиками, т. е. интеграция гена НЕбА^ произошла не перед первым делением дробления инъецированной яйцеклетки, а позже. Косвенным подтверждением мозаициама одной из милей может служить тот факт, что от нее было получено потомство, среди которого был обнаружен один мышонок с интегрированной в геном конструкцией, содержащей ИВбА^. Это могло произойти только в том случае, если генеративная ткань была полностью или частично трансгенной.

2. Опыты по получению трансгенных свиней.

Полученные в опытах на мьшах результаты указывали на способность белкового продукта экспрессии созданной генной конструкции к секреции в кровяное русло трансгекпого животного, что позволило перейти к экспериментальной работе со свиньями. Совокупность таких свойств как многоплодность, высокие темпы роста и хорошая биологическая изученность свиней позволила нам остановиться на них при выборе потенциального живого ферментера белка НВзА^, секретирующего его з сыворотку крови.

Исследования проводили в 1988-1989 гг на базе Всесоюзного института животноводства. Работа по получению трансгенных свиней проводилась на двух стадиях развития ранних эмбрионов:

- 8 -

1. стадия двух пронуклеусов

2. стадия двух бластомеров.

При работе с эмбрионами первой стадии мы применяли центрифугирование перед микроинъекцией для визуализации пронуклеусов.

После введения генетического материала в ранние эмбрионы свиньи и их трансплантации в организм реципиентов было получено потомство, среди которого, по данным гибридизационного анализа по Саузерну (Маниатис и соавт., 1984) и анализа экспрессии гена иммуноферментным методом (Кущ и соавт., 1987), были обнаружены трансгенные особи.

Было проинъецировано 239 эмбрионов, 219 из которых были трансплантированы в организм 9 животных-реципиентов ( 48 на одноклеточной и 171 на двухклеточной стадии). 20 эмбрионов были травмированы при микроинъекции.

5 из 64 родившихся поросят содержали последовательности введенной рекомбинантной ДНК, у 2 из них белок синтезировался в количествах, достаточных для его достоверного обнаружения в сыворотке крови.

Полученные данные суммированы в таблице 1.

Обшдя эффективность получения трансгенных сЕиней совпадает с данными Накгаг еЪ а1. 1985) и составляет около 8,77..

Кроме того, еще у 14 мшотных, у которых не было обнару-

Табл.1. Получение трансгенного потомства из зигот свиней, . . инъецированных ДНК регамбипаятной конструкции с - геном HBsAg.

N I I Показатели I Число I I 7.

1 I Инъецировано зигот I 239

. 2 I а/ Трансплантировано I 219 I 91, 6 -

I б/ из них 1-клеточных I 48 I ' 21, 9 от 2а

I в/ из них 2-клеточных I 171 I 78. 1 от 2а

: 3 I Реципиенты инъецированных I

I зигот I 12

: 4. I Из них супоросных I 10 I 83, 3 от 3 .

: 5 I Получено поросят СП I 29, 2 от 2а

6 I Обнаружна интеграция I

I гена I 5 I 7, 8 от 5

I I

. жвно интеграции в ДНК,-выделенную из ушей, была отмечена эксп- ; . рессия НВзА^. Концентрация его в сыворотке крови колебалась у ; : разных гигвотных от 3 до 125 нг/мл. :

: Подробный анализ интеграции :г экспрессии'гена НВэАг про- : : водили в различных органах одного из поросят (N 8). :

: Подробный тибридиационный анализ ДНК этого•поросенка при ; : помощи рестрикционных эндонуклеаз приведен на рис. 3. :

Рис. 3. Гибридизационный анализ интеграции гена поверхностного антигена вируса гепатита В челоовека в ДНК трансгенного поросенка N 8.

1. ДНК плазмиды рМЗНСЭ, обработанная рестриктазой в количестве, сооответствующем 3 копиям на диплоидный геном

2. То же, 0,3 копии на геном

3. Хромосомная ДНК трансгенной особи, обработанная рестриктазой Hindi II

4. То же, рестриктазой PStI

5. То же, рестриктазами HindiII и Ecol

6. То же, рестриктазами BglII и EcoRI

7. То жз, рестриктазами EcoRI и BglII

СлэЕа указаны размеры маркерных фрагмзнтов е тысяч,ах пар нуклеотидоз.

