Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений

Сташевски, Зенон

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений"

На правах рукопис

Сташевски Зенон

ТРАНСГЕНЕЗ РУУ"™-СР ГЕНОМ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ У ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВИРУ СО УСТОЙЧИВЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 [^ОЯ 2С

Казань-2009

003482364

Работа выполнена в лаборатории селекции картофеля ГНУ Татарского научно-исследовательского института сельскохозяйственных наук РАСХН

доктор биологических наук, профессор Ильинская Ольга Николаевна

доктор биологических наук, профессор Бугаева Татьяна Вадимовна

кандидат биологических наук Уразов Наиль Гумерович

ФГОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», г. Москва

Защита состоится «26» ноября 2009 г. в ■*■> часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан » октября 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Абрамова З.И.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирусные болезни растений вызывают большие потери урожая экономически важных сельскохозяйственных культур во всем мире [Росс, 1989; Иванюк с соавт., 2005].

Из 30-и с лишним вирусов, которыми поражаются растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., У-вирус картофеля (YBK) в настоящее время является наиболее экономически значимым. YBK, впервые описанный Смитом в 1931 году [Smith, 1931], до сих пор является наиболее опасным патогеном картофеля. При высадке инфицированных YBK семенных клубней картофеля снижение урожайности культуры составляет от 30 до 85%, а в некоторых случаях достигает 100%, по сравнению с урожайностью свободного от вирусов семенного материала [Шпаар, 2004; Иванюк с соавт., 2005]. и другие некротические штаммы этого вируса вызывают системный некроз растений табака, что частично или полностью уничтожет его посадки [Kollar et al, 1993]. Штаммы YBK?™ и YBKrN-mlga вызывают некрозы на клубнях, снижая товарный вид и пищевую ценность картофеля [Вайдеманн с соавт., 1999; Иванюк с соавт., 2005]. В результате экспансии некротических штаммов YBK многие хорошо известные сорта табака и картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Horvatfa et al., 1999; Zagorska et al., 2000; Basky, 2002].

Семеноводство картофеля на безвирусной основе, позволяющее получать свободный от вирусов посадочный материал, является сложным и дорогостоящим мероприятием. Схема защиты от перезаражения растений чаще всего строится на многократном применение инсектицидов для. уничтожения переносчиков вирусов - крылатых тлей [Solomon-Blackburn et al., 2001b; Zamalieva et al., 2007]. Интенсивное применение химических средств защиты -не только дорогостоящее, но и небезопасное для окружающей среды и людей мероприятие.

Такие эпидемиологические особенности . YBK, как способность к перенесению большим числом крылатых тлей, а также появление все новых штаммов фитопатогена затрудняют его диагностику, селекцию на устойчивЬсть и борьбу с вирусом. Успехами селекции последних лет.доказана возможность выведения вирусоусгойчивых сортов картофеля. Источниками устойчивости служат примитивные дикие виды и культурные сорта картофеля, несущие гены устойчивости [Росс, 1989; Solomon-Blackburn et at., 2001а]. Методы классической селекции имеют ряд ограничений, главным из которых является длительность создания вирусоусгойчивых сортов. Новые возможности в создании устойчивых к вирусам сортов картофеля открываются в связи с разработкой способов получения трансгенных растений. Для создания трансгенной вирусоустойчивости используются разные фрагменты генома самого вируса. Среди всех функциональных последовательностей вируса для трансформации растений наиболее широко используется ген белка оболочки вируса. В 1986 году было обнаружено появления устойчивости растений табака к вирусу табачной мозаики при внедрении в растение гена белка оболочки этого вируса [Powell-Abel et al., 1986]. Впоследствии подобная устойчивость была получена в отношении вирусов различных таксономических групп у иболее

распространенных сортов табака и картофеля [James, 1998; Solomon-Blackburn et al,, 2001b].

На основании вышесказанного особую актуальность приобретает создание устойчивых к вирусам трансгенных растений табака и картофеля, несущих ген белка оболочки особо опасного некротического штамма YBK. Оценка эффективности регенерации растений табака и картофеля, трансформированных с помощью Agrobacterium tumefaciens, будет иметь большое теоретическое и практическое значение для повышения эффективности генетической трансформации экономически важных сельскохозяйственных культур. Изучение вирусоустойчивости трансгенных растений позволит углубить понимание механизмов взаимоотношения в системе растение-вирус, что в свою очередь поможет в разработке новых подходов защиты от опасных фитопатогенов. Создание и комплексный анализ трансгенных растений с новыми биологическими свойствами имеет важное значение для биохимии, молекулярной биологии растений, а также для использования таких растений в сельскохозяйственном производстве. Культивирование вирусоустойчивых растений имеет большое значение в локальном и глобальном масштабах для сохранения биоразнообразия сортов сельскохозяйственных культур, обладающих уникальными свойствами, но исчезнувших с производства в связи с распространением опасных фитопатогенов. Прямое практическое значение будет иметь повышение вирусоустойчивости перспективных сортов табака и картофеля, и тем самым восстановление их привлекательности для сельскохозяйственного производства.

Цель и задачи исследований. Целью- настоящей работы явилось создание устойчивых к вирусам трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solatium tuberosum L., несущих PVf™-CP ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Оценить эффективность регенерации растений из разных видов эксплантов табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solarium tuberosum L. для использования в генетической модификации растений с помощью агробактериальной трансформации.

2. Провести генетическую трансформацию растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L. PVY'-CP геном белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

,3. Показать интеграцию и экспресию PVY^^-CP гена в канамицин-устойчивых регенерантах табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L.

4. Вьивить устойчивые к вирусам трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущие ген PV}mN-CP.

5. Выявить и охарактеризовать тип устойчивости трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущих ген РУГ^-СР.

Научная новизна. Генная конструкция pGAYHCP, содержащая ген PVY^-CP, клонированный из венгерского изолята штамма YBRf™ кольцеобразного некроза клубней, впервые была использована для генетической

трансформации растений картофеля S. tuberosum L. Растения сортов картофеля S. tuberosum L. Минденеш и Самодий кифли, и сортов табака N. tabacum L. Вирджин Д, Стамм С2 и Хевеши 11 были впервые вовлечены в эксперимент по созданию генетически модифицированных растений. Была показана эффективность использования дисков микроклубней картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли для трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens.

Впервые получены трансгенные растения табака и картофеля, несущие ген PVY^^-CP YBIC™. Проведены комплексные молекулярно-биохимические исследования полученных трансгенных растений табака и картофеля. Установлен разный уровень экспрессии СР гена в независимых линиях трансгенных растений табака и картофеля.

Проведены комплексные (лабораторные и полевые) исследования вирусоустойчивости трансгенных растений, несущих PVY^^-CP ген YBK?*™, к двум штаммам YBK (УВЬР*0, принадлежащим к разным серотипам.

Впервые показано проявление патоген-опосредованной крайней вирусоустойчивости у трансгенных растений, полученных при генетической трансформации растений табака сортов Вирджин Д, Стамм С2 и Хевеши И, и картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли генной конструкцией, содержащей PVY^m-CP ген YBP^TN. Результаты настоящей работы свидетельствуют о сохранении хозяйственно-ценных признаков исходных сортов у вновь созданных трансгенных линий. Показано существенное повышение урожайности и качества получаемой продукции, у созданных растений трансгеных линий табака и картофеля.

Практическая значимость. Перспективы внедрения результатов работы определяется двумя аспектами: экономической значимостью картофеля и огромной вредоносностью YBK. В мировом масштабе картофель занимает 4-ое место по объемам производства. Во многих странах он составляет основу продовольственной безопасности. Картофель - универсальная сельскохозяйственная культура, также служит сырьем для пищевого и промышленного производства. В связи с этим снижение опасности системных последствий распространения болезней, вызываемых YBK, реально уменьшит негативное влияние на экономику стран - производителей картофеля. Полученные трансгенные растения табака и картофеля, обладающие крайней устойчивостью к YBK, могут быть использованы в виде новых сортов в сельскохозяйственном производстве и вовлечены в селекционные программы по созданию вирусоустойчивых сортов табака и картофеля методами традиционной селекции. В целом проведенная работа служит наглядным примером сохранения биоразнообразия сортов сельскохозяйственных культур, обладающих уникальными свойствами, но исчезнувших с полей из-за с распространения опасных фитопатогенов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводится в соответствии с тематическим планом НИР ГНУ ТатНИИСХ РАСХН 17.01.01. «Создать сорта картофеля с высоким потенциалом продуктивности, устойчивые к болезням и неблагоприятным условиям среды» (2002-2005 гг.), по заказу МСХиП РТ тема

27 «Создать высокопродуктивные сорта картофеля, устойчивые к болезням и неблагоприятным условиям среды» (2002-2005 гг.) Авторские исследования получили персональную, поддержку программ UNESCO/BETCEN и Program Biotechnology 2000, Центра сельскохозяйственной, биотехнологии, г. Гёдёлё, Венгрия, в рамках которых были созданы трансгенные растения. Полевые испытания .вирусоуст;ойчивосгги, полученных трансгенных растений проведены на базе Института селекции картофеля, г. Кестхей, Венгрия (лицензия на испытания генетически модифицированных организмов № 54.570/3/2000) в рамках персонального гранта автора фонда ALF (№ LT97560). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее эффективно регенерация трансгенных растений, выявленных по признаку канамицин-устойчивости, трех сортов табака (Вирджин Д, Стамм С2, Хевеши 11) происходит из срезов листовых пластинок, а у двух сортов картофеля (Минденеш, Самодий кифли) из дисков микроклубней.

2. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L. содержат PVYm'CP ген и синтезируют белок оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y вируса картофеля.

3. Трансгенные растения двух сортов картофеля Solanum tuberosum L. и трех сортов табака Nicotiana tabacum L-, несущие PVY^CP-ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля обладают устойчивостью к двум штаммам (YBI<°/C и YßK^™) Y-вируса картофеля.

4. Восемь независимых линии трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущие РРУ^СР-ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля, обладают крайней устойчивостью к двум штаммам {YBH?'C и YBK^™) Y-вируса картофеля.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Итоговой отчетной конференции Института ботаники " Institute of Botany annual report" (Вильнюс, 1998), I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» (Минск, 2005), 10-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), Международном конгрессе «Картофелеводство России: актуальные проблемы науки и практики» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Повышение эффективности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству» (Казань, 2008), 17-ой конференции Европейской Ассоциации по исследованиям картофеля (Брашов, 2008), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 2008), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным

университетом и Гиссенским университетом им Ю. Либиха Российско-германской международной конференции «Развитие междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад DAAD» (Казань, 2009), а также на итоговых научных конференциях ГНУ ТатНИИСХ (2001-2008) и научных семинарах кафедры микробиологии Казанского государственного университета (2008,2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, включает 20 таблиц, 16 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 237 источников, из них 219 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Вектором для генетической трансформации служила генная конструкция pGAYHCP, созданная Коллар с соавторами [Kollar et al., 1993], несущая ген руун™_ср YBK*™ (Венгерский изолят PVY-H) [Beczner et al., 1984] под контролем промотора PcaMv 35s вируса мозаики цветной капусты и селективный маркерный ген NTP II для растений, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину, в пределах Т-ДНК области (рисунок 1).

LB IY.MV -lis PVY^-CP Tnos Pnos NTP II Tnos RB

Рисунок 1 - Схема Т-ДНК вектора для экспрессии PVY^-CP гена в растениях. Структура Т-ДНК вектора, использованного для получения трансгенных растений картофеля. LB и RB - левая и правая границы Т-ДНК, соответственно; PcaMv 35s - 35S промотор вируса мозаики цветной капусты; PVY^-CP - ген белка оболочки PVY*1™, Tnos - терминатор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens, Pnos - промотор гена нопалинсинтазы А. tumefaciens, NTP II - ген неомицин-фосфотрансферазы II, селективный маркерный ген для растений.

Трансформацию растений табака и картофеля проводили с использованием Gram- С58С1 (Rif) штамма Agrobacterium tumefaciens [Zambryski et al., 1983].

Вирусные штаммы. Вирусологический анализ трансгенных растений проводили с использованием очищенных вирусных частиц двух штаммов: YBK1™ (изолят D-10) и YBI<0/C (изолят Ка-49) [Wolf ei al., 2000].

Асептические, безвирусные растения картофеля Solanum tuberosum L. двух сортов венгерской селекции Минденеш (М) и Самодий кифли (SK) (из коллекции Института селекции картофеля (г. Кеегхей, Венгрия) были использованы для создания трансгенных растений. Оба сорта характеризуются низкой устойчивостью к YBK?™.

Растения табака Nicotiana tabacum L.. использованные для создания трансгенных растений, были представлены германским сортом Вирджин Д (VD), германским гибридом Стамм С2 (SC) и венгерским сортом Хевеши 11 (Hl I).

Растения вышеперечисленных сортов и гибрида являются неустойчивыми к YBK01 и Семена были получены из селекционно-семеноводческой компании

"Agrotab Breding and Seed Production Ltd. (г. Дебрецен, Венгрия).

Культивирование растений в асептической культуре и создание трансгенных растений. Для выращивания нетрансгенных растений табака и картофеля использовалась питательная среда Мурасиге и Скуга (MC) [Murashige et al., 1962]. Микроклубни получали в асептической культуре на микрочеренках растений картофеля [Borque et al., 1987]. Трансформацию дисков микоклубней, и регенерацию растений картофеля проводили согласно указаниям Ишида с соавторами [lshidae/ al., 1989]. Трансформацию листовых и стеблевых эксплантов, и регенерацию растений картофеля проводили согласно указаниям Ан с соавторами [An et ai, 1986]. Трансформацию срезов листовых пластинок и сегментов корней, и регенерацию растений табака проводили согласно указаниям Хорш с соавторами [Horsch et al., 1988].

Анализ интеграции PV)^TN-CP гена в геноме Кшг-регенерантов табака и картофеля проводили с помощью ПЦР [Jozsa et al., 2002] и Саузерн-блоттинг гибридизации [Sambrook et al., 1989].

Определение экспрессии PVY^'^'-CP гена в трансгенных растениях проводили методом нозерн-блоттинг гибридизации и с помощью иммуноблотинга (вестерн-блоттинг анализ) [Sambrook et al.. 1989]. Радиоактивные зонды для нозерн-блотгинг гибридизации готовили методом включения 32Р- радиоактивно меченых нуклеотидов во время синтеза РНК с помощью ДНК-зависимой РНК полимеразы фага Т7 на матрице - линейной плазмиде, содержащей P\rïN™-CP ген [Sambrook et al., 1989]. При вестерн-блоттинг анализе для выявления белка оболочки в исследуемых образцах трансгенных растений использовали антитела, специфичные к YBK, сопряженных с щелочной фосфатазой (Anti-potato virus Y-antibody-AP-conjugate Boehringer Mannheim GmbH Cat No. 647 420).

Определение вирусной РНК в растениях табака проводили с помощью дот-блот анализа [Sambrook et al., 1989].

Определение YBK в растениях проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), используя поликлональные антитела к YBK (Loewe Biochemica Gmbh) согласно методике, описанной Кларк и Адаме [Clark et al., 1977] и с помощью биотеста на индикаторных растениях межвидового гибрида А6 S. demissum х S. tuberosum.

