Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Золова, Ольга Эдуардовна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус гепатита В (НВ V). Общая характеристика

1.1.1. Краткая история обнаружения и исследования вируса гепатита В, его таксономическое положение

1.1.2. Структура вируса гепатита В

1.1.2.1. Белки оболочки вируса гепатита В.

1.1.2.2. Главный белок оболочки вируса гепатита В малый поверхностный антиген HBsAg)

1.1.3. Организация генома вируса гепатита В

1.1.4. Особенности репродукции вируса гепатита В

1.1.5. Регуляция синтеза поверхностных белков НВ V

1.1.6. Эпидемиология вируса гепатита В

1.2. Трансгенные растения - возможные системы для производства вакцин

1.2.1. Предпосылки для использования трансгенных растений в качестве продуцентов вакцин

1.2.2. "Съедобные" вакцины и их получение в растениях

1.2.2.1. Использование химерных вирусных конструкций в создании вакцино-продуцирующих растений

1.2.2.2. Получение растений-продуцентов вакцин с использованием агробакгериальной трансформации

1.2.2.3. Экспрессия в трансгенных растениях поверхностного антигена вируса гепатита В

1.2.3. Повышение уровня экспрессии трансгенов - одна из задач генноинженерной биотехнологии растений

1.2.4. Увеличение синтеза HBsAg в трансгенных растениях -одно из требований для разработки "съедобных" вакцин против гепатита В

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы и ллазмиды

2.2. Растения

2.3. Среды

2.3.1. Микробиологические среды

2.3.2. Среды для культивирования растений

2.4. Растворы 47 2.4.1. Другие растворы и буферы

2.5 Ферменты

2.6. Другие реактивы и материалы

2.7. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК

2.8. Конструирование плазмид для трансформации растений

2.9. Введение метки в ДНК

2.10. Скрининг рекомбинантных клонов

2.11. Перенос ДНК на фильтры по Саузерну

2.12. Гибридизация на фильтрах по Саузерну

2.13. Трансформация листовых дисков табака

2.14. Выделение суммарной растительной ДНК

2.15. Определение активности неомицинфосфотрансферазы И (NPTII)

2.16. Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола

2.17. РНК-ДНК гибридизация

2.18. ПЦР-анализ трансгенных растений

2.19. Определение содержания HBs-антигена в трансгенных растениях 57 2.19.1 Подготовка пробы 5 8 2.19.2. Процедура

2.20. Фракционирование белков из экстракта растений сульфатом аммония разных степеней насыщения (5-80%)

2.21. Иммуноблоттинг 60 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg)

3.1.1. Конструирование плазмид для трансформации растений, содержащих ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты

3.1.2. Генетическая трансформация растений табака 76 3.1.3 Молекулярно-биохимический анализ растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В

3.2. Анализ HBs-антигена в трансгенных растениях табака

3.3. Анализ поколения F1 трансгенных растений табака, содержащих ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В"

В начале девяностых годов были опубликованы результаты первых экспериментов по созданию трансгенных растений, продуцирующих белки - вакцины. Гены белков, которые сами не являются инфекционными агентами, но содержат антигенные детерминанты бактерий или вирусов, переносили в растения. Такие трансгенные растения синтезировали продукты чужеродных генов наряду с собственными. Подробные исследования показали, что полученные в растениях и очищенные иммуногены после инъекции животным стимулировали образование иммуноглобулинов против соответствующих патогенов.

В 1992 г. была высказана идея создания вакцинных препаратов на основе трансгенных растений. По ряду причин, во многих странах вакцины используются не так широко, как это необходимо. Вакцинные препараты, получаемые традиционными способами, дороги и требуют хранения в холодильниках, большинство вакцин вводятся парентерально, а это не всегда удобно при массовых иммунизациях. Кроме того, при получении вакцин с использованием культур клеток животных существует вероятность загрязнения вакцинных препаратов вирусами животных (в 1961 г. обнаружили, что культура клеток почки макаки, используемая ранее для производства вакцины против вируса полиомиелита, была заражена вирусом SV40). Растения же являются безопасными системами для получения терапевтических белков, поскольку не содержат патогенных для млекопитающих вирусов. В растительных клетках есть необходимые механизмы ко- и посттрансляционных модификаций, важных для активности многих полипептидов млекопитающих. С этой точки зрения растения являются более оптимальными системами, чем бактерии (например, рекомбинантные антитела, получаемые в трансгенных растениях, не уступают по специфичности и аффинности моноклональным антителам полученным в гибридомах).

