Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез в растениях поверхностного антигена вируса гепатита B: повышение биологической безопасности трансгенных растений

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез в растениях поверхностного антигена вируса гепатита B: повышение биологической безопасности трансгенных растений"

ПУЧКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

СИНТЕЗ В РАСТЕНИЯХ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В: ПОВЫШЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

03.01.03 - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 /»АПР 2011

Пущино -2011

4843854

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений Филиала Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Рукавцова Елена Борисовна

доктор биологических наук, профессор

Романов Георгий Александрович

доктор биологических наук Равин Виктор Константинович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится 21 апреля 2011 г. в 1530 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.038.01. при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан 21 марта 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

/к

Т.И. Смолихина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В России остро стоит проблема профилактики заболевания гепатитом В. Кардинально решить этот вопрос может только проведение всеобщей вакцинации населения страны против гепатита В, начинаемой с группы риска. Растительные системы перспективны для производства рекомбинантных белков медицинского назначения, поскольку обладают рядом преимуществ перед другими эукариотными продуцентами. Растения не содержат патогенных для млекопитающих вирусов, а также обладают необходимыми механизмами энзиматической постсинтетической модификации для полноценного синтеза функциональных эукариотических белков. Актуальность задачи состоит в получении растений-продуцентов поверхностного антигена вируса гепатита В (НВбА§, НВБ-антигена) для фармакологического производства на их основе вакцинных препаратов против вируса гепатита В. Трансгенные растения с тканеспецифической экспрессией гена HBsЛg позволят упростить процесс выделения и очистки антигена, либо вовсе его исключить при создании дешевых и безопасных съедобных вакцинных препаратов.

Для отбора трансгенных растений традиционно используют селективные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам или гены-репортеры. Используемые в настоящее время коммерческие трансгенные растения с устойчивостью к вредителям и гербицидам представляют существенную потенциальную биологическую и экологическую опасность, связанную с их негативным влиянием на полезные организмы агробиоценозов. В связи с этим остро стоит проблема разработки методов получения трансгенных растений нового поколения без "генетического мусора", к которому относятся селективные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам и другие маркерные гены.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы - создать биобезопасные трансгенные растения, синтезирующие поверхностный антиген вируса гепатита В в количестве, достаточном для проведения доклинических испытаний, и исследовать иммуногенность полученных растений-продуцентов в экспериментах на лабораторных животных.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Получить трансгенные растения, содержащие ген HBsAg под контролем различных промоторов.

2. Повысить уровень синтеза НВв-антигена в трансгенных растениях.

3. Создать биобезопасные безмаркерные растения, синтезирующие ИВб-антиген.

4. Провести анализ иммуногенности на лабораторных мышах съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений.

Научная новизна работы. Получены растения табака и культуры клеток и тканей с геном ЯДуЛ^ под контролем промоторов генов маннопин-

и октопинсинтазы агробактерий (Аосз)ЗАтазРтаз. Проанализирована

экспрессия антигена в трансгенных растениях, показан ее тканеспецифичный характер под контролем данных промоторов.

Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген HBsAg под контролем модифицированного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S с четырьмя энхансерами. Количество HBs-антигена достигало 0,1% от общего растворимого белка растений, достаточное для исследования их иммуногенности в доклинических испытаниях.

С целью повышения биобезопасности трансгенных растений разработан способ получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген HBsAg. Преимущество разработанного способа заключается в экспрессии в растениях генов целевых белков без дополнительных селективных генов или генов-репортеров. При этом сокращается время отбора трансгенных растений и появляется возможность прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена. Показан стабильный синтез HBs-антигена в растениях поколения F1.

Впервые проведены длительные доклинические испытания на животных клубней трансгенных растений картофеля в качестве съедобной вакцины. Уровень антител в сыворотке крови иммунизированных мышей был значительно выше протективного (до 350 мМе/мл) и сохранялся в течение более года после начала вакцинации.

Теоретическая и практическая значимость. Применение специфических промоторов позволит синтезировать нужный белок в съедобных органах растений, что упростит производство вакцин и позволит использовать их для оральной иммунизации. Данные, полученные в ходе доклинических испытаний, подтверждают перспективность использования трансгенных растений в качестве субстанции для производства вакцины против вируса гепатита В. Разработанный способ создания безмаркерных растений позволяет получать биобезопасные растения - продуценты терапевтически важных белков. Результаты работы могут быть использованы в научных исследованиях различных организаций в областях молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений, в том числе Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), на IX международной конференции «Биология культивируемых клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), на Российско-Корейском семинаре «Современная наука и высокие технологии» (Пущино, 2008), на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на XX-XXIII зимних международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 20082011), на IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на XVI-XVIII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых

ученых «Ломоносов» (Москва, 2009-2011), на Пущинской научно-практической конференции «Системная биология» (Пущино, 2009), на 13-15-ой Международных пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009-2011), на Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 2010).

Конкурсная поддержка работы. Исследования проводились в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ. На протяжении всего этого периода исследования были частью плановых НИР. Исследования поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований, Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека», Программой Президиума РАН «Поддержка инноваций и разработок», Программой Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере "Участник молодежного научно-инновационного конкурса (У.М.Н.И.К)"-2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 патент на изобретение, 6 статей в научных сборниках.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 107 страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы, включающего 187 источников, из них 173 иностранных. Работа содержит 21 рисунок и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали стерильно выращенные растения табака Nicotiana tabacum L. сорта Самсун, картофеля Solanum tuberosum L. сорта Дезире, томата Lycopersicon esculentum Mill, сорта Субарктик Пленти. Растения in vitro культивировали при температуре 24-26 °С, освещенности 2 клк и влажности 65%, в 0,2-1-литровых стеклянных сосудах на агаризованной селективной питательной среде MC (Murashige a. Skoog, 1962). Для получения семян табака и томата и клубней картофеля растения выращивали в закрытом грунте на станции искусственного климата «Биотрон». Для проведения доклинических испытаний вакцины против гепатита В на основе трансгенных клубней картофеля использовали три группы по 10 аутбредных мышей NMRI весом 23-25 г из питомника лабораторных животных Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино).

В настоящей работе использовали бактериальные штаммы Е. coli ТОРЮ F', HB 101, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al., 1984), GV3101 (pMP90RK) (Koncz a. Schell, 1986), CBE21 (pTiBo542) (Revenkova et al., 1993), а также плазмиды pSS-Ag, pE1802-Ag, pE1945-Ag, pBM-Ag (Рукавцова и др., 2003, 2007, 2009). Для выращивания клеток Е. coli и А. tumefaciens использовали питательные среды LB и YEB. Плазмидную

ДНК выделяли с помощью метода щелочного лизиса (Birnboim a. Doly, 1979) либо с помощью наборов для выделения плазмид Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit (Zymo Research, США). Для клонирования фрагментов ДНК в плазмидных векторах использовали стандартные методики молекулярной биологии (Маниатис и др., 1984). Гидролиз ДНК рестриктазами проводили согласно рекомендациям фирм-производителей. Перенос плазмид в А. tumefaciens осуществляли методом прямой трансформации клеток очищенной плазмидной ДНК (An et al., 1988), либо методом электропорации. Анализ клонов А. tumefaciens проводили рестрикционным анализом плазмидных ДНК с последующей гибридизацией на фильтрах по Саузерну (Southern, 1975), либо гибридизацией бактериальных клонов на фильтрах (Маниатис и др., 1984).

Трансформацию листовых дисков растений проводили, как описано (Draper et al., 1988). Трансформацию семян табака и томатов проводили с помощью вакуумной инфильтрации в присутствии агробактерий.

Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали амплификатор MJ Mini (Bio-Rad, США). Для ПЦР-анализа ДНК выделяли из листьев растений двумя методами - модифицированным методом (Edwards et al., 1991) или с использованием СТАВ (Doyle а. Doyle, 1987).

Концентрацию белка в экстрактах растительных тканей определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976). Количество HBs-антигена в клетках растений анализировали с помощью тест-систем «Вектогеп В - HBs-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Оральную иммунизацию мышей проводили с использованием клубней картофеля, синтезирующего HBs-антиген. Наличие антител против HBsAg в сыворотке крови иммунизированных животных анализировали методом ИФА, используя тест-систему «BeKTOHBsAg-антитела» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. Растительные системы имеют перспективы успешного использования для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе.

В связи с этим перед нами стояла задача получения биологически безопасных трансгенных растений, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В в количествах, достаточных для проведения доклинических испытаний на лабораторных животных.

1. Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген НВяАд под контролем модифицированных агробактернальных промоторов

Для создания трансгенных растений - продуцентов вакцины против гепатита В мы использовали ген поверхностного антигена вируса гепатита В (НВзА§). Этот ген экспрессируется в клетках дрожжей с целью получения рекомбинантной вакцины против гепатита В и был предоставлен нам коллегами из НПК "Комбиотех" (Москва). Нами проведен анализ аминокислотной последовательности белкового продукта данного гена с помощью программ для предсказания вероятных сайтов локализации белков в клетке "¡РБОЯТ" и "РБСЖТ" (http://www.psort.org), который показал, что полипептид НВбА§ имеет >}-концевой сигнальный пептид и четыре трансмембранные области (рис. 1). Наиболее вероятная его локализация в растительной клетке - мембрана эндоплазматического ретикулума. Эти данные позволили предположить, что продукт гена поверхностного антигена вируса гепатита В будет стабильно сохраняться в клетках растений.