Определение вирусоустойчнвостн трансгенных растений картофеля проводили с помощью (1) искусственного* заражения растений картофеля очищенными вирусными препаратами двух штаммов YBK (YBKи YBK?C) в теплице, (2) заражения с помощью переносчиков вирусов (крылатых тлей) в условиях высокого инфекционного фона УВК^Ш в полевых условиях и (3) инокуляции методом прививки па инфицированные YBK*1™ растения табака и томата.

Определение пирусоустойчивости трансгенных растений табака проводили с помошыо (1) искусственного заражения растений табака очищенными вирусными препаратами двух штаммов YBK (УВК^Ш и YBK°C ) в теплице и (2)

заражения с помощью переносчиков вирусов (крылатых тлей) в условиях высокого инфекционного фона УВ1Ст в полевых условиях.

Результаты исследований

Получение микроклубней картофеля ¿"условиях асептической культуры. Среднее количество микроклубней на один микрочеренок составило 0,88 штук у сорта Минденеш и 0,92 штуки у сорта Самодий кифли. У сорта Минденеш 86% микроклубней картофеля были больше 3 мм. Данный показатель у сорта Самодий кифли был ниже и составил 61%. У данного сорта 39% микроклубней были меньше Змм.

Подбор эксплантов для трансформации. В результате проведенного исследования в качестве эксплантов для со-культивации с А. Ште/аЫепя были определены срезы листовых пластинок (1-2 см2) табака и диски микроклубней картофеля (таблица 1).

Таблица 1

Регенерация растений табака и картофеля из эксплантов, трансформированных генной конструкцией рвАУНСР с помощью штамма С58С1 А. ште/аЫепх____

сорт Тип эксплшгга Экспланты Регенераты Регенераты на один эксплант

Табак N. tabacum L.

Вирджин Д срезы листовых пластинок 10'/102/103 411 / О2 / 183 4,11 / О2 / 1,83

сегменты корней 20/20/20 0/0/0 0/0/0

Стамм С2 срезы листовых пластинок 10/10/10 63/0/34 6,3/0/3.4

сегменты корней 20/20/20 0/0/0 0/0/0

Хевеши 11 срезы листовых пластинок 10/10/10 37/0/13 3,7 / 0 / 1,3

сегменты корней 20 / 20 / 20 0/0/0 0/0/0

Картофель S. tuberosum L.

листья 10/10/10 8/0/1 0,8 / 0 / 0,05

Минденеш сегменты стеблей 20/20/20 14/0/0 0,35/0/0

диски микроклубней 10/10/10 18/0/9 1,8/0/0,9

Самодий кифли листья 10/10/10 6/0/0 0,6/0/0

сегменты стеблей 20/20/20 7/0/0 0,18/0/0

диски микроклубней 5/5/10 7/0/4 1,4/0/0,8

Примечания: - неинокулированные A. tumefaciens экспланты культивировали на соответствующих питательных средах для индукции каллусо- и побегообразования без добавления бактериостатического (Сх 500мг/л) и селективного агентов (Km 100 мг/л) 2 -неинокулированные A. tumefaciens экспланты культивировали на соответствующих питательных средах для индукции каллусо- и побегообразования (питательная среда + Сх 500мг/л + Km 100мг/л);3 -инокулированные A. tumefaciens экспланты культивировали на соответствующих питательных средах для индукции каллусо- и побегообразования (питательная среда + Сх 500мг/л + Km 100мг/л).

Трансформация и регенерация растений картофеля S tuberosum L. Прямую регенерацию Ктг-побегов с трансформированных дисков микроклубней картофеля проводили в течение 80 дней. Большинство регенерантов было получено в промежутке между 25-50 днями инкубации на канамицин содержащей селективной

среде (100 мг/л). Всего было получено 37 КлУ-регенерантов сорта Минденеш (рисунок 2) и 4 - сорта Самодий кифли.

Рисунок 2 (А) - Регенерация Ктг-микрорастений картофеля сорта Минденеш на питательной среде, содержащей селективный агент канамицин (100 мг/л). (Б) Тепличное трансгенное растение картофеля (М1 1), несущее ген РУ)'ти-СР.

Трансформация и регенерация растений табака N. ¡аЬасит Ь. Регенерация побегов табака проходила через промежуточную стадию образования каллуса по периметру листовых эксплантов с последующей индукцией регенерации побегов (рисунок ЗА). Концентрация селективного агента канамицина в питательной среде составила - 300 мг/л. Всего в результате агробактериальной трансформации срезов листовых пластинок табака было получено 116 линий Ктг-регенерантов табака: 38 из эксплантов сорта УЭ (рисунок ЗБ), 55 - из гибрида БС и 23 - из сорта Н11.

Рисунок 3 (А) - Регенерация побегов габака из трансформированных клеток листовых срезов табака сорта ЭС через стадию каллуса на селективной питательной среде, содержащей Кш (300 мг/л). (Б) - Укоренение регенерировавшего побега табака УОЗ на питательной среде, содержащей Кт (100 мг/л).

Анализ интеграции РУУМЪ-СР гена в геном растений табака и картофеля. Методом ПЦР интеграция Р\'Унп'-СР гена в геном растений была показана у 153 из 157 исследованных Ктг-регенерантов табака и картофеля (рисунок 4; таблица 2).

Рисунок 4 - ПЦР анализ Кт'-регенерантов картофеля сорта Минденеш на наличие гена в трансформированных растениях. 1 - отрицательный контроль -нетрансформированное растение сорта М; 2-8 - ДНК Кт'-регенерантов картофеля М2 МЗ, М4, М5, Мб, М7, М8; 9 - положительный контроль - ДНК плазмиды рбАУНСР; 10 -отрицательный контроль - ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы; 11 - маркер молекулярной массы - ДНК фага X, обработанная рестриктазой Р^Л.

Таблица 2

Результаты анализа интеграции РУУ^^-СР гена в геном растений табака и

картофеля

Линии трансгенных растений табака и картофеля, полученные из исходных сортов Количество, шт. Доля РУУ'^-СР (+) трансгенны.х растений от числа Кт'-регенерантов, %

руУ'Кср (+) Кгп- трансгенные регенераты растения

Табак

Вир джин Д 38 38 100

Стамм С2 55 53 96

Хевеши 11 23 23 100

Картофель

Минденеш 37 35 95

Самодий кифли 4 4 100

Всего 157 153

Изучение экспрессия РУ1^т-СР гена в трансгенных растениях табака и

картофеля. Анализ накопления РНК транскриптов РУУ*-СР гена был проведен у 3 трансгенных растений табака (БСЗ, УЭ7) и 3 трансгенных растений

картофеля (М2, МЗ, М4), несущих РУУ^-СР ген. Данный анализ также был проведен у Ктг-регенеранта картофеля Мб, у которого РУУ*™-С.Р ген не был выявлен с помощью ПЦР анализа (рисунок 4). Результаты Нозерн-блот анализа показали наличие РНК транскриптов трансгена во всех исследованных трансгенных растениях, несущих РУ}ШЫ-СР ген. РНК транскрипт трансгена отсутствовал у Кш'-регенеранта картофеля Мб, у которого РУ)ШК-СР ген не был выявлен с помощью ПЦР анализа (рисунок 5). Уровень накопления РНК транскриптов руу"™- СР гена в исследованных трансгенных растениях табака и картофеля был примерно одинаковым, за исключением линии У021, где выявлено меньшее количество РНК транскрипта трансгена.

8сз\тшу1>7 + - мб м4 мз м2

Рисунок 5 - Нозерн-блот анализ транскрипция Р]/У!Гт-СР гена в трансгенных растениях картофеля и табака. Стрелкой показано положение РНК транскрттга, интродуцированного в трансгенные растения гена РЮ^™-СР. + - положительный контроль - РНК нетрансформированного, свободного от вирусной инфекции растения табака сорта Вирджин Д с добавлением РНК, синтезированной ДНК-зависимой РНК

полимеразой фага Т7 на матрице - линейной плазмиде, содержащей РУУ^-СР ген;---

отрицательный контроль - РНК нетрансформированного, свободного от вирусной инфекции растения табака сорта Вирджин Д; 8СЗ, У021, УИ7, Мб, М4, МЗ, М2 - РНК трансгенных растений табака (БСЗ, УШ1, УЭ7) и картофеля (Мб, М4, МЗ, М2).

Методом вестерн-блотгинг гибридизации экспрессия СР УВК*ГР! была показана у 125 (80%) трансгенных растений табака и картофеля из числа 153 изученных независимых линий трансгенных растений, несущих РУУ^-СР ген. У 29 (19%) линий трансгенных растений табака и картофеля, у которых интеграция трансгена в растительный геном была показана с помощью ПЦР анализа, экспрессия СР УВ1СГ'*' не была выявлена. Содержание белкового продукта трансгена в образцах независимых линий трансгенных растений табака и картофеля варьировало от очень низкого до высокого (рисунок 6, таблица 3). Сравнительный анализ результатов изучения уровня экспрессии СР в трансгенных растениях табака и картофеля, принадлежащих к разным линиям, позволил выявить некоторые закономерности экспрессии трансгена и различия между группами линий, полученными на основании генетической трансформации РГУму-СР геном разных сортов табака и картофеля (таблица 3). Значительная часть линий трансгенных растений табака и картофеля показывала высокий (32%) и средний (30%) уровень экспрессии СР. Больше всего трансгенных линий с высоким (42%) и средним (45%) уровнем экспрессии СР было выявлено у трансформантов сорта табака Вирджин Д. Меньше всего трансгенных линий с данными характеристиками (26% и 25%) экспрессии СР было обнаружено у трансформантов гибрида табака Стамм С2. Линии трансгенных растений табака и картофеля с низким содержанием продукта трансгена (19%) и линии в которых СР УВК"т! не был обнаружен (19%) составили меньше половины всех РУУ^т-СР ген несущих регенерантов данных культур. 11 (31%) линий трансгенных растений, полученных в результате генетической трансформации картофеля сорта Минденеш, показывали низкий и очень низкий уровень экспрессии трансгена. У 19 (36%) Р УУ!т'!-СР (+) линий, принадлежащих к группе трансформантов табака сорта Стамм С2, не было установлена экспрессия СР УВ1С. Интересно отметить, что БО УВКН!К был выявлен во всех Р\/УЫ™-СР ген несущих трансгенные растения, полученных в результате генетической трансформации табака сорта Вирджин Д. Всего 5 растений, принадлежащих к данной группе трансформантов, показали низкий уровень экспрессии гетерологичного белка.

+ vdi yd2 vd3 vim vd5 vd6 yd7 vd8 vd9 vd10 vdi1 vd12 vd 1л vd14 vd15 vdi6vdi7 vu18 vd19vd20

A S: ку' у' у1 у' ку,! у1

- + sci SC2 sc3 SC4

■

ку '

. •":■,

щ'". ку,;. у." у1 ку'!

— + М4 Ml М2 Ml М7 Мб MS М8 М10 МИ М12 М13 М14 М15 М16 М17 М20 М18 MI9

ШШ?- ' г ' ;Г ' Ш £

mm' *. : • ' -

' ** " .¡'лу" ■ ■■ ■ ' •:

В в в в в в в в у в ку ку в в у в в в в

— + М21 МИ M23 М28 М24

'"/Ш .

КУ в

иш

M2S М26 М27 М29 МЗО М31 ДШ M33 М34 М35 М36 М37

Рисунок 6 - Вестерн-блот анализ экспрессии РУУ^М-СР гена в трансгенных растениях табака сортов Вир джин Д (А), Стамм С2 (Б) и картофеля сорта Минденеш (В).

Стрелкой показано положение СР УВНЛ1Ъ.--отрицательный контроль - экстракты

белков нетрансгенных, свободных от вирусной инфекции растений соответствующих сортов табака; + - положительный контроль - экстракты белков нетрансгенных, УЛЛ*™ инфицированных растений соответствующих сортов табака и картофеля; УБЗ-УШО (А), 8С1-8СЗ (Б) и М4-М37 (В) - экстракты белков независимых линий трансгенных растений табака и картофеля, полученных в результате генетической трансформации растений табака сортов Вирджин Д (А), Стамм С2 (Б) и картофеля сорта Минденеш (В). Степень устойчивости (В - восприимчивый, У - устойчивый, КУ - крайне устойчивый) независимых линий трансгенных растений табака и картофеля к УВК при механической инокуляции в тепличных условиях (') (А, Б) и инфицировании с помощью вирусных векторов в полевых условиях (2) (А, Б, В).

Таблица 3

Экспрессия РУ^т-СР гена в трансгенных растениях табака и картофеля_

Количество РУУ^^-СР (+) линий, показывающих разный уровень экспрессии СР, шт. (доля СР (+) линий от общего числа РУ/'п-СР (+) линий, %)

Название линии

Высокий

Средний

Низкий

СР(-)

VD1

16(42)

17(45)

5(13)

SC1

14 (26)

13 (25)

1(15)

¡9(36)

HI1

7(30)

6(26)

4(18)

6(26)

11(31)

10(29)

11(31)

3(9)

2(50)

1(25)

Всего

50 (32) ~Г

46 (30)

29(19)

29 (19)

Примечания. 1 - линии трансгенных растений табака М tabacum l., полученные в результате генетической трансформации растений табака сортов Вирджин Д (VD), Стамм С2 (SC) и Хевеши 11 (Н11); 2 - линии трансгенных растений картофеля S. tuberosum L., полученные в результате генетической трансформации растений картофеля сортов Минденеш (М) и Самодий кифли (SK).

Изучение стабильности экспрессия PVY!*1N-C.P гена в трансгенных растениях табака и картофеля. Экспрессия генов растений меняется в онтогенезе и под воздействием внешних факторов. Для изучения стабильности экспрессии PVY*'IN-CP гена в трансгенных растениях табака и картофеля на трех стадиях развития растений проводили вестерн-блоттинг анализ. Первый (I) -спустя 2 недели после высадки укоренившихся К.тг-регенерантов в почву. Второй (I!) - на стадии бутонизации и цветения и третий (III) - на стадии созревания семян табака и накопления урожая клубней картофеля. В результате было установлено, что в линиях трансгенных растений, в которых не был обнаружен СР J'ßA^™ (SCI, М7, Ml6) на ранней стадии развития, он также отсутствовал во время бутонизации-цветения и стадии созревания. Также была показана стабильность уровня экспрессии трансгена в растениях трансгенных линий (VD5, SC2, SC3, М8), в которых СР КбЛ^™ был выявлен на ранней стадии развития (рисунок 7).

n(- n<+ vd5 vd5 vd5 sci sci sc 2 sc2 sc3 sc3 m7 m7 m7 m8 .48 m16 m16 st+ st-

i ii iii i iii i ii i ii i 11 iii i ii i iii

h .06 12.08 17.09 11 0(> 1 7.09 12.08 17.09 12.08 [7 09 17.08 27.08 22 09 17 08 27.0s 27.08 22 09

Рисунок 7 - Сравнительное изучение экспресии РУ)мт-СР гена на разных стадиях развития трансгенных растений картофеля и табака с помощью яестерн-блоггинг анализа. Стрелкой показано положение СР УВК!™Ь. N1-, — отрицательный контроль -экстракты белков нетрансгенных, свободных от вирусной инфекции растений табака и картофеля; N1+, 51+ - положительный контроль - экстракты белков нетрансгенных, УВН^'' инфицированных растений табака и картофеля. 8С1, БС2, БСЗ, М7, М8, М16 - экстракты белков независимых линий трансгенных растений табака и картофеля, несущих РУУ^'^-СР ген УВЛ"'". В нижней части рисунка указана стадия развития растения (расшифровка указана в тексте) и дата проведения анализа.