нению интенсивности гкбридизационных сигналов с интенсивностью в опыте по реконструкции, где на агарозный гель в тех же условиях наносили соответствующую плззмиду в количествах, эквивалентных содержанию трансгена в количестве 0,3 и 3 копий на геном. Данные исследования показывают, что встраивание гена в клетки животного носило, по-видимому, мозаичный характер, так как число копий трансгена может быть оценено как 0,3 - 0,5 на диплоидный геном. Очевидно также, что кодируаадя и регулятор-ные части рекомбинантной конструкции, видимо, не претерпели значительных изменений, так как: а/ гибридизационный анализ выявляет характеристические фрагменты из этой области; б/ данные иммунофзрментного анализа говорят о наличии в сыворотке крови животного белков, реагирующих с антителами к поверхностному антигену вируса гепатита Е В то кг вреет из-за мозалчности трансгена мы не можем различать между двумя возможностями: 1/ интеграцией нескольких копий гена, претерпевших перестройку во вспомогательных участках конструкции по типу "голова к хвосту" и 2/ интегрцией 1-2 копий гена, что может давать сигналы с длиной, отличающейся от предсказанной по рестрикци-онной карте конструкцкции из-за выявления на авторадиограмме областей генома свиньи, прилежащих к трансгену.

Для выявления формы существования введенных генов - интегрированных в хромосомную ДНК или в виде кольцевых минихро-мосом - анализировали трансгенную.особь.на-присутствие экзогенных последовательностей в исходной, нэ обработанной рест-риктазами, ДНК. Полог-эние сигнала совпадает с положением кле-

точной ДНК, и это дает основания пологать, что введенный генетический материал интегрирован в хромосомы сеиньи.

В экстрактах и лизатах органоЕ поросенка N8 с помощью иммуноферментной тест-системы выявлено присутствие НВзА^, однако его содержание в разных органах было неодинаковым (см. табл. 2). Высокое содержание НВБАг (100 - 200 нг/мл) было обнаружено в почках, мышцах и сердце. В клетках сердечной мышцы этот антиген был, по-видимому, прочно ассоциирован с клеточными органоидами, поскольку эффективное освобождение НВбА^ было достигнуто лишь при лизисе клеток. В легочной ткани выявлено незначительное количество НВвА^.

Табл.2. Выявление в различных органах и тканях

трансгенного поросенка N 8.

Органы и ткани I Концентрация НВзА^, I нг/мл

I экстракты 1 I I лизаты*

Почка I 200 I 0

Ыышцы I 110-1 0

Сердце I 10 I 220

Легкие I 7 I I I 0

-а Лизаты были приготовлены из разрушенных меток после экс-

тракции

Для изучения тканеспецифичности экспрессии гена прямым иммунофяуоресцентным методом анализировали гистологические срезы печени, лимфатических узлов и мышечной ткани поросенка N 8. Специфическое связывание моноклональных антител было обнаружено в цитоплазме клеток печени и лимфатических узлов.

В клетках мышечной ткани, так же, как и во всех тканях контрольных животных, свечение цитоплазмы не наблюдалось.

Гибридизационный анализ ДНК, выделенной из различных органов другого трансгенного поросенка (И 49), показал, что встраивание рекомбинантной конструкции произошло не на самых ранних этапах дробления развивающегося эмбриона, так как трансген обнаружен в регистрируемых количествах лишь в некоторых тканях. Достоверно значимое количество трансгена (0,1 копии) обнаружено в мышцах, печени, селезенке и лимфатическом узле, а в эпидермисе, семенниках и соединительной ткани гибридизационный сигнал зарегистрировать не удалось.

О гаэличестве интегрированных копий в ДНК поросенка можно судить при сравнении с интенсивностью гибридизационных сигналов в опыте по реконструкции, где на агарозный гель в идентичных условиях наносили используемую плазмиду в количестве 0,3 и 3 копии на геном (Рис. 4).