Таким образом, преимущества растений для производства гетерологичных белков (в том числе вакцин), по сравнению с другими системами (бактериальными, дрожжевыми, животными клетками и трансгенными животными), очевидны: растительную биомассу можно нарабатывать в неограниченных количествах при небольших энергетических затратах, при этом исключается вероятность контаминации вакцин патогенными вирусами животных, а так же имеются все условия для полноценного синтеза функциональных эукариотических белков. Исходя из вышесказанного, растения могут быть перспективными объектами для разработки новых безопасных технологий производства вакцин, в частности, против гепатита В.

Вирусный гепатит В - одна из широко распространенных инфекций человека, которая приводит к тяжелым последствиям, в том числе к хроническим поражениям печени, переходящим в цирроз и рак печени. В настоящее время на Земном шаре официально зарегистрировано около 400 миллионов человек, инфицированных вирусом гепатита В, однако по данным исследований Всемирной Организации Здравоохранения фактическое число носителей этого вируса около двух миллиардов. Эффективных средств лечения гепатита В пока не существует. До сих пор наилучшим способом защиты от данной болезни является вакцинация. Современные прививочные препараты против гепатита В предназначены для парентерального применения, причем требуется несколько инъекций для создания защитного уровня антител в организме привитого. Кроме того, процедура очистки их основного компонента - поверхностного антигена вируса гепатита В, сложная и дорогостоящая, что ограничивает использование таких вакцин.

В 1992 г. Мэйсоном с соавторами впервые получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген поверхностного антигена HBsAg вируса гепатита В. Было показано, что рекомбинантный белок HBsAg (HBs-антиген) подвергается необходимому гликозилированию в растениях, собирается в вирусоподобные частицы и сохраняет иммуногенные свойства. Интересны последние исследования в области получения растений, синтезирующих HBs-антиген: оказалось, что пероральное применение определенных доз таких растений совместно с однократным парентеральным введением субиммуногенной дозы коммерческой вакцины приводит к появлению высокого уровня антител против HBsAg. Эти данные открывают новые перспективы для использования растений, продуцирующих иммуногенные белки.

Цель данной работы - создание растений табака, экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. конструирование плазмид, содержащих дрожжевой ген поверхностного антигена вируса гепатита В под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S);

2. получение трансгенных растений Nicotiana tabacum, трансформированных вышеуказанными конструкциями;

3. молекулярно-биологичеекий и биохимический анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Золова, Ольга Эдуардовна

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы рекомбинантные плазмиды для трансформации растений, содержащие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.

2. Получены трансгенные растения табака, у которых показано наличие гена поверхностного антигена вируса гепатита В и синтез соответствующей мРНК.

3. Трансгенные растения синтезируют поверхностный антиген вируса гепатита В, что подтверждено иммуноферментным анализом.

4. Ген HBsAg передается поколению F1 растений и экспрессируется на том же уровне, что и у исходных трансгенных растений-регенерантов.

5. У растений, экспрессирующих ген HBsAg под одинарным 35S промотором, количество продуцируемого антигена составляет 0,0001 -0,001% от общего растворимого белка, а у растений с этим геном под двойным 35S промотором находится в пределах 0,002 - 0,05%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования последних лет показали, что растения могут быть перспективными объектами для разработки новых безопасных технологий производства вакцин. Современные методы молекулярной биологии позволяют идентифицировать иммуногенные белки патогенов, ответственные за стимулирование иммунного ответа. Гены таких белков успешно работают в растениях, при этом происходит полноценный синтез их продуктов, способных нормально функционировать (Mason a. Arntzen, 1995). Было установлено, что полученные в растениях иммуногены после инъекции животным стимулировали образование иммуноглобулинов против соответствующих патогенов (Mason et al., 1992; Arntzen, 1997; Gomez et al., 1998; Ma a. Vine, 1999; Richter a. Kipp, 1999; Tuboly et al., 1999). Проведенные эксперименты показали, что возможно использование съедобных растений с целью создания вакцин для пероральной иммунизации (Haq et al., 1995; Mason et al., 1996; Arakawa et al., 1997; Arakawa etal., 1998).