Наблюдения за экспрессией РУ}^т-СР гена при . вегетативном размножении картофеля микрочеренкованием в асептической культуре и размножении клубнями показали стабильность экспрессии трансгена, как у регенерантов, полученных из трансформированных клеток, так и у их вегетативного потомства.

Определение вирусоустойчивости трансгенных растений табака. В группах линий УЭ и 8С выход трансгенных растений, обладающих крайней устойчивостью к двум штаммам )'ВК (УВК1*1*, УВК<и) был низким. Данный тип устойчивости определял высокую эффективность защиты трансгенных растений против вирусной инфекции, вносимой при механической инокуляции и передаваемой вирусными векторами. Среди линий, полученных из исходного сорта Н11, трансгенных растений с крайней устойчивостью не выявлено. Все оставшиеся независимые линии трансгенных растений, принадлежащие к группам УЭ, 5С и НИ, обладали «восстанавливающейся» вирусоустойчивостью. Отдельные независимые линии трансгенных растений отличались по скорости «востановления» вирусоустойчивости. Во всех изученных трансгеиных растениях табака крайняя вирусоустойчивостъ и

«восстанавливающееся» вирусоустойчивость распространялись на оба штамма УВК (УВкшы, УВ1<°'), использованных для изучения вирусоустойчивости (таблица 4).

Таблица 4

Результаты изучения вирусоустойчиЬости трансгенных растений табака,

,/лта

-СР

Линии трансгенных Крайне устойчивые к УВК/устойчивые к УВК/ инфицированные ' YBK линии трансгенных растений табака

полученные из исходных сортов Механическая инокуляция в теплице YBKmN УВК"С Искусственный инфекционный фон УВК*"" в поле

Вирджин Д (VD) 3/4/7 3 / 1 / 7 2/0/2

Стамм С2 (SC) 2/14/16 2/14/16 2/0/2

Хевеши 11 (НИ) 0/121 12 1 ,• , . . ______ 0/ 12/12 -

Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля. Двадцать три линий трансгенных растений картофеля M и четыре - SK, полученные соответственно на основе растений исходных сортов Минденеш и Самодий кифли, несущих ген PVYS1K-C!\ были изучены на проявление патоген-опосредованной вирусоустойчивости. Было выявлено три линий (Mil, М12 и М21) трансгенных растений, обладающих крайней устойчивостью к двум штаммам YBK (YBK^m, У В к*'(). Данный тип устойчивости определял высокую эффективность защиты трансгенных растений против вирусной инфекции, вносимой при механической инокуляции, передаваемой вирусными векторами и при инокуляции прививкой на инфицированные растения семейства пасленовых. Среди линий, полученных из исходного сорта SK, трансгенных растений с крайней устойчивостью не выявлено. У трансгенных растений линий М8, М9, М15 было показано проявление крайней формы патоген-опосредованной «восстанавливающейся» устойчивости. Все оставшиеся независимые линии трансгенных растений, принадлежащие к группам M и SK, обладали «восстанавливающейся» вирусоустойчивостью. Отдельные независимые линии трансгенных растений отличались по скорости «востановления» вирусоустойчивости. Во всех изученных трансгенных растениях табака крайняя вирусоустойчивость и «восстанавливающееся» вирусоустойчивость распространялись на оба штамма УВК (УВКУВКР С), использованных для изучения вирусоустойчивости (таблица 5).

Таблица 5

Результаты изучения вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля, несущих ген PVY^-CP

Линии трансгенных растений картофеля, полученные из исходных сортов

Крайне устойчивые к УВК/устойчивые к УВК/инфицированные УД/У линии трансгенных растений картофеля

Механическая инокуляция в теплице'

YBK"N YBK"*-'

Искусственный инфекционный фон

YBK

та.

Прививка на инфицированные YBK'17"' растения

Минденеш (М)

6/ 17/23 6/17/23

3/3/23

3/3

Самодий кифли (SK) _

0/4/4

0/0/4

Примечания: - 20 мкг/мл очищенного вируса.

Обсуждение результатов

В настоящей работе нами были получены устойчивые к YBK трансгенные растения табака и картофеля из исходных восприимчивых к данному вирусу растений сортов данных культур. Использованные нами перспективные сорта табака и картофеля были впервые вовлечены в эксперименты по созданию генетически модифицированных растений, обладающих экономически значимыми биологическими свойствами.

Получение микроклубней картофеля в условиях асептической культуры. Эффективная система получения микроклубней картофеля в асептической культуре имеет большое значение для биохимических и биотехнологических экспериментов. В результате анализа литературных данных, нами был подобран способ индукции клубнеобразования, основанный на имитировании клубнеобразования в естественных условиях [Borque et al., 1987]. Полученные нами результаты исследований свидетельствуют о достаточно высокой эффективность индукцйи клубнеобразования у сортов Минденеш (88%) и Самодий кифлй (92%). Однако у сорта Самодий кифли образовывались сильно удлиненные и тонкие микроклубни, из которых удалось приготовить лишь небольшое количество эксплантов, оказавшихся пригодными для агробактериальной трансформации. Возможно, формирование сильно удлиненных и тонких микроклубней у данного сорта является следствием генотип-специфического взаимодействия растений данного сорта с содержащей фитогормон питательной средой [Ranlli, 2007].

Трансформация и регенерация растений картофеля S. tuberosum L. При подборе эксплантов для агробактериальной трансформации в виде основных критериев были выделены: 1) эффективность регенерации побегов на селективной среде; 2) отсутствие регенерации побегов на нетрансформированных эксплантах в условиях селективного давления антибиотика; 3) универсальность эксплантов разных сортов по отношению к питательной среде [Дрейпер с соавт., 1991]. Нами было экспериментально установлено, что всем критерием соответствовали диски микроклубней картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли. Следует отметить, что эффективность действия селективного агента и продолжительность процесса регенерации зависели от толщины экспланта. Установлено, что для агробактериальной трансформации целесообразно использовать диски микроклубней картофеля с двухсторонним срезом и толщиной 2-3 мм. По-видимому, микроорганизмы A. tumefaciens наиболее эффективно трансформировали недиференцированные клетки меристематической ткани, находящиеся в почках (глазках) дисков микроклубней. В целом диски микроклубней картофеля являются удобными эксплантами для использования в экспериментах агробактериальной трансформации картофеля.

Методика трансформации листьев и сегментов стеблей картофеля, описанная Ан с соавторами [An et al., 1986], оказалась неэффективной в случае сортов Минденеш и Самодий кифли. Результаты наших исследований позволяют предположить, что в случае листовых эксплантов сортов Минденеш

и Самодий кифли причиной отсутствия процесса регенерации побегов являлась слишком высокая концентрация селективного агента канамицина (100 мг/л). Данный факт, далее подтвержденный другими исследователями [Bukovinszki el al., 2007], свидетельствует о необходимости разработки безмаркерной системы агробактериальной трансформации листовых эксплантов сортов Минденеш и Самодий кифли. Полное отсутствие регенерации побегов из стеблевых эксплантов сортов Минденеш и Самодий кифли в первую очередь свидетельствует о необходимости оптимизации состава питательных сред. Другой возможной причиной может быть слишком маленькая площадь контакта микроорганизмов с зоной делящихся клеток (камбий / перицикл) у сегментов стеблей картофеля [Beaujean et al., 1998].

Вирусоустойчивость трансгенных растений табака и картофеля

Фенотипическое проявление патоген-опосредованной

вирусоустойчивости трансгенных растений. Полученные линии тансгенных растений табака и картофеля обладали разной степенью устойчивости к YBK. Пять независимых линий трансгенных растений табака и три независимые линий трансгенных растений картофеля показали крайнюю степень вирусоустойчивости к YBK (рисунок 6, таблицы 4, 5). Среди независимых линий трансгенных растений табака и картофеля также был выявлен полиморфизм уровня экспрессии РУ}тУ-СР гена. Основываясь на результатах сравнительного изучения данных вестерн-блот анализа независимых линий трансгенных растений нами были выделены три уровня экспрессии CP: высокий, средний и низкий. Также были обнаружены линии трансгенных растений, у которых CP не был показан с помощью вестерн-блоттинг анализа (рисунок 6). Анализ уровня экспрессии CP и степени вирусоустойчивости трансгенных растений, несущих PVY -CP ген YBK"™, показал, что у большинства линий обладающих крайней вирусоустойчивостью уровень экспрессии CP был низким (рисунок 6). В одной из данных линий (SCI) CP не был выявлен, в двух других - уровень экспрессии данного белка был средним (SC4) и высоким (М21). Среди трансгенных растений табака и картофеля, показывающих «восстанавливающуюся» вирусоустойчивость, уровень экспрессии CP варьировал от высокого до низкого. У некоторых из данных линий CP не был выявлен. Опираясь на вышеизложенные факты можно сделать предположение, что в большинстве случаев вирусоустойчивость трансгенных растений, несущих РУ\^™-СР ген не зависит от экспрессии CP в клетках данных растений. Результаты, указывающие на непричастность или по крайней мере низкий уровень влияния CP вируса, кодируемого трансгеном, были получены разными исследователями [Lindo etal., 1992; Van der V\ugX etal., 1992; Koilat et al., 1993; Smith et a!., 1995].

Штаммоспецифичность вирусоустойчивости трансгенных растении, опосредованной PVYslN-CP геном YBKntk. Степень штаммоспецифичности зависит от подобранной исследователем последовательности трансгена. Нами обнаружено, что вирусоустойчивость трансгенных растений, несущих PVY^m-СР ген YBK'TN, проявляется в одинаковой степени к двум штаммам: YBKXI1' и YBК(>с, относящимся к разным серотипам. Данный факт дает возможность полагать, что PVYNlb-CP геном опосредованная вирусоустойчивость не является штаммоспецифичной и распространяется на разные штаммы YBK.

Механизм патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений. Среди 153 линий трансгенных растений табака и картофеля, в которых была подтверждена интеграция PVY^-CP ген YBRвыявлено большое разнообразие комбинаций, включающих определенный уровень экспрессии белка трансгена с определенной степенью вирусоустойчивости (рисунок 6). Полученные нами результаты не противоречат данным литературы, свидетельствующим о разнообразии сочетаний разных уровней экспрессии CP с разными уровнями вирусоустойчивости трансгенных растений [Lindbo et al, 1992; Smith et al., 1995; Goodwin et al., 1996, Jozsa et al., 2002a, b ]. В связи с этим, группировка трансгенных растений по степени проявления данных признаков представляла собой сложную задачу.

Наиболее малочисленную группу трансгенных растений составляли линии, показывающие низкий или не детектируемый уровень экспрессии CP в сочетании крайней устойчивостью к YBK. По-видимому, данные трансгенные растения содержат оптимальное количество копий трансгена, обеспечивающее оптимальный уровень его экспрессии, необходимый для запуска механизма РНК-Интерференции [Goodwin et al., 1996]. Промежуточное положение между трансгенными растениями вирусоустойчивых линий и восприимчивыми к вирусу нетрансгенными растениями исходных сортов, занимали линии трансгенных растений табака и картофеля, обладающие «восстанавливающейся» вирусоустойчивостью. Вероятно, данные трансгенные растения, показывающие высокий или средний уровень экспрессии CP и обладающие «восстанавливающейся» вирусоустойчивостью, имели одну или две копии трансгена в своем геноме (рисунок б). Согласно модели экспрессии «порогового» уровня РНК транскрипта трансгена, где ключевое место занимает доза гена [Goodwin et al., 1996], одной копии трансгена, даже находящейся под контролем сильного промотора, чаще всего не хватает для проявления высокой степени вирусоустойчивости трансгенных растений. Большинство трансгенных растений, содержащих одну копию трансгена, показывают «восстанавливающуюся» вирусоустойчивость. Созданные нами трансгенные растения, показывающие низкий уровень экспрессии CP, или у которых не был выявлен CP, и обладающие «восстанавливающейся» вирусоустойчивостью, возможно, имели слишком большое количество копий трансгена (>8). Вероятней всего к их числу принадлежали трансгенные растения с медленно «восстанавливающейся» вирусоустойчивостью. Известно, что в таких растениях РНК транскрипты трансгена не обнаруживаются, или уровень транскрипции множественных копий трансгена бывает очень низким. В данном случае в клеточном ядре блокируется сам процесс транскрипции трансгена, и в цитоплазму вообще не поступает или поступает лишь небольшое количество РНК транскрипта трансгена. У растений инструментом регуляции транскрипции ДНК является связанное с РНК-интерференцией метилирование ДНК [English et al., 1996].

По-другому представляется проявление вирусоустойчивости в нескольких созданных нами трансгенных растений, обладающих крайней степенью вирусоустойчивости при среднем (SC4) или высоком (М21) уровне экспрессии СР. Вероятней всего в данных трансгенных растениях

вирусоустойчивосгь в значительной степени была обусловлена СР-опосредованной супрессией репликации вирусной РНК [Chapman et al., 1992].

Патоген-опосредованное подавление супрессии РНК-интерференции в вирусоустойчивых трансгенных растениях. Важным моментом при создании вирусоустойчивых растений является преодоление защитных механизмов вируса. Результата? наших экспериментов позволяют полагать, что полученные трансгённые растения, обладающие крайней степенью устойчивости к YBK, в результате экспрессии PVY^-CP гена подавляли защитный механизм YBK, препятствующий деградации его РНК в растениях. Вирусы растений в процессе эволюции приобрели способность противостоять действию поспранскрипционного сайленсинга генов с помощью супрессоров белковых комплексов, вовлеченных в механизм РНК-интерференции. В случае YBK сильным супрессором РНК-интерференции является белок хелперного компонента-протеазы (НС-Pro) вируса [Solomon-Blackburn et al., 2001]. Наиболее вероятно, что в полученных нами трансгенных растениях, обладающих крайней формой устойчивости, РНК-интерференция инициируется сразу после (или даже во время) проникновения вирусной РНК в клетки трансгенного растения. Так, в инокулированных YBK трансгенных растениях табака, обладающих крайней вирусоустойчивостью, нам не удалось с помощью дот-блот гибридизации обнаружить вирусную РНК. Также, в инокулированных YBK трансгенных растениях картофеля, обладающих крайней вирусоустойчивостью, не обнаружено развития симптомов, ИФА не показал накопление YBK.

Практическое значение патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений. В целом, результаты проведенных нами исследований показывают' большую практическую значимость PVY^-CP геном опосредованной вирусоустойчивости доя таких экономически важных культур, как картофель и табак. Нами была показана перспективность стратегии создания новых сортов сельскохозяйственных растений с помощью интеграции целевых генов, обеспечивающих высокоэффективное проявление экономически значимых свойств данных растений, таких как высокая урожайность, высокое качество получаемой продукции и сохранение уникального сочетания основных качественных характеристик исходных сортов. Более того, ряд полученных нами трансгенных растений отвечают требованиям повышенной биологической безопасности. Низкий уровень накопления CP у вирусоустойчивых трансгенных растений снижает риск распространения продуктов трансгена в окружающей среде и тем самым способствует более интенсивному использованию механизма патоген-опосредованной вирусоустойчивости при создании новых сортов сельскохозяйственных растений.