МЕ№Т8АРЬ01)1Л.У1д;)АС^РР1Л.:ГК11Т1Р05Ь

О8™Т8ЬЫРЬООТТУС1СХ№08РТ8Ш

ЗРТЯСРРТСРОУКШМСЬККШГЬРИИСЫ

ЕЬЬУЬШУдОМЬРУСРЬШОВЗТТЗТСтРСК

ТСМТТАдСтТ8МУР8СССТКР81)СтМСТС1Р

ffSSWAFCтKFLWEWASARFSWLSLLVPFV

QWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWCтPSLYSI

Ь8РР]1Р1ХР1ГРС1ЛУУУ1

Рис. 1. Структура полипептида НВзА£, синтезируемого в клетках растений. Белок содержит Ы-концевой сигнальный пептид (подчеркнут) и четыре трансмембранные области (выделены красным цветом).

Нами получены растения и культуры клеток и тканей табака с геном HBsAg под контролем комбинированных промоторов генов маннопин- и октопинсинтазы агробактерий (Аосз)ЗАтазРтаз. Схема этих конструкций представлена на рисунке 2. В качестве источника гена HBsAg использовали рекомбинантную плазмиду р88-НВзА§, содержащую синтетический ген, кодирующий полипептид HBsAg/mayw (Рукавцова и др., 2003). В экспериментах по клонированию использовали векторы для трансформации растений рЕ1802 и рЕ1945, содержащие промотор (Аосз)3АтазРта5, любезно предоставленные доктором С. Гелвином (Университет Пердью, США) (N1 е! а!., 1995). Промотор (Аосз^АтаэРтаэ состоит из регуляторных

элементов генов октопинсинтазы (oes) и маннопинсинтазы (mas), выделенных из A. tumefaciens. В составе комбинированного промотора находятся тройной повтор активатора гена oes, активатор гена mas, промотор гена mas. Вектор рЕ1945 отличается от вектора рЕ1802 наличием интрона гена алкогольдегидрогеназы кукурузы adhl и отсутствием энхансера TL. По данным некоторых исследователей, включение интронов в генетические конструкции для трансформации растений может увеличивать синтез трансгенов в клетках растений (Rose, 2004). Использованные нами векторы содержали полилинкер с сайтами для клонирования, сигналы полиаденилирования и терминации гена агропинсинтазы (ags), а также селективный ген неомицинфосфотрансферазы (nptll') для отбора растений, и необходимые для встривания в растительный геном последовательности LB и RB из Т-ДНК Ti-плазмиды. Как показано ранее, эти промоторы обеспечивали в растениях экспрессию гена ß-глюкуронидазы (GUS) во много раз большую, чем под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (Ni et al., 1995).

Для встраивания гена HBsAg в вектор для трансформации растений рЕ1802, ген фланкировали сайтами рестрикции Крп\ и Sail с использованием праймеров для ПЦР:

1) 5'- CGGGTACCATGGААААСАТТАСТТ;

2) 5 '-CGGTCGACCTATCATTAAATGTAAAC.

Амплифицированный ген клонировали в бинарный вектор рЕ1802 по сайтам рестрикции Крп\ и Sail. Для клонирования в вектор рЕ1945 ген HBsAg был вырезан из плазмиды pSS-HBsAg по сайтам рестрикции Xhol и Cfñl и встроен в вектор по этим же сайтам. Полученными генетическими конструкциями трансформировали штамм Е. coli НВ101.

Векторные конструкции pE1802-Ag и pE1945-Ag, содержащие ген HBsAg под контролем промотора (Aocs)3AmasPmas, переносили в штамм А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404) методом прямой трансформации. Выделяли плазмидную ДНК из отдельных колоний агробактерий и анализировали ее электрофорезом в агарозном геле. Полученные штаммы агробактерий использовали для заражения листовых дисков табака. Отобрали по 15-20 линий трансформантов для дальнейшего молекулярно-генетического и биохимического анализа.

С помощью ПЦР-анализа подтверждено наличие гена HBsAg в трансгенных растениях (рис. 3). Образцы содержали фрагменты ДНК, по молекулярному весу соответствующие размерам гена HBsAg.

Количество HBs-антигена в полученных растений исследовали с помощью иммуноферментного анализа. Проанализированные линии трансгенных растений содержали различное количество антигена, достигающее 0,01% от общего количества растворимого белка. Наибольшее содержание HBs-антигена обнаружено в корнях растений, что подтверждает тканеспецифичность используемых промоторов (Aocs)3AmasPmas. Наличие интрона гена алкогольдегидрогеназы adhl в генетической конструкции pE1945-Ag не привело к усилению экспрессии гена HBsAg, что может быть

связано с неэффективным расположением интрона в использованной плазмиде. Анализ количественного содержания НВз-антигена в растениях, экспрессирующих ген HBsAg под контролем разных промоторов, представлен на рисунке 4.

pSS-HBsAg

Ири1 I

. 'i üri.'.lri ■-. 11. HBl4fl tflt-l»..........PnOI ЛДИ рДд7

pBI801-Ag

.....м^.......w. Auft л-t. .MimrwAW HBsaa Pnai rpill вДдт-

pF,1945-Ag

Рис. 2. Схема получения конструкций pE1802-Ag и pE1945-Ag, содержащих ген HBsAg под контролем агробактериальных промоторов (Aocs)3AmasPmas. Aocs - активатор гена oes; Amas - активатор гена mas; TL - энхансер; Pmas - промотор гена mas; Pnos - промотор гена нопалинсинтазы; ags-ter и pAg7 сигналы полиаденилирования и терминации генов агропинсинтазы и Ag7, соответственно; ADH - интрон гена алкогольдегидрогеназы кукурузы; HBsAg - ген поверхностного антигена вируса гепатита В; nptll - ген неомицинфосфотрансферазы И; RB, LB- правая и левая границы Т-ДНК.

Рис. 3. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В. 1 - ДНК плазмиды, содержащей ген HBsAg; 2 - контроль - ПЦР без ДНК; 3-8 - ДНК трансгенных растений, трансформированных pE1802-Ag; 9-14 - ДНК трансгенных растений, трансформированных pE1945-Ag; 15 - ДНК нетрансгенного растения.

□ Лиаь

I Корни

0,008

0,007 0,006 0,005 0,004 0,00.3 0,002 0,001 0

4

.......[I

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис. 4. Количество HBs-антигена в листьях и корнях трансгенных растений табака, содержащих ген HBsAg под контролем различных промоторов. 1 - нетрансформированное растение; 2-7 - растения, трансформированные pE1802-Ag (линии 8, 11, 12, 13, 16, 21); 8-17 -растения, трансформированные pE1945-Ag (линии 1-10). Представлены средние арифметические значения результатов трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения.

На основе восьми линий трансгенных растений с наиболее высокой экспрессией HBs-антигена нами получены культуры «косматых корней» и каллусные культуры. Агробактериальный промотор гена маннопинсинитазы проявляет свою различную активность в растительных тканях и органах, которая максимальна в корнях и каллусах (Langridge et al., 1989; Рукавцова и др., 1996). Культуры «косматых» корней создавали путем заражения эксплантов трансгенных растений штаммом агробактерий Agrobacterium rhizogenes А4, содержащим ген поверхностного антигена вируса гепатита В. Так называемые «косматые» корни (hairy roots) являются опухолевым образованием в форме новых корешков (Tepfer, 1984). Быстрый рост корней на безгормональной среде и генетическая стабильность делают культуры «косматых» корней идеальной системой для производства рекомбинантных белков. Каллусогенез инициировали из эксплантов листьев растений, синтезирующих HBs-антиген под контролем промоторов (Aocs)3AmasPmas, выращенных in vitro. Уровень синтезированного антигена HBsAg в различных линиях «косматых» корней и каллусных культурах достигал 0,01% от общего растворимого белка и оставался на таком же уровне, как и корнях исходных трансгенных растений (рис. 5, 6). По-видимому, данный эффект, объясняется тем, что каллусная культура культивируется на ауксин-

содержащей среде, что на прямую воздействует на регуляцию ауксин-зависимых октопинсинтазного и маннопинсинтазного промоторов (Ьаг^пс1§е е1 а1., 1989).

Содержание HBsAg в культурах косматых корней

й 0,012

о

г

= а. 0,01

о №

р и те 0,008

си

о я

о 3 ■х и 0,006

ю ю

н 0,004

о

ад 0,002

<

ш Ж 0

I I I

Рис. 5. Содержание ИВв-антигена в культурах «косматых корней», полученных из некоторых линий трансгенных растений табака. 1-4 - табак, трансформированный рЕ1802-А£ (линии 1, 8, 11, 16); 5-8 - табак, трансформированный рЕ1945-А§ (линии 1, 5, 6, 10). Представлены средние арифметические значения результатов трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения.

Рис. 6. Содержание НВз-антигена в каллусных культурах, полученных из некоторых линий трансгенных растений табака. 1-5 - табак, трансформированный pE1802-Ag (линии 8, 11, 12, 13, 21); 5-8 - табак, трансформированный рЕ1945-А§ (линии 1, 4, 6, 9). Представлены средние арифметические значения результатов трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения.

2. Оптимизация экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях

Различия в частоте использования кодонов среди разных организмов приводят к многочисленным проблемам, касающимся экспрессии гетерологичных генов. Некоторые гены, в частности бактериальные, неэффективно экспрессируются в растениях, поскольку их ДНК содержит множество последовательностей, которые воспринимаются растительными клетками как места сплайсинга, сигналы полиаденилирования, терминации транскрипции и сигналы деградации мРНК (van Aarssen et al., 1995; De Rocher et al., 1998). Кроме того, y растений другая частота использования кодонов по сравнению с бактериями и другими организмами. Значительно повысить экспрессию чужеродных белков в растениях обычно удается с помощью значительной модификации исходных последовательностей генов (Strizhov et al., 1996).