Иммуноферментный анализ сыворотки крови трансгенного поросенка N 49 обнаружил активную экспрессию интегрированного гена. Так, в возрасте 4 мес содержание антигена в сыворотке крови жиеотного составляло 10 нг/мл, в 5 мэс - 70, а к 11 мес

к I

4 •

» Г) 4 0 \

2

: 2 3 4 5 6

7 8

9 10 Ш:

Рис. 4. Гибридизационный анализ интеграции гена поверхностного антигена вируса гепатита В человека в хромосомную ДНК клеток различных тканей поросенка N 49:

1. ДНК плазмиды рМЗНС9, обработанная рестриктазой в количестве 3'копии на геном; 2. то же, 1 копия на геном; 3. то мэ, 0,3 копии на геном; 4. хромосомная ДНК печени поороосенка, обработанная рестриктазой РЭЫ; 5. то же из эпидермиса; 6. то же. из семенника; 7. то же из селезенки; 8. то же из соединитель-ноой ткани; 9. то же из слизистого эпителия; 10. то же из мышцы; 11. то же из лимфатического узла.

снизилось до 0,1 нг/мл. Это изменение, возможно, связано с половым созреванием и изменением секреции глюкокортикоидных гормонов, являющихся активаторами металлотионеинового промотора.

Результаты "ДНК/РНК гибридизации на тканевых срезах поросенка N 49 подтверждают данные ДНК/ДНК блот-гибридизации. Лишь в незначительной части клеток печени, мышц, селезенки и лимфатического узла обнаружен радиационный сигнал. Необходимо отметить, что в печени наибольшую активность сигнала регистрировали в гепатоцитах, купферовых клетках и макрофагах. Кроме того, в соединительной строме и глиссоновой капсуле встречались единичные меченые вытянутые фибробластоподобные клетки. Однако, большая часть клеток в соединительной ткани печени не содержала гибридизационного сигнала . На гистологических срезах мышцы гибридизация не была обнаружена в поперечно-полосатых мышечных волокнах, но в межмышечных волокнах встречались интенсивно меченные макрофаги. В селезенке и в лимфатическом узле гибриди-зационный сигнал также регистрировали в макрофагах. Полностью лишен меченых клеток эпидермис.

Итак, нами были получены и проанализированы трансгенные свиньи, содержащие геи поверхностногь антигена вируса гепатита В человека, показаны эффективная экспрессия этого гена и выход продукта в сыворотку крови и тем самым продемонстрирована возможность использования трансгенных сельскохозяйственных ."животных (свиней) для получения биологически активных продугггов.

Однако, при получении трансгенных свиней возникает немало трудностей, и прежде всего это касается трудоемкости этой работ}. Кроме того, несмотря на многоплодностъ свиней, их репро-

дуктивные возможности ограничены.

3. Опыты по получению трансгенных рыб.

Несколько предпочтительнее в атом отношении работа по получению трансгенных рыб.

В качестве объекта исследования наш был выбран карп. Это связано с тем, что эти рыбы разводятся в промышленных условиях, обладают большой плодовитостью и хорошей скоростью прироста биомассы, что очень вшкно при получении биопродуцентов биологически активных продуктов.

Эту работу проводили в 1989 - 1990 гг на базе Всесоюзного института прудового и рыбного хозяйства. Нами было проинъеци-ровано 200 икринок карпа. Инъекции проводили в бласгодиск до появления первой борозды дробления.

Непосредственно-во время инъекций или сразу после них погибло около 30 икринок. В ходе эмбриогенеза мы наблюдали повышенную смертность зародышей. После вылупления из икринок смертность среди личинок узхе мало отличалась от нормы. В итоге достигли взрослого состояния 64 карпа

В связи с тем, что эти карпы интересовали нас главным образом в качестве возможных продуцентов НВзА§, они были в первую очередь проверены на возможную экспрессию этого продукта в кровь. С этой целью сыворотка крови всех 64 карпов в возрасте 4 мес была проанализирована на наличие в ней белка НВзАе. У Б карпов была обнаружена экспрессия НВзА®, после чего они были проанализированы на возможную интеграцию конструкции, содержа-

. - 17 -

щей ген НВвА^, в хромосомную ДНК С этой целью анализировали суммарную хромосомную ДНК, выделенную из плавников. У 3 из 6 карпов (NN 34, 84, 75) была отмечена интеграция.