Гепатит В является острой проблемой во многих странах мира., решением которой пока остается вакцинация населения. В настоящее время против этой инфекции применяются парентеральные вакцины, которые требуют повторного введения и имеют сложную технологию изготовления, однако их высокая стоимость ограничивает возможности использования. Большое внимание уделяется созданию на основе трансгенных растений вакцин против вируса гепатита В. Получены растения табака, картофеля, салата, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В. Было показано, что рекомбинантный белок HBsAg подвергается необходимому гликозилированию в растениях, способен собираться в вирусоподобные частицы и обладает иммуногенными свойствами (Mason et al., 1992; Liu et al., 1994). При испытании полученного в растениях HBsAg на лабораторных животных, у последних обнаруживали образование соответствующих антител (Ehsani et al., 1996; Kapusta et al., 1999; Richter et al., 2000). Недавно обнаружено, что пероральное применение трансгенных растений, синтезирующих HBs-антиген, молено эффективно сочетать с парентеральным введением промышленной вакцины против гепатита В (Richter et al., 2000; Kong, 2001). Однако, коммерческих "растительных" вакцин против гепатита В пока не существует.

Результаты данной работы показали возможность экспрессии в растениях табака гена поверхностного антигена вируса гепатита В, адаптированного для дрожжевой продуцирующей системы. Были получены две конструкции для трансформации растений, содержащие ген поверхностного антигена в одном случае под одинарным промотором вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S (pGAHB), в другом - под двойным промотором CaMV 35S (pSSHB). В результате агробактериальной трансформации данными конструкциями получены две группы растений. Проведен их молекулярно-биологический и биохимический анализ. Подтверждены наличие и транскрипция гена HBsAg в трансгенных растениях. Определено количество продукта гена HBsAg в растительных экстрактах. Было показано, что в растениях, содержащих ген HBsAg под двойным промотором CaMV 35S синтезируется по крайней мере в десять раз больше HBs-антигена, чем при использовании одинарного промотора 35S. В некоторых линиях растений, содержащих ген HBsAg под контролем двойного промотора, количество HBs-антигена составляло до 0,02% от общего растворимого белка листьев. Обнаружено, что содержание антигена существенно не менялось в листьях различных ярусов растений. Было предпринято фракционирование белков из растительного экстракта, которое показало, что 86,5 % всего HBs-антигена, находящегося в эстракте, осаждается сульфатом аммония при степени насыщения 40%. Эти данные

95 возможно использовать в дальнейшей работе по очистке HBsAg из растений.

Из семян растений, содержащих ген HBsAg под двойным промотором 35S, вследствие самоопыления были получены растения поколения F1. Показано, что ген HBsAg передается по наследству и экспрессируется в количестве 0,002 - 0,05% от суммарного растворимого белка. Этот уровень экспрессии гена HBsAg достаточен для проведения исследований по выделению и очистке HBs-антигена из растительной ткани, и для анализа его иммуногенных свойств. Конструкция для генетической трансформации растений pSSHB, полученная в данной работе, в дальнейшем может быть использована для работы с культурными растениями с целью создания продуцентов вакцины против вируса гепатита В.

96

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Золова, Ольга Эдуардовна, Пущино

1. Балаян М.С., Михайлов М.И. Вирусные гепатиты. Энциклопедический словарь. М.: Амипресс, 1999. http://www.hepatitMo.rii/dict/Hbs.htm

2. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Фрейдлин И.С. и др. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицина, 1994. 528 с.

3. Глазко В.И., Доманский Н.Н., Созинов А.А. Современные направления использования ДНК-технологий // Цитология и генетика. 1998. Т. 32. № 5. С. 80-93.

4. Гриненко Л.Е., Алексеева М.Н., Тимченко А.В. и др. Изучение вирусных гепатитов на территории республики Саха (Якутия) // Актуальные вопросы клинической медицины в условиях Севера. Якутск. 1994. С. 99-105.

5. Друца В.Л., Буданов М.В., Борисова В.Н., Яковлева И.М. Патент РФ № 2088664, 1997.

6. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А. и др. Нестабильность экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 446-452.

7. Левенко Б.А. Биотехнология растений: сегодня и завтра // Физиология и биохимия культурных растений. 1999. Т. 31. С. 163-172.

8. Лернер Р.А. Синтетические вакцины // В мире науки. 1983. № 4. С. 4-13.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480с.