выводы

1. Установлено, что наиболее эффективно регенерация трансгенных растений, выявленных по признаку канамицин-устойчивости, трех сортов табака Nicotiana tabacum L. (Вирджин Д, Стамм С2, Хевеши 11) происходит из срезов листовых пластинок, а у двух сортов картофеля Solanum tuberosum L. (Минденеш, Самодий кифли) из дисков микроклубней.

2. Впервые получено 116 линий канамицин-устойчивых регенератов табака Nicotiana tabacum L. сортов Вирджин Д, Стамм С2, Хевеши 11 и 41 линия канамицин-устойчивых регенератов картофеля Solanum tuberosum L. сортов Минденеш и Самодий кифли, свидетельствующих об успешной генетическщй трансформации растений табака и картофеля РУУ*™-СР геном белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

3. Методом ПЦР показана интеграция PVY-CP гена в 114 (98%) из 116 независимых линий канамицин-устойчивых регенератов табака Nicotiana tabacum L. и в 39 (35%) из 41 независимых линий канамицин-устойчивых регенерантов картофеля Solanum tuberosum L., потдверждающая высокую эффективность :! генетической конструкции и метода генетической трансформации. <

4. Методами нозерн-блоттинг гибридизации и вестерн-блоттинг гибридизации', показана экспресия РЮ^™-СР гена в 89 (78 %) из 114 независимых линиях ..трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и в 35 (90%), из 39 независимых линий трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L.

5. Установлен полиморфизм трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущих ген PVY^-CP по признаку вирусоустойчивости и механизму проявления признака, позволивший провести отбор трансгенных линий, обладающих крайней степенью защиты от патогена.

6. Выявлено 5 (4%) из 114 линий трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и 3 (8%) из 39 линий трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L., несущих ген PVY^-CP, обладающих крайней устойчивостью к двум штамам (YBX?10 и YBK*™) Y-вируса картофеля, пригодных для использования в сельскохозяйственном производстве.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Jozsa, R. Potato Virus Y Coat Protein Gene Induced Resistance in Valuable Potato Cultivare [Text] / R. Jozsa, Z. Stasevski, I. Wolf, S. Horvath, E. Balazs // Acta Phytopathologica et Entomológica Hungarica. - 2002. - V. 37 (1-2). - Р. 1 - 7.

2. Jozsa, R. Potato Virus Y High level of fíeld resistance of transgenic tobaccos induced by integrated Potato virus Y coat protein gene [Text] / R. Jozsa, Z. Stasevski, E. Balazs // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. - 2002. - V. 37 (1 -2).-P. 311 —316.

3. Зайнуллин, А.А. Использование современных методов тестирования Y-вируса картофеля в пробирочных растениях [Текст] / А.А. Зайнуллин, А.С.Зайнуллина, Ф.Ф Замалиева., 3.3. Салихова, 3. Сташевски, И.В Пикалова.,

А.В .Богданова, JI.B. Михеева // Вестник защиты растений. - 2002. - №3. — С. 37 -41.

4. Замалнева, Ф.Ф. Система семеноводства картофеля на оздоровленной основе в республике Татарстан [ Текст] / Ф.Ф. Замалиева, Г.Ф. Сафиуллина, P.P. Назмиева, 3. Сташевски, 3.3. Салихова // Вестник защиты растений. - 2006. -№1,-С. 50-55.

5. Zamalieva, F.F. Potato seed production in middle Volga region [Text] /F.F. Zamalieva, Z. Stasevski, G.F. Safiulina, R.R. Nazmieva, V.B. Karimova, Z.Z. Salikhova, I.V. Pikalova, E.A. Gimaeva, S.G. Vologin, E.A. Prishchepenko, L.A. Garanina, E.F. Davletshina, G.D. Kadyrova // Potato production and innovative technologies /; In: A J. Haverkort and B.V. Anisimov (eds.). - Wageningen, The Netherlands: Wageningen Academic Publishers, 2007.-P. 184-193. ,

6. Сташевски, 3. Вирусоустойчивость трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L., несущих PVY^-CP ген белка оболочки Y вируса картофеля [Текст] / 3. Сташевски, О.Н. Ильинская // Экологическая генетика. -2009.-Т. IV-С. 20-33.

7. Карамова, Н.С. Мутагенное действие экстрактов растений картофеля S. tuberosum L., обработанных пестицидами [Текст] / Н.С. Карамова, 3. Сташевски, А.П. Денисова И Ученые записки Казанского университета Сер. Естеств. Науки. - 2009. — Т. 151.KH.1.C. 155-163.

8. Замалиева, Ф.Ф. Совершенствование системы семеноводства картофеля на оздоровленной основе [Текст] / Ф.Ф. Замалиева, Г.Ф. Сафиуллина, P.P. Назмиева, 3. Сташевски, 3,3. Салихова П Картофель и овощи. - 2006. - № 2. -С. 16-19.

9.. Замалиева, Ф.Ф. Семеноводство картофеля на оздоровленной основе [Текст] / Ф.Ф. Замалиева, 3.3. Салихова 3. Сташевски, Г.Ф. Сафиуллина, P.P. Назмиева / Защита и карантин растений. - 2007. - №2. — С. 18 - 20.

10. Сташевски, 3. Неблагоприятные факторы окружающей среды [Текст]./ 3. Сташевски // Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков / Б.В. Анисимов, Г.Л. Белов, Ю.А. Варицев, С.Н. Еланский [и др.]; под ред. С.Н. Еланского. - Москва: Картофелевод, 2009. - С. 118-129.

11. Вафии, P.P. Способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК^гликозилазы / Р.Р. Вафин, Р.Р. Вафин, Ф.Ф. Замалиева, И.В. Пикалова, 3. Сташевски, Т.М. Ахметов, Ш.К. Шакиров, Р.Х. Равилов // Патент РФ на изобретение № 2307167, опубл. 27.09.2007, Бюлл. № 27.

12. Pikalova, I.V. Comparison of potatoes cultivars resistance to viruses diseases in Tatarstan growing conditions [Text] /V.A. Osokin, Z. Stashevski, Z.Z. Salikhova, G.R. Mukhametshina, A.A. Zainullin, A.S. Zainullina, G.F. SafiuIIina, R.R. Nazmijeva, F.F. Zamalijeva // Ecology and Life (International Journal), Novgorod the Great - 2nd Edition. - 2002. - Issue 6. - P.35.

13. Stasevski, Z. Analysis of potato virus dispersion in the recovered potato cultivation area [Text] / Z. Stashevski, I.V. Pikalova, V.A. Osokin, Z.Z. Salikhova, G.R. Mukhametshina, A.A. Zainullin, A.S. Zainullina, G.F. SafiuIIina, R.R. Nazmijeva, F.F. Zamalijeva // Ecology and Life (International Journal), Novgorod the Great. - 2nd Edition. - 2002. - Issue 6. - P. 35.

14. Stasevski, Z. Pathogen-derived resistant to potato virus Y induced by integrated virus coat protein in potato Solatium tuberosum L. and tobacco Nicotiana tabacum L. [Text] / Z. Stasevski, L. Palkovics // Institute of botany annual report Abstracts of reports presented at the annual conference of the institute of Botany, December 16 -17, 1998.-P. 27.

15. Сташевски, 3. Вирусоустойчивые трансгенные растений табака, несущие ген белка оболочки Y-вируса картофеля [Текст] / 3. Сташевски Р. Ёшфа, Э. Балащ // Научные материалы первой всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям, Санкт-Петербург, 2002 г. - С. 162-163.

16. Замалйева, Ф.Ф. Семеноводство картофеля на оздоровленной основе в среднем Поволжье [Текст] Ф.Ф. Замалйева, З.Сташевски, 3.3. Салихова, Р.Р. Назмиева, Г.Ф. Сафиуллина / Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков», Минск, 2005 г. - С. 36 - 42.

17. Сташевски, 3. Вирусоустойчивые трансгенные сорта картофеля, несущие ген белка оболочки у вируса картофеля [Текст] 3, Сташевски, Л. Палкович, Э. Балаш // Материалы XIII Международной научной конференции-«Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение», Казань, 4 - 8 апреля 2005 г.-С. 80 —81.

18. Вафин, P.P. Разработка техники мультиплексной ОТ:ПЦР на выявление PYY и PVX в системе защиты от контаминации продуктами амплйфиации на основе разрушающего действия урацил ДНК гликозидаза [ Текст] / Р.Р. Вафин, И.И. Пикалова, 3. Сташевски, Ф.Ф. Замалйева, О.Г. Зарипов // Материалы XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение», Казань, 4 - 8 апреля 2005 г» - С. 17 - 19.

19. Вологин, С.Г. Исследование влияния инсектицидных препаратов на полимеразную цепную реакцию и реакцию обратной транскрипции [Текст] / С.Г. Вологин, И.В. Пикалова, P.P. Вафин, 3. Сташевски, 3.3. Салихова, Э.Ф. Давлетщина, Г.Д. Кадырова, Ф.Ф. Замалйева / Сборник тезисов 10-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 17-21 апреля 2006 г. - С. 361.

20. Замалйева, Ф.Ф. Семеноводство картофеля в Среднем Поволжье [Текст] / Ф.Ф. Замалйева, 3. Сташевски, Г.Ф. Сафиуллина, P.P. Назмиева, В.Б. Каримова, 3.3. Салихова, И.В. Пикалова, Е.А. Гимаева, С.Г. Вологин, Е.А. Прищипенко, Л.А. Гаранина, Э.Ф. Давлеппина, Г.Д. Кадырова // Материалы международного конгресса «Картофелевдство России: актуальные проблемы науки и практики», Москва, 2007 г..-^ С- 91 - 99.

21. Zamalieva, F.F. Potato seed production in Tatarstan [Text] / F.F. Zamalieva,, Z. Stasevski, G.F. Safiulina, R.R. Nazmieva, Z.Z. Salikhova, I.V. Pikalova, E.A. Gimaeva, S.G. Vologin, E.A., Davletshina, G.D. Kadyrova // Potato for a changing world: 17-th triennial . Conference of European Association for Potato Research: abstracts of papers and posters / S.C. Chiru, Gh. Olteanu, C. Aidea, C. Badarau (eds), - Brasov, July 2008.- P. 320 - 323.

22. Сташевски, 3. Оценка гибридных комбинаций картофеля по устойчивости к YBK [Текст] / 3. Сташевски, Е.А. Гимаева, И.В. Пикалова, Н.П. Склярова, //

Картофелеводство: результаты, инновации, практический опыт: Материалы научно-практической конференции и координационного совета «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства». — Москва, 2008. — Т.1.-С. 456-464.

23. Сташевски, 3. Вирусоустойчивость трансгенных сортов картофеля [Текст] / 3. Сташевски, И. Волф, III. Хорват, Э. Балаш // Материалы Всеросс. научно-практической конф. молодых ученых «Повышение эффективности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству», Казань, 6-7 февраля 2008 г. - С. 292-299.

24. Stasevski, Z. Pathogen-derived transgenic resistance to PVY [Text] / Z. Stasevski // материалы XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им Ю. Либиха, Казань, 5-7 нюня 2009 г. - С. 54 - 55.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф. О.Н. Ильинской за поддержку и внимательное отношение к работе; проф. Э. Балашу и доктору Л. Попковичу (Центр Сельскохозяйственной Биологии, Гёдёлё, Венгрия) за научно-методическое сопровождение работы; доктору X. Шандору (Институт селекции картофеля, Кестхей, Венгрия) за техническое сопровождение полевых испытаний; проф. К. Цеминису и доктору Ю. Просцявичюсу (Институт Ботаники, Вильнюс, Литва) за организационно-финансовую поддержку проекта.

Отзывы просим направлять по факсу: (843) 238-76-01 (отд. аспирантуры КГУ, дис. совет Д 212.081.08).

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41,541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 21.10.2009 г. Усл. п.л 1,4 Заказ № К-6777. Тираж 100 экх Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сташевски, Зенон

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирусы растений. Y-вирус картофеля.

1.1.1. Систематическое положение YBK.

1.1.2. Штаммы YBK.

1.1.3. Строение YBK.

1.1.4. Геном YBK.

1.1.5. Белки YBK.

1.1.6. Размножение YBK.

1.1.7. Передвижение YBK по инфицированному растению.

Л. 1.8. Взаимодействие между вирусами.

1.2. Вирусные болезни растений табака N. tabacum L. и картофеля

S. tuberosum L.

1.2.1. Заражение растений.

1.2.2. Симптомы и патогенез.

1.3. Устойчивость растений к вирусам.

1.3.1. Вертикальная устойчивость растений к вирусам.

1.3.2. Наследование вертикальной устойчивости к вирусам.

1.3.3. Механизмы проявления вертикальной устойчивости растений к вирусам.

1.3.4. Горизонтальная устойчивость растений к вирусам.

1.3.5. Механизмы проявления горизонтальной устойчивости растений к вирусам.

1.4. Создание трансгенных растений, устойчивых к вирусным болезням.

1.4.1. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном белка оболочки вируса.

1.4.2. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном транспортного белка вируса.

1.4.3. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном вирусной репликазы.

1.4.4. Механизм проявления патоген-опосредованной вирусоустойчивости 52 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Вирусные штаммы и вектор для генетической трансформации.

2.2. Растительный материал.

2.2.1. Растения картофеля Solatium tuberosum L.

2.2.2. Растения табака Nicotiana tabacum L.

2.3. Питательные среды.

2.4 Трансформация и регенерация растений.

2.4.1. Трансформация и регенерация растений картофеля.

2.4.2. Трансформация и регенерация растений табака.

2.5. Молекулярные методы.

2.5.1. ПЦР анализ и Саузерн-блоттинг анализ.

2.5.2. Нозерн-блоттинг анализ.

2.5.3. Дот-блот анализ.

2.6. Иммунологические методы.

2.6.1. Р1ммуноблотинг (вестерн-блотгинг анализ).

2.6.2. Иммуноферментный анализ.

2.7. Фитопатологические методы исследования.

2.7.1. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений методом механической инокуляции.

2.7.2. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля методом прививки.

2.7.3. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений в полевых условиях.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Получение микроклубней картофеля в условиях асептической культуры

3.2. Подбор эксплантов для трансформации^.

3.3. Трансформация и регенерация растений.

3.3.1. Трансформация и регенерация растений картофеля S. tuberosum L.

3.3.2. Трансформация и регенерация растений табака N. tabacum L.

3.4. Анализ интеграции PVYwm-CP гена в геном растений табака

N. tabacum L. и картофеля S. tuberosum L.

3.5. Изучение экспрессии PVYWN-CP гена.

3.5.1 Нозерн-блоттинг анализ экспрессии PVY ' -CP гена в трансгенных растениях табака и картофеля.