В таблице N 3 приведены результаты исследования карпов на наличие интеграции и экспрессии гена НВБАе.

Табл. 3. Экспрессия НВзА^ в трансгенньгх карпах

N рыбы I I Копийность I I Уровень экспрессии нг/мл

34 I 5 I 4

75 I 20 I 4

84 I 1 I 4

27 I I 4

23 I I 80

51 I I I 20

На рис. 5 представлен детальный анализ ДНК этих рыб после того, как она была обработана рестриктазами РБИ, ЕсоШ+РЗи, Вз-тШ. Очевидно, что рекомбинантная конструкция не претерпела заметных перестроек после вгедения в яйцеклетку.

I 2

У:Н И

I ]

? и

...» I;

Г—'Г»

и

4 5 6 7 8 9 10 II 12

'¡Це' са '.4Л ЙК:'.."-

•! ! ¡Г;

13

Ш МИГ

I' -А. /

I, :• Ш' '

£

< ■ г

V

I \

_14

I '

)

Рис. 5. Гибридизационный анализ интеграции гена НЕйАг в ДНК трансгенных карпов. Порядок нанесения образцов ДНК:

1. ДНК плазмиды рШНС9, обрабоотанная рестриктазой РЗи, в количестве, соответствующем-3 копиям на геном;

2. то ж, 1 копия на геном; 3 - 5 ДНК трансгенного карпа N 34 /3 - ДНК в количестве 10 мкг, обработанная рестриктазой геи; 4. та ив, рестриктазами ЕсоЕи и геи; 5. то же, рестриктазой ВалШ/; 6-8 тот же анализ при повторном выделении ДНК из плавников карпа N 34 /количество ДНК на каждой дороокке - 1 мкг/; 9-11 ДНК трансгенного карпа К 84, обработанная рестриктазами /9. геи; 10. ЕсоИ и геи; 11. ВалШ/ 12 - 14"ДНК трансгенного карпа N 75, обработанная рестриктазами в той не последовательности.

карпа N 75. 11а автографе все размеры фрагментов ДНК, выделенной из плавников и обработанной рестриктазами, в точности соответствовали длине аналогичных фрагментов исходной конструкции. Копии генов, по всей вероятности, соединялись в ориентации "голова к хвосту".

При анализе рестрицированной ДНК карпа N 84 выявляются характеристические фрагменты, которые, вероятно, выщепляются из внутренних районов констру]щии. Так, при обработке ДНК рес-триктазой геи на автографе детектируется только одна полоса длиной 2800 пар нуклеотидов вместо двух вычисленных по рест-рпкционной карте.

Скорее всего, произошла интеграция 1 копии трансгена, вследствие чего пограничные фрагменты конструкции удлинились за счет эндогенной ДНК.

Сложнее разобраться с рестриктами, которые образовались при обработка ДНК карпа N 34 и сгибридизировались с меченым радиоачлчЕНым зондом. Кроме фрагментов, которые можно ожидать при сохранении всей целостности введенной конструкции, на автографе видны дополнительные полосы. Существует 2 варианта объяснения этого результата: либо произошла небольшая перестройка рекоибинантной ДНК, либо копии нарушили порядок встраивания "голова к хеосту".

При долгих экспозициях во всех 3 образцах ДНК мзхно зи-леть отдельные слабые полосы, различаются по размзру, и, по-видимому, соответствующее сигналам от крайних членен ганде-мз. Этот факт и то, что нерестрицированная ДНК всех трзх рь:5 при электрофоретическоим разделении движется вместе с клеточ-

ной ДНК, позволяет с большой вероятностью предполагать, что рекомбинантная ДНК встроилась в геном рыб.