10. П.Михайлов В.В., Ручко В.М., Махлай А.А. Трансгенные растения в вакцинологии // Вопросы вирусологии. 2001. Т. 46. № 1. С. 4-8.

11. Романов Г.А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности // Физиология растений. 2000. Т. 47. №.3. С. 343-353.

12. Учайкин В.Ф., Конев В.А., Каганов Б.С. и др. Иммуноферментный анализ при вирусных гепатитах у детей // Эпидемиол. и инфекцион. болезни. 1996. № 1. С. 44-49.

13. Adjamian F. The hepatitis В virus: general description, physical structure, genetic organization, gene transcripts and genomic regulatory elements // Биополимеры и клетка. 1999. Т. 15. № 2. С. 109-121.

14. Agraz A., Duarte С.А., Costa L., Fontirrochi G. hrnnunoaffinity purification of recombinant hepatitis В surface antigen from yeast using a monoclonal antibody // J. Chromatogr. A. 1994. V. 672. P. 25-33.

15. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors // Plant molecular biology manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. A3. P. 1-19.

16. An G., Watson B.D., Chiang C.C. Transformation of tobacco, potato and Arabidobsis thaliana using a binary Ti vector system // Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 301-305.

17. Arakawa Т., Chong D.K.X., Lawrence M., Langridge W.H.R. Expression of cholera toxin В subunit oligomers in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 403-413.

18. Arakawa Т., Chong D.K.X., Langridge W.H.R. Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin В subunit vaccine // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 292-297.

19. Arakawa Т., Yu J., Chong D.K.X., Hough J., Engen P.C., Langridge W.H.R. A plant-based cholera toxin В subunit-insulin fusion protein protects against the development of autoimmune diabetes // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 934-938.

20. Arntzen C.J. Edible vaccines I I Public. Health. Rep. 1997. V. 112. P. 190 -197.

21. Bancroft W.H., Mundon F.K., Russel P.K. Detection of additional antigenic determinants of hepatitis В antigen // J. Immunol. 1972. V. 109. P. 842-848.

22. Bartenschlager R., Schaller H. The ammo-terminal domain of the hepadnaviral P-gene encodes the terminal protein (genome-linked protein) believed to prime reverse transcription // EMBO J. 1988. V. 7. P. 4185-4192.

23. Bayer M.E., Blumberg B.S., Werner B. Particles associated with Australia antigen in the sera of patients with leukemia, Down s syndrome and hepatitis //Nature. 1968. V. 218. P. 1057-1059.

24. Beasley R.P., Hwang L.Y., Lin C.C., Chien C.S. Hepatocellular carcinoma and hepatitis В virus: a prospective study of 22707 men in Taiwan // Lancet. 1981. V. 2. P. 1129-1133

25. Becker D. Binary vectors which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 203.

26. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513.

27. Blumberg B.S., Gerstley B.S.J., Hungerford D.A., London W.T., Sutnik A.J. A serum antigen (Australlia antigen) in Downs syndrome, leukemia and hepatitis// Annals of Internal Medicine. 1967. V. 66. P. 924-931.

28. Bosch V., Bartenschlager R., Radziwill G., Schaller H. The Duck hepatitis В virus P-gene codes for protein strongly assosiated with the 5'-end of the viral DNA minus strand // Virology. 1988. V. 166. P. 475-485.

29. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

30. Brechot C., Pourcel C., Louise A, et al. Presence of integrated hepatitis В virus DNA sequences in cellular DNA of human hepatocellular carcinoma // Nature. 1980. V. 286. P. 533-535.

31. Brown P. Polio vaccine linked to cancer// Science. 1996. V. 151. P. 16.

32. Burrell C.J., Mackay P., Greenaway P.J., Hofschneider P.H., Murray K. Expression in Escherichia coli of hepatitis В virus DNA sequences cloned in plasmidpBR322 //Nature. 1979. V. 279. P. 43-47.

33. Cattaneo R., Will H., Schaller H. Hepatitis В vims transcription in the infected liver // EMBO J. 1984. V. 3. P. 2191.

34. Chen P.J., Chen C.R., Sung J.L., Chen D.S. Identification of a doubly spliced viral transcript joining the separated domains for putative protease and reverse transcriptase of hepatitis В virus // J. Virol. 1989. V. 63. P. 41654171.

35. Cheng K.-C., Moss B. Selective synthesis and secretion of particles composed of the hepatitis В virus middle surface directed by a vaccinia virus: induction of antibodies to pre-S and S epitopes // J. Virol. 1987. V. 61. P. 1286-1290.