Для повышения экспрессии HBs-антигена в клетках трансгенных растений нами проведено изменение нуклеотидной последовательности гена HBsAg с учетом частоты встречаемости кодонов в растениях. Для модификации гена использовали программу Grafical Codon Usage Analyser (www.gcua.schoedl.de). Синтез модифицированного гена HBsAg проведен фирмой «Евроген» (ИБХ РАН, Москва). Синтезированный ген встроен под контроль сильного вирусного промотора с двойным энхансером на основе промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S). Генетические конструкции перенесли в штамм A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) методом прямой трансформации. Полученные штаммы агробактерий использовали для заражения листовых дисков табака, картофеля и томата.

Регенеранты трансгенных растений были подвергнуты комплексному молекулярно-биологическому и биохимическому анализу. Исследования показали, что при использовании модифицированной последовательности гена HBsAg уровень экспрессии антигена остался таким же, как и при использовании исходной последовательности (не более 0,01-0,05% от общего растворимого белка). Вероятно, для достижения более высокого уровня синтеза HBs-антигена в растениях требуется использование более сильных регуляторных элементов, например, промотора с несколькими энхансерами.

Для усиления экспрессии HBs-антигена в трансгенных растениях нами получена генетическая конструкция с геном HBsAg на основе бинарного растительного вектора pPCV91 (Strizhov et al., 1996). Вектор для трансформации растений pPCV91 был создан на основе плазмиды pPCV720 (Koncz et al., 1994). Этот вектор содержит промотор CaMV 35S с четырьмя энхансерами и нетранслируемую лидерную последовательность АО, тРНК вируса табачной мозаики (Gallie a. Kado, 1989). Ген HBsAg встроили в этот вектор по сайту рестрикции ВатШ и получили плазмиду pPCV-Ag (рис. 7), которую перенесли в супервирулентный штамм A. tumefaciens СВЕ21 (pTiBo542) (Revenkova et al., 1993).

Вап?Н1 ХЬа I ВатН!

Рис. 7. Схема плазмиды рРСУ-А§. СаМУ35Б - промотор 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты с четырьмя энхансерами; ДО - нетранслируемая лидерная последовательность тРНК вируса табачной мозаики; рпоБ -промотор гена нопалинсинтазы агробактерий; рА358 рА§4 - сигналы полиаденилирования 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты и гена 4 агробактерий; HBsAg- ген поверхностного антигена вируса гепатита В; ИрИ -ген гигромицинфосфотрансферазы; ЯВ, ЬВ - правая и левая границы Т-ДНК.

Трансгенные растения табака и томата, содержащие ген HBsAg под контролем промотора СаМУ 35Б с четырьмя энхансерами, получены методами агробактериальной трансформации листовых эксплантов и вакуумной инфильтрации семян. Экспрессия гена в таких растениях возросла не менее, чем в два раза по сравнению с экспрессией в ранее полученных растениях, в которых ген HBsAg находился под контролем двойного промотора 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты. Синтез НВз-антигена составил до 0.1% от общего растворимого белка, что является уровнем, достаточным для получения вакцины против гепатита В на основе таких растений и проведения доклинических испытаний (рис. 8).

Антиген, % от растворимого белка

0,14 ■

■ — тш ........................■

И

1

р| ................................■

■Н ид

12 3 4

Рис. 8. Содержание НВз-антигена в нескольких линиях трансгенных растениях с наибольшей экспрессией гена HBsAg под контролем промотора СаМУ 35Б с четырьмя энхансерами. 1 -нетрансформированное растение; 2-4 - табак, трансформированный рРСУ-А§ (линии 15-1, 16-5, 16-6); 5 - табак, содержащий ген HBsAg под контролем двойного промотора СаМУ 358. Представлены средние арифметические значения результатов трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения.

3. Получение безмаркерных трансгенных растений с геном HBsAg

Нами разработан способ получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (Бурьянов и др., 2009; Рукавцова и др., 2009а,б). Преимущество разработанного метода заключается в том, что обеспечивается экологическая и биологическая безопасность трансгенных растений, экспрессирующих гены целевых белков без дополнительных селективных генов или генов-репортеров. При этом сокращается время отбора трансгенных растений и одновременно появляется возможность прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена.

На основе вектора pBIN19 (Frisch, 1995) в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ сконструирована плазмида рВМ с репликоном широкого круга хозяев RK2, путем удаления гена устойчивости к антибиотику канамицину nptH, вместе с промотором и сигналом полиаденилирования (Рукавцова и др., 2009а,б). Вектор для трансформации растений рВМ содержит область Т-ДНК агробактерий для интеграции в растительный геном, а также полилинкер исходного вектора с удобными сайтами для клонирования (рис. 9). При этом плазмида рВМ укорочена на 2600 п.н. по сравнению с исходным вектором pBIN19, что дает преимущества при трансформации растений, так как может снизить нежелательный эффект длинных векторных последовательностей на плотность упаковки ДНК в хроматин и, соответственно, на экспрессию целевого гена (Etchberger а. Hobert, 2008). Для отбора бактериальных генов в векторе присутствует ген nptlll (Trieu-Cuot, 1983), который в растительный геном не включается, поскольку содержится вне области агробактериальной Т-ДНК. С целью создания трансгенных растений без дополнительных селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам, в вектор рВМ был встроен ген HBsAg под контролем промотора CaMV 35 SS (рис. 9).

Плазмиду pBM-Ag перенесли в А. tumefaciens LBA 4404 (pAL4404) и полученными агробактериями трансформировали листовые экспланты табака и гипокотили томата, а также семена методом вакуумной инфильтрации. С помощью иммуноферментного анализа произвели отбор трансгенных растений, содержащих ген HBsAg. Этот анализ, основанный на высокой избирательности и специфичности реакций "антиген-антитело", обладает рядом преимуществ: использование минимальных количеств образцов, высокая чувствительность (0,1-0,5 нг/мл), возможность как качественной, так и количественной оценки результатов экспрессии целевого гена (рис. 10).

Семена, полученные от безмаркерных трансгенных растений табака и томата, экспрессирующих HBs-антиген под контролем двойного промотора CaMV 35SS, были простерилизованы и высажены на среду MC без селективных агентов. Спустя месяц у проростков табака и томата поколения Fl отбирали листья и подвергали молекулярно-генетическому и биохимическому анализу. Наличие гена HBsAg в растениях поколения Fl подтверждено с помощью ПЦР (рис. 11).

R. S|)h I

Рис. 9. Схема конструирования рекомбинантной плазмиды pBM-Ag для получения безмаркерных растений, содержащих ген HBsAg. CaMV35SS -двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; pACaMV-сигнал полиаденилирования вируса мозаики цветной капусты; HBsAg - ген поверхностного антигена вируса гепатита В; nptll - ген неомицинфосфотрансферазы II; TL, TR - левая и правая границы Т-ДНК, KmR - ген устойчивости к антибиотику канамицину для селекции бактерий; oriV - начало репликации; ColEl - начало репликации из плазмиды ColEl; R, К, Sm, В, SI, S - сайты рестрикции EcoRl, Крп\, Smal, Ват\\\, Sail, Sphl.

вектор с целевым геном

растите. iьная клетка

трапеформац ия

селективная среда неселективная среда

анализ растений

присутствие целевого гена прямая детекция целевого продукта, ■ппввшпрн отбор линий с максимальным

I

экспрессия целевого гена

синтезом

-л-'-.. - м. f

детекция целевого продукта, отбор линии с максимальным синтезом

'«■г

экспрессия целевого гена

присутствие целевого гена

Рис. 10. Прямая детекция синтезируемых целевых продуктов трансгенных растениях с помощью иммунологического анализа.

- 700 п.н.

К+К-12345678

Рис. 11. ПЦР-анализ безмаркерных трансгенных растений томата поколения Р1. К+ - ДНК плазмиды, содержащей ген HBsAg^, К-контроль - ПЦР без ДНК; 1-8 - ДНК трансгенных растений, трансформированных плазмидой рВМ-А§.

Белковые экстракты из листьев некоторых линий растений поколения F1 проанализированы на наличие HBs-антигена (рис. 12, 13). Проведено сравнение безмаркерных трансгенных растений табака и томата поколений F0 и F1, содержащих ген HBsAg под контролем промотора CaMV 35SS. Показано, что экспрессия антигена в нескольких линиях трансгенных растений табака и томата, выращенных в культуре in vitro, составляла до 0,02-0,05% от общего растворимого белка. В экстрактах контрольных, нетрансформированных растений антигенной активности не выявлено.

%

0.05

S 0.04

В

I

} 0.03

I..I

Рис. 12. Количество НВз-антигена в листьях трансгенных безмаркерных растений табака, содержащих ген HBsAg под контролем промотора СаМУ 3588. 1 - нетрансформированное растение; 2 - трансгенное растение поколения Р0, линия 21; 3 - трансгенное растение поколения Р0, линия 22; 411 - трансгенные растения поколения Р1, линия 21; 12-13 - трансгенные растения поколения П, линия 22; 14-16 - трансгенные растения с геном HBsAg, содержащие ген устойчивости к канамицину. Представлены средние арифметические значения результатов трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения.