3.5.2 Вестерн-блотгинг анализ экспрессии PVT ' -CP гена в трансгенных растениях табака.

3.5.3. Вестерн-блотгинг анализ экспрессии PVYVTN-CP гена в трансгенных растениях картофеля.

3.5.4. Изучение стабильности экспрессии PVYNM-CP гена в трансгенных растениях табака и картофеля.

3.6. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений табака

N. tabacum L.

3.6.1. Определение вирусоустойчивости с помощью механической инокуляции в тепличных условиях.

3.6.2. Определение вирусоустойчивости в полевых условиях.

3.7. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля

S. tuberosumh.

3.7.1. Определение вирусоустойчивости с помощью механической инокуляции в тепличных условиях.

3.7.2. Определение вирусоустойчивости в полевых условиях.

3.7.3. Определение вирусоустойчивости с помощью прививки на инфицированные YBKwm растения.

3.8. Изучение химического состава клубней и хозяйственно-ценных свойств трансгенных растений картофеля.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Получение микроклубней картофеля в условиях асептической культуры

4.2. Трансформация и регенерация растений картофеля S. tuberosum L.

4.3. Трансформация и регенерация растений табака N. tabacum L.

4.4. Экспрессия PVYvm-CP гена в трансгенных растениях табака и картофеля

4.5. Вирусоустойчивость трансгенных растений табака и картофеля.

4.5.1. Фенотипическое проявление патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений.

4.5.2. Зависимость степени патоген-опосредованной вирусоустойчивости от уровня экспрессии CP в трансгенных растениях табака и картофеля.

4.5.3. Штаммоспецифичность вирусоустойчивости трансгенных растений, опосредованной РУУут-CP геном YBKwm.

4.5.4. Механизм патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений.

4.5.5. Патоген-опосредованное подавление супрессии РНК-интерференции в вирусоустойчивых трансгенных растениях.

4.6. Практическое значение патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений"

Из 30-и с лишним вирусов, которыми поражаются растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solarium tuberosum L., Y-вирус картофеля (YBK) в настоящее время является наиболее экономически значимым. YBK, впервые описанный Смитом в 1931 году [Smith, 1931], до сих пор является наиболее опасным патогеном картофеля. При высадке инфицированных YBK семенных клубней картофеля снижение урожайности культуры составляет от 30 до 85%, а в некоторых случаях достигает 100%, по сравнению с урожайностью свободного от вирусов семенного материала [Шпаар, 2004; Иванюк с соавт., 2005]. YBKW и другие некротические штаммы этого вируса вызывают системный некроз растений табака, что частично или полностью уничтожет его посадки [Kollar et al., 1993]. Штаммы YBKWN и YBKYN~m'8a вызывают некрозы на клубнях, ухудшая товарный вид и пищевую ценность картофеля [Вайдеманн с соавт., 1999; Иванюк с соавт., 2005]. В результате экспансии некротических штаммов YBK многие хорошо известные сорта табака и картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Horvath et al., 1999; Zagorska et al., 2000; Basky, 2002].

Семеноводство картофеля на безвирусной основе, позволяющее получать свободный от вирусов посадочный материал, является сложным и дорогостоящим мероприятием. Схема защиты от перезаражения растений чаще всего строится на многократном применении инсектицидов для уничтожения переносчиков вирусов — крылатых тлей [Solomon-Blackburn et al., 2001b; Zamalieva et al., 2007]. Интенсивное применение химических средств защиты - не только дорогостоящее, но и небезопасное для окружающей среды и людей мероприятие.

Такие эпидемиологические особенности YBK, как способность к переносу разными видами крылатых тлей, а также появление все новых штаммов фитопатогена затрудняют его диагностику, селекцию на устойчивость и борьбу с вирусом. Успехами селекции последних лет доказана возможность выведения вирусоустойчивых сортов картофеля. Источниками устойчивости служат примитивные дикие виды и культурные сорта картофеля, несущие гены устойчивости [Росс, 1989; Solomon-Blackburn et al., 2001а]. Методы классической селекции имеют ряд ограничений, главным из которых является длительность создания вирусоустойчивых сортов. Новые возможности в создании устойчивых к вирусам сортов картофеля открываются в связи с разработкой способов получения трансгенных растений. Для создания трансгенной вирусоустойчивости используются разные фрагменты генома самого вируса. Среди всех функциональных последовательностей вируса для трансформации растений наиболее широко используется ген белка оболочки вируса. В 1986 году было обнаружено- появление устойчивости растений табака к вирусу табачной мозаики при внедрении в растение гена белка оболочки этого вируса [Powell-Abel et al., 1986]. Впоследствии подобная устойчивость была получена в отношении вирусов различных таксономических групп у наиболее распространенных сортов табака и картофеля [James, 1998; Solomon-Blackburn et al., 2001b].

На основании вышесказанного особую актуальность приобретает создание устойчивых к вирусам трансгенных растений табака и* картофеля, несущих ген белка оболочки особо опасного некротического штамма YBK. Оценка эффективности регенерации растений табака и картофеля, трансформированных с помощью Agrobacterium tumefaciens, будет иметь большое теоретическое и практическое значение для повышения эффективности генетической трансформации экономически важных сельскохозяйственных культур. Изучение вирусоустойчивости трансгенных растений позволит углубить понимание механизмов взаимоотношения в системе растение-вирус, что в свою очередь поможет в разработке новых подходов защиты от опасных фитопатогенов. Создание и комплексный анализ трансгенных растений с новыми биологическими свойствами имеет важное значение для биохимии, молекулярной биологии растений, а также для использования таких растений в сельскохозяйственном производстве. Культивирование вирусоустойчивых растений имеет большое значение в локальном и глобальном масштабах для сохранения биоразнообразия сортов сельскохозяйственных культур, обладающих уникальными свойствами, но исчезнувших с производства в связи с распространением опасных фитопатогенов. Прямое практическое значение будет иметь повышение вирусоустойчивости перспективных сортов табака и картофеля, и тем самым восстановление их привлекательности для сельскохозяйственного производства.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось создание устойчивых к вирусам трансгенных растений табака Nicotiana

JT\T tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущих PVY 1 -CP ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Оценить эффективность регенерации растений из разных видов эксплантов табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L. для использования в генетической модификации растений с помощью агробактериальной трансформации.

2. Провести генетическую трансформацию растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L. PVYNTN-CP геном белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля. ууу

3. Показать интеграцию и экспресию PVY -CP гена в канамицин-устойчивых регенерантах табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L.

4. Выявить устойчивые к вирусам трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solarium tuberosum L., несущие ген PVYNTN-СР.

5. Выявить и охарактеризовать тип устойчивости трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solatium tuberosum L., несущих ген PVYS1^-CP.

Научная новизна. Генная конструкция pGAYHCP, содержащая ген PVYSIN-CP, клонированный из венгерского изолята штамма YBKNTN кольцеобразного некроза клубней, впервые была использована для генетической трансформации растений картофеля S. tuberosum L. Растения сортов картофеля S. tuberosum L. Минденеш и Самодий кифли, и сортов табака N. tabacum L. Вирджин Д, Стамм С2 и Хевеши 11 были впервые вовлечены в эксперимент по созданию генетически модифицированных растений. Была показана эффективность использования дисков микроклубней картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли для трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens.

Впервые получены трансгенные растения табака и картофеля, несущие ген pyyNTN'ср YBKWN. Проведены комплексные молекулярно-биохимические исследования полученных трансгенных растений табака и картофеля. Установлен разный уровень экспрессии CP гена в независимых линиях трансгенных растений табака и картофеля.

Проведены комплексные (лабораторные и полевые) исследования вирусоустойчивости трансгенных растений, несущих PVYSTN-CP ген YBFCVTlV, к двум штаммам YBK (YBK°/C, YBKWN), принадлежащим к разным серотипам. Впервые показано проявление патоген-опосредованной крайней вирусоустойчивости у трансгенных растений, полученных при генетической трансформации растений табака сортов Вирджин Д, Стамм С2 и Хевеши 11, и картофеля сортов Минденеш и Самодий кифли генной конструкцией, vr7"*vr Y7'V содержащей руу -СР ген YBK". Результаты настоящей работы свидетельствуют о сохранении хозяйственно-ценных признаков исходных сортов у вновь созданных трансгенных линий. Показано существенное повышение урожайности и качества получаемой продукции у созданных растений трансгеных линий табака и картофеля.

Практическая значимость. Перспективы внедрения результатов работы определяются двумя аспектами: экономической значимостью картофеля и огромной вредоносностью YBK. В мировом масштабе картофель занимает 4-ое место по объемам производства. Во многих странах он составляет основу продовольственной безопасности. Картофель — универсальная сельскохозяйственная культура, также служит сырьем для пищевого и промышленного производства. В связи с этим снижение опасности системных последствий распространения болезней, вызываемых YBK, реально уменьшит негативное влияние на экономику стран -производителей картофеля. Полученные трансгенные растения табака и картофеля, обладающие крайней устойчивостью к YBK, Moiyr быть использованы в виде новых сортов в сельскохозяйственном производстве и вовлечены в селекционные программы по созданию вирусоустойчивых сортов табака и картофеля методами традиционной селекции. В целом, проведенная работа служит наглядным примером сохранения биоразнообразия сортов сельскохозяйственных культур, обладающих уникальными свойствами, но исчезнувших с полей из-за с распространения опасных фитопатогенов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования: Работа проводилась в соответствии с «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации» на 2001-2005 гг. и тематическим планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.006.09683 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки») Авторские исследования, в рамках которых были созданы трансгенные растения, получили персональную поддержку программ UNESCO/BETCEN и Program Biotechnology 2000, Центра сельскохозяйственной биотехнологии, г.

Гёдёлё, Венгрия. Полевые испытания вирусоустойчивости полученных трансгенных растений, проведенные на базе Института селекции картофеля, г. Кестхей, Венгрия (лицензия на испытания генетически модифицированных организмов № 54.570/3/2000), были подержаны персональным грантом фонда ALF, № LT97560.

Положения, выносимые на защиту:

2. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solatium tuberosum L. содержат PVY CP ген и синтезируют белок оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

3. Трансгенные растения двух сортов картофеля Solanum tuberosum L. и трех сортов табака Nicotiana tabacum L., несущие PWNTNCP -ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля обладают устойчивостью к двум штаммам (YBK°/C и YBKvm) Y -вируса картофеля.

4. Восемь независимых линий трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущие- PVYn™CP-ген белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней. Y-вируса картофеля, обладают крайней устойчивостью* к двум штаммам и YBKwn) Y-вируса картофеля.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Итоговой отчетной конференции Института ботаники " Institute of Botany annual report" (Вильнюс, 1998), I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), Международной научнопрактической конференции «Актуальные вопросы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» (Минск, 2005), 10-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), Международном конгрессе «Картофелеводство России: актуальные проблемы науки и практики» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Повышение эффективности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству» (Казань, 2008), 17-ой конференции Европейской Ассоциации по исследованиям картофеля (Брашов, 2008), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 2008), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им Ю. Либиха Российско-германской международной конференции «Развитие междисциплинарных исследований: перспективные направления и вклад DAAD» (Казань, 2009), а также на итоговых научных конференциях ГНУ ТатНИИСХ (2001-2008) и научных семинарах кафедры микробиологии Казанского государственного университета (2008, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сташевски, Зенон

выводы

2. Впервые получено 116 линий канамицин-устойчивых регенерантов табака Nicotiana tabacum L. сортов Вирджин Д, Стамм С2, Хевеши 11 и 41 линия канамицин-устойчивых регенерантов картофеля Solanum tuberosum L. сортов Минденеш и Самодий кифли, свидетельствующих об успешной генетической трансформации растений табака и картофеля PVTWN-CP геном белка оболочки штамма кольцеобразного некроза клубней Y-вируса картофеля.

3. Методом ПЦР показана интеграция PVYWN-CP гена в 114 (98%) из 116 независимых линий канамицин-устойчивых регенерантов табака Nicotiana tabacum L. и в 39 (95%) из 41 независимых линий канамицин-устойчивых регенерантов картофеля Solanum tuberosum L., потдверждающая высокую эффективность генетической конструкции и метода генетической трансформации.

4. Методами нозерн-блоттинг гибридизации и вестерн-блоттинг угу гибридизации показана экспрессия PVY '-CP гена в 89 (78 %) из 114 независимых линий трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и в 35 (90%) из 39 независимых линий трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L.

5. Установлен полиморфизм трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и картофеля Solanum tuberosum L., несущих ген PVYntn-CP по признаку вирусоустойчивости и механизму проявления признака, позволивший провести отбор трансгенных линий, обладающих крайней степенью защиты от патогена.

6. Выявлено 5 (4%) из 114 линий трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и 3 (8%) из 39 линий трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L., несущих ген PVY*™-CP, обладающих крайней устойчивостью к двум штамам (YBK°/C и YBKNTN) Y-вируса картофеля, пригодных для использования в сельскохозяйственном производстве.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю проф. О.Н. Ильинской за поддержку и внимательное отношение к работе; проф. Э. Балашу и доктору Л. Попковичу (Центр Сельскохозяйственной Биотехнологии, Гёдёлё, Венгрия) за научно-методическое сопровождение работы; доктору X Шандору (Институт селекции картофеля, Кестхей, Венгрия) за техническое сопровождение полевых испытаний; проф. К. Цеминису и доктору Ю. Просцявичюсу (Институт Ботаники, Вильнюс, Литва) за организационно-финансовую поддержку проекта.

Заключение

Биологические особенности клеточных паразитов растений,, каковыми являются вирусы, определяют их массовое распространение и высокую вредоносность, а также исключительно сложную систему защиты от данных фитопатогенов. За последние 30 лет достигнуты значительные- успехи в изучении организации генома-,и пептидной структуры фитовирусов,. а также биохимических и молекулярных механизмов взаимодействия вирусов и растений-хозяев. Активно ведется поиск генов, определяющих естественную вирусоустойчивость растений, и изучение закономерностей их фенотипического проявления. Сочетание знаний об эпидемиологии вирусов и механизмах естественной устойчивости растений легло в основу системы семеноводства картофеля на безвирусной основе, позволяющей в определенной степени ограничивать вредоносность вирусов. Следует подчеркнуть, что темпы распространения новых, более вредоносных вирусов или штаммов уже известных вирусов, опережают результаты исследований, направленных на разработку эффективных подходов защиты растений, методами классической селекции. Перспективным подходом, позволяющим оперативно реагировать на динамично меняющуюся эпидемиологическую обстановку, является использование генно-инженерных методов при создании вирусоустойчивых растений. Для получения трансгенных вирусоустойчивых растений используются различные гены самого патогена. Анализ данных литературы свидетельствует о перспективности использования феномена патоген-опосредованной вирусоустойчивости для получения трансгенных растений с новыми экономически значимыми биологическими свойствами. Результаты экспериментов по трансгенезу растений генами вирусов позволяют предполагать существование нескольких возможных механизмов устойчивости к патогену (белок-опосредованный и РНК-опосредованный). Следует отметить, что зачастую каждый эксперимент по трансгенезу является уникальным и тем самым расширяет понимание ключевых механизмов проявления вирусоустойчивости. Обобщение приведенных данных литературы позволяет нам обоснованно считать, что патоген-опосредованная, вирусоустойчивость, определяемая геном CP вируса, является эффективным подходом к конструированию трансгенных растений, обладающих стабильным проявлением признака вирусоустойчивости. В связи с вышеизложенным основное внимание в работе уделено созданию и исследованию трансгенных растений экономически важных культур картофеля и табака, несущих PVYNTN-CP ген устойчивых к одному из наиболее опасных фитопатогенов — YBK.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Вирусные штаммы и вектор для генетической трансформации

Для создания генной конструкции был использован Венгерский изолят PVY-H некротического штамма вызывающий образование кольцевых некрозов на клубнях картофеля [Beczner et al., 1984]. Использованная для агробактериальной трансформации генная конструкция pGAYHCP была создана ранее Коллар с соавторами [Kollar et al., 1993], в у J. у wmw результате клонирования PVY 1 -CP гена белка оболочки YBK ' [Thole et al., 1993] в вектор pGA482 [An et al., 1986] для трансформации растений. Генная

JT\I конструкция pGAYHCP содержит ген под контролем промотора PcaMv 35S вируса мозаики цветной капусты и селективный маркерный ген NTP II для растений, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину, в пределах Т-ДНК области (рисунок 3). Трансформацию растений табака и картофеля проводили с использованием Gram- С58С1 (Rif) штамма Agrobacterium tumefaciens [Zambryski et al., 1983].