36. Conrad U., Fiedler U., Artsaenko O., Phillips J. High-level and stable accumulation of single-chain Fv antibodies in plant storage organs // J. Plant Physiol. 1998. V. 152. P. 708-711.

37. Cramer C.L. Bioproduction of human enzymes in transgenic tobacco // Engineering plants for commercial products and applications / Eds Collins G.B. & Sheperd R.J. NY: New York Academy of Sciences. 1996. P. 62-71.

38. Cramer C., Boothe J.G., Oishi K.K. Transgenic plants for therapeutic proteins: linking upstream and downstream strategies // Curr. Topics Microbiol. Immunol. 1999. V. 240. P. 95-118.

39. Curtiss R., Cardineau G.A. 1990. World Intellectual Property Organization. PCT/US89/03799.

40. Dane D.S., Cameron C.H., Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with australia-antigen-associated hepatitis // Lancet. 1970. V. 1. P. 695-698.

41. Dalsgaard К., Uttenthal A., Jones T.D. et al. Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease // Nature Biotechnology. 1997. V. 15. P. 248-252.

42. De F., Ruvo ML, Verdoliva A. et al. N-terminal myristylation of HBV preSl domain enhances receptor recognition // J. Pept. Res. 2001. V. 57. P. 390400.

43. Diao J., Khine A.A., Sarangi F. et al. X protein of hepatitis В virus inhibits Fas-mediated apoptosis and is associated with upregulation of the SAPK/JNK pathway // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 8328-8340.

44. Doran P.M. Foreign protein production in plant tissue cultures // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 199-204.

45. Eble В., MacRae D., Lingappa V., Ganem D. Multiple topogenic sequences determine the transmembrane orientation of hepatitis В surface antigen // Mol. Cell. Biol. 1987. V. 7. P. 3591-3601.

46. Edman J.C., Hallewell R.A., Valenzuela P., Goodman H.M., Rutter W.J. Synthesis of hepatitis В surface and core antigens in E.coli // Nature. 1981. V. 291. P. 503-506.

47. Edwards K., Johnston C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

48. Ehsani P., Khabiri A., Domansky N.N. Polypeptides of hepatitis В surface antigen produced in transgenic potato//Gene. 1997. V. 190. P. 107-111.

49. Elmore L.W., Hancock A.R., Chang S.F. et al. Hepatitis В virus X protein and p53 tumor suppressor interactions in the modulation of apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 14707-14712.

50. Farza H., Hadchouel M., Scotto J. et al. Replication and gene expression of hepatitis В virus in a transgenic mouse that contains the complete viral genome // J. Virol. 1988. V. 62. P. 4144-4152.

51. Feitelson M.A., Millman I., Blumberg S. Tree squirrel hepatitis В virus: antigenic and structural characterization // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 2994-2997.

52. Fischer R, Emans N. Molecular farming of pharmaceutical proteins // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 279-299.

53. Fischer R., Hoffmann K., Schillberg S., Emans N. Antibody production by molecular farming in plants // J Biol Regul Homeost Agents. 2000. V. 14. P. 83-92.

54. Franken E., Teuschel U., Hain R. Recombinant proteins from transgenic plants // Current Opinion in Biotechnology. 1997. V. 8. P. 411-416.

55. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. et al. Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation // Nature. 1985. V. 319. P. 791-793.

56. Galbraith D.W., Zeiher C.A., Harkins K.R., Afonso C.L. Biosynthesis, processing and targeting of the G-protein of vesicular stomatitis virus in tobacco protoplasts // Planta. 1992. V. 186. P. 324-336.

57. Giddings G., Allison G., Brooks D., Carter A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals//Nature Biotehnol. 2000. V. 18. P. 1151-1155.

58. Ghendon Y.Z. World health organization strategy for control of hepatitis В // Control of virus disease / Eds Kurstan E. N.-Y.: Marcel Dekker Inc. 1993. P. 141-164.

59. Goddijn O.J., Ma P.J. Plants as bioreactors // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P. 379-387.

60. Gomez N., Carillo C., Salinas J. et al. Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis coronavirus in transgenic plants // Virology. 1998. V. 249. P. 352-358.

61. Guo J.-T., Pugh J.C. Topology of the large envelope protein of duck hepatitis В virus suggests a mechanism for membrane translocation during particle morphogenesis // J. Virol. 1996. V. 71. P. 1107-1114.