Отсутствие факта интеграции рекомбинантной конструкции в геном карпов NN 27, 23 и 51 можно объяснить тем, что эти рыбы являются мозаиками.

Мозаицизм карпа N 51 был подтвержден тем, что от него было получено потомство, среди которого встречаются трансгенные особи. Из нескольких тысяч мальков, полученных от этого карпа, наш для анализа было выборочно взято 10 штук.

ДНК, выделенная из этих мальков, была проанализирована с помощью реакции цепной полимеризации на наличие рекомбинантной конструкции. Два из этих 10 мальков оказались трансгенными. Таким образом, эффективность интеграции в нашей работе с карпами, равная примерно 5Х, может быть значительно выше за счет обнаружения мозаиков.

Анализ крови на наличие белка НВзА£ дал отрицательный результат. Этому может быть несколько объяснений. Во-первых, для активации ЫГ-промотора необходимы тяжелые металлы, а в кормах, . используемых для карпов, они отсутствуют. Во-вторых, рыб содержали в момент взятия проб крови при температуре +4 С, что. значительно сникает метаболизм. Шэтому необходим повторный анализ после введения в корм тяжелых металлов и при достаточно высокой температуре воды, в которой содержатся рыбы.

•Работы по дальнейшему анализу потомства карпа N 51 на наличие экспрессии продолжаются в настоящее врет. Кроме того, ведется также работа по получению потомства от остальных трансгенных карпов.

ВЫВОДЫ

У-

1. В качестве модели были получены 4 трансгенные мыши, несущие в своем геноме рекомбинантную конструкцию, содержащую ген НЕбА» под контролем промоторной области гена металлотионе-ина мыши и участка ' сплайсинга ' и полиаденилирования мРНК в клетках трансгенных животных.

2. Была обнаружена способность этой рекомбинантной конструкции экспрессироваться и сегрегировать НВэАе в кровеносное русло этих трансгенных мышей. В крови двух мышей антиген обнаружен в количестве 4 нг/мл, у двух других - 10 и 22 нг/мл.

3. Выли получены 5 трансгенных свиней, несущих ту же рекомбинантную конструкцию, содержащую ген НВбАе, и обнаружена экспрессия этого гена. Концентрация НВэА& в сыворотке различных животтг" ;колеблется от 3 до 125 нг/мл.

4. Выло получгно 6 трансгенных карпов, несущих е своем гено).;о ту же рекомбинантнуга конструкцию, и обнаружена экспрессия этого гена. У 4 рыб содержание НВзА% в крови было 4 нг/мл, у остальных 20 и 80 нг/мл.

5. Обнаружена способноость этой рекомбинантной конструкции сохраняться в интегрированной форме у потомков одного из трансгенных карпов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Б. А.Кузин, И. М. Васильев, М. С. Слезингер, И.Я.Шихов, А. А. Некрасов, .В. П. Семеняченко, Л. К. Эрнст. Микроманипуляции с ранниш эмбрионами свиней. - Доклады ВАСХНИЛ, 1988, N 10 с. 29-31

2. И. Ы. Васильев, Т. Е Васильева, Г. П. Георгиев, М.А.Грашук, Г. Н. Ениколопов, Б. А. Кузин, А. А. Кущ, О. Е Масадова, Т. Е Мичурина, А. А. Некрасов, Т. М. Никонова, К С. Слезингер, Н.Г. Хрущрв, И. Я. Шихое, Л. К Эрнст. Получение трансгенных свиней, содержащих и акспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека. - Доклады АН СССР, 1989, т. 306, N 1, с. 206-209.

3. Л. К Эрнст, Б. А. Кузин, Г. Н. Ениколопов, М. С. Слезингер, Г. П. Георгиев, И-ЯШихов, И. М. Васильев, М.А.Грашук, А. А. Некрасов, А. А. Кущ, О. ЕМасалова, Т. Е Васильева, Т. Е Мичурина, Н. Г. Хрущов. Перенос гена поверхностного антигена вируса гепатита В человека е зиготы свиньи и исследование тканеспецифич-кости его экспрессии. - Доклады ВАСХНЮ1, 1990, N 9, с. 45-49.

к>