Для вирусологического анализа использовали растворы очищенных вирусных частиц двух штаммов

YBKn™ (изолят D-10) и YBK°/C (изолят Ка

49) [Wolf et al., 2000].

Рисунок 3 - Схема Т-ДНК вектора для экспрессии PVYwm-CP гена в растениях. LB и RB - левая и правая границы Т-ДНК, соответственно; Рсаму 35S rr\T

35S промотор вируса мозаики цветной капусты; PVY 1 -CP — ген белка оболочки pvyntn

Tnos - терминатор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens, Pnos - промотор гена нопалинсинтазы A. tumefaciens, NTP II - ген неомицин-фосфотрансферазы II, селективный маркерный ген для растений.

2.2. Растительный материал

2.2.1. Растения картофеля Solanum tuberosum L.

Растения картофеля Solanum tuberosum L. двух сортов венгерской селекции Минденеш (М) и Самодий кифли (SK) были использованы для создания трансгенных растений. Оба сорта характеризуются низкой уудГ устойчивостью к ybk 1. При заражении растений данных сортов штаммом ybkwtn на клубнях образуются некротические кольца. Асептические, безвирусные растения вышеуказанных сортов были получены из Института селекции картофеля (г. Кестхей, Венгрия), ^трансформированные растения картофеля выращивали на питательной среде МСК (таблица 6). Микроклубни получали в асептической культуре на микрочеренках растений картофеля, высаженных на питательной среде МСИК (таблица 6) [Borque et al., 1987]. Колбы (100 мл) с микрочеренками инкубировали при +19°С в темноте.

2.2.2. Растения табака Nicotiana tabacum L.

Растения табака Nicotiana tabacum L., использованные для создания трансгенных растений, были представлены германским сортом Вирджин Д (VD), германским гибридом Стамм С2 (SC) и венгерским сортом Хевеши 11 (НИ). Растения вышеперечисленных сортов и гибрида являются неустойчивыми к YBK°C и YBKwn. Их семена были получены из селекционно-семеноводческой компании Agrotab Breeding and Seed Production Ltd. (г. Дебрецен, Венгрия). Для генетической трансформации использовали в асептической культуре выращенные растения табака. Для этого семена стерилизовали и высевали на искусственную питательную среду МСТ (таблица 7). Стерилизацию семян проводили по следующей методике: 1 минута в 70 % растворе спирта (2 капли TWIN 20), 13 минут в 50% раствор ШРО (содержит NaCIO) (2 капли TWIN 20), 3 раза по 1 минуте в стерильной воде.

2.3. Питательные среды

Питательные среды для культивирования бактерий. A. tumefaciens культивировали в жидкой питательной среде LB (на 1000 мл дистиллированной воды: триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl - 10 г, рН 7,0 ). Для приготовления агаризованной питательной среды в LB добавляли 15 г бактериологического агара [Bertani, 1951].

Питательные среды для культивирования растений. За основу питательной среды для выращивания растений табака и картофеля была взята питательная среда Мурасиге и Скуга (МС) (таблица 5) [Murashige et al., 1962]. рН готового раствора солей доводили до 5,7. Добавляли сахарозу, дополнительные компоненты и агар. После автоклавирования в слегка остывшую питательную среду добавляли термочувствительные компоненты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сташевски, Зенон, Казань

1. Амбросов, А. Л. Вирусные болезни картофеля и меры борьбы с ними. Текст. / А.Л. Амбросов. Мн: Ураджай, 1975. - С. 89.

2. Блоцкая, Ж. Б. Вирусные, вироидные и фитоплазменные болезни картофеля Текст. / Ж. В. Блоцкая. Мн.: Белпринт, 2000. - 119с.

3. Вайдеманн, X. Л. Новый опасный штамм вируса Y картофеля в Европе Текст. / X. Л. Вайдеманн, Д. Шпаар, Ж. В. Блоцкая // Изв. Акад. Аграрных наук Респ. Беларусь. 1999. - Т. 1. - С. 48-51.

4. Дрейпер, Дж. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство Текст. : [пер. с англ.] / под ред. Дж. Дрейпер, Р. Скотт, Ф. Армитидж, Р. Уолден. М. : Мир, 1991.-408 с.

5. Дьяков, Ю. Т. Общая и молекулярная фитопатология Текст. / Ю. Т. Дьяков, О. Л. Озерецковская, В. Г. Джавахия, С. Ф. Багирова. М.: Общество фитопатологов, 2001. - 302 с.

6. Замалиева, Ф. Ф. Система семеноводства картофеля на оздоровленной основе в республике Татарстан Текст. / Ф.Ф. Замалиева, Г.Ф. Сафиуллина, P.P. Назмиева, 3. Сташевски, 3.3. Салихова // Вестник защиты растений. -2006.-№1.-С. 50-55.

7. Зыкин, А. Г. Тли переносчики вирусов картофеля Текст. / А.Г. Зыкин. -Л.: Колос, 1970.-71 с.

8. Зыкин, А. Г. Вирусные болезни картофеля Текст. / АТ\ Зыкин. Л.: Колос, 1976 - 77 с.

9. Ивановский, Д: Uber die Mosaikkrankheit der Tabakpflanze Текст. 7 Д. Ивановский, // Bull. Acad. Imp. Sci. St. Petersburg. 1892. - V. III. - P. 35-65.

10. Иванюк, В. Г. Защита картофеля, от болезней, вредителей и сорняков Текст. / В. Г. Иванюк, С. А. Банадысев, Г. К. Журомский. Мн.: Белпринт, 2005. - 696с. - ISBN 985-459-060-7.

11. Карамова, Н. С. Мутагенное действие экстрактов растений картофеля S. tuberosum L., обработанных пестицидами Текст. / Н.С. Карамова, 3.

12. Сташевски, А. П. Денисова // Ученые записки Казанского университета Сер. Естеств. Науки. 2009. - Т. 151. кн. 1. С. 155-163.

13. Мэтьюз, P. Вирусы растений Текст. : [пер. с англ.] / Р. Мэтьюз. М. : Мир, 1973. - 600 с. - Перевод изд.: Plant Virology / R. Е. F. Matthews. - New York and London: Academic Press, 1970.

14. Росс, X. Селекция картофеля. Проблемы и перспективы Текст. : [пер. с англ.] / X. Росс. М.: ВО "Агропромиздат", 1989. - 183 с. - Перевод изд.: Potato Breeding - Problems and Perspectives / H. Ross. — Berlin and Hamburg: Verlag Paul Parey, 1986.

15. Шпаар, Д., Картофель: Выращивание уборка, хранение Текст. / под ред. Д. Шпаар, А. Быкин, Д. Дрегер и др. Торжок: ООО «Вариант», 2004. -466 с.

16. Шуберт, Й. К проблеме диагностики штаммов Y-вируса картофеля (PVY) Текст. / Й. Шуберт, Ф. Рубенштайн, М. Хрцановска, Д. Шпаар // Вестник защиты растений. — 2004. Т. 3. — С. 3-10.

17. An, G. Transformation of tobacco, tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system Text. / G. An, B. D. Watson, С. C. Chiang // Plant Physiology. 1986.-V. 81.-P. 301-305.

18. Atreya, C. D. A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmaissibility of a potyvirus Text. / C.D. Atreya, B. Raccah, T.P. Pirone // Virology.^ 1990.-V. 178.-P. 161-165.

19. Bantounas, I. RNA interference and the use of small interfering RNA to study gene function in mammalian systems Text. /1. Bantounas, L. A. Phylactou, J. B. Uney // J. Mol. Endocrinology. 2004. - V. 33. - P. 545-557.

20. Barker, H. Expression of genes for resistance to potato virus Y-potato plants and protoplasts Text. / H. Barker, B. D. Harrison // Ann. Appl. Biol. 1984. - V. 105.-P. 531-545.

21. Barker, H. The development of resistance to luteoviruses mediated by host genes and pathogen-derived transgenes Text. / H. Barker and P. M. Waterhouse //

22. The Luteoviridae / Eds. H. G. Smith, H. Barker. Wallingford: CAB International, 1999.-P.-139-163.

23. Barnett, O. W. A summary of potyvirus taxonomy and definitions Text. / O. W. Barnett // Potyvirus Taxonomy. New York : 1992. - P. 435-444.

24. Bartels, R. Symptoms bildung von viren der Kartoffel-Y-Gruppe, auf A6 Blatten P. R. Text. / R. Bartels // Potato Res. 1970. - V. 13 - P. 119-128.

25. Basky, Z. The relationship between aphid dynamics and two prominent potato viruses (PVY and PLRV) in seed potatoes in Hungary Text. / Z. Basky // Crop Protection. 2002. - V. 21. - P. 823-827.

26. Baulcombe, D. Replicase-mediated resistance, a novel type of virus resistance in transgenic plants Text. / D. Baulcombe // Trends Microbiol. — 1994. -P. 60-63.

27. Baur, E. Zur Aetiologie der infectiosen Panachierung Text. / E. Baur // Ber. Deut. Botan. Ges. 1904. - V. 22. - P. 453-460.

28. Beachy, R. N. Mechanisms and applications of pathogen-derived resistance in transgenic plants Text. / R. N. Beachy // Current Opinion in Biotechnology. -1997.-V. 8.-P. 215-220.

29. Beczner, L. Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato Text. / L. Beczner, J. Horvath, I. Romhanyi, H. Forster // Potato Res. -1984.-V. 27. -P: 339-352.

30. Beekman, A. G. B. Breeding for resistance Text. / A. G. B. Beekman // Viruses of potatoes and seed-potato production / Eds. J. A. de Bokx, J. P. H. van der Want. Wageningen: PUDOC, 1987. - P. 162-170.

31. Beijrinck M. W. Over een contagium vivum fluidum als oorzaak van de vlekziekte der tabaksbladen Text. / M. Beijrinck // Afdel. Wis-Natuurk. 1898. -V. 7.-P. 229-235.

32. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli Text. / G. Bertani, // J. Bacteriol. 1951. - V. 62. - P. 293-300.

33. Bonness, M. S. Pokeweed antiviral protein inactivates pokeweed ribosomes; implications for the antiviral mechanism Text. / M. S. Bonness, M. P. Ready, J. D. Irvin, T. J. Mabry // The Plant Journal. 1994. - V. 5. - P. 173-183.

34. Borque, J. E. Use of an in vitro tuberization system to study tuber protein gene expression Text. / J. E. Borque, J. C. Miller, W. D. Park // In Vitro Cellular and Development Biology. 1987. - V. 23. - P. 381-386.

35. Braun, C. J. Expression of amino-terminal portions of full length viral replicase genes in transgenic plants confers resistance to potato virus X infection Text. / C. J Braun, C. L. Hemenway // Plant Cell. 1992. - V 4. - P. 735-744.

36. Brigneti, G. Molecular mapping of the potato virus Y resistance gene Ryst0 in potato Text. / G. Brigneti, J. Garsia-Mas, D. C. Baulcombe // Theor. Appl. Genet. 1997.-V. 94.-P. 198-203.

37. Broadbent, L. The epidemiology of tomato mosaic. VII. The effect of TMV on tomato fruit yield and quality under glass Text. / L. Broadbent // Ann. Appl. Biol. 1964. - V. 54. - P. 209-224.

38. Brown, C. R. Selection for resistance to PVX and PVY in tetraploid potato populations Text. / C.R. Brown, E. N. Fernandez-Northcote // Am. Pot. J. 1981. -V. 58. - P. 536-537.

39. Burton, W. G. The Potato 3rd ed. Text. / W. G. Burton. Singapore : Longman Technical and Scientific, 1989. - 742 p.

40. Carrington, J. C. A viral cleavage site cassette : identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing Text. / J. C. Carrington, W. G. Dougherty // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 3391-3395.

41. Carrington, J. C. A second proteinase encoded by plant potyvirus Text. / J.

42. C. Carrington, S. M. Сагу, T. D. Parks, W.G. Dougherty // EMDO J. 1989a. - V. 8.-P. 365-370.

43. Carrington, J. C. Autocatalytic processing of the potyvirus helpercomponent proteinase in Escherichia coli and in vitro Text. / J. C. Carrington, D.

44. D. Fried, Т. C. Sanders // J. Virology. 1989b. - V. 63. - P. 4459-4463.

45. Chapman, S. N. Potato virus X as a vector for gene expression in plants Text. / S. N. Chapman, T. A. Kavanagh, D. C. Baulcombe // Plant J. 1992. - V. 2.-P. 549-557.

46. АН, Т. Maoka, К. T. Natsuaki // Virus Genes. 2007a. - V. 35. - P. 359-367.

47. Chikh Ali, M. The occurrence and characterization of new recombinantiisolates of PVY displaying shared'properties of PVYNW and PVYN™ Text. / M. Chikh Ali, T. Maoka, К. T. Natsuaki // J. Phytopathology. 2007b. - V. 155. - P. 409-415.

48. Chikh Ali, M. Whole Genome Sequence and Characterization of a Novel Isolate of PVY Inducing Tuber Necrotic Ringspot in Potato and Leaf Mosaic in

49. Tobacco Text. / M. Chikh Ali, T. Maoka, К. T. Natsuaki // J. Phytopathology. -2008.-V. 156.-P. 413-418.

50. Chrzanowska, M. Nowe izolaty wirusa Y zagrazajace ziemniakom w Polsce Text. / M. Chrzanowska // Hodowla Roslin I Nasiennictwo. 1987. - T. 5-6. - S. 8-11.

51. Chrzanowska, M. New isolates of necrotic strain of Potato virus Y СPVYn) found recently in Poland Text. / M. Chrzanowska // Potato Research. 1991. - V. 34.-P. 179-182.

52. Clark, M. F. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses Text. / M. F. Clark, A.N. Adams // J. Gen. Virol. 1977. - V. 34. - P. 475-483.