Рис. 13. Количество НВв-антигена в листьях трансгенных безмаркерных растений томата, содержащих ген HBsAg под контролем промотора СаМУ 3588. 1 - нетрансформированное растение; 2 - трансгенное растение поколения Р0, линия 6; 3 - трансгенное растение поколения Р0, линия 8; 4-12 - трансгенные растения поколения Р1, линия 6; 13-18 - трансгенные растения поколения П, линия 8. Представлены средние арифметические значения результатов трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения.

4. Иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями картофеля

Для анализа иммуногенности на мышах съедобной вакцины на основе трансгенных растений использовали безмаркерные трансгенные растения картофеля Solarium tuberosum L. сорта Дезире, полученные с использованием рекомбинантной плазмиды pBM-Ag (Рукавцова и др., 2009а).

Трансгенный картофель с геном HBsAg для получения клубней выращивали в закрытом грунте на станции искусственного климата «Биотрон». Количество HBs-антигена в клубнях растений, определенное с помощью тест-системы для иммуноферментного выявления HBsAg, составляло до 1 мкг/г сырой массы клубня.

Для изучения иммуногенности антигена, синтезируемого клубнями картофеля, использовали три группы по 10 аутбредных мышей NMRI весом 23-25 г. Животные первой и второй групп питались трансгенными клубнями картофеля на 1, 7 и 14-е сутки эксперимента, в расчете 20 г клубней на мышь (что составило 20 мкг HBsAg), причем мышам первой группы давали в качестве адъюванта по 20 мкг гликопина (ГМДГГ). Контрольная группа получала стандартный корм без картофеля.

В связи с использованием рекомбинантных вакцин, обладающих слабой иммуногенностью, появляется необходимость использования адъювантов. Показано, что наиболее эффективными адъювантами являются соединения, активирующие переход клеток иммунной системы из состояния естественного ответа в состояние адаптивного специализированного ответа через активацию патоген-ассоциированных рецепторов (Guy, 2007). Таким требованиям полностью соответствует гликопин (ГМДП). Это вещество представляет собой фрагмент клеточной стенки бактерий, способный эффективно модулировать иммунный статус и активировать биосинтез антител (Ростовцева и др., 1981; Иванов и др., 1996). В настоящее время ГМДП применяется в медицине и ветеринарии в качестве иммунокорректора и адъюванта.

Для оценки иммунитета против гепатита В у мышей каждой группы собирали препараты крови из хвостовой вены с интервалом 10-14 суток. Получаемую сыворотку крови замораживали и хранили на -20 °С. Все собранные образцы анализировали методом ИФА на наличие антител против HBsAg, используя тест-систему D-0562 (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Показано, что уровень антител к HBsAg в сыворотке крови мышей первой и второй групп начинал увеличиваться на 36-50-е сутки после первого кормления (рис. 14). У мышей группы, получавшей трансгенный картофель вместе с адъювантом ГМДП, содержание антител к HBsAg составило до 85 мМе/мл. У мышей, получавших картофель без адъюванта, уровень антител на 50-е сутки с начала эксперимента был выше - до 170 мМе/мл. В крови мышей третьей, контрольной группы, антител к HBsAg не обнаружено.

мМП/мл

Рис. 14. Динамика содержания антител к HBsAg в сыворотке крови мышей: 1 - получавших клубни трансгенного картофеля в сочетании с адъювантом ГМДП; 2 - получавших картофель без адъюванта; 3 -контрольной группы, получавшей стандартный корм. Тонкими стрелками показано время кормления картофелем, толстой - время инъекции рекомбинантной дрожжевой вакциной. Измерения проводили- в трех аналитических повторностях. Приведены средние значения и их стандартные отклонения.

С целью исследования усиления иммунного ответа против- НВзА§, синтезируемого трансгенными растениями, на 71-е сутки эксперимента животным первой и второй экспериментальных групп "вводили внутрибрюшинно по 0.5 мкг рекомбинантной дрожжевой вакцины против гепатита В (НПК «Комбиотех», Москва). Содержание антител стало повышаться у мышей обеих экспериментальных групп уже через неделю и достигло максимума у разных мышей через 15-43 суток после инъекции (до 250-350 мМе/мл). Скорость и амплитуда повышения титра НВз-антител были различны среди животных, что зависит от физиологических особенностей отдельных мышей. Вторичный иммунный ответ очень быстро развивался при повторном введении антигена, что происходит за счет клеточного и гуморального иммунитета, активируются клетки памяти. Достоверных различий в уровне антител между группами мышей, получавших трансгенный картофель с адъювантом ГМДП и без адъюванта, не обнаружено. Однако в первой группе больше мышей дали иммунный ответ (8 из 10) по сравнению со второй группой (4 из 10). На 120-е сутки после начала эксперимента уровень антител к НВзА§ в обеих группах мышей оставался протективным (более 10 мМе/мл) и составлял 50-100 мМе/мл.

Через год было проведено повторное трехкратное кормление мышей экспериментальных групп клубнями трансгенного картофеля без дополнительного введения адъюванта и рекомбинантной вакцины. У мышей,

проявляющих иммунный ответ к вирусу гепатита В во время предыдущего эксперимента, уровень антител к HBsAg в сыворотке крови повысился до 140-185 мМе/мл и сохранялся в течение нескольких месяцев (рис. 14). Таким образом, была проведена бустерная вакцинация для усиления постиммунизационной защиты, а также подтверждено, что у животных сохраняется стойкая иммунологическая память к инфекции. Следует отметить, что такие исследования были проведены впервые, до настоящего времени не существовало данных о мониторинге иммунитета к вирусу гепатита В такой продолжительности при использовании трансгенных растений в качестве съедобной вакцины.

Таким образом, клубни картофеля, синтезирующие НВв-антиген, проявляют высокую иммуногенность при их использовании в оральной вакцинации. Следует отметить, что в результате кормления мышей трансгенными клубнями картофеля, экспрессирующими HBsAg, был выявлен как первичный, так и вторичный иммунный ответ. Использование специфических промоторов позволит синтезировать нужный белок в съедобных органах растений, что упростит производство вакцин и позволит использовать их для оральной иммунизации. Полученные данные показывают перспективность использования безмаркерных трансгенных растений в качестве эффективной субстанции для производства съедобной вакцины против гепатита В.

выводы

1. Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем различных промоторов.

2. Показана тканеспецифическая экспрессия HBs-антигена под контролем комбинированных агробактериапьных промоторов генов маннопин- и октопинсинтазы в корнях и культуре тканей растений.

3. Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген HBsAg под контролем промотора CaMV 35S с четырьмя энхансерами. Количество HBs-антигена достигало 0,1% от общего растворимого белка клеток растений.

4. С целью повышения биобезопасности вакцины против гепатита В созданы безмаркерные растения, синтезирующие HBs-антиген.

5. Проведен анализ иммуногенности съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений картофеля. Уровень антител в сыворотке крови иммунизированных мышей был значительно выше протективного (до 350 мМе/мл) и сохранялся в течение более года после начала вакцинации.

6. Полученные данные показывают перспективность использования безмаркерных трансгенных растений в качестве эффективной субстанции для производства съедобной вакцины против гепатита В.

Список работ, опубликованных по теме диссертации СТАТЬИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ЖУРНАЛАХ

1. Рукавцова Е.Б., Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A., Чеботарева E.H.. Бурьянов Я.И. Получение безмаркерных трансгенных растений // Доклады РАН. 2009. Т. 426. № 2. С. 261-264.

2. Рукавцова Е.Б., Гаязова А.Р., Чеботарева E.H.. Бурьянов Я.И. Получение свободных от дополнительных генетических маркеров растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2009. Т. 45. № 8. С. 1055-1060.

3. Рукавцова Е.Б., Чеботарева E.H.. Руденко Н.В., Бурьянов Я.И. Иммуногенность клубней биологически безопасного картофеля, синтезирующего поверхностный антиген вируса гепатита В // Доклады РАН. 2011. Т. 437. № 4. С. 571-573.

ПАТЕНТЫ

1. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Юхманова A.A., Пиголева C.B., Рукавцова Е.Б., Чеботарева E.H., Гаязова А.Р. Рекомбинантная плазмида рВМ и способ получения с ее использованием безмаркерных трансгенных растений, синтезирующих целевой продукт. Патент на изобретение № 2410433 от 02.06.2009 г. Опубл. 27.01.2011. Бюл. № 3.

СТАТЬИ В НАУЧНЫХ СБОРНИКАХ

1. Гаязова А.Р., Чеботарева E.H., Рукавцова Е.Б., Шульга Н.Я., Бурьянов Я.И. Анализ экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях и клеточных культурах // Сборник материалов школы-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия-2007». Пущино. 2007. С. 41-44.

2. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Юхманова A.A., Алексеева В.В., Шульга Н.Я., Дьяченко О.В., Шевчук Т.В., Гаязова А.Р., Чеботарева E.H. Создание биологически безопасных трансгенных растений нового поколения с полезными свойствами // Сборник научных трудов по Программе Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека». Москва. 2008. С. 217-219.

3. Рукавцова Е.Б., Чеботарева E.H.. Гапеева Т.А., Волотовский И.Д., Бурьянов Я.И. Синтез поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) в потомстве трансгенных безмаркерных растений табака и томата // Сборник материалов I Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований». М.: Издательско-полиграфический комплекс НИИРР. 2009. Вып. 1. С. 85-88.

4. Рукавцова Е.Б., Аббасова С.Г., Руденко Н.В., Чеботарева E.H.. Бурьянов Я.И. Разработка съедобной вакцины против гепатита В на основе клубней трансгенного картофеля // Сборник материалов I Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Актуальные вопросы развития современной науки, техники и технологий». М.: Издательско-полиграфический комплекс НИИРР. 2009. С. 106-109.

5. Чеботарева E.H.. Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. Вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений: результаты доклинических испытаний // Труды Томского государственного университета. Сер. биологическая: Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии. Материалы Первой Всероссийской молодёжной научной конференции, посвященной 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете. Томск: Изд-во Томского ун-та. 6-9 октября 2010. Т. 275. С. 245-247.

6. Чеботарева E.H.. Руденко Н.В., Видягина Е.О., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. Исследование иммуногенности поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями // Материалы Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького «Биология будущего: традиции и инновации». Екатеринбург. 25-28 октября 2010. С. 83-84.

Заказ № 204-!/03/2011 Подписано в печать 17.03.2010 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1

.«Г^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

■Л ^ \v\vw. с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пучко, Елена Николаевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Использование трансгенных растений в качестве продуцентов антител, вакцин и терапевтически ценных белков.

1.1.1. Синтез биофармацевтических белков в трансгенных растениях.

1.1.2. Производство антител с помощью трансгенных растений

1.1.3. Вакцины на основе трансгенных растений.

1.2. Синтез гена поверхностного антигена вируса гепатита В в различных растительных системах.

1.2.1. Вирус гепатита В, этиология вируса и его структурные компоненты.

1.2.2. Вакцины против гепатита В на основе растений.

1.2.3. Выбор растительных систем экспрессии и методов трансформации.

1.2.4. Оптимизация экспрессии HBsAg в рекомбинантных растительных системах.

1.2.5. Структурная характеристика НВзА£, синтезированного в трансгенных растениях.

1.2.6. Исследования иммуногенности НВэАд, синтезируемого трансгенными растениями.

1.3. Повышение биологической безопасности трансгенных растений.

1.3.1 .Получение безмаркерных трансгенных растений.

1.3.1.1. Использование трансформации растений без селективных маркеров устойчивости.

1.3.1.2. Метод котрансформации.

1.3.1.3. Сайт-специфическая рекомбинация.

1.3.1.4. Метод получения безмаркерных растений с использованием транспозонов.

1.3.1.5. Использование векторной системы МАТ для получения безмаркерных растений.

1.3.1.6.Удаление маркерных генов из хлоропластов растений.

1.4.3аключение.

2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Штаммы бактерий и плазмиды.

2.3. Микр обиологические среды.

2.4. Среды для культивирования растений.

2.5. Растворы и буферы.

2.6. Ферменты, использованные в работе.

2.7. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК.

2.8. Конструирование плазмид для трансформации растений.

2.9. Введение метки в ДНК.

2.10. Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах.

2.11. Гибридизация на фильтрах по Саузерну.

2.12. Трансформация листовых эксплантов табака.

2.13. Трансформация семян табака и томата с помощью вакуумной инфильтрации.

2.14. Выделение суммарной растительной ДНК для ПЦР-анализа.

2.15. Электрофорез в агарозном геле.

2.16. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений.

2.17. Выделение белка из тканей растений.

2.18. Определение белка в растительных экстрактах.

2.19. Иммуноферментный анализ

2.20. Оральная иммунизация мышей клубнями трансгенного картофеля.

2.21. Измерение количества антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных мышей.

3. Результаты и обсуждение.

3.1.Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген HBsAg под контролем комбинированных агробактериальных промоторов.

3.2.0птимизация экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях.

3.3. Получение безмаркерных трансгенных растений с геном

HBsAg.

3.4. Иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями картофеля.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез в растениях поверхностного антигена вируса гепатита B: повышение биологической безопасности трансгенных растений"

В настоящее время для производства гетерологичных белков используют бактерии, грибы, клеточные культуры насекомых и млекопитающих, трансгенные животные и растения. Во многих системах уровень экспрессии эукариотических белков нативной структуры ограничен неспособностью к формированию дисульфидных связей, а также отсутствием у прокариотических организмов энзиматических систем постсинтетической модификации. Другой причиной, лимитирующей использование многих систем экспрессии, является высокая стоимость производства из-за использования трудоемких методов выращивания, многокомпонентных стерильных питательных сред. При использовании культур клеток млекопитающих или трансгенных животных возможно присутствие в конечном белковом продукте патогенных вирусов и прионов.

В связи с вышесказанным, трансгенные растения имеют большой технологический потенциал для высокоэффективного производства безопасных гетерологичных белков в промышленном масштабе. Растения обладают рядом важных преимуществ, поскольку наращивание растительной биомассы при применении разработанных агротехнических приемов является достаточно простым и недорогим процессом, требующим небольших энергетических затрат. Кроме того, растительные объекты обладают необходимыми механизмами энзиматической постсинтетической модификации эукариотических белков. При использовании растений в качестве продуцентов отсутствует вероятность их заражения патогенными вирусами млекопитающих. Получение трансгенных растений с тканеспецифической экспрессией позволяет упростить процесс выделения и очистки белков, либо вовсе его исключить при синтезе рекомбинантных белков в составе съедобных вакцинных препаратов.

Несмотря на существование рекомбинантных вакцин против инфекционных заболеваний, многие из них, например, гепатит В, до сих пор 7 является причиной стойкой виремии у людей. В мире насчитывается около 350 миллионов хронических носителей вируса гепатита В, что составляет 5% от общей численности населения Земли. От 75 до 100 миллионов из них погибают от цирроза печени или гепатоцеллюлярной карциономы (Sunil Kumar et al., 2007). Рекомбинантные вакцины против гепатита В на основе дрожжей-продуцентов дорогостоящи, что ограничивает их применение в массовых программах иммунизации в развивающихся странах. Вакцины на основе растений могут стать экономически выгодной альтернативой. В 1992 году Мэйсон с соавторами впервые создали трансгенные растения табака, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg, HBs-антиген) (Mason et al., 1992). Показано, что HBs-антиген подвергается необходимому гликозилированию в растениях, собирается в вирусоподобные частицы и сохраняет иммуногенные свойства. Однако коммерческие вакцины против вируса гепатита В на основе трансгенных растений до сих пор не созданы.

Для создания коммерческих растительных вакцинных препаратов против гепатита В необходимо увеличение уровня экспрессии HBs-антигена, а также получение растений, не содержащих селективных маркеров устойчивости к антибиотикам и гербицидам с целью повышения биологической безопасности растений-продуцентов.

Цель данной работы — создать био безопасные трансгенные растения, синтезирующие поверхностный антиген вируса гепатита В в количестве, достаточном для проведения доклинических испытаний, и исследовать иммуногенность полученных растений-продуцентов в экспериментах на лабораторных животных.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Получить трансгенные растения, содержащие ген HBsAg под контролем различных промоторов.

2. Повысить уровень синтеза НВз-антигена в трансгенных растениях.

3. Создать биобезопасные безмаркерные растения, синтезирующие НВв-антиген.

4. Провести анализ иммуногенности на лабораторных мышах съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пучко, Елена Николаевна

выводы

1. Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (НВбА£) под контролем различных промоторов.

2. Показана тканеспецифическая экспрессия НВз-антигена под контролем комбинированных агробактериальных промоторов генов маннопин- и октопинсинтазы в корнях и культуре тканей растений.

3. Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген HBsAg под контролем промотора СаМУ 35Б с четырьмя энхансерами. Количество НВв-антигена достигало 0,1% от общего растворимого белка клеток растений.

4. С целью повышения биобезопасности вакцины против гепатита В созданы безмаркерные растения, синтезирующие НВв-антиген.

5. Проведен анализ иммуногенности съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений картофеля. Уровень антител в сыворотке крови иммунизированных мышей был значительно выше протективного (до 350 мМе/мл) и сохранялся в течение более года после начала вакцинации.

6. Полученные данные показывают перспективность использования безмаркерных трансгенных растений в качестве эффективной субстанции для производства съедобной вакцины против гепатита В.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. За последние годы в растениях синтезировано множество ценных белков - белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Растительные клетки имеют энзиматические системы посттрансляционной модификации, необходимые для сборки синтезируемых мономерных белков вакцины в иммуногенные мультимерные формы. В растениях можно осуществить полноценный синтез целевых антигенов, способных вызывать активный иммунный ответ (Mason а. Arntzen, 1995). Интенсивно разрабатывается концепция «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу. При этом отпадает потребность в дорогостоящей очистке антигенов, которая необходима для создания вакцин с парентеральным способом введения (Walmsley a. Amtzen, 2000). Антигены, экспрессируемые в растениях при прохождении пищеварительного тракта и могут быть доставлены к клеткам слизистой оболочки, ответственным за мукозную систему иммунитета.

Синтезированный в растениях поверхностный антиген вируса гепатита В по своим физико-химическим и иммунологическим свойствам не отличается от антигена, полученного из клеток дрожжей и при введении в организм стимулирует образование специфичных антител (Thanavala et al., 1995). Поскольку HBs-антиген собирается в растительных клетках в мультимерные частицы, которые накапливаются внутри мембранных везикул, то такая естественная "биоинкапсуляция" в растительной клетке защищает антиген от агрессивного воздействия в пищеварительном тракте до тех пор, пока он не вступит в контакт с эффекторами иммунной системы на слизистой поверхности кишечника (Kong et al., 2001).

Результаты данной работы подтвердили возможность использования трансгенных растений в качестве продуцентов вакцины против гепатита В, в том числе и съедобной.

Нами получены трансгенные растения, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В. Для осуществления тканеспецифической экспрессии НВз-антигена сконструированы плазмиды, содержащие ген HBsAg под контролем модифицированных промоторов генов маннопин- и октопинсинтазы агробактерий (Аос8)ЗАшаБРша8. Наибольшее содержание НВэ-антигена обнаружено в корнях растений, что подтверждает тканеспецифичность используемых промоторов. На основе нескольких линий растений получены культуры «косматых» корней и каллусные культуры с уровнем синтезированного НВБ-антигена до 0,01% от общего растворимого белка.

Увеличить синтез НВв-антигена в трансгенных растениях удалось, используя промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты СаМУ 358 с четырьмя энхансерами. Количество ИВБ-антигена в полученных растениях достигало 0,1% от общего растворимого белка клеток растений, что является уровнем, достаточным для проведения доклинических испытаний.

С целью повышения биобезопасности трансгенных растений нами получена векторная конструкция рВМ-А§, не содержащая селективного гена устойчивости к канамицину. Разработан метод отбора регенерантов трансгенных растений, основанный на использовании иммуноферментного анализа. В результате получены безмаркерные растения табака и томата. Показан стабильный синтез НВБ-антигена в растениях поколения

Проведены длительные испытания иммуногенности съедобной вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений картофеля. Уровень антител в сыворотке крови иммунизированных мышей был значительно выше протективного (до 350 мМе/мл) и сохранялся в течение более года после начала вакцинации. До настоящего времени не существовало данных о мониторинге иммунитета к вирусу гепатита В такой продолжительности при использовании

87 трансгенных растений в качестве съедобной вакцины.

Полученные данные подтверждают перспективность использования безмаркерных трансгенных растений в качестве эффективной субстанции для производства съедобной вакцины против гепатита В.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пучко, Елена Николаевна, Пущино

1. Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита: Практическое руководство. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. 432 с.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480 с.

3. Михайлов М.И. В третье тысячелетие без гепатитов // Медицина для всех. 1999. №2. С. 1-3.

4. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир. 2000. 592 с.

5. Ростовцева Л.И., Андронова Т.М., Малькова В.П., Сорокина И.Б., Иванов В.Т. Синтез и противоопухолевое действие гликопептидов, содержащих N-ацетилглюкозаминил-(р1—>4)-1^-ацетилмурамил-дисахаридное звено // Биоорганическая химия. 1981. Т. 7. С. 1843-1858.

6. Рукавцова Е.Б., Абрамихина Т.В., Шульга Н.Я. и др. Тканеспецифическая экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в клетках трансгенных растений и культуры тканей // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 864-869.

7. Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Золова О.Э. и др. Комбинированное использование регулируемых промоторов и прививок в генноинженерной биотехнологии растений // Биотехнология. 1996. № 9. С. 24-28.

8. Ю.Рукавцова Е.Б., Гаязова А.Р., Чеботарева Е.Н., Бурьянов Я.И. Получение свободных от дополнительных генетических маркеров растений, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2009а. Т. 45. С. 1055-1060.

9. П.Рукавцова Е.Б., Захарченко Н.С., Пиголева С.В. и др. Получение безмаркерных трансгенных растений // Доклады РАИ. 20096. Т. 426. С. 261264.

10. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я. и др. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В //Генетика. 2003. Т. 39. С. 51-56.

11. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Крымский М.А. и др. Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях картофеля и его характеристика // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1422-1430.

12. Эмонд Р., Роуланд X., Уэлсби Ф. Инфекционные болезни. М.: Практика. 1998. 439 с.

13. Agraz A., Duarte С.A., Costa L., Fontirrochi G. Immunoaffinity purification of recombinant hepatitis В surface antigen from yeast using a monoclonal antibody // J. Chromatogr. A. 1994. V. 672. P. 25-33.

14. Almquist K.C., McLean M.D., Niu Y. et al. Expression of an anti-botulinum toxin 1 A neutralizing single-chain Fv recombinant antibody in transgenic tobacco // Vaccine. 2006. V. 24. P. 2079-2086.

15. Alvarez M.L., Pinyerd H.L., Crisantes J.D. et al. Plant-made subunit vaccine against pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice // Vaccine. 2006. V. 24. P. 2477-2490.

16. Alvarez M.L., Pinyerd H.L., Topal E., Cardineau G.A. P19-dependent and P19-independent reversion of Fl-V gene silencing in tomato // Plant Mol. Biol. 2008. V. 68. P. 61-79.

17. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors // Plant Molecular Biology Manual / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. A3. P. 1-19.

18. Arakawa T., Chong D.K.X., Langridge W.H.R. Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin B subunit vaccine // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 292-297.

19. Arakawa T., Chong D.K.X., Lawrence M., Langridge W.H.R. Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. V. 6. P. 403-413.

20. Araki H., Jearnpipatkul A., Tatsumi H. et al. Molecular and functional organization of yeast plasmid pSRl // J. Mol. Biol. 1985. V. 182. P. 191-203.

21. Arntzen C.J., Mahoney R.T. Plant-derived vaccines: a new approach to international public health // J. Food Sci. 2004. V. 69. P. 8-15.

22. Barta A., Sommergruber K., Thompson D. et al. The expression of a nopaline synthase human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant Mol. Biol. 1986. V. 6. P. 347-357.

23. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513.

24. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

25. Brown J.L., Carman W.F., Thomas H.C. The hepatitis B virus // Clin. Gastroenterol. 1990. V. 4. P. 721-746.

26. Castañón S., Marin M.S., Martín-Alonso J.M. et al. Immunization with potato plants expressing VP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus // J. Virol. 1999. V. 73. P. 4452-4455.

27. Cheon B.Y., Kim H.J., Oh K.H. et al. Overexpression of human erythropoietin (EPO) affects plant morphologies: retarded vegetative growth in tobacco and male sterility in tobacco and Arabidopsis II Transgenic Res. 2004. V. 13. P. 541-549.

28. Chikwamba R.K., Scott M.P., Mejia L.B. et al. Localization of a bacterial protein in starch granules of transgenic maize kernels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11127-11132.

29. Chong D.K.X., Langridge W.H.R. Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 71-78.

30. Crawley M.J., Hails R.S., Rees M., Kohn D., Buxton J. Ecology of transgenic oilseed rape in natural habitats //Nature. 1993. V. 363. P. 620-623.

31. Dale E.C., Ow D.W. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 10558-10562.

32. Dale P.J. Spread of engineered genes to wild relatives // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 30-32.

33. Daley M., Knauf V.C., Summerfelt K.R., Turner J.C. Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants // Plant Cell Rep. 1998. V. 17. P. 489496.

34. Daniell H., Lee S.B., Panchal T., Weibe P.O. Expression of native cholera toxin B subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts //J. Mol. Biol. 2001a. V. 311. P. 1001-1009.

35. Daniell H., Mathukumar B., Lee S. B. Marker free transgenic plants: engineering the chloroplast genome with the use of antibiotic selection // Curr. Genet. 2001b. V. 39. P. 109-116.

36. Daniell H., Singh N., Mason H., Streatfield S. Plant-made vaccine antigens and biopharmaceuticals // Trends Plant Sci. 2009. V. 14. P. 669-679.

37. Depicker A., Herman L., Jacobs A., Schell J., Van Montagu M. Frequencies of simultaneous transformation with different T-DNAs and their relevance to the

38. Agrobacterium plant cell interaction I I Mol. Gen. Genet. 1985. V. 201. P. 477484.

39. De Rocher E.J., Vargo-Gogola T.C., Diehn S.H., Green P.J. Direct evidence for rapid degradation of Bacillus thuringiensis toxin mRNA as a cause of poor expression in plants // Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 1445-1461.

40. De Vetten N., Wolters A. M.5 Raemakers K. et al. A transformation method for obtaining marker-free plants of a cross-pollinating and vegetatively propagated crop //Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 439-442.

41. DeWilde C., Peeters K., Jacobs A., Peck I., Depicker A. Expression of antibodies and Fab fragments in transgenic potato plants: a case study for bulk production in crop plants //Mol. Breed. 2002. V. 9. P. 271-282.

42. De Zoeten G.A., Penswick J.R., Horisberger M.A. et al. The expression, localization, and effect of a human interferon in plants // Virology. 1994. V. 172. P. 213-222.

43. Dieryck W., Pagnier J., Poyart C. et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco//Nature. 1997. V. 386. P. 29-30.

44. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. 1987. V.19. P. 11-15.

45. Draper J., Scott R., Hamil J. Transformation of dicotyledonous plant cells using the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens and the Ri plasmid of A. rhizogenes II Plant Genetic Transformation and Gene Expression. 1988. P. 69-160.

46. Ebinuma H., Komamine A. MAT (Multi-Auto-Transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of marker-free transgenic plants // In Vitro Cell. Dev. Biol. 2001. V. 37. P. 103-113.

47. Edwards K., Johnstone C., Thomson C.A. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

48. Ehsani P., Khabiri A., Domansky N.N. Polypeptides of hepatitis B surface antigen produced in transgenic potato // Gene. 1997. V. 190. P. 107-111.

49. Etchberger J.F., Hobert O. Vector-free DNA constructs improve transgene expression in C. elegans //Nat. Methods. 2008. V. 5. P. 3.

50. Ewen S.W., Pusztai A. Effects of diets containing genetically modified potatoes expressing Galanthus nivalis lectin on rat small intestine // Lancet. 1999. V. 354. P. 1726-1727.

51. Fernandez-San Millan A., Mingo-Castel A., Miller M., Daniell H. A chloroplast transgenic approach to hyperexpress and purify human serum albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation // Plant Biotechnol. 2003. V. l.P. 77-79.

52. Fiedler U., Phillips J., Artsaenko O., Conrad U. Optimization of scFv antibody production in transgenic plants // Immunotechnology. 1997. V. 3. P. 205-216.

53. Fischer R., Schumann D., Zimmermann S. et al. Expression and characterization of bispecific single-chain Fv fragments produced in transgenic plants // Eur. J. Biochem. 1999. V. 262. P. 810-816.

54. Freytag L.C., Clements J.D. Mucosal adjuvants // Vaccine. 2004. V. 23. P. 18041813.

55. Frisch D.A., Harris-Haller L.W., Yokubaitis N.T. et al. Complete sequence of the binary vector Bin 19 //PlantMol. Biol. 1995. V. 27. P. 405-409.

56. Galeffi P., Lombardi A., Pietraforte I. et al. Functional expression of a single-chain antibody to ErbB-2 in plants and cell-free systems // J. Translational Medicine. 2006. V. 4. P. 1-13.

57. Gallie D.R., Kado C.I. A translational enhancer derived from tobacco mosaic virus is functionally equivalent to a Shine-Dalgarno sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 129-132.

58. Gao Y., Ma Y., Li M. et al. Oral immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg // World J. Gastroenterol. 2003. V. 9. P. 996-1002.

59. Gelvin S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 16-37.

60. Gomez N., Carillo C., Salinas J. et al. Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis coronavirus in transgenic plants // Virology. 1998. V. 249. P. 352-358.

61. Guy B. The perfect mix: recent progress in adjuvant research // Nat. Rev. Microbiol. 2007. V. 5. P. 505-517.

62. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen C.J. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. V. 268. P. 714-716.

63. Hernould M., Suharsono S., Litvak S., Araya A., Mouras A. Male-sterility induction in transgenic tobacco plants with an unedited atp9 mitochondrial gene from wheat//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 2370-2374.

64. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. V. 342. P. 76-78.

65. Hobbs S.L., Warkentin T.D., DeLong C.M. Transgene copy number can be positively or negatively associated with transgene expression // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 17-26.

66. Hoekema A., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. Transfer of octopine T-DNA segment to plant cells mediated by different types of Agrobacterium tumour- or root-inducing plasmids: generality of virulence systems // J. Bacteriol. 1984. V. 158. P. 383-385.

67. Hoess R.H., Abremski K. Mechanism of strand cleavage and exchange in the Cre-lox site-specific recombination system // J. Mol. Biol. 1985 V. 181. P. 351-362.

68. Holger P. Marker-free transgenic plants // Plant Cell, Tissue a. Organ Culture. 2003. V. 74. P. 123-134.

69. Kang T.J., Loc N.H., Jang M.O. et al. Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization // Transgenic Res. 2003. V. 12. P. 683-691.

70. Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus // FASEB J. 1999. V. 13. P. 1796-1799.

71. Khoudi H., Laberge S., Ferullo J.-M. et al. Production of diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants // Biotechnol. Bioengin. 1999. V. 64. P. 135143.

72. Ko K., Tekoah Y., Rudd P.M. et al. Function and glycosylation of plant-derived antiviral monoclonal antibody // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 8013-8018.

73. Komari T., Hiei Y., Saito Y. et al. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers // Plant J. 1996. V. 10. P. 165-174.

74. Koncz C., Martini N., Szabados L. et al. Specialized vectors for gene tagging and expression studies // Plant Mol. Biol. Manual. / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1994. B. 2. P. 1-22.

75. Koncz C., Shell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector//Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P. 383-396.

76. Kong Q., Richter L. Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. V. 98. P. 11539-11544.

77. Lacks S., Greenberg B. Complementary specificity of restriction endonucleases of Diplococcus pneumoniae with respect to DNA methylation // J. Mol. Biol. 1977. V. 114. P. 153-168.

78. Langridge W.H.R., Fitzgerald K.J., Koncz C., Schell J., Szalay A.A. Dual promoter of Agrobacterium tnmefaciens mannopine synthase genes is regulated by plant growth hormones //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. V. 86. P. 3219-3223.

79. Larrick J.W., Yu L., Naftzger C. et al. Production of secretory IgA antibodies in plants // Biomol. Eng. 2001. V. 18. P. 87-94.

80. Lau J.M., Korban S.S. Analysis and stability of the respiratory syncytial virus antigen in a T3 generation of transgenic tomato plants // Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2009. V. 96. P. 335-342.

81. Lau JM, Korban SS. Transgenic apple expressing an antigenic protein of the human respiratory syncytial virus // J. Plant Physiol. 2010. V. 167. 920-927.

82. Lee J.S., Choi S.J., Kang H.S. et al. Establishment of a transgenic tobacco cellsuspension culture system for producing murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor // Mol. Cell. 1997. V. 7. P. 783-787.

83. Leite A., Kemper E.L., da Silva M.J. et al. Expression of correctly processed human growth hormone in seeds of transgenic tobacco plants // Mol. Breed. 2000. V. 6. P. 47-53.

84. Liu Y.L., Wang J.F., Qiu B.S. et al. Expression of human hepatitis B virus surface antigen gene in transgenic tobacco // Sci. China (Series B). 1994. V. 37. P. 37-41.

85. Lodish H., Berk A., Zipursky L.S. et al. Molecular Cell Biology. N.Y.: W.F. Freeman. 2000. 294 pp.

86. Lutz K.A., Bosacchi M.H., Maliga P. Plastid marker-gene excision by transiently expressed CRE recombinase //Plant J. 2006. V. 45. P. 447-456.

87. Ma J.K.C., Hiatt A., Hain M. et al. Generation and assembly of secretory antibodies in plants // Science. 1995. V. 268. P. 716-719.

88. Ma J.K.C., Hikmat B.Y., Wycoff K. et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 601-606.

89. Magnuson N.S., Linzmaier P.M., Reeves R. et al. Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture // Protein Exp. Purif. 1998. V. 13. P. 43-52

90. Maliga P. Progress towards commercialization of plastid transformation technology // Trends Biotechnol. 2003. V. 21. P. 20-28.

91. Mason H.S., Arntzen C.J. Transgenic plants as vaccine production systems // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. P. 388-392.

92. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 5335-5340.

93. Mason H.S., Haq T.A., Clements J.D., Arntzen C.J. Edible vaccine protects mice against E. coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene// Vaccine. 1998. V. 16. P. 1336-1343.

94. Mason H.S., Lam D.M.-K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1174511749.

95. Masterson R.V., Furtek D.B., Grevelding C., Schell J. A maize Ds transposable element containing a dihydrofolate reductase gene transposes in Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana //Mol. Gen. Genet. 1989. V. 219. P. 461-466.

96. Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R. Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells // Plant Mol. Biol. 1995. V. 27. P. 1163-1172.

97. Matzke M.A., Matzke A.J.M., Mittelsten-Scheid O. Inactivation of repeated genes: DNA-DNA interaction? // Homologous Recombination in Plants. / Ed. Paszkowski J. Amsterdam: Kluwer Acad. Publ. 1994. P. 271-307.

98. Michel M.L. Towards immunotherapy for chronic hepatitis B virus infections // Vaccine. 2002. V. 20. P. 83-88.

99. McCormick A.A., Kumagai M.H., Hanley K. et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor derived single chain Fv epitopes in tobacco plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 703708.

100. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotechnology. 1995. V. 13. P. 14841487.

101. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.

102. Murray C., Sutherland P.W., Phung M.M. et al. Expression of biotin-binding proteins, avidin and streptavidin, in plant tissues using plant vacuolar targeting sequences // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 199-214.

103. Murray K. A molecular biologist's view of viral hepatitis // Proc. R. Soc. London. 1987. V. 230. P. 107-146.

104. Ni M., Cui D., Einstein J., Narasimhulu S., Vergara C.E., Gelvin S.B. Strength and tissue specificity of chimeric promoters derived from the octopine and mannopine synthase genes // Plant J. 1995. V. 7. P. 661-676.

105. Nykiforuk C.L., Boothe J.G., Murray E.W. et al. Transgenic expression and recovery of biologically active recombinant human insulin from Arabidopsis thaliana seeds // Plant Biotechnol. J. 2006. V. 4. P. 77-85.

106. Ohya K., Matsumura T., Ohashi K. et al. Expression of two subtypes of human IFN-alpha in transgenic potato plants // J. Interferon Cytokine Res. 2001. V. 21. P. 595-602.

107. Ow D.W. GM maize from site-specific recombination technology, what next? // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. V. 18. P. 115-120.

108. Panahi M., Cheng X., Alii Z. et al. Plant-derived human insulin-like growth factor precursor prohormone IGF-IB caused differentiation of human neuroblastoma cell lines SH-SY5Y //Mol. Breed. 2003. V. 12. P. 21-31.

109. Parmenter D.L., Boothe J.G., van Rooijen G.J.H. et al. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 1167-1180.

110. Patzer E.J., Nakamura G.R., Simonsen C.C., Levinson A.D., Brands R. Intracellular assembly and packaging of hepatitis B surface antigen particles occur in the endoplasmic reticulum // J. Virol. 1986. V. 58. P. 884-892.

111. Peterson D.L. Paul D.A. Lam J. Tribby I. Achord D.T. Antigenic structure of hepatitis B surface antigen: identification of "d" subtype determinant by chemical modification and use of monoclonal antibodies // J. Immunol. 1984. V. 132 P. 920-927.

112. Pniewski T., Kapusta J., Plucienniczak A. Agrobacterium-mediated transformation of yellow lupin to generate callus tissue producing HBV surface antigen in a long-term culture II J. Appl. Genet. 2006. V. 47. P. 309-318.

113. Qin M., Bayley C., Stockton T., Ow D.W. Cre recombinase-mediated site-specific recombination between plant chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 1706-1710.

114. Ranee I., Norre F., Gruber V., Theisen M. Combination of viral promoter sequences to generate highly active promoters for heterologous therapeutic protein over-expression in plants // Plant Sci. 2002.V. 162. P. 833-842.

115. Revenkova E.Y., Kraev A.S., Skryabin K.G. Construction of a disarmed derivative of the supervirulent Ti plasmid pTiBo542 // Plant Biotechnology and Molecular Biology / Ed. Skiyabin K.G. Moscow. 1993. P. 67-76.

116. Richter L., Thanavala Y., Arntzen C.J., Mason H.S. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1167-1171.

117. Rigano M.M., Alvarez M.L., Pinkhasov J. et al. Production of a fusion protein consisting of the enterotoxigenic Escherichia coli heat-labile toxin B subunit and a tuberculosis antigen in Arabidopsis thaliana II Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 502-508.

118. Rigano M.M., Dreitz S., Kipnis A.-P. et al. Oral immunogenicity of a plant-made, subunit, tuberculosis vaccine //Vaccine. 2006. V. 24. P. 691-695.

119. Rigano M.M., Walmsley A.M. Expression systems and developments in plant-made vaccines // Immunology and cell biology. 2005. V. 83. P. 271-277.

120. Rommens C.M., Humara J.M., Ye J. et al. Crop improvement through modification of the plant's own genome // Plant Physiol. 2004. V.135. P. 421-431.

121. Rose A.B. The effect of intron location on intron-mediated enhancement of gene expression in Arabidopsis II Plant J. 2004. V. 40. P. 744-751.

122. Ruf S., Hermann M., Berger I.J., Carrer H., Bock R. Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of foreign protein in fruit // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 870-875.

123. Santi L., Giritch A., Roy C.J. et al. Protection conferred by recombinant Yersinia pestis antigens produced by a rapid and highly scalable plant expression system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 861-866.

124. Sawahel W.A. The production of transgenic potato plants expressing human ainterferon using lipofectin-mediated transformation // Cell. Mol. Biol. Lett. 2002. V. 7. P. 19-29.

125. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silkelastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation // Transgenic Res. 2004. V. 13. P. 51-57.

126. Scutt C.P., Zubko E., Meyer P. Techniques for the removal of marker genes from transgenic plants // Biochimie. 2002. V. 20. P.383-392

127. Sekar V. A rapid screening procedure for the identification of recombinant bacterial clones // BioTechniques. 1987. V. 5. P. 11-13.

128. Semenyuk E.G., Stremovskiy O.A., Edelweiss E.F. et al. Expression of single-chain antibody-barstar fusion in plants // Biochimie. 2007. V. 89. P. 31-38.

129. Sidorov V.A., Kasten D., Pang S.-Z. et al. Stable chloroplast transformation in potato: use of green fluorescent protein as plastid marker // Plant J. 1999.V. 19. P.209-216.

130. Smith M.L. Mason H.S., Shuler M.L. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: kinetics of antigen accumulation in bath culture and its intracellular form //Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 80. P. 812-822.

131. Smith M.L. Richter L., Arntzen C.J., Shuler M.L., Mason H.S. Structural characterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oral immunization studies // Vaccines. 2003. V. 21. P. 4011-4021.

132. Sojikul P., Buehner N. Mason H.S. A plant signal peptide-hepatitis B surface antigen fusion protein with enhanced stability and immunogenicity expressed in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 2209-2214.

133. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

134. Staub J.M., Garcia B., Graves J. et al. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts //Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 333338.

135. Sternberg N., Hamilton D. Bacteriophage PI site-specific recombination between loxP sites // J. Mol. Biol. 1981. V. 150. P. 467-486.

136. Stibbe W., Gerlich W.H. Structural relationships between minor and major proteins of hepatitis B surface antigen// J. Virol. 1983. V. 46. P. 626-629.

137. Stoger E., Vaquero C., Torres E. et al. Cereal crops as viable production and storage systems for pharmaceutical scFv antibodies // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 583-590.

138. Streatfield S.J. Oral hepatitis B vaccines candidates produced and delivered in plant material // Immunol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 219-226.

139. Streatfield S.J., Jilka J.M., Hood E.E. et al. Plant-based vaccines: unique advantages // Vaccine. 2001. V. 21. P. 2742-2748.

140. Streatfield S.J., Lane J.R., Brooks C.A. et al. Corn as a production system for human and animal vaccines // Vaccine. 2003. V. 21. P. 812-815.

141. Strizhov N., Keller M., Mathur J. et al. A synthetic crylC gene, encoding a Bacillus thuringiensis 8-endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 15012-15017.

142. Sugita K., Kasahara T., Matsunaga E., Ebinuma H.A. Transformation vector for the production of marker-free transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency // Plant J. 2000. V. 22. P. 461-469.

143. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Bapat V.A. Production of hepatitis B surface antigen in recombinant plant systems: an update // Biotechnol. Prog. 2007. V. 23. P. 532-539.

144. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Revathi C.J., Prasad K.S.N., Bapat V.A. Expression of hepatitis B surface antigen B in tobacco cell suspension cultures // Protein Expr. Purif. 2003. V. 32. P. 10-17.

145. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Revathi C.J., Srinivas L., Bapat V.A. Expression of hepatitis B surface antigen B in transgenic banana plants // Planta. 2005. V. 222. P. 484-493.

146. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Srinivas L. et al. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots // Plant Sci. 2006a. V. 170. P. 918-925.

147. Sunil Kumar G.B., Srinivas L., Ganapathi T.R., Bapat V.A. Hepatitis B surface antigen expression in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants using for different expression cassettes // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2006b. V.84. P. 315-323.

148. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes // J. Infect. Dis. 2000 V. 182. P. 302-305.

149. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 607-609.

150. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes. Sexual transmission of the transformed genotype and phenotype // Cell. 1984. V. 37. P. 959-967.

151. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S. et al. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 3378-3382.

152. Thanavala Y., Yang Y.F., Lyons P., Mason H.S., Arntzen C J. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 3358-3361.

153. Tiollais P., Cameron P., Briggs M. Virus like particles in serum of patients with Australia antigen associated hepatitis // Lancet. 1970. V. 1. P. 695-698.

154. Tiollais P., Pourcel C., Dejean A. The hepatitis B virus // Nature. 1985. V. 317. P. 489-495.

155. Torres E., Vaquero C., Nicholson L. et al. Rice cell culture as an alternative production system for functional diagnostic and therapeutic antibodies // Transgenic Res. 1999. V. 8. P. 441-449.

156. Tregoning J.S., Nixon P., Kuroda H. et al. Expression of tetanus toxin fragment C in tobacco chloroplasts // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1174-1179.

157. Trieu-Cuot P., Courvalin P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5'-aminoglycoside phosphotransferase type III // Gene. 1983. V. 23. P. 331-334.

158. Tuboly T., Yu W., Bailey S. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2023-2028.

159. Van Aarssen R., Soetaert P., Stam M. et al. CryIA(b) transcript formation in tobacco is inefficient//PlantMol. Biol. 1995. V. 28. P. 513-524.

160. Verch T., Yusibov V., Koprowski H. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector // J. Immunol. Methods. 1998. V. 220. P. 69-75.

161. Voss A., Niersbach M., Hain R. et al. Reduced virus infectivity in N. tabacum secreting a TMV-specific full-size antibody // Mol. Breed. 1995. V. 1. P. 39-50.

162. Walmsley A.M., Arntzen C.J. Plants for delivery of edible vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. V. 11. P. 126-129.

163. Yin J., Li G., Ren X., Herrler G. Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes // J. Biotechnol. 2007. V. 127. P. 335-347.

164. Yoder J.I., Goldsbrough A.P. Transformation system for generation markerfree transgenic plants // Biotechnology. 1994. V. 12. P.263-267.

165. Yoder J.I., Palys J., Alpert K., Lassner M. Ac transposition in transgenic tomato plants // Mol. Gen. Genet. 1988. V. 213. P. 291-296.

166. Youm J.W., Jeon J.H., Kim H. et al. Transgenic tomatoes expressing human beta-amyloid for use as a vaccine against Alzheimer's disease // Biotechnol. Lett. 2008. V. 30. P. 1839-1845.

167. Zeitlin L., Olmsted S.S., Moench T.R. et al. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immnoprotection of the vagina against genital herpes //Nat. Biotechnol. 1998. V.16. P. 1361-1364.

168. Zhang C.L., Chen D.F., McCormac A.C. et al. Use of the GFP reporter as vital marker for Agrobacterium-mQdiated transformation of sugar beet (Beta vulgaris L.) //Mol. Biotechnol. 2001. V. 17. P. 109-117.

169. Zhang H., Liu M., Li Y. et al. Oral immunogenicity and protective efficacy in mice of a carrot-derived vaccine candidate expressing UreB subunit against Helicobacter pylori II Protein Exp. Purif. 2010. V. 69. P. 127-131.

170. Zheng G.-G., Yang Y.-H., Rao Q. et al. Expression of bioactive human M-CSF soluble receptor in transgenic tobacco plants // Protein Expr. Purif. 2006. V. 46. P. 367-373.

171. Zhong G.-Y., Peterson D., Delaney D.E. et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds // Mol. Breed. 1999. V. 5. P. 345-356.

172. Zhu Z., Hughes K., Huang L. et al. Expression of human a-interferon cDNA in transgenic rice plants // Plant Cell, Tissue a. Organ Culture. 1994. V. 36. P. 197204.

173. Zuo J.R., Nui Q.W., Moller S.G., Chua N.H. Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 157-161.1. Благодарности