62. Guo W., Bell K.D., Ou J.H. Characterization of the hepatitis В virus Enhl enhancer and X promoter complex//J. Virol. 1991. V. 65. P. 6686-6692.

63. Hain R., Stabel P., Gernilofsky A.P., Steinbiss H.H. et al. Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimeric gene by plant protoplasts//Mol Gen Genet. 1985. V. 199. P. 161-168.

64. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen С.J. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. V. 268. P. 714-716.

65. Haviv I., Shamay M., Doitsh G., Shaul Y. Hepatitis В virus pX targets TFIIB in transcription coactivation// Mol Cell Biol. 1998. V. 18. P. 1562-1569.

66. Herbers K., Sonnewald U. Production of new/modified proteins in transgenic plants // Cur. Opin. in Biotechnol. 1999. V. 10. P. 163-168.

67. Heermann K.H., Goldmann U., Schwartz W. et al. Large surface proteins of hepatitis В virus containing the Pre-S sequence // J. Virol. 1984. V. 52. P. 396-402.

68. Hiatt A.C., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants //Nature. 1989. V. 342. P. 76-78.

69. Hoekema A., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. Transfer of octopine T-DNA segment to plant cells mediated by different types of Agrobacterium tumour- or root-inducing plasmids: generality of virulence systems// J. Bacterid. 1984. V. 158. P. 383-385.

70. Hsiang J.L. Biochemical detection of hepatitis В virus constituents // Adv. Clin. Chem. 1989. V. 27. P. 143-199.

71. Huang H.L., Jeng K.S., Ни C.P. et al. Identification and characterization of a structural protein of hepatitis В virus: a polymerase and surface fusion protein encoded by a spliced RNA // Virology. 2000. V. 275. P. 398-410.

72. Kaplan P.M., Greenman R.L., Gerin J.L., Piircell R.H., Robinson W.S. DNA polymerase associated with human hepatitis В antigen // J. Virol. 1973. V. 12. P. 995-1005.

73. Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis В virus // FASEB J. 1999. V. 13. P. 1796-1799.

74. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells // Nature. 1987. V. 327. P. 70-73.

75. Kobayashi S., Saigoh K., Urashima Т., Asano Т., Isono K. Detection of hepatitis В virus x transcripts in human hepatocellular carcinoma tissues // J Surg Res. 1997. V. 73. P. 97-100.

76. Kong Q., Richter L., Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis В surface antigen expressed in transgenic plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 11539-11544.

77. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

78. Lam D.M.-K., Arntzen С,J. Anti-viral vaccines expressed in plants. United States Patent. USA: Edible vaccines, Inc.(Conroe, TX), 1993.

79. Lamm M.E. Interaction of antigens and antibodies at mucosal surfaces // Annu. Rev. Microbiol. 1997. V. 51. P. 311-340.

80. Liu Y.-L., Wang J.-F., Qiu B.-S., Zhao S.-Z., Tian B. Expression of human hepatitis В virus surface antigen gene in transgenic tobacco // Science in China. 1994. V. 37. P. 37-41.

81. Levrero M., Jean-Jean O., Balsano C., Will H., Pemcaudett M. Hepatitis В virus (HBV) X gene expression in human cells and anti-HBx antibodies detection in chronic HBV infection // Virology. 1990. V. 174. P. 299-304.

82. Ma J.K.-C., Hiatt A. Expressing antibodies in plants for immunotherapy // Transgenic plants: a production system for industrial and pharmaceutical proteins / Eds Owen M.R.L. & Pen P. London, UK: John Wiley & Sons. 1996. P. 229-243.

83. Maddrey W.C. Hepatits В an important public health issue // Clin.Lab. 2001. V. 47. P. 51-55.

84. Mahon B.P., Moore A., Johnson P.A., Mills K.H. Approaches to new vaccines // Crit. Rev. Biotechnol. 1998. V. 18. P. 257-282.

85. Marion P.L., Oshiro L.S., Regnery D.C., Scullard G.H., Robinson W.S. A virus in Beechi ground squirrels which is related to hepatitis В virus of human // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1980. V. 77. P. 2941-2944.

86. Mason W.S., Seal G., Summers J. Virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human hepatitis В virus // J. Virol. 1980. V. 36. P. 829-836.

87. Mason H.S., Lam D.M.-K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis В surface antigen in transgenic plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 11745-11749.

88. Mason H.S., Arntzen C.J. Transgenic plants as vaccine production systems // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P. 388-392.

89. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 5335-5340.

90. Mason H.S., Haq T.A., Clements J.D., Arntzen C.J. Edible vaccine protects mice against E.coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene//Vaccine. 1998. V. 16. P. 1336-1343.

91. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotechnology. 1995. V.13. P. 1484-1487.

92. Miele L. Plants as bioreactors for biopharmaceuticals: regulatory considerations // Trends Biotechnol. 1997. V. 15. P. 45-50.

93. Modelska A., Dietzschold В., Sleysh N. et al. Immunization against rabies with plant-derived antigen // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 2481-2485.

94. Moloney M.M. "Molecular farming" in plants: achievements and prospects I I Biotechnol. Eng. 1995. V. 9. P. 3-9.

95. Мог T.S., Gomez-Lim M.A., Palmer K.E. Perspective: edible vaccines a concept coming of age // Trends Microbiol. 1998. V. 6. P. 449-453.

96. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.

97. Nagy F., Kays A., Chua N.-H. Analysis of gene expression in transgenic plants I I Plant Mol. Biol. Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. В 4. P. 1-29.

98. Neurath A.R., Kent S.B.H., Strick N. et al. Hepatitis В virus contains preS gene-encoded domains // Nature. 1985. V. 315. P. 154-156.

99. Okamoto H., Tsuda F., Sakugawa H. et al. Typing hepatitis В virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes // J. Gen. Virol. 1988. V. 69. P. 2575-2583.

100. Okochi K., Murakami S. Observation on Australia antigen in Japanese // Vox Sang. 1968. V. 15. P. 374-385.

101. Pawlowski K., Kunze R., De Vries S., Bisseling T. Isolation of total, poly(A) and polysomal RNA from plant tissues // Plant Mol. Biol. Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1994. D 5. P. 1-13.

102. Paszkowski J., Shillito R.D., Saul M. et al. Direct gene transfer to plants // EMBO J. 1984. V. 3. P. 2717-2722.

103. Porta C., Spall V.E., Loveland J. et al. Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides // Virology. 1994 V. 202. P. 949-955.

104. Prince A.M. An antigen detected in the blood during the incubation period of serum hepatitis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. V. 60. P. 814821.

105. Reiss В., Sprengel R., WШ H., Schaller H. A new sensitive method for quantitative and qualitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell extracts // Gene. 1984. V. 30. P. 211-218.

106. Richter L., Kipp P.B. Transgenic plants as edible vaccines // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. V. 240. P. 159-176.

107. Richter L., Thanavala Y., Arntzen C.J., Mason H.S. Production of hepatitis В surface antigen in transgenic plants for oral immunization // Nature Biotechnology. 2000. V. 18. P. 1167-1171.

108. Robinson W.S., Greenman R.L. DNA polymerase in the core of the human hepatitis В virus candidate // J. Virol. 1974. V. 13. P. 1231-1236.

109. Robinson W.S., Clayton D.A., Greenman R.L. DNA of a human hepatitis В virus candidate // J. Virol. 1974. V. 14. P. 384-391.

110. Ryu С .J., Cho D.Y., Gripon P. et al. An 80-kilodalton protein that binds to the pre-Sl domain of hepatitis В virus // J. Virol. 2000. V.74. P. 110-119.

111. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Nat. Acad. Sci. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

112. Sekar V. A rapid screening procedure for the identification of recombinant bacterial clones // BioTechniques. 1987. V. 5. P. 11-13.

113. Shaul Y., Rutter W.J., Laub O. A human hepatitis В viral enhancer element // EMBO J. 1985. V. 4. P. 427-430.

114. Sijmons P. C. et al. Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants // Bio/Technology. 1990. V. 8. P. 217-221.

115. Smith G., Walmsley A., Polkinghorne I. Plant-derived immunocontraceptive vaccines//Reprod. Fertil. Dev. 1997. V. 9. P. 85-89.

116. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

117. Soussan P., Garreau F., Zylberberg H. et al. In vivo expression of a new hepatitis В virus protein encoded by a spliced RNA // J. Clin. Invest. 2000. V. 105. P. 55-60.

118. Sprengel R., Kaleta E.F., Will H. Isolation and characterization of a hepatitis В vims endemic in herons // J. Virol. 1988. V. 62. P. 3832-3839.

119. Stibbe W., Gerlich W.H. Structural relationships between minor and major proteins of hepatitis В surface antigen // J. Virol. 1983. V. 46. P. 626629.

120. Stoeckle M., Guan L. Improved resolution and sensivity of Northern blots using polyacrilamide-urea gels//BioTechniques. 1993. V. 15. P. 227-231.

121. Su T.S., Lai C.J., Huang J.L. et al. Hepatitis В virus transcripts produced by RNA splicing// J. Virol. 1989. V. 63. P. 4011-4018.

122. Summers J., Smolec J.M., Suyder R. A virus similar to human hepatitis В virus associated with hepatitis and hepatocyte in woodchucks // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 4533-4537.

123. Summers J., Mason W.S. Replication of the proteins of a hepatitis B-like virus by reverse transcription of an RNA intermediate // Cell. 1982. V. 29. P. 403-415.

124. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G., Clements J.D., Levine M.M., Arntzen C.J. bnmunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato // Nat Med. 1998. V. 4. P. 607-609.

125. Terre7 S., Petit M.A., Brechot C. Defective hepatitis В virus particles are generated by packaging and reverse transcription of spliced viral RNA in vivo // J.Virol. 1991. V. 65. P. 5539-5543.

126. Thanavala Y. Novel approaches to vaccine development against HBV // J. Biotechnol. 1996. V. 44. P. 67-73.

127. Thanavala Y., Yang Y.F., Lyons P., Mason H.S., Arntzen C.J. Immimogenicity of transgenic plant-derived hepatitis В surface antigen // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 3358-3361.

128. The hepatitis В virus page. 2001. http://wvvw.ipriinus.ca/~harlequin /HBV/hbsags.htm

129. Tiollais P., Pourcel C., Dejean A. The hepatitis В virus // Nature. 1985. V. 317. P. 489-495.

130. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn В., Schell J., Steinbiss H. A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions // Nucl. Acids Res. 1987. V. 15. P. 5890.

131. Tuboly Т., Yu W., Bailey S. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. V.18. P. 2023-2028.

132. Turpen Т.Н., Reinl S.J., Charoenvit Y. et al. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mosaic virus // Bio/Technology. 1995. V. 13. P. 53-57.

133. Twu J.S., Robinson W.S. Hepatitis В virus X gene can transactivate heterologous viral sequences // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2046-2050.

134. Usha R., Rohll J.B., Spall V.E. et al. Expression of an animal virus antigenic site on the surface of plant virus particle // Virology. 1993. V. 197. P. 366-374.

135. Vandekerckhove J. et al. Enkephalines produced in transgenic plants using modified 2S storage proteins // Bio/Technology. 1989. V. 7. P. 929932.

136. Voss A., Niersbach M., Hain R. et al. Reduced virus infectivity in N. tabacum secreting a TMV-specific full-size antibody // Molecular Breeding. 1995. V. l.P. 39-50.110

137. Walmsley А.М., Arntzen С. J. Plants for delivery of edible vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 126-129.

138. Wampler D.E., Lehman E.D., Boger J., McAleer W.J., Scotnick E.M. Multiple chemical forms of hepatitis В surface antigen produced in yeast // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 6830-6834.

139. Whitelam G.C. The production of recombinant proteins in plants // J. Sci. Food Agric. 1995. V. 68. P. 1-9.

140. World Health Organization. The World Health report 1998. Executive summury: life in the 21st century a vision for all. 1998.

141. Xu Z., Jensen G., Yen T.S.B. Activation of hepatitis В virus S promoter by the viral large surface protein via induction of stress in the endoplasmic reticulum//J. Virol. 1997. V. 71. P. 7387-7392.

142. Yu J., Langridge W.H. Novel approaches to oral vaccines. Delivery of antigens by edible plants // Curr. Infect. Dis. Rep. 2000. V. 2. P. 73-77.

143. Yuh C.H., Ting L.P. The genome of the hepatitis В virus contains a second enhancer: cooperation of two elements within this enhancer is required for its function // J. Virol. 1990. V. 64. P. 4281-4287.

144. Yusibov V., Modelska A., Steplewski K. et al. Antigens produced in plants by infection with chimeric plant viruses immunize against rabies virus and HIV-1 //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 5784-5788.