53. Cockerham, G. Genetical study on resistance to potato viruses X and Y Text. / G. Cockerham // Heredity. 1970. - V. 25 - P. 309-348.

54. Commoner, B. Linear biosynthesis of tobacco mosaic vims. Development and test of a model Text. / B. Commoner // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 1962. -V. 48.-P. 2076-2083.

55. De Bokx, J. A. Potato virus Y Text. / J. A. De Bokx, H. Huttinga // Descriptions of Plant Viruses, no. 242; eds. B. D. Harrison, A. F. Murant. -Wellesbourne: Commonwealth Mycological Institute, Kew and Association of Applied Biologists, 1981. P. 27-33.

56. Delhey, R. Zur Natur der extremen Virusresistenz bei der Kartoffel I. Das X-Virus Text. / R. Delhey'// Phytopath. 1974. - Z. 80. - P. 97-119.

57. Delhey, R. Zur Natur der extremen Virusresistenz bei der Kartoffel I. Das Y-Virus Text. / R. Delhey // Phytopath. 1975. - V. 80. - P. 97-119.

58. Donnelly, D. Potato microtuber production and performance: A review Text. / D. Donnelly, W. K. Coleman // Am. J. Potato Res. 2003. - V. 80. - P. 103-115.

59. Dougherty, W. G. Expression and function of polyviral gene products Text. / W. G. Dougherty, J. C. Carrington // Annu. Rev. Phytopathology 1988. - V. 26. -P. 123-143.

60. Edwardson, J.R. Some properties of the potato virus Y-group Text. / J.R.Edwardson // Fla. Ageic. Exp. Stn. Monogr. 1974. - Ser. 4. - 225 p.

61. Ellis, P. Production of monoclonal antibodies for detection and identification of strains of potato virus Y Text. / P. Ellis, R. Stace-Smith, G. Bowler, D. J. Mackenzie // Canadian J. Plant Pathol.- 1996. V.l 8. - P. 64-70.

62. Feher, A. Expression of 9. PVX coat protein gene under the control of extensin-gene promoter confers virus resistance on transgenic potato plants Text. / A. Feher, G. K. Skryabin, , E. Balazs [et al.] // Plant Cell Report. 1992. - V. 11. -P. 48-52.

63. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Text. / A. Fire, S. Xu, , M.K. Montgomery, S.A. Kostas, S.E. Driver, C.C. Mello // Nature/ 1998. - V. 391. - P. 806-811.

64. Freankel-Conrat, H. Reconstitution of active tobacco mosaic virus from its inactive protein and nucleic acid components Text. / H. Freankel-Conrat, R. C. Williams // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 1955. - V. 41. - P. 690-698.

65. Garcia, J. A. Proteolytic activyti of the plum box potyvirus NIa-protein in Escherichia coli Text. / J. A. Garcia, J. L. Riechmann, S. Lain // Virology. -1989a. V. 170. - P. 362-369.

66. Garcia, J. A. Artificial cleavage site recognized by plum box potyvirus protease in Escherichia coli Text. / J. A. Garcia, J. L. Riechmann, S. Lain // J. Virology. 1989b. -V. 170. - P. 2457-2460.

67. Garcia, J. A. Proteolytic activyti of the plum, box potyvirus NIa-protein on excess nftur'al and artificial subctrates in Escherichia coli Text. / J. A. Garcia, J. L. Riechmann, M. T. Martin, S. Lain // FEBS Lett. 1989c. - V. 257. - P. 269273.

68. Garcia, J. A. Mutational analysis of the plum pox potyvirus polyprotein processing by the NIa protease in Escherichia coli Text. / J. A. Garcia, S. Lain, M. T. Cervera, J. L. Riechmann, M. T. Martin // J. Gen. Virology. 1990. - V. 71. -P. 2773-2779.

69. Gibson, R. W. The resistance of three Solanum species to Myzus persicae, Macrosiphum euphorbiae and Aulacortbum solani (Aphididae: Homoprotera) Text. / R. W. Gibson // Annual Applied Biology. 1971. - V. 68. - P. 245-251.

70. Gibson, R. W. The development of mature plant resistance in four potato cultivars against aphid-inoculated potato virus Y° and YN Text. / R. W. Gibson // Potato Res. 1991. - V. 34. - P. 205-210.

71. Gibson, R. W. Wild potato repels aphids by release of aphid alarm pheromones Text. / R. W. Gibson, J. A. Pickett // Nature. 1983. - V. 302. - P. 608-609.

72. Golemboski, D. B. Plants transformed with tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus Text. / D. B. Golemboski, G. P. Lomonosoff, M. Zaitlin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. - V. 87. - P. 6311-6315.

73. Gonsales, D. Coat-protein-mediated protection: analysis of transgenic plants for resistance in a variety of crops Text. / D. Gonsalves, J.L. Slightom, // Semin. Virol. 1993. - V. 4. - P. 397-405.

74. Goodwin, J. Genetic and biochemical dissection of transgenic RNA-mediated virus resistance Text. / J. Goodwin, K. Chapman, S. Swaney, T. D. Parks, E. A. Wersman, W. G. Dougherty // Plant Cell. 1996. - V. 8. - P. 95-105.

75. Govier, D.A. A virus-induced component in plant needed when aphids acquire potato virus Y from purified preparations Text. / D.A. Govier, B. Kassanis // Virology. 1974. - V. 61. - P. 420-426.

76. Graham^ M. W. The search for the perfect potato Text. / M. W.- Graham, P. Keese, P. M. Waterhouse // Today's Life Sci. 1995. - V. 7. - P. 34-41.

77. Gunasinghe, U. B. Association of potato Y gene products with chloroplasts in tobaccoText. / U. B. Gunasinghe, P. H. Berger // Mol. PI. Microbe Interact. -1991.-V. 4.-P. 452-457.

78. Halford, N.G. Prospects for genetically modified crops Text. / N.G. Halford // Annals of Applied Biology. 2004. - V. 145. - P. 17-24.

79. Hamilton, A. J. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants Text. / A. J. Hamilton, D. C. Baulcombe // Science. 1999. -V. 286.-P. 950-952.

80. Hari, V. The RNA of tobacco etch virus : further characterization and detection of protein linked to RNA Text. / V. Hari // Virology. 1981. - V. 112. -P. 391-399.

81. Hari, V. The RNA of tobacco etch virus contains poly (A) Text. / V. Hari, A. Siegel, C. Rozek, W.E. Timberlake // Virology. 1979. - V. 92. - P. 568-571.

82. Harrison, H. Virus structure Text. / H. Harrison, D. C. Wiley, J. J. Skehel // Fields Virology ; B. N. Fields, D. N. Knipe, P.M. Howley. N. Y. : Lippincott-Raven, 1996.-P. 59-100.

83. Hay, J.M. Nucleotide sequence of the coat proteine gene of the necrotic strain of potato virus Y from New Zealand Text. / J.M. Hay, A.P. Fellowes, G.M. Timmerman // Archives of Virology. 1989. - V.107. - V. 111-122.

84. Hellmann, G.M. In vitro analysis of tobacco vein mottling virus NIa cistron: evidence for a vims- encoded protease Text. / G.M. Hellmann, J. G. Shaw, R.E. Rhoads // Virology. 1988. - V.163. - V. 554-562.

85. Hemenway, С. Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNA Text. / C. Hemenway, R. F. Fang, W. K. Kaniewski, N. H. Chua, N. E. Turner // EMBO J. -1988. V.7. - V. 1273-1280.

86. Hiebert, E. Characterization of some proteins assotiated with viruses in the potato Y group Text. / E. Hiebert,'J. G: McDonald // Virology. 1973. - V. 56. -P. 349-361.

87. Hinostroza-Orihuela, A. M. Some characteristics of infectious RNA from potato virus Y Text. / A. M. Hinostroza-Orihuela // Virology. 1975. - V. 67. -P. 276-278.

88. HoIIings, M. Potyviruses Text. / M. Hollings, A. A. Brunt // Handbook of

89. Plant Virus Infections : Comparative Diagnosis ; eds. E. Kurstac. Amsterdam:

90. Elsevier/North Holland, 1981. P. 731-807.

91. Horsch, R. B. Leaf disc transformation Text. / R. B. Horsch, J. Fry, N. Hoffman, J. Neidermeyer, S. G. Rogers, Rr. T. Fraley // Plant Molecular Biology Manual. 1988: -V. 5. - P. 1-9.

92. Horvath, S. Virological problems of potato production in Hungary Text. / S. Horvath, I. Wolf // Abstracts of the 14th Conference of the European Association of Potato Research, 1999. P. 383-384.

93. Jarret, R. L. Effects on medium components on shoot formation from cultured tuber discs of potato Text. / R. L. Janet, P. M. Hasegawa, H. T. Erickson // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1980. - V. 105. - P. 238-242.

94. Johnson, R. Specifity in gene-for-gene interactions between plants and pathogens Text. / R. Johnson, D.R. Knott // Plant Pathology. 1992. - V. 41. - P. 1-4.

95. Jones, R. A. C. The ecology of viruses infecting wild and cultivated potatoes in the Andean region of South America Text. / R. A. C. Jones // Pests, Pathogens and Vegetation / Eds. J. M. Thresh London : Pitman Books, 1981. - P. - 87-107.

96. Jones, R. A. C. Strain group specific and virus specific hypersensitive reactions to infection with potyviruses in potato Text. / R. A. C. Jones // Ann.

97. Appl. Biol. 1990. -V. 3. - P. 93-105.

98. Jozsa, R. Potato Virus Y Coat Protein Gene Induced Resistance in Valuable Potato Cultivars Text. / R. Jozsa, Z. Stasevski, I. Wolf, S. Horvath, E. Balazs // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 2002a. - V. 37. - P. 1-7.

99. Jozsa, R. High level of field resistance of transgenic tobaccos induced by integrated potato virus Y coat protein gene Text. / R. Jozsa, Z. Stasevski, E. Balazs // Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 2002b. - V. 37. -P. 311-316.

100. Kashiwazaki, S. Nucleotide sequence of the capsid protein gene of barley yellow mosaic virus Text. / S. Kashiwazaki, Y. Hayano, Y. Minobe, T. Omura, H. Hibino, T. Tsuchizaki //Journal of Gen Virology. 1989. -V. 70. - P. 3105-3023.

101. Kawchuk, L. M. Sense and antisense RNA-mediated resistance to potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants Text. / L. M. Kawchuk, R. R. Martin, J. Macpherson // J. Mol. Pl.-Microbe Interact. 1991. - V. 4. - P. 247-253.

102. Kerlan, C. Variability of Potato virus Y in Potato crops in Frace Text. / C. Kerlan, M. Tribodet, L. Glais, M. Guillet // J. Phytopathol. 1999. - V. 147. - P. 643-651.

103. Kerr, A. A reply to R. Johnson and D.R. Knott Text. / A. Kerr // Plant Pathology. 1992. - V. 41. - P. 4.

104. Kikuta, Y. Shoot-bud formation and plantlet regeneration in potato tuber tissue cultured in vitro Text. / Y. Kikuta, Y. Okazawa // J. Fac. Agric. Hokkaido Univ.-1982.-V. 61.-P. 166-179.

105. Knorr, D. A. point mutation in the tobacco mosaic virus capsid protein gene induces hypersensitivity to Nicotiana sylvestris Text. / D. A. Knorr and W. O. Dawson//Proc. Natl. acad. Sci. USA- 1988.-V. 85. -P. 170-174.

106. Kollar, A. Efficient pathogen-derived resistance induced by integrated potato virus Y coat protein gene in tobacco Text. / A. Kollar, V. Thole, T. Dalmay, P. Salamon, E. Balazs // Biochimie. 1993. - V. 75. - P. 623-629.

107. Lain, S. The complete nucleotide sequence of plum pox potyvirus RNA Text. / S. Lain, J.L. Riechmann, E. Mendex, J.A. Garcia // Vims Research. -1989.-V. V. 13.-P. 157-172.

108. Lain, S. RNA helicase: a novel activity associated with a protein encoded by a positive strand RNA virus Text. / S. Lain, J.L. Riechmann, J.A. Garcia // Nucleic Acids Reseach. 1990. - V. 18. - P. 7003-7006.

109. Lam, S. L. Shoot formation in potato tuber discs in tissue culture Text. / S. L. Lam // American Potato Journal. 1975. - V. 52. - P.103-106.

110. Lehmann, P. Structure and evolution of plant disease resistance genes Text. / P. Lehmann // J. Appl. Genet. 2002. - V. 43. - P. 403-414.

111. Leiser, R. M. Reinigung und einige Eigenschaften des Kartoffel-YVirus. Text. / R. M. Leiser, J. Richter // Arch. Phytopathology. 1978. - V. 14. - P. 337-350.

112. Le Romancer, M. Biological characterisation of various geographical isolates of potato virus Y inducing superficial necrosis on potato tubers Text. / M. Le Romancer, C. Kerlan, M. Nedellec // Plant. Pathol. 1994. - V. 43. - P. 138-144.

113. Li, H. Strong host resistance targeted against a viral suppressor of the plant gene silencing defence mechanism Text. / H. Li, A. P. Lucy, H. Guo, W. Li, L. Ji, S. Wong, S. Wong, S. Ding// The EMBO Journal.- 1999. V. 18: - P. 26832691.

114. Longstaff, M. Extreme resistance to potato virus X infection in plants expressing a modified component of the putative viral replicase Text. / M.1.ngstaff, G. Brigneti, F. Boccard, S. Chapman, D. Baulcombe // EMBO J. -1993.-V. 12.-P. 379-386.

115. Makkouk, К. M. Characterization of potato Virus Y Strains Isolated from Pepper Text. / К. M. Makkouk, D. J. Gumpf// Phytopathology. 1974. - V. 64. -P. 1115-1119.

116. Malnoe, P. Small-scale field tests with transgenic potato, cv. Bintje, to test resistance to primary and secondary infections with potato virus Y Text. / P. Malnoe, L. Farinelli, G. F. Collet, W. Reust // PI. Mol. Biol. 1994. - V. 25. - P. 963-975.

117. Maule, A. J. Source of natural resistance to plant viruses: status and prospects Text. / A. J. Maule, C. Caranta, M. I. Boulton // Molecular Plant Pathology. -2007.-V. 8.-P. 223-231.

118. Mayer, A. Ueber die Mosaikkrankheit des Tabaks Text. / A. Mayer // Landwirtsch. Versucht-Stationen. 1886. -V. 32. - P. 451-467.

119. McDonald; J. G. Host, range, symptomology and serology of isolates of Potato virus Y (PVY) that shared properties with both the PVYS and PVY° strain groups Text. / J. G. McDonald, R. P. Singh // Am Potato J. 1996a. - V. 73. - P. 309-315.

120. McDonald, J. G. Response of potato cultivars to North American isolates of pyyNTN Texf| / j G McDonald, R. P. Singh // Am Potato J. 1996b. - V. 73. - P. 317-323.

121. Missiou, A. Generation of transgenic plants highly resistant to potato virus Y (PVY) through RNA gene silencing Text. / A. Missiou, K. Kalantidis, A. Boutla, S. Tzortzakaki, M. Tabler, M. Tsagris // Molecular Breeding 2004. - V. 14. - P. 185-197.

122. Moghal, S. M. Towards a system for the identification and classification of potyviruses. I. Serology and amino acid composition of six distinct viruses Text. / S. M. Moghal, R. I. B. Francki // Virology. 1976. - V. 73. - P. 350-362.

123. Mouches, C. Turnip yellow mosaic virus RNA-replicase contains host and virus-coded subunits Text. / C. Mouches, T. Candresse, J. M. Bove // Virology. -1984.-V.134.-P. 78-79.

124. Mueller, E. Homology-dependent resistance, transgenic vims resistance in plants related to homology-dependent gene silencing Text. / E. Mueller, J. Gilbert, G. Davenport, G. Brigneti, D. C. Baulcombe // Plant J. 1995. - V. 7. - P. 1001-1013.

125. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Text. / T.Murashige and F. Skoog // Physiol Plant. 1962. -V. 15.-P: 473-497.

126. Murphy, J. F. The VPg tobacco etch vims is the 49-kDa proteinase or the N-terminal 24-kDa part of proteinase Text. / J. F. Murphy, R. E. Rhoads, A. G. Hunt, J. G. Shaw // Virology. 1990. - V. 178. - P. 285-288.

127. Plant Viruses Online Potato Y potyvirus Electronic data. - 1996. -Режим доступа : http://image.fs.uidaho.edu/vide/descr652.html. — Дата доступа : 11.10.2001.

128. Ponz, F. Mechanisms of resistance to plant viruses Text. / F. Ponz and G. Bruening // Ann. Rev. Phytopathol. 1988. - V.24. - P. 355-381.

129. Powell-Abel, P. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene Text. / P. Powell-Abel, R.S. Nelson, B. De [et al.] // Science. 1986. - V. 232. - P. 738-743.

130. Prins, M. Strategies for antiviral resistance in transgenic plants Text. / M. Prins, M. Laimer, E. Noris, J. Shubert, M. Wassenegger, M. Tepfer // Molecular Plant Pathology. 2008. - V. 9. - P. 73-83.

131. Ranalli, P. Microtubers Text. / P. Ranalli // Potato Research'. 2007. - V. 50i-P: 301-304.

132. Ranalli; P. Innovative propagation methods in seed tuber multiplication programs.Text. / P. Ranalli // Potato Research. 1997. - V. 40. - P. 439-453.

133. Rast, A. Th. B. Yield of glasshouse tomatoes as effected by strains of tobacco mosaic Text. / A. Th. B. Rast//Neth. J. PI. Path. 1967.-V. 73.-P. 147-156.

134. Reavy, B. Immunity to potato mop-top virus in Nicotiana benthamiana plants expressing the coat protein gene is effective against fungal inoculations of the vims

135. Text. / В. Reavy, M. Arif, S. Kashiwazaki et al.] // Mol. Pl.-Microbe Interact. -1995.-V. 8.-P. 286-291.

136. Register, J. C. Resistance to TMV in transgenic plants results from interference with an early event in infection Text. / J. C. Register, R. N. Beachy// Virology. 1988. - V. 166. - P. 524-532.

137. Riechmann, J. L. The genome-linked protein and 5'RNA sequence of plum pox virus Text. / J. L. Riechmann, S. Lain, J. A. Garcia // J. Gen. Virology. -1989.- V. 69.-P. 1509-1516.

138. Robaglia, С. M. Nucleotide sequence of potato virus Y (N strain) genomic RNA Text. / С. M. Robaglia, M. Durand-Tardif, G. Tronchet [et al.] // J. Gen. Virology. 1989. - V. 70. - P. 935-947.

139. Ross, H. Major and minor genes in breeding virus-resistant varieties Text. / H. Ross // Proc. Int. Congr. Research for the Potato in the Year 2000. Int. Pot. Center, Lima, 1983. P. 165-166.

140. Rubino, L. Biologically active cymbidium ringspot virus satellite RNA in transgenic plants suppresses accumulation of DI RNA, Text. / L. Rubino, J.C. Carrington, M. Russo // Virology. 1992. - V. 188. - P. 429-437.

141. Saladrigas, М. V. Potato gene X1 confers inoculum dependent resistance to potato virus X replication in protoplasts Text. / M. V. Saladrigas, M. F. Ceriani, A.C. Tozzini, A. I. Arese, H. E. Hopp // Plant Cell Physiology. 1990. - V. 31. -P. 749-755.

142. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual Text. / J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 2nd edition. Cold Spring Harbor, New York : Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. - p.432.

143. Seppaenen, P. Movement protein-derived resistance to triple gene block-containing plant viruses Text. / P. Seppaenen, R. Puska, J. Honkanen, L. G. Tyulkina, O. Fedorkin, S. Y. Morozov [et al.] // J. Gen. Virol. 1997. - V. 78. - P. 1241-1246.

144. Shah, D. M. Resistance to diseases and insects in transgenic plants; progress and applications to agriculture Text. / D. M. Shah, С. Т. M. Rommens, R. N. Beachy // Trends Biotechnol. 1995. - V.13.-P. 362 -368.

145. Shahabuddin, M. Mapping of the tobacco vein mottling virus VPg cistron Text. / M. Shahabuddin, // J.G. 1988. - V. 163. - P. 635-637.

146. Shukla, D. D. Coat protein of potyviruses. 3. Comparision of amino acid sequences of the coat protein of four Austrlian strains of sugareane mosaic virus Text./ D.D. Shukla, K.H. Gough, C.W. Ward // Achives of Virology. 1987. -V.96.-P. 59-74.

147. Shukla, D. D. Amino acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group Text. / D.D. Shukla, C.W. Ward // Journal of Genetic Virology/ 1988. - V.69. - P. 2703-2710.

148. Shukla, D. D. Structure of potyvirus coat proteins and application in the taxonomy of the potyvirus group Text. / D. D. Shukla, C. W. Ward // Adv. Virus Res. 1989a. - V.36. - P. 273-314.

149. Shukla, D. D. Identification and classification of potyviruses on basis of coat protein sequence data and serology Text. / D. D. Shukla, C. W. Ward // Arch. Virol. 1989b.-V.106.-P. 171-200.

150. Shukla, D. D. Structure and function of potivyrus genome with special reference to the coat protein coding region Text. / D. D. Shukla, M. J. Frenkel, C. W. Ward // Canadian J. Plant Pathology. 1991. - V. 13. - P. 178-191.

151. Siaw, M. F. E. Identification of protein covalently linked to the 5'-terminus of tobacco vein mottling virus RNA Text. / M. F. E. Siaw, M. Shahabuddin, S. Ballard [et al] // Virology. 1985. - V. 142. - P. 134-143.

152. Smith, R. E. New light on curly top of sugar beet Text. / R. E. Smith, P. A. Boncquet // Phytopathology. 1915. - V. 5. - P. 103-107.

153. Smith, К. M. Composite nature of some potato viruses of the mosaic group Text. / К. M. Smith // Nature. 1931. - V. 127. - P. 702.

154. Smith, К. M. Some notes on a suspected variant of Solanum virus 2 (potato virus 2) Text. / К. M. Smith, R. W. G. Dennis // Annal. Appl. Biol. 1940. - V. 27.-P. 65-70.

155. Smith, H. A. Transgenic potato vims Y resistance in potato: Evidence for RNA-mediated cellular responce Text. / H. A. Smith, H. Powers, S. L. Swaney, C. Brown, W. G. Dougherty // Phytopathology. 1995. - V. 85. - P. 864-870.

156. Smith, N. A. Total silencing be intron-spliced hairpin RNAs Text. / N. A. Smith, S. P. Sigh, M. B. Wang, P. A. Stoutjesdijk, A. G. Green, P. M. Waterhouse // Nature. 2000. - V. 407. - P. 319-320.

157. Solomon, R. M. Methods of screening for resistance to potato viruses X and Y Text. / R. M. Solomon // Abstract of 7th Triennial Conf. Eur. Ass. Pot. Res., Warsaw, 1978.-P. 134-135.

158. Solomon, R. M. Screening potato cvs. for major gene resistance to potato viruses X and Y Text. / R. M. Solomon // Ann. Appl. Biol. 1983. - V.102. - P. 134-135.

159. Solomon, R. A possible mechanism for exclusion of plant vimses from embryonic and meristem cultures Text. / R. Salomon // Research Virology. -1989.-V. 1989.-V. 140.-P. 453-460.

160. Solomon, R. The role of the N-terminus of potyvirus coat in aphid transmission Text. / R. Salomon, B. Raccah // Abstracts P83-7 of VIII International Congress of Virology, Berlin, 26-31 August 1990. P. 26-31.

161. Solomon-Blackburn, R. M. A review of host major-gene resistance to potato vimses X, Y, A and V in potato, genes, genetics and mapped locations Text. / R. M. Solomon-Blackbum, H. Barker // Heredity 2001a. - V.86. - P. 8-16.

162. Solomon-Blackburn, R. M. Breeding vims-resistant potatoes (,Solatium tuberosum): a review of traditional and molecular approaches Text. / R. M. Solomon-Blackburn, H. Barker // Heredity 2001b. - V.86. - P. 17-35.

163. Stace-Smith, R. Purification and composition of potato vims Y. Text. / R. Stace-Smith, J. H. Tremaine // Phytopathology. 1970. - V.60. - P. 1785-1793.

164. Stark, D. M. Protection against potyvirus infection in transgenic plants: Evidence for broad spectmm resistance Text. / D. M. Stark, R. N. Beachy // Bio/Technology. 1989. - V.7. - P. 1257-1262.

165. Stirpe, F. Dianthins, ribosome-damaging proteins with anti-viral properties from Dianthus caryophyllus L. (carnation) Text. /F. Stirpe, D. G. Williams, L. J. Onyon, R. F. Legg //Biochem. J. 1981. - V. 195. - P. 399-405.

166. Tacke, E. Genetic engineering of potato for broad-spectrum protection against virus infection Text. / E. Tacke, F. Salamini, W. Ronde // Nature Biotechnol. 1996. V. 14. - P. - 1597-1601.

167. Thole, V. Cloning and sequencing of potato virus Y (Hungarian isolate) genomic RNA Text. / V. Thole, T. Dalmay, J. Burgyan, E. Balazs // Gene.1993.-V. 123.-P. 149-156.

168. Thomas, P. E. Reduced field spread of potato leafroll virus in potatoes transformed with the potato leafroll virus coat protein gene Text. / P. E. Thomas, W. K. Kaniewski, E. C. Lawson // Plant Dis. 1997. - V. 81. - P. 1447-1453.л

169. Thornbury, D. W. Purification and characterization of potyvirus helper component Text. / D.W. Thornbury G.M. Hellmann, R.E. Rhoads, T.P. Prione // Virology. 1985. - V. 144. - P: 260-267.

170. Valkonen, J.P. T. Natural genes and mechanisms for resistance to viruses in cultivated and wild potato species (Solanum spp.) Text. / J. P. T. Valkonen // PI. Breed. 1994. - V. 112. - P. 1-16.

171. Valkonen, J. P. T. Resistance to Myzus persicae (Sulz.) in wild potatoes of the series Etuberosa Text. / J. P. T. Valkonen, G. Brigneti, E. Pehu // PI. Breed.1994.-V. 112.-P. 1-16.

172. Valvekeris, D. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection Text. / J. P. T. Valkonen, G. Brigneti, E. Pehu // PI. Breed. 1994. - V. 112. - P. 1-16.

173. Van.den Elzen, P. J. M. Virus and fungal resistance, from laboratory to field Text. / D. Valvekens, M. Van Montagu^ M." Van Lusebettens // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1988. - V. 85. - P. 5536-5540.

174. Van der Plank, J. E. Specific susceptibilityand species feeding in gene-for-gene systems Text. / J. E. Van der Plank // Adv. Plant Pathology. 1986. - V. 5. -P. 19-223.

175. Van der Plank, J. E. The two gene-for-gene hypotheses and a test to distinguish them Text. / J. E. Van der Plank // Plant Pathology. 1991. - V. 40. -P. 1-3.

176. Van der Vlugt, R. A. A. Evidence for sense RNA-mediated protection in tobacco plants transformed with viral coat protein cistron Text. / R. A. A. Van der Vlugt, R. K. Ruiter, R. Goldbach // Plant Molecular Biology. 1992. - V. 20. - P. 631-639.

177. Varma, A. Some observations on the structure of the filamentous particles of several plant viruses Text. / A. Varma, A. J. Gibbs, A. J. Woods, J. T. Finch // J. Gen. Virol. 1968. - V. 2. - P. 107-114.

178. Vaucheret, H. Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators Text. / H. Vaucheret, M. Fagard // Trends Genet. 2001. - V. 17. - P. 29-35.

179. Viruses of plants — Known susceptibilities in So/anaceae Electronic data. 1996. - Режим доступа : http://image.fs.uidaho.edu/vide/famlyl24.html. - Дата доступа: 11.10.2001.

180. Virus structure Electronic data. 1999. - Режим доступа : http://tulane.edu/~dmsander/WWW/224/Structure224.html. - Дата доступа : 10.10.2001.

181. Voinet, О. Induction and suppression of RNA silencing: insights of viral infections Text. / O. Voinet, Y. M. Pinto, D. C. Baulcombe // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 14147.

182. Voinet, O. Induction and suppression of RNA silencing: insights of viral infections Text. / O. Voinet // Nature Rev. Genet. 2005. - V. 6. - P. 206-220.

183. Wang, M. В. A single copy of a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus Text. / M. B. Wang, D. C. Abbot, P. M. Waterhouse // Mol. Plant. Pathology 2000. - V. 1. - P. 347-356.

184. Ward, C. W. Taxonomy of potyvimses current problems and some solutions Text. / C. W. Ward, D. D. Shukla // Intervirology. 1991. - V. 32. - P. 269-296.

185. Waterhouse, P. M. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Text. / P. M. Waterhouse, M. W. Graham, M. B. Wang // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - V. 95. - P. 959-964.

186. Waterhouse, P. M. Role of short RNAs in gene silencing Text. / P. M. Waterhouse, M.B. Wang E. J. Finnegan // Trends Plant Sci. 2001. - V. 6. - P. 297-301.

187. Weidemann, H. L. Importance and control of potato virus YN (PVYN) in seed potato production Text. / H. L. Weidemann // Potato Research. 1988. - V. 31.-P. 85-94. - '

188. White, J. L. A simple method for detection of viral satellite RNAs in small plant tissue samples Text. / J.L. White, J. M. Kaper // J. Virol. Methods. 1989. -V. 23.-P. 83-94.

189. Yusibov, V. High-affinity RNA-binding domains of alfalfa mosaic virus coat protein are not required for coat protein-mediated resistance Text. / V. Yusibov, L. S. Loesch-Fries //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V. 92. - P. 1-5.

190. Zagorska, H. Reakcja na wirusy odmian ziemniaka znajdujacych sie w-krajowym Odmian w 2000 roku Text. / H. Zagorska, M. Ghrzanowska, J*. Pietrack // Biuletyn Instytutu Hodowli I Aklimatyzacji Roslin. 2000. - V. 215. - S. 293303.

191. Zambryski, P. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity Text. / P. Zambryski, H. Joos, C.Genetello // EMBO J. 1983. - V. 2. - P. 2143-2150.

Информация о работе

Сташевски, Зенон
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы