Трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены гетерологичных секреторных нуклеаз, как модель для изучения вирусоустойчивости

Трифонова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены гетерологичных секреторных нуклеаз, как модель для изучения вирусоустойчивости
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены гетерологичных секреторных нуклеаз, как модель для изучения вирусоустойчивости"

На правах рукописи

Трифонова Екатерина Александровна

Трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены гетерологичных секреторных нуклеаз, как модель для изучения вирусоустойчивости

Генетика-03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссершции на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2006

Работа выполнена в лаборатории цитолог ии и генетики СО РАН, г.

генной инженерии растений Института Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Алексей Владимирович Кочетов Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Лидия Александровна Першина Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Анатолий Борисович Беклемишев ГУ НИИ биохимии СО РАМН г.Новосибирск

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток

Защита состоится [±_ jUfbQ 2006 г. на утреннем заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г.Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: dissovfo bionet.nsc ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

Автореферат разослан У GMjiMf 2006 г.

Ученый секретарь у

Диссертационного совета —~

доктор биологических наук А.Д. Груздев

¿00 Sk

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Создание генно-инженерными методами растений с повышенной устойчивостью к таким быстро эволюционирующим патогенам, как вирусы, является одной из актуальных проблем как современной молекулярной биологии, так и биотехнологии. Однако, недостаточное понимание молекулярных механизмов формирования системной устойчивости и взаимодействия растительных вирусов с защитными системами высших растений затрудняет создание новых способов контроля болезней сельскохозяйственно-ценных растений.

В настоящее время защитные системы высших растений принято классифицировать на белок-опосредованные системы неспецифической приобретенной устойчивости и высокоспецифические системы, основанные на РНК-опосредованных механизмах (Prins, 2003). Общим компонентом всех белок-опосредованных систем неспецифической устойчивости является накопление специфических белков, связанных с патогенезом (pathogenesis-related proteins, PR-proteins). Наиболее изученными считаются салицилат-индуцируемые PR-белки, формирующие SAR. В настоящее время различают 14 групп этих белков, в основном выполняющих гидролитические или ингибиторные функции (Van Loon and Van Strien, 1999).

На момент начала наших исследований среди PR-белков не было идентифицировано белков с рибонуклеазной активностью. Совсем недавно было показано, что по крайней мере некоторые из белков PR-10 имеют рибонуклеазную активность и локализованы внутриклеточно (вакуолярно), также было показано участие белка PR-10 горького перца в противовирусной защите растений (Park et al., 2004).

Еще менее изученными являются салицилат-неиндуцируемые PR-белки, накапливающиеся в тканях растений после поранения. Эти белки не классифицированы на группы, и наиболее известными из них являются экстраклеточные нуклеазы (Ye and Droste, 1996; Kariu et al., 1998; Leßrasseur et al., 2002) и ингибиторы протеиназ (Pieterse and Van Loon, 1999). И хотя роль индукции растительных экстраклеточных нуклеаз после поранения окончательно не выяснена, исходя из ферментативной активности этих белков и некоторых экспериментальных данных (Salganic, 1984; Gergerich and Scott, 1988; Атабеков и др., 1990; Wolf, 1991) можно сделать предположение, что экстраклеточные нуклеазы активно участвуют в противовирусной защите растений. Дополнительные исследования взаимодействия этих ферментов с патогенами необходимы для понимания молекулярных механизмов неспецифической устойчивости у высших растений.

Неспецифический характер опосредуемой нуклеазами устойчивости, вне зависимости от локализации этих ферментов в клетках растений, дает возможность создания генно-инженерными методами растений с повышенной устойчивостью к неродственным вирусам, а в свете имеющихся литературных данных, возможно также к грибам и вироидам.

Основной генно-инженерной стратегией повышения устойчивости растений к вирусным инфекциям является перенос в ядерный геном растений

1 j РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ 1

БИБЛИОТЕКА /

фрагментов геномов патогенов (Wilson, 1993). Попытки создания трансгенных растений, устойчивых к широкому спектру вирусов, в рамках данной стратегии успеха не имели (Van den Boogaart et al., 2001; Rinne et al., 2005).

В настоящее время успешно реализовано два способа повышения устойчивости к широкому спектру вирусов путем трансгенеза. Один из них заключается в экспрессии генов интерферон-индуцируемой 2'-5'-олигоаденилатной противовирусной системы млекопитающих (Truve et al., 1993; 1994; Honda et al., 2003), возникающая в результате устойчивость выражается лишь в небольшой задержке формирования симптомов инфекции Второй способ заключается в клонировании генов растительных противовирусных белков, инактивирующих рибосомы, и является спорным из соображений биобезопасности (Lodge et al., 1993; Wang et al., 1998; Vandenbussche et al., 2004). Создание новых стра1егий получения растений с широким спектром устойчивости к вирусам является актуальной задачей современной биотехнологии, и индуцируемое повышение нуклеазной активности может стать одной из таких стратегий.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение влияния экстраклеточных нуклеаз на формирование устойчивости растений к вирусным патогенам с использованием трансгенных растений, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз. В рамках работы были поставлены следующие задачи:

1. Создать генетические конструкции, несущие гены секреторных нуклеаз, позволяющие повышать уровень нуклеазной активности в трансгенных растениях.

2 Получить трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены секреторных нуклеаз.

3. Оценить уровень нуклеазной активности в полученных трансгенных растениях и ее локализацию.

4. Определить степень вирусоустойчивости трансгенных растений табака с повышенной экстраклеточной нуклеазной активностью.

Научная новизна и практическая ценность. В результате проведенных исследований была создана модельная система для изучения механизмов неспецифической устойчивости растений к вирусам. Клонированы гены гетерологичных секреторных нуклеаз и с их использованием созданы векторы для экспрессии в растительных клетках. Впервые получены трансгенные растения, экспрессирующие гены панкреатической секреторной рибонуклеазы быка и секреторной нуклеазы Serratia marcescens. Показано, что уровень нуклеазной активности в листьях и стеблях полученных растений значительно повышен по сравнению с контролем.

Исследовано влияние повышенной нуклеазной активности на устойчивость растений к вирусам. Впервые показано, что экстраклеточные нуклеазы непосредственно участвуют в формировании устойчивости растений к вирусным инфекциям, что вносит вклад в понимание молекулярных механизмов неспецифической устойчивости растений.

Получены трансгенные растения картофеля хозяйственно ценных сортов с повышенным уровнем экстраклеточной нуклеазной активности. Предложена

новая стратегия создания растений, устойчивых к широкому спектру вирусных, а возможно также грибковых и вироидных инфекций, с использованием методов генетической инженерии, основанная на противовирусном действии экстраклеточных нуклеаз.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004 г.), Международной научно-практической конференции Института картофелеводства HAH Беларуси (Минск, 2003 г.), Первом Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г); и на российских конференциях: 7-ой пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003 г), конференции МОГИС (Москва, 2003), Ш-ем съезде ВОГИС «Генетика в XXI веке» (Москва, 2004 г.).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы (247 наименований). Работа изложена на 111 страницах, включает 17 рисунков и 5 таблиц в тексте диссертации.

По теме работы опубликовано 5 работ в рецензируемых журналах и подана заявка на патент.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для конструирования были использованы следующие плазмиды: pBlueScript KS (фирма «Stratagene»), рС27 (Alliotte et al., 1988), pGSH160 (Deblaere et al., 1987). Все процедуры, использованные при клонировании, были проведены согласно методикам, приведенным у Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1984). Секвенирование последовательностей ДНК клонированных генов проводилось на базе Межинститутского центра секвенирования ДНК на однокапиллярном анализаторе фрагментов ДНК (модель ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) или четырехканальном анализаторе (модель ABI3100 производства фирмы Applied Biosystems) с использованием специфических праймеров.

Для прямой трансформации клеток A. tumefaciens была использована методика (An et al., 1988), с модификациями.

Трансформацию растений табака Nicotiana tabacum SRI проводили методом агробактериальной трансфекции листовых дисков в точности как описано (Deblaere et al., 1987). Трансформанты, устойчивые к канамицину (100 мг/л), переносили в отдельные стерильные пробирки для культивирования в условиях климакамеры, затем хорошо укоренившиеся растения переносили в грунт в теплицу. Для анализа использовались растения, достигшие 4-6 недельного возраста. Трансгенные растения картофеля Solanum tuberosum L сортов Белоярский ранний и Каприз были получены методом трансформации клубневых дисков, которая проводилась по (Snyder and Belknap, 1993), с небольшими изменениями. В этой части работы принимали участие сотрудники ИЦиГ M.JI. Комарова, A.B. Романова и Н.С. Леонова.

Определение активности маркерного фермента NPT II в экстрактах из листьев табака и картофеля проводилось по методике (Reiss et al., 1984) с некоторыми модификациями.

Геномную ДНК контрольных и траисгенньтх растений табака и картофеля выделяли из одного или двух грамм свежих молодых листьев с использованием SDS и протеиназы К по методике Дрейпера и Скотта (Дрейпер и Скотт, 1991).

В качестве зондов для гибридизации использовали ПЦР-фрагменты, амплифицированные с производных плазмиды рС27, несущих гены гетерологичных нуклеаз, со специфичными праймерами. Фрагменты ДНК были помечены (a-32P)dATP (Amersham Pharmacia Biotech, UK) по методике мечения со случайными праймерами (Feinberg and Vogelsten, 1983). Геномную ДНК гидролизовали соответствующими рестриктазами, разделяли в агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану Hybond N+. Блот-гибридизация по Саузерну осуществлялась по протоколу Amersham Pharmacia Biotech , мембрану помещали на экспозицию с рентгеновской пленкой (Agfa, Belgium).

Нуклеазная активность экстрактов оценивалась по высвобождению кислоторастворимого материала из суммарной дрожжевой РНК по методикам (Blank and McKeon, 1989; Galiana et al., 1997), с различными модификациями Оптическую плотность кислоторастворимого супернатанта измеряли при 260нм Анализ спектра белков с нуклеазной активностью в экстрактах трансгенных и контрольных растений проводили в SDS-полиакриламидном геле с добавлением РНК в матрикс разделяющего геля по методике (Yen and Green, 1991), с модификациями.

В экспериментах по инфицированию растений использовалась японская линия вируса табачной мозаики ОМ ВТМ (Nozu and Okada, 1968). Очищенные препараты ВТМ были получены из экстрактов инфицированных растений табака (cv. Samsun) с ярко выраженными мозаичными симптомами Растения выращивались в теплице с естественным освещением. В листья 14-16 дневных растений втиралась смесь карборунда с суспензией ВТМ в бидистиллированной воде Содержание ВТМ-антшена в образцах определялось количественным методом ELISA (Clark and Adams, 1977) с кроличьими антителами и меченными пероксидазой антителами на использованную линию ВТМ. Содержание вируса определялось по калибровочной кривой, построенной для очищенного препарата ВТМ. В этой части работы принимали участие сотрудники БПИ ДВО РАН В.И. Малиновский и М.В.Сапоцкий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание модельных конструкций, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз.

Создание растений с измененным уровнем нуклеазной активности с помощью методов генетической инженерии является одним из перспективных подходов для изучения роли нуклеаз в физиологии высших растений. В рамках данной работы было запланировано создать несколько модельных конструкций, экспрессирующих гены секреторных нуклеаз. Мы использовали гены нуклеазы Serratia marcescens и панкреатической рибонуклеазы Bos taurus.

В качестве первого целевого гена был использован ген экстраклеточной нуклеазы Serratia marcescens, фермента, для которого была показана противовирусная активность при экзогенном применении для животных, тутового шелкопряда и пчел (Троицкая и др., 1981; Панфилова и Салганик,

1983) Этот фермент является сахаронеспецифичной гидролазой, гидролизующей как РНК, так и ДНК и в одноцепочечной, и в двуцепочечной форме; требует 0.005М Mg2+ в качестве кофактора, активен в широком диапазоне рН от 6 до 10.

В качестве второго целевою гена был использован ген панкреатической рибонуклеазы Bos taurus. Этот фермент использует в качестве субстрата исключительно одноцепочечную РНК. Оптимум рН 7.5, хотя фермент активен в очень широком диапазоне рН от 5 до 10 без существенного снижения активности, не нуждается в катионных кофакторах, исключительно стабилен, в том числе и термостабилен, очищается от примесей кипячением (Sorrentino, 1998).

Фрагменты ДНК, полученные в результате амплификации, были клонированы в плазмиде pBlueScript. Оба гена были использованы с последовательностями собственных лидерных пептидов. Далее гены были переклонированы в векторы рС27 и pGSH160 под контроль 2'-промотора маннопинсинтазы (MAS2') Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Особенностью данного промотора является индуцибельность поранением, что позволяет смоделировать с его помощью природный паттерн экспрессии нуклеаз, связанных с патогенезом (Langridge et al., 1989). Получены плазмиды pC27SMN, pGSH160BN, pC27BN. Схемы Т-областей векторов приведены на рисунке 1.

LB 3'OCS

npt II

Pstl Hrndlll С

PT1/PT2 bov. nuclease 3'T7 RB pGSH160BN

Hmdlll Clal Pstl Pstl BamHI

Smal EcoRI Pstl Clal

Pstl

pC27BN

LB S marc nuclease

♦Л I

Xbal EcoRI EcoRV Clal

PT2/PT1 npt II

Pstl

pC27SMN

Рис.1. Схемы Т-обласчей бинарных векторов pGSH160BN и pC27BN со встроенным геном панкреатической рибонуклеазы быка и pC27SMN со встроенным геном нуклеазы S marcescens Обозначения: LB, RB - повторы, ограничивающие Т-область в бинарных векторах; bov.nuclease - ген панкреатической рибонуклеазы быка; S marc nuclease - ген секреторной нуклеазы Serratia marcescens; РТ1/РТ2 - двунаправленный промотор гена маннопинсинтазы; npt II - ген неомицинфосфотрансферазы II E.coli; 3'OCS - 3' часть гена октопинсинтазы Ti-плазмиды А. tumefaciens; 3'Т7 - 3' часть гена Т7 Ti-плазмиды A tumefaciens; Smal, Xbal, EcoRI, EcoRV, Clal, BamHI, Pstl - сайты рестрикции, использованные при конструировании и анализе векторов

2. Получение и анализ трансгенных растений табака.

Со всеми описанными выше конструкциями были получены трансформанты табака, устойчивые к канамицину. Трансформангы были проанализированы на экспрессию маркерного фермента неомицинфосфотрансферазы (ЫРТИ). Для дальнейших исследований использовали только растения, устойчивые к канамицину и активно экспрессирующие ген неомицинфосфотрасферазы II (прШ). Геномная ДНК некоторых растений была дополнительно проанализирована с помощью полимеразной цепной реакции на наличие полноразмерной встройки целевого гена со специфическими праймерами (рисунок 2) и блот-гибридизацией по Саузерну (рисунок 3).

1 т п.н.

500 п.н.

Рис 2. Тестирование трансгенных растений табака pC27BN-1! на наличие полноразмерной встройки гена панкреатической нуклеазы быка полимеразной цепной реакцией Нанесения по дорожкам' 1 Нетрансгенный табак SRI ; 2 Трансгенный табак SRI, экспрессирующий ген панкреатической нуклеазы быка; 3 Вектор pC27BN, 4 Маркер молекулярных весов т.п.н.

Рис. 3. Саузерн блот-гибридизация НтсМП-гидролизатов геномной ДНК контрольного (К) и трансгенного табака линии рС27В>1-11 (Т).

В качестве зондов в гибридизации использовали фрагменты, полученные с помощью ПЦР с использованных для трансформации векторов, со специфическими праймерами. Как следует из рис. 3, в геномной ДНК трансгенного табака линии рС27В1М-11 присутствует одна встройка целевого гена.

3. Анализ полученных трансгенных растений табака на наличие повышенного уровня нуклеазной активности.

В рамках настоящего исследования необходимо было выбрать из созданных нами конструкций те, которые эффективно повышают уровень нуклеазной активности в трансгенных растениях. Результаты измерений для линий трансгенных растений pC27SMN-12 и pC27SMN-17, экспрессирующих ген нуклеазы Serratia marcescens и pGSH160BN-25 и pGSH160BN-27, экспрессирующих ген панкреатической рибонуклеазы быка, представлены в таблице 1, для линий растений рС27 BN - в таблице 2.

Таблица 1 Нуклеазная активность листовых экстрактов трансгенных растений табака линий рС273МК и рОБШбОВМ___

Линии растений Средняя OD Стандартная ошибка

Контроль 1 0,808 0,117

Контроль 2 0,665 0,020

PC27SMN-12 4,915 0,287

PC27SMN-17 6,647 0,104

PGSH160BN-25 0,761 0,098

PGSH160BN-27 0,777 0,075

Примечания: контроль 1'и 2 - трансгенные растения, не несущие генов гетерологичных нуклеаз. pC27SMN-12 и pC27SMN-17 - трансгенные растения, экспрессирующие ген нуклеазы Serratia marcescens; pGSH160BN-25 и PGSH160BN-27 - трансгенные растения, экспрессирующие ген панкреатической рибонуклеазы быка Средняя оптическая плотность представлена в оптических единицах.

Таблица 2 Нуклеазная активность листовых экстрактов трансгенных растений табака

линий рС27 BN, эксп рессирующих ген панкреатической рибонуклеазы быка

Линии растений Средняя OD Стандартная ошибка

Контроль 0.833 0.067

PC27BN-1 2.783 0.356

PC27BN-2 1.033 0.044

PC27BN-3 2.133 0.111

PC27BN-4 1.667 0.111

PC27BN-5 9.000 0 667

PC27BN-6 1.200 0.067

PC27BN-7 5.133 0.511

PC27BN-8 9.667 0.444

PC27BN-9 1.833 0.111

PC27BN-10 7.567 0.156

PC27BN-U 8.100 0.067

Примечания- вектор, использованный для трансформации - pC27BN. 1-11 - номера линий трансгенных растений. Средняя оптическая плотность представлена в оптических единицах.

Согласно полученным нами данным, представленным в таблице 1, нуклеазная активность растений, экспрессирующих ген нуклеазы Serratia marcescens, более чем в 6 раз превышает таковую у контрольных растений, в то

время как активность листовых экстрактов растении, экспрессирующих ген панкреатической нуклеазы быка, достоверно не отличается от контроля Мы предположили, что возможно отсутствие значительного прироста нуклеазной активности у линий трансгенного табака рСЯН160ВК-25 и рС8Н160ВМ-27 связано с дефектами использованного вектора р05Н160.

Как можно видеть из представленных в таблице 2 данных, уровень нуклеазной активности грубых листовых экстрактов трансгенных растений табака, полученных с использованием конструкции рС27ВЫ, выше уровня активности в листовых экстрактах контрольных растений. Так, нуклеазная активность экстрактов линий рС27ВМ-5 и рС27ВЫ-8 более чем в 10 раз превышает активность экстрактов контрольных растений. Таким образом, нами были получены трансгенные растения, экспрессирующие ген панкреатической рибонуклеазы быка и характеризующиеся повышенным уровнем нуклеазной активности.

Из того, что трансгенный продукт функционально активен, можно заключить, что трансгенные белки корректно процессируются и секретируются Мы дополнительно проанализировали локализацию трансгенного продукта для линии растений рС27ВМ Нами были получены экстракты межклеточной жидкости и сопоставлена нуклеазная активность этих экстрактов с активностью грубых экстрактов и остаточной активностью фракции дебриса Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Таблица 3. Локализация нуклеазной активности в трансгенных растениях табака,

Линии растений СЮ, гр. экстракт (Ж, апопласт СЮ, дебрис

Контроль 0 833 0 500 0.300

рС27ВМ-1 2 783 2.300 1.300

рС27ВЫ-3 2.133 2.400 1 100

рС27В1М-4 1.667 1.900 1.100

рС27ВЫ-8 9.667 12.00 1.400

рС27В>М0 7.567 8.000 1.400

рС27ВМ-11 8 100 7 100 1 400

Примечания вектор, использованный для трансформации - рС27ВК 1-11 - номера линий трансгенных растений. Средняя оптическая плотность преде гавлена в оптических единицах. Апопласт - нуклеазная активность в апопластной фракции, дебрис - остаточная нуклеазная активность грубых экстрактов, полученных после вымывания апопластной фракции.

Как следует из таблицы 3, основной прирост нуклеазной активности наблюдается именно во фракции межклеточной жидкости. В случае линии рС27В!\'-8, нуклеазная активность экстракта апопласта в 24 раза выше активности экстракта контроля и в 9 раз выше остаточной нуклеазной активности дебриса. Таким образом, мы можем сделать вывод, что транш енные растения, полученные с использованием вектора рС27В1М, не только экспрессируют ген панкреатической нуклеазы быка, но и активно секретируют трансгенный белок.

Мы оценили количественно содержание трансгенного продукта в экстрактах растений табака линий рС27ВЫ в процентах к суммарному растворимому белку. Для этого мы добавляли препарат коммерческой панкреатической рибонуклеазы быка к экстрактам нетрансгенного табака и оценивали прирост нуклеазной активности по методике, описанной выше. Для линий рС27В1<-5, рС27ВМ-8, рС27В1\М0 и рС27ВМ-11, экспрессирующих ген рибонуклеазы быка на высоком уровне, содержание трансгенного продукта составляло 0.02-0.04% по отношению к суммарному растворимому белку.

В целом, высокий уровень нуклеазной активности в экстрактах полученных нами трансгенных растений табака не сопровождался видимыми изменениями фенотипа, сроков развития и плодовитости, что позволило нам сделать вывод о возможности использования полученных модельных конструкций для модификации других видов растений с целью повышения уровня экстраклеточной нуклеазной активности.

4. Анализ спектра белков с нуклеазной активностью с помощью электрофореза в 5П8-полиакриламидном асйу^-геле.

Мы проанализировали полученные нами трансгенные растения табака на присутствие в них белкового продукта, соответствующего по подвижности продукту привнесенного гена, в 505-полиакриламидном асцуцу-геле с добавлением субстрата (в нашем случае РНК) в матрикс разделяющего геля. Результаты эксперимента представлены на рисунке 4.

Рисунок 4 Анализ нуклеазной активности трансгенных и контрольных растений табака в ЗИЗ-полиакриламидном геле с добавлением РНК в матрикс разделяющего геля. Нанесения по дорожкам: 1 - грубый экстракт трансгенного растения линии рС27ВЫ-8, 10 мкг; 2 - грубый экстракт трансгенного растения линии рС27ВК-8, 50 мкг; 3 - грубый экстракт нетрансгенного растения табака, 50 мкг, 4 - панкреатическая рибонуклеаза быка, коммерческий препарат.

Как видно из рисунка 4, в трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген рибонуклеазы быка, присутствуют две дополнительных нуклеазных активности. По подвижности эти активности соответствуют двум (из четырех различимых на форезе) изоформам коммерческого препарата панкреатической рибонуклеазы. Интенсивность полос на форезе подтверждает десятикратное увеличение нуклеазной активности в трансгенных табаках линий рС27ВК 5, 8, 10 и 11 по сравнению с контролем.

На рисунке 5 можно увидеть, что в трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген нуклеазы Serratia marcescens, также присутствует дополнительная активность, соответствующая по подвижности коммерческому препарату нуклеазы Serratia marcescens. Как следует из фореграммы, активность бактериальной нуклеазы заметно меньше активности панкреатической рибонуклеазы быка.

Рисунок 5. Анализ нуклеазной активности трансгенных и контрольных растений табака в SDS-полиакриламидном геле с добавлением РНК в матрикс разделяющего геля Нанесения по дорожкам 1 - нуклеаза Serratia marcescens, коммерческий препарат, - 26 kDa; 2 - грубый экстракт трансгенного табака линии pC27SMN-12, 3 - грубый экстракт трансгенного табака линии pC27BN-ll; 4 - грубый экстракт нетрансгенного растения табака; 5 - панкреатическая рибонуклеаза быка, коммерческий препарат, -14 kDa

Суммируя все проведенные нами эксперименты можно сказать, что неспецифическая нуклеаза Serratia marcescens, продуцируемая трансгенными растениями табака, значительно менее активна, менее стабильна и/или хуже секретируется, чем продуцируемая растениями панкреатическая рибонуклеаза быка.

5. Анализ полученных трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики (ВТМ).

Мы проанализировали полученные трансгенные растения табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики (ВТМ). Анализ был проведен на базе БПИ ДВО РАН. Для анализа были использованы растения табака второго поколения от самоопыления линии pC27BN, для которых блот-гибридизацией и анализом расщепления маркерного гена NPT II в поколениях было показано наличие одной встройки целевого гена. Трансгенные и контрольные растения были инокулированы различными концентрациями ВТМ. Было протестировано проявление симптомов инфекции и накопление вирусного антигена (капсидного белка). Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Мы обнаружили, что накопление вирусного антигена в трансгенных растениях существенно снижено по сравнению с контрольными, а симптомы болезни развивались со значительной задержкой или полностью отсутствовали в зависимости от концентрации вируса в инокулюме. В целом, при низких и физиологических концентрациях вируса в инокулюме (0.01-0.1 мкг/мл) трансгенные растения характеризовались отсутствием или существенной задержкой накопления вируса и проявления симптомов инфекции по сравнению с контрольными. При высоких концентрациях вируса (10 мкг/мл) различия

между контрольными и трансгенными растениями становились менее заметными на поздних стадиях (14-28 DAI - дней после инфицирования) инфекции.

Таблица 4. Проявление симптомов и содержание ВТМ-антигена в листьях контрольного и трансгенного табака в зависимости от концентрации ВТМ в инокулюме и DAI (days after infection) - дней после инфицирования.

Линии Концентрация ВТМ в инокулюме, мкг/мл

0.001 0.01 0.1 1 10

7DAI

SR1 0 0 19.1±1.2 33.4±2.1 93.4±2.6

11-2 0 0 0 0 0

11-3 0 0 0 8.9±1 6 19.7±2 1

11-8 0 0 0 0 0

11-10 0 0 0 0 24.8±1 3

14DA1

SR1 0" 0- 59.9±4.4+ 100.0±4.2Т 162.4±2.5"

11-2 0 0- 0 70.1±3 3 127.4±6.8+

11-3 0" 0' 0" 31.8±2.2" 86.0±4.4"

11-8 0- 0" 0' 41.4±2 0 76.4±З.Г

11-10 0 0" 0' 65.3-Ь4.1 + 59 9±2 Г

21 DAI

SR1 0'+ 29.3±3.6" 146.5±6.4+ 125.8±8.4+ 191 1±5.3+

11-2 0 0" 0" 103.5±6 4"^ 136 9±6.0+

11-3 0" 0" 0" 87.6±5.9"+ 149.7±4.8+

11-8 0- 0~ 0" 74.8±3.4"~1" 133.8±2.7"

И-10 0" 0" П.5±2.3+ 95 5±5.1+ 121.0±3.5+

Примечания: - симптомы отсутствовали; т симптомы присутствовали; — симптомы отсутствовали даже на 28 DAI; -+ симптомы были зафиксированы только на 28 DA1. Накопление антигена приведено в мкг на см2 листовой поверхности.

Итак, мы показали, что полученные нами трансгенные растения табака, экспрессирующие ген панкреатической рибонуклеазы быка, более устойчивы к инфекции вирусом табачной мозаики. Судя по литературным данным, это устойчивость высокого уровня, поскольку она проявляется в отсутствии или существенной задержке появления мозаичных симптомов инфекции и накопления вирусного антигена. Уровень полученной у трансгенных растений устойчивости зависит от концентрации вируса в инокулюме. Мы предполагаем, что экстраклеточные рибонуклеазы могут прямо гидролизовать геномную РНК

вируса табачной мозаики на некоторых стадиях инфекционного процесса. С другой стороны, возможно, что экстраклеточные нуклеазы проникают в поврежденные в процессе инфицирования и поранения клетки, что приводит к гибели как вируса, так и клетки. Только в случае, если концентрация вируса в инокулюме достаточно высока, ВТМ преодолевает нуклеазный барьер. Наши экспериментальные данные находятся в соответствии с опубликованными ранее сообщениями об антивирусном эффекте гетерологичных нуклеаз при их введении в экстраклеточное пространство растений (Атабеков и др., 1990; Gergerich and Scott, 1988; Wolf, 1991; Galiana et al., 1997).

Повышение уровня экстраклеточной нуклеазной активности, вероятнее всего, усиливает уже существующую у растений систему защиты от вирусных и грибных патогенов, проявляющуюся в увеличении активности S-подобных экстраклеточных рибонуклеаз (Galiana et al., 1997, Hugot et al., 2002; LeBrasseur et al., 2002). Как известно, многие растительные экстраклеточные рибонуклеазы индуцируются поранением (Ye and Droste, 1996; Kariu et al., 1998; LeBrasseur et al., 2002) и вообще не детектируются в неповрежденных тканях растений, что дает основания считать их PR-белками, неиндуцируемыми салициловой кислотой и связанными с индукцией системной устойчивости IRH-типа. Кроме того, по крайней мере одна из S-подобных экстраклеточных рибонуклеаз табака индуцируется также и салициловой кислотой (Galiana et al., 1997; Hugot et al., 2002), что делает возможным участие этих ферментов в формировании SAR.

Полученное в данной диссертационной работе доказательство того, что повышение экстраклеточной нуклеазной активности, привносимое гетерологичными ферментами, повышает вирусоустойчивость растений, позволяет выдвинуть предположение об участии собственных экстраклеточных нуклеаз в формировании индуцируемой противовирусной устойчивости высших растений.

В настоящее время вирусы являются одним из основных источников потерь урожая сельскохозяйственных растений и создание устойчивых к вирусам сортов генно-инженерными методами - одна из актуальных проблем как молекулярной биологии, так и биотехнологии. Основной стратегией повышения устойчивости растений к вирусным инфекциям является генерация устойчивости патогенного происхождения (pathogen-derived resistance - PDR) (Powell-Abel el al., 1986). Попытки создания трансгенных растений, устойчивых к широкому спектру вирусов, в рамках данной стратегии успеха не имели

Существует несколько успешных стратегий создания растений, устойчивых к широкому спектру вирусных инфекций. Одна из них заключается в экспрессии генов интерферон-индуцируемой 2'-5'-олигоаденилатной противовирусной системы млекопитающих (Truve et al., 1993; 1994; Honda et al., 2003), но уровень возникающая в этом случае устойчивости невысок. Второй стратегией является экспрессия генов белков, инактивирующих рибосомы (Lodge et al., 1993; Wang et al., 1998; Vandenbussche et al., 2004), но общеизвестна токсичность рибосом-инактивирующих белков (они избирательно повреждают рРНК 60S-субъединицы эукариотической рибосомы).

Нами предложена новая стратегия повышения устойчивости растений к широкому спектру вирусов с использованием методов генной инженерии:

экспрессия в растениях генов секреторных нуклеаз. К безусловным плюсам этой стратегии относится неспецифический характер и достаточно высокий уровень генерируемой таким образом устойчивости.

При использовании генов нуклеаз также возникает вопрос о цитотоксичности данных ферментов. Было предложено несколько вариантов решения этой проблемы. Во-первых, использовать гены рибонуклеаз, избирательно гидролизующих только двуцепочечный субстрат, и потому нетоксичных для большинства внутриклеточных РНК, за исключением вирусных репликативных интермедиатов (Watanabe et al., 1995; Sano et al., 1997). Во-вторых, использовать мутантные гены, лишенные ферментативной активности, но сохранившие способность связывать РНК (Zhang et al., 2001). И в том, и в другом случае авторы продемонстрировали генерацию высокой устойчивости в трансгенных растениях, выражающуюся в отсутствии проявления симптомов инфекции и снижении накопления зрелых вирионов.

Нами предложен третий вариант решения проблемы цитотоксичности нуклеаз' использование для трансгенеза генов секреторных нуклеаз, чья активность проявляется исключительно в апопласте растений. Кроме тою, количественная оценка содержания панкреатической рибонуклеазы быка, проведенная нами, показала, что даже в наиболее высокоэкспрессирующих трансген линиях количество гетерологичной нуклеазы не превышает 0.04% от суммарного растворимого белка. Для сравнения можно заметить, что количество отдельных PR-белков при формировании SAR может достигать 1% суммарного растворимого белка (Heil and Bostock, 2002). Это означает, что продукция трансгенной панкреатической рибонуклеазы не является слишком большой нагрузкой для клеток растений, что и отражается в отсутствии задержки роста и развития полученных нами трансгенных растений. Насколько нам известно, это первая работа о получении вирусоустойчивых трансгенных растений, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз.

6. Получение и анализ трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L.

Для проверки предложенной стратегии нами был получен трансгенный картофель сортов Белоярский ранний и Каприз. Для этого эксперимента был использован ген нуклеазы S marcescens из-за способности данного фермента гидролизовать двуцепочечную РНК. Кроме вирусов, для картофеля большой проблемой является инфицирование вироидом веретеновидности клубней. Геномная РНК вироида сильно структурирована и в основном находится в двуцепочечной форме. Создание вироидоустойчивых сортов картофеля является трудной биотехнологической задачей (Hammond, 1997).

Трансгенный картофель был получен методом трансформации клубневых дисков. Полученные трансформанты были проанализированы на экспрессию маркерного гена. Результаты эксперимента представлены на рисунке 6.

1 2 3

4 5 6

♦ -

Рис. 6. Активность маркерного гена неомицинфосфотрансферазы II (nptll) в экстрактах трансгенных и контрольного растений картофеля сорта Белоярский Ранний Нанесения по дорожкам: 1 - экстракт нетрансгенного растения картофеля; 2 - экстра«! трансгенного растения картофеля линии pC27SMN-b4; 3 - экстракт трансгеннот растения картофеля линии pC27SMN-b5; 4 - экстракт трансгенного растения картофеля линии pC27SMN-b7; 5 - экстракт трансгенного растения картофеля линии pC27SMN-Ь8; 6 - экстракт трансгенного растения картофеля линии pC27SMN-bl 1.

Трансформанты были также проанализированы на наличие встройки в геноме методом блот-гибридизации геномной ДНК. В качестве зонда был использован ген нуклеазы Serratia marcescens, полученный с помощью полимеразной цепной реакции на векторе pC27SMN.

1 2 3 4 5 6

7 К- 11

Рис 7. Саузерн блот-гибридизация негидролизованной геномной ДНК (дорожки 1, 3 и 5) и ЕсоШ-гидролизатов геномной ДНК (дорожки 2, 4 и 6) контрольного и трансгенных растений картофеля линий рС275МЫ-Ь7 и рС278М>)-Ь11

Из рисунка 6 видно, что все проанализированные линии экспрессируют маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II. Рисунок 7 демонстрирует, что линии рС27ЙМК'-Ь7 и рС278ММ-Ы 1 имеют по одной инсерции в геномной ДНК.

Был проведен анализ полученных трансгенных растений картофеля на наличие повышенного уровня нуклеазной активности. Результаты данною эксперимента приведены в таблице 5.

Таблица 5 Нуклеазная активность лисювых экстрактов трансгснных растений картофеля, экспрессирующих ген нуклеазы Serratia marcescens

Линии растений Средняя OD Стандартная ошибка

Контроль 0 980 0.125

PC27SMN-b4 2.999 0.369

PC27SMN-b5 3.035 0.356

PC27SMN-b7 3.123 0.243

PC27SMN-b8 2.655 0 172

PC27SMN-bl 1 2.650 0.074

PC27SMN-kl 1.863 0.327

PC27SMN-k2 2.338 0.431

Примечания: вектор, использованный для трансформации - pC27SMN Ь4, Ь5, Ь7, Ь8, Ы1 - линии трансгенного картофеля сорта Белоярский ранний, к1 и к2 - линии грансгенного картофеля сорта Каприз. Средняя оптическая плотность представлена в оптических единицах.

Из приведенных в таблице 5 данных видно, что нуклеазная активность грубых листовых экстрактов трансх енного картофеля достоверно отличается от нетрансгенного. В среднем, уровень нуклеазной активности в экстрактах трансгенных растений в 2-3 раза выше, чем в экстрактах контрольных растений. Следует отметить, что повышенный уровень нуклеазной активности в целом не сопровождался видимыми изменениями фенотипа и темпов роста, как и в случае растений трансгенного табака. В настоящее время полученный нами трансгенный картофель тестируется на вирусоустойчивость.

Выводы:

1. Созданы генетические конструкции, несущие гены нуклеазы бактерии Serratia marcescens и панкреатической рибонуклеазы быка.

2. Впервые получены трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены гетерологичных секреторных нуклеаз и характеризующиеся нуклеазной активностью, повышенной по сравнению с нетрансгенным контролем в 2-10 раз.

3. Показано, что трансгенные растения табака, экспрессирующие панкреатическую рибонуклеазу, характеризуются высокой вирусоустойчивостью. При концентрации вируса в инокулюме от 0,01 до 0,1 мкг/мл трансгенные растения не проявляли симптомов заражения, что позволяет сделать вывод об участии секреторных нуклеаз в формировании противовирусного иммунитета растений.

4. Высокая вирусоустойчивость в сочетании с отсутствием видимых фенотипических отклонений позволяет использовать полученные трансгенные растения в качестве модельной системы для изучения молекулярных механизмов неспецифической устойчивости высших растений к патогенам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кочетов А.В., Шакирова Н.В., Лукашева В.В, Комарова М.ЛПилюгин М В., Трифонова Е.А., Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Шумный В.К. Экспрессия модельных бицистронов в трансгенных растениях // Докл. Акад. Наук. 1996. Т.349. N.4. С.549-552.

2. Трифонова Е.А., Кочетов А.В., Шумный В.К. Роль нуклеаз в физиологических процессах высших растений // Успехи совр. биол. 2000. Т. 120. С.395-405.

3 Трифонова Е.А., Комарова М.Л., Сырник О.А., Кочетов А.В., Шумный В.К. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum SRI, экспрессируюшие нуклеазу Serratia marcescens // Генетика. 2002. Т.38. С.274-277 4. Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С., Комарова М.Л., Коваль B.C., Макарова Н.Н., Илинский Ю.Ю., Трифонова Е.А., Шумный В.К Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т.40.С. 282-285. 5 Трифонова Е.А., Комарова М.Л., Леонова Н.С., Щербань А.Б., Кочетов

A.В., Малиновский В.И., Шумный В.К. Трансгенные растения картофеля Solatium tuberosum L., экспрессирующие ген секреторной нуклеазы Serratia marcescens // Доклады РАН. 2004. Т.394.С. 411-413.

6. Трифонова Е.А., Кочетов А В., Комарова М.Л., Шумный В.К., Малиновский

B.И., Сапоцкий М.В. Способ получения трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Заявка №2005130280 от 28.09.2005.

Подписано к печати 28.03.2006 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 40.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

лоовь

7464

-7464

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трифонова, Екатерина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Неспецифические системы устойчивости высших растений к вирусным патогенам.

1.1.1. Системная приобретенная устойчивость.

1.1.2. Использование генов PR-белков в генетической инженерии.

1.1.3. Системная устойчивость, индуцируемая непатогенными почвенными бактериями.

1.1.4. Устойчивость, индуцируемая насекомыми-фитофагами.

1.2. Специфические системы защиты растений от вирусных патогенов.

1.2.1. Перекрестная защита.

1.2.2. Использование механизмов перекрестной защиты для создания вирусоустойчивых растений путем трансгенеза: трансгенные растения, экспрессирующие гены капсидных белков вирусов.

1.2.3. Индуцируемый вирусами генетический сайленсинг.

1.2.4. Использование механизмов генетического сайленсинга для создания вирусоустойчивых растений путем трансгенеза.

1.3. Использование неструктурных генов вирусного происхождения для создания вирусоустойчивых растений путем трансгенеза.

1.4. Другие подходы создания вирусоустойчивых растений путем трансгенеза.

1.4.1. Трансгенные растения, экспрессирующие N-гены табака.

1.4.2. Трансгенные растения, экспрессирующие гены а- и p-интерферона человека и 2'-5'-олигоаденилатную противовирусную систему млекопитающих.

1.4.3. Трансгенные растения, экспрессирующие антитела.

1.4.4. Трансгенные растения, экспрессирующие гены белков, инактивирующих рибосомы.

1.4.5. Трансгенные растения, экспрессирующие гены рибозимов.

1.5. Роль нуклеаз в физиологических процессах высших растений.

1.5.1. Роль нуклеаз в генерации индуцируемой устойчивости растений к патогенам.

1.5.2. Трансгенные растения, экспрессирующие гены нуклеаз.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.2.Методы.

2.2.1. Конструирование и анализ векторов.

2.2.2. Приготовление и трансформация компетентных клеток E.coli.

2.2.3. Выделение и анализ плазмидной ДНК.

2.2.4. Полимеразная цепная реакция.

2.2.5. Приготовление и прямая трансформация компетентных клеток Agrobacterium tumefaciens.

2.2.6. Получение трансгенных растений табака и картофеля.

2.2.7. Определение активности неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях.

2.2.8. Выделение и анализ геномной ДНК растений методом блот-гибридизации.

2.2.9. Определение нуклеазной активности грубых экстрактов растений табака и картофеля.

2.2.10. Анализ спектра белков с нуклеазной активностью в экстрактах трансгенных и контрольных растений в SDS-полиакриламидном геле с добавлением РНК в матрикс разделяющего геля.

2.2.11. Линии вирусов и инфицирование растений.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Создание модельных конструкций, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз.

3.1.1. Клонирование гена нуклеазы Serratia marcescens.

3.1.2. Клонирование гена панкреатической рибонуклеазы быка.

3.2. Получение трансгенных растений табака.

3.3. Анализ полученных трансформантов на экспрессию маркерного гена, наличие полноразмерной вставки и инсерции в геномной ДНК.

3.4. Анализ полученных трансгенных растений табака на наличие повышенного уровня нуклеазной активности.

3.5. Локализация панкреатической рибонуклеазы в тканях трансгенных растений табака и количественная оценка содержания трансгенного белка.

3.6. Получение трансгенных растений картофеля.

3.7. Анализ полученных трансформантов картофеля на экспрессию маркерного гена и наличие инсерции в геномной ДНК.

3.8. Анализ полученных трансгенных растений картофеля на наличие повышенного уровня нуклеазной активности.

3.9. Анализ спектра белков с нуклеазной активностью с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном activity-геле.

3.10. Анализ полученных трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики (TMV).

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены гетерологичных секреторных нуклеаз, как модель для изучения вирусоустойчивости"

Актуальность проблемы

Создание генно-инженерными методами растений с повышенной устойчивостью к таким быстро эволюционирующим патогенам, как вирусы, является одной из актуальных проблем как современной молекулярной биологии, так и биотехнологии. Однако, недостаточное понимание молекулярных механизмов формирования системной устойчивости и взаимодействия растительных вирусов с защитными системами высших растений затрудняет создание новых способов контроля вирусных болезней сельскохозяйственно-ценных растений.

На момент начала наших исследований среди PR-белков не было идентифицировано белков с рибонуклеазной активностью. Совсем недавно было показано, что по крайней мере некоторые из PR-10-белков имеют рибонуклеазную активность и локализованы внутриклеточно (вакуолярно), также было показано участие PR-10-белка горького перца в противовирусной защите растений (Park et al., 2004).

Еще менее изученными являются салицилат-неиндуцируемые PR-белки, накапливающиеся в тканях растений после поранения. Эти белки не классифицированы на группы, и наиболее известными из них являются экстраклеточные нуклеазы (Ye and Droste, 1996; Kariu et al., 1998; LeBrasseur et al., 2002) и ингибиторы протеиназ (Pieterse and Van Loon, 1999). И хотя роль индукции растительных экстраклеточных нуклеаз после поранения окончательно не выяснена, исходя из ферментативной активности этих белков и некоторых экспериментальных данных (Salganic, 1984; Gergerich and Scott, 1988; Атабеков и др., 1990; Wolf, 1991) можно сделать предположение, что экстраклеточные нуклеазы активно участвуют в противовирусной защите растений. Дополнительные исследования взаимодействия этих ферментов с патогенами необходимы для понимания молекулярных механизмов неспецифической устойчивости у высших растений.

Основной генно-инженерной стратегией повышения устойчивости растений к вирусным инфекциям является перенос в ядерный геном растений фрагментов геномов патогенов (Wilson, 1993). Попытки создания трансгенных растений, устойчивых к широкому спектру вирусов, в рамках данной стратегии успеха не имели (Van den Boogaart et al., 2001; Rinne et al., 2005).

В настоящее время успешно реализовано два способа повышения устойчивости к широкому спектру вирусов путем трансгенеза. Один из них заключается в переносе генов интерферон-индуцируемой 2'-5'-олигоаденилатной противовирусной системы млекопитающих (Truve et al., 1993; 1994; Honda et al., 2003). Возникающая в результате устойчивость выражается лишь в небольшой задержке формирования симптомов инфекции. Второй способ заключается в клонировании генов растительных противовирусных белков, инактивирующих рибосомы, и является спорным из соображений биобезопасности (Lodge et al., 1993; Wang et al., 1998; Vandenbussche et al., 2004). Создание новых стратегий получения растений с широким спектром устойчивости к вирусам является актуальной задачей современной биотехнологии и индуцируемое повышение нуклеазной активности может стать одной из таких стратегий.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение влияния экстраклеточных нуклеаз на формирование устойчивости растений к вирусным патогенам с использованием трансгенных растений, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз. В рамках работы были поставлены следующие задачи:

2. Получить трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены секреторных нуклеаз.

3. Оценить уровень нуклеазной активности в полученных трансгенных растениях и ее локализацию.

4. Определить степень вирусоустойчивости трансгенных растений табака с повышенной экстраклеточиой нуклеазной активностью.

Научная новизна и практическая ценность

В результате проведенных исследований была создана модельная система для изучения механизмов неспецифической устойчивости растений к вирусам. Клонированы гены гетерологичных секреторных нуклеаз и с их использованием созданы векторы для экспрессии в растительных клетках. Впервые получены трансгенные растения, экспрессирующие гены панкреатической секреторной рибонуклеазы быка и секреторной нуклеазы Serratia marcescens. Показано, что уровень нуклеазной активности в листьях и стеблях полученных трансгенных растений значительно повышен по сравнению с контролем.

Получены трансгенные растения картофеля хозяйственно ценных сортов с повышенным уровнем экстраклеточной нуклеазной активности. Предложена новая стратегия создания растений, устойчивых к широкому спектру вирусных, а возможно также грибковых и вироидных инфекций, с использованием методов генетической - инженерии, основанная на противовирусном действии экстраклеточных нуклеаз.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004 г.) и Международной научно-практической конференции Института картофелеводства НАН Беларуси (Минск, 2003 г.); и на российских конференциях: на 7-ой пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003 г), на конференции МОГИС (Москва, 2003), на Первом Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г.), на Ill-ем съезде ВОГИС «Генетика в XXI веке» (Москва, 2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей.

1. Кочетов А.В., Шакирова Н.В., Лукашева В.В, Комарова M.JL, Пилюгин М.В., Трифонова Е.А., Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Шумный В.К. Экспрессия модельных бицистронов в трансгенных растениях // Докл. Акад. Наук. 1996. Т.349. N.4. С.549-552.

3. Трифонова Е.А., Комарова M.JL, Сырник О.А., Кочетов А.В., Шумный В.К. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum SRI, экспрессирующие нуклеазу Serratia marcescens // Генетика. 2002. Т.38. С.274-277

4. Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С., Комарова МЛ., Коваль B.C., Макарова Н.Н., Илинский Ю.Ю., Трифонова Е.А., Шумный В.К. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т.40.С. 282-285.

5. Трифонова Е.А., Комарова M.JI., Леонова Н.С., Щербань А.Б., Кочетов А.В., Малиновский В.И., Шумный В.К. Трансгенные растения картофеля Solanum tuberosum L., экспрессирующие ген секреторной нуклеазы Serratia marcescens // Доклады РАН. 2004. Т.394.С. 411-413.

По материалам работы подана заявка на патент:

Трифонова Е.А., Кочетов А.В., Комарова M.JL, Шумный В.К., Малиновский В.И., Сапоцкий М.В. Способ получения трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Заявка № 2005130280 от 28.09.2005.

Благодарности. В разные периоды работа финансировалась за счет следующих грантов: поддержки ведущих научных школ № 2275.2003.4, Министерства образования РФ ЗВ02-1.4-464, комплексного интергационного проекта Со РАН № 59, интеграционной программе РАН № 12.5.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю к.б.н. А.В. Кочетову и сотрудникам лаборатории генной инженерии растений к.б.н. M.J1. Комаровой, А.В. Романовой, С.Е. Титову и Я.С. Колодяжной; сотрудникам БПИ ДВО РАН д.б.н. В.И. Малиновскому и к.б.н. М.В. Сапоцкому; сотруднику лаборатории молекулярной генетики злаков А.Б. Щербаию; сотруднице селекционно-генетической лаборатории Н.С. Леоновой, сотруднице сектора мутагенеза и репарации З.И. Панфиловой, участвовавших в ряде экспериментов или в обсуждении полученных результатов, отраженных в совместных публикациях.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Трифонова, Екатерина Александровна

Выводы:

3. Показано, что трансгенные растения табака, экспрессирующие панкреатическую рибонуклеазу, характеризуются высокой вирусоустойчивостыо. При концентрации вируса в инокулюме от 0,01 до 0,1 мкг/мл трансгенные растения не проявляли симптомов заражения, что позволяет сделать вывод об участии секреторных нуклеаз в формировании противовирусного иммунитета растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трифонова, Екатерина Александровна, Новосибирск

1. Атабеков И.Г., Бойко В.В., Волкова Т.И. и др. Способ выращивания картофеля. 1990. Авторское свидетельство № 1585328.

2. Дорохов Ю.Л., Карпова О.В., Калинина И.О., Иванов К.И., Фролова О.Ю., Самуилова О.В., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. 1996. Кодируемые тобамовирусами транспортные белки подавляют трансляцию геномных вирусных РНК in vitro. ДАН. 349: 259-261.

3. Дрейпер Дж., Скотт Р. 1991. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Москва. Мир. 237-276.

4. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н., Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений. Под ред. Чл.-кор. РАН С.Г. Инге-Вечтомова. СПб.: Наука, 2000. - 539с.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. Мир.

6. Панфилова З.И., Салганик Р.И. 1983. Получение мутантов Serratia marcescens суперпродуцентов эндонуклеазы путем воздействия нитрозометилмочевиной на синхронизированную культуру. Микробиология. 52: 974-978.

7. Плотников В.К. 1992. Стабильность мРНК как фактор регуляции экспрессии генов в клетках эукариот. Успехи соврем, биологии. 112: 186-197.

8. Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., Комарова М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. 1993. Оценка вирусоустойчивости трансгенных растений табака и люцерны, несущих ген Р-интерферона человека. ДАН. 331: 652-654.

9. Рыбин В.А. 1935. Самостерильность и самофертильность как фактор селекции. Теоретические основы селекции растений. 3: 463-494

10. Смирнов С.П., Крашенинникова Л.В., Пухальский В.А. 1991. Устойчивость к вирусу табачной мозаики у трансгенных растений табака, продуцирующих а-интерферон человека. ДАН СССР. 317: 732-734.

11. Суриков И.М. 1972. Генетика внутривидовой несовместимости мужского гаметофита и пестика у цветковых растений. Успехи соврем, генетики. 4: 119-169.

12. Троицкая Е.Н., Насириллаев У.Н., Салганик Р.И., Баталина Т.А. 1981. Бактериальная эндонуклеаза в борьбе с распространением вируса ядерного полиэдроза на выкормках тутового шелкопряда. Шелк. 3: 17-19.

13. Alexander D., Goodman R.M., Gut-Rella М. et al. 1993. Increased tolerance to two Oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesis-related protein-la. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7327-7331.

14. Alliotte Т., Zhu L.H., Van Montagu M., Inze D. 1988. Plant expression vectors with the origin of replication of the W-type plasmid Sa. Plasmid 19: 251-254.

15. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors. 1988. Plant molecular biology. Manual. Eds: Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Kluwer Acad.Publ. 3:1-19.

16. Anderson J.M., Palukaitis P., Zaitlin M. 1992. A defective replicase gene induces resistance to cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 87598763.

17. Anderson M.A., McFadden G.I., Bernatzky R., Atkinson A., Orpin Т., Dedman H., Tregear G., Fernley R., Clarke A.E. 1989. Sequence variability of three alleles of the self-incompatibility gene of Nicotiana alata. Plant Cell.l: 483-491

18. Andika I.В., Kondo H., Tamada T. 2005. Evidence that RNA silencing-mediated resistance to beet necrotic yellow vein virus is less effective in roots than in leaves. Mol. Plant Microbe Interact. 18: 194-204.

19. Antoniw J.F., White R.F., Carr J.P. 1984. An examination of the effect of human a-interferons on the infection and multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco. Phytopathol. 109: 367371.

20. Asad S., Haris W.A., Bashir A., Zafar Y., Malik K.A., Malik N.N., Lichtenstein C.P. 2003. Transgenic tobacco expressing geminiviral RNAs are resistant to the serious viral pathogen causing cotton leaf curl disease. Arch. Virol. 148: 2341-2352.

21. Atabekov J.G., Taliansky M.E. 1990. Expression of a plant virus-coded transport function by different viral genomes. Advances in Virus Research. 38: 201-248.

22. Bantignies В., Seguin J., Muzac I., Dedaldechamp F., Gulick P., Ibrahim R. 2000. Direct evidence for ribonuclease activity of a PR-10-like protein from white lupin roots. Plant Mol. Biol. 42: 871-881.

23. Bariola P.A., Howard C.J., Taylor C.B., Verburg M.T., Jaglan V.D., Green P.J. 1994. The Arabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphate limitation. Plant J. 6: 673-685

24. Bariola P.A., Macintosh G.C., Green P.J. 1999. Regulation of S-Like Ribonuclease Levels in Arabidopsis. Antisense Inhibition of RNS1 or RNS2 Elevates Anthocyanin Accumulation. Plant Physiol. 119: 331-342.

25. Baulcombe D. 2002. RNA silencing. Curr. Biol. 12: 82-84.

26. Beecher В., Murfett J., McCIure B.A. 1998. RNasel from Escherichia coli cannot substitute for S-RNase in rejection of Nicotiana plumbaginifolia pollen. Plant Mol.Biol. 36: 553-63

27. Benedik M.J., Strych U. 1998. Serratia marcescens and its extracellular nuclease. FEMS Microbiol.Letts. 165: 1-13.

28. Blank A., McKeon T.A. 1989. Single-strand-preferring nuclease activity in wheat leaves is increased in senescence and is negatively photoregulated. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 31693173

29. Bliffeld M., Mundy J., Potrykus I., Futterer J. 1999. Genetic engineering of wheat for increased resistance to powdery mildew disease. Theor. Appl. Genet. 98: 1079-1086.

30. Boedtker H., Simmons N.S. 1958. The preparation and characterization of essentially uniform tobacco mosaic virus particles. J. Amer. Chem. Soc. 80: 2550-2556.

31. Boonrod K., Galetzka D., Nady P.D., Conrad U., Krczal G. 2004. Single-chain antibodies against a plant viral RNA-dependent RNA polymerase confer virus resistance. Nat. Biotechnol. 22: 856-862.

32. Braun C.J., Hemenway C.L. 1992. Expression of amino-terminal portions or full-length viral replicase genes in transgenic plants confers resistance to potato virus X infection. Plant Cell. 4: 735-744.

33. Breda С., Sallaud С., el-Turk J., Buffard D., de Kozak I., Esnaut R., Kondorosi A. 1996. Defense reaction in Medicago sativa: a gene encoding a class 10 PR protein is expressed in vascular bundles. Mol. Plant Microbe Interact. 9: 713-719.

34. Brigneti G., Voinnet O., Li W.X., Ji L.H., Ding S.W., Baulcombe D.C. 1998. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBOJ. 17:6739-6746.

35. Broglie K., Chet I., Holliday M. et al. 1991. Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani. Science. 254: 1194-1197.

36. Broothaerts W., Janssens G.A., Proost P., Broekaert W.F. 1995. cDNA cloning and molecular analysis of two self-incompatibility alleles from apple. Plant Mol.Biol. 27: 499-511

37. Carbone D., Arnaudi. 1930. L'immunita nelle piante. Monografie dell'Instituto Sieroterapico Milanese, Milano.

38. Chellappan P., Masona M.V., Vanitharani R., Taylor N.J., Fauquet C.M. 2004. Broad spectrum resistance to ssDNA viruses associated with transgene-indiced gene silencing in cassava. 2004. Plant Mol. Biol. 56: 601-611.

39. Chen Z.X., Silva H., Klessig D.F. 1993. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Science.262: 1883-1886.

40. Chester K.S. 1933. The problem of acguired phisiological immunity in plants. Quart. Rev. Biol. 8:275-324.

41. Chye M.L., Zhao K.J., He Z.M., Ramalingam S., Fung K.L. 2005. An agglutinating chitinase with two chitin-binding domain confers fungal protection in transgenic potato. Planta. 220:717730.

42. Cillo F., Finetti-Sialer M.M., Papanice M.A., Gallitelli D. Analysis of mechanisms involved in Cucumber mosaic virus satellite RNA-mediated transgenic resistance in tomato plants. Mol. Plant Microbe Interact. 17: 98-108.

43. Clark M.F., Adams A.N. 1977. Characteristic of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34: 475-483.

44. Clarke A.E., Newbigin E. 1993. Molecular aspects of self-incompatibility in flowering plants. Annu. Rev.Genet. 27: 257-279

45. Cooper B. 1999. Genetic mechanisms for engineering host resistance to plant viruses. Handbook of biological control. Academic press. 557-574.

46. Cooper В., Lapidot M., Heick J.A., Dodds J.A., Beachy R.N. 1995. A defective movement protein of TMV in transgenic plants confers resistance to multiple viruses whereas the functional analog increases susceptibility. Virology. 206: 307-313.

47. Cordelier S., de Ruffray P., Fritig В., Kauffmann S. 2003. Biological and molecular comparison between localized and systemic acquired resistance induced in tobacco by a Phytophthora megasperma glycoprotein elicitin. Plant Mol. Biol. 51: 109-18.

48. Creelman R.A., Mullet J.E. 1997. Biosynthesis and action of jasmonates in plants. Annu. Rev. Plant Physiol, and Plant Mol. Biol. 48: 355-381.

49. Crowell D.N., John M.E., Russell D., Amisino R.M. 1992. Characterization of a stress-induced, developmentally regulated gene family from soybean. Plant. Mol. Biol. 18: 459-466.

50. Culver J.N. 1996. Tobamovirus cross protection using a potexvirus vector. Virology. 226: 228235.

51. Cuozzo M., O'Connell K.M., Kaniewski W., Fang R.-X., Chua N.-H., Turner N.E. 1988. Viral protection in transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic virus coat protein or its antisense RNA. Bio/Technology. 6: 549-557.

52. Darwin C. 1876. The Effect of Cross and Self Fertilization in the Plant Kingdom. London.

53. De Feyter R., Young M., Schroeder K., Dennis E.S., Gerlach W. 1996. A ribozyme gene and an antisense gene are equally effective in conferring resistance to tobacco mosaic virus on transgenic tobacco. Mol. Gen. Genet. 250: 329-338.

54. De Jong A.J., Cordewener J., Lo Schiavo F. et al. 1992. A carrot somatic embiyo mutant is rescued by chitinase. Plant Cell. 4: 425-433.

55. Deblaere R., Reynaerts A., Hofte H., Hernalsteens J.-P., Leemans J. and Van Montagu M. 1987. Vectors for cloning in plant cells. Methods Enzymol. 153: 277-292.

56. Delaney T.R., Uknes S., Vernooij В., Friederich L., Weymann K., Negrotto D., Gaffney Т., Gut-Rella M., Kessmann H., Ward E., Ryals J. 1994. A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science. 266: 1247-1250.

57. Dodds J.A. 1999. Cross-protection and systemic acquired resistance for control of plant diseases. Handbook of biological control. Academic press. 549-556.

58. Dodds J. A., Lee S.Q., Tiffany M. 1985. Cross protection between strains of cucumber mosaic virus: Effect of host, and type of inoculum on accummulation of virions and double stranded RNA of the challenge virus. Virology. 144: 301-309.

59. Dodds P.N., Clarke A.E., Newbigin E. 1996. Molecular characterisation of an S-like RNase of Nicotiana alata that is induced by phosphate starvation. Plant Mol. Biol. 31:227-238.

60. Dong X. 2004. NPR1, all things considered. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 547-552.

61. During K., Hippe S., Kreuzaler F., Schell J. 1990. Synthesis and self-assembly of a functional monoclonal antibodies in transgenic Nicotiana tabacum. Plant Molecular Biology. 15: 281-293.

62. Durner J., Klessig D. 1995. Ingibition of ascorbate peroxidase by salicylic acid and 2,6-dochloroisonicotinic acid, two induces of plant defense responses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:11312-11316.

63. Durrant W.E., Dong X. 2004. Systemic acquired resistance. Annu. Rev. Phytopathol. 2004. 42: 185-209.

64. Feinberg A.P., Vogelsten B. 1983. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132: 6-13.

65. Fristensky В., Horovitz D., Hadwiger L.A. 1988. CDNA sequences for pea disease resistance response genes. Plant Mol. Biol. 11: 713-715.

66. Gaffney Т., Friederich L., Vernooij В., Negrotto D., Nye G., Uknes S., Ward E., Kessmann H., Ryals, J. 1993. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science. 261: 754-756.

67. Gallie R.D., Chang S.-C. Young T. 2002. Induction of RNase and nuclease activity in cultured maize endosperm cells following sucrose starvation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 68: 163-170.

68. Gallie R.D., Chang S.-C., Young T. 2002. Induction of RNase and nuclease activity in cultured maize endosperm cells following sucrose starvation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 68: 163-170.

69. Gergerich R.C., Scott H.A. 1988. The enzymatic function of ribonuclease determines plant virus transmission by leaf-feeding beetles. Phytopathology. 78: 270-272.

70. Goldbach R., Bucher E., Prins M. 2003. Resistance mechanisms to plants viruses: an overview. Virus Research. 92: 207-212.

71. Golemboski D.B., Lomonossoff G.P., Zaitlin M. 1990. Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 6311-6315.

72. Green P.J. 1994. The ribonucleases of higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45: 421-445

73. Green T.R., Ryan C.A. 1972. Wound-induced proteinase inhibitor in plant leaves: A possible defence mechanism against insects. Science. 175: 776-780.

74. Hammond J. 1997. Repelling plant pathogens with ribonuclease. Nature Biotechnol. 15: 1247.

75. Han S., Wu Z., Yang H., Wang R., Yie Y., Xie L., Tien P. 2000. Ribozyme-mediated resistance to rice dwarf virus and the transgene silencing in progeny of transgenic rice plants. Transgenic Res. 9: 195-203.

76. Heil M., Baldwin I.T. 2002. Fitness costs of induced resistance the emerging experimental support for slippery concept. Trends in Plant Science. 7:61-67.

77. Heil M., Bostock R.M. 2002. Induced systemic resistance (ISR) against pathogen in the context of induced plant defences. Annals of Botany. 89: 503-512.

78. Heil M., Hilpert A., Kaiser W., Linsermair K.E. 2000. Reduced growth and seed set following chemical induction of pathogen defence: does systemic acquired resistance (SAR) incur allocation costs? Jour. Ecology. 88: 645-654.

79. Hily J.M., Scorza R., Webb K., Ravelonandro M. 2005. Accumulation of the long class of siRNA is associated with resistance to Plum pox virus in a transgenic woody perennial plum tree. Mol. Plant Microbe Interact. 18: 794-799.

80. Hoffland E., Hakulinen J., Van Pelt J.A. 1996. Comparison of systemic resistance induced by avirulent and non-pathogenic Pseudomonas species. Phytopathology. 86:757-762.

81. Huang J.-C., Chang F.-C., Wang C.-S. 1997. Characterization of a lily tapetal transcript that shares sequence similarity with a class of intracellular pathogenesis-related (IPR) proteins. Plant Mol. Biol. 34: 681-686.

82. Hugot K., Ponchet M., Marais A., Ricci P., Galiana E. 2002. A tobacco S-like RNase inhibits hyphal elongation of plant pathogens. Mol. Plant Microbe Interact. 15: 243-250.

83. Hulett H.R., Loring H.S. 1965. Effect of particle length distribution on infectivity of tobacco mosaic virus. Virology 25: 418-430.

84. Huttner E., Tucker W., Vermeulen A., Ignart F., Sawyer В., Birch R. 2001. Ribozyme genes protecting transgenic melon plants against potyviruses. Curr. Issues Mol. Biol. 3:27-34.

85. Huynh Q.K., Borgmeyer J.R., Smith C.E., Bell L.D., Shah D.M. 1996. Isolation and characterization of a 30 kDa protein with antifungal activity from leaves of Engelmannia pinnatifida. Biochem. J. 316: 723-727

86. Ioerger T.R., Gohlke J.R., Xu В., Kao T.-h. 1991. Primary structural features of the self-incompatibility protein in Solanaceae. Sex. Plant Reprod. 4:81-87

87. Itoh Y., Takahashi K., Takizawa H., Nikaidou N., Tanaka H., Nishihashi H., Watanabe Т., Nishizawa Y. 2003. Family 19 chitinase of Streptomyces griseus HUT6037 increases plant resistance to the fungal disease. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:847-855.

88. Izhar S., Frankel R. 1971. Mechanism of male sterility in Petunia: The relationship between pH, callase activity in the anthers, and the breakdown of the microsporogenesis. Theor. Appl. Genet. 41: 104-108.

89. Ji L.H., Ding S.W. 2001. The supressor of transgene RNA silensing encoded by Cucumber mosaic virus interferes with salicylic acid-mediated virus resistance. Mol. Plant Microbe Interact. 14: 715-724.

90. Jin W., Horner H.T., Palmer R.G. 1997. Genetics and cytology of a new genie male-sterile soybean Glycine wax (L.) Merr.. Sex. Plant Reprod. 10: 13-21.

91. Jost W., Bak H., Glund K., Terpstra P., Beintema J.J. 1991. Amino acid sequence of an extracellular, phosphate-starvation-induced ribonuclease from cultured tomato (Lycopersicon esculentum) cells. Eur.J.Biochem. 198: 1-6

92. Kao Т.Н., McCubbin A.G. 1996. How flowering plants discriminate between self and non-self pollen to prevent inbreeding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 12059-12065

93. Kaplan I.B., Taliansky M.E., Malyshenko S.I., Ogarkov V.I., Atabekov J.G. 1988. Effect of human interferon of reproduction of plant- and mycoviruses. Arch. Phytopathol. 24: 3-8.

94. Karban R., Baldwin I.T. 1997. Induced responses to herbivory. Chicago and London: University of Chicago Press.

95. Kariu Т., Sano K., Shimokawa H., Itoh R., Yamasaki N., Kimura M. 1998. Isolation and characterization of a wound-inducible ribonuclease from Nicotiana glutinosa leaves. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 1144-1151

96. Kauffmann S., Legrand M., Geoffroy P. et al. 1987. Biological function of 'pathogenesis-related' proteins: Four PR- proteins of tobacco have 1,3-D-glucanase activity. EMBO J. 6: 3209-3212.

97. Коек M., Loffler A., Abel S., Glund К. 1995. cDNA structure and regulatory properties of a family of starvation-induced ribonucleases from tomato. Plant Mol. Biol. 27: 477-485

98. Kollar A., Thole V., Dalmay Т., Salamon P., Balazs E. 1993. Efficient pathogen-derived resistance induced by integrated potato virus Y coat protein gene in tobacco. Biochimie. 75: 623-629.

99. Koncz C., De Greve H., Andre D., Deboeck F., Van Montagu M., Schell J. 1983. The opine synthase genes carried by Ti plasmids contain all signals necessary for expression in plants. EMBOJ.2: 1597-1603.

100. Kumar D., Klessig D.F. 2003. High-affinity salicylic acid-binding protein 2 is required for plant innate immunity and has salicylic acid-stimulated lipase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100:16101-16106.

101. Langenberg W.G., Zhang L., Court D.C., Giunchedi L., Mitra A. 1997. Transgenic tobacco plants expressing the bacterial rnc gene resist virus infection. Mol. Breeding. 3: 391-399.

102. Langridge W.H.R., Fitzgerald K.J., Koncz C., Schell J., Szalay A.A. 1989. Dual promotor of Agrobacterium tumefaciens mannopine synthase genes is regulated by plant growth hormons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 3219-3223.

103. LeBrasseur N.D., Macintosh G.C., Perez-Amador M.A., Saitoh M., Green P.G. 2002. Local and systemic wound-induction of RNase and nuclease activities in Arabidopsis: RNS1 as a marker for a JA-independent systemic signaling pathway. 29: 393-403.

104. Lecellier C.H., Dunoyer P., Arar K., Lehmann-Che J., Eyquem S., Himber C., Saib A., Voinnet O. 2005. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science. 308: 557-560.

105. Lee H.-S., Huang S., Kao T.-H. 1994. S proteins control rejection of incompatible pollen in Petunia inflata. Nature. 367: 560-563.

106. Legrand M., Kauffmann S., Geoffroy P. et al. 1987. Biological function of pathogenesis-related proteins: Four tobacco pathogenesis-related proteins are chitinases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 6750-6754.

107. Lers A., Khalchitski A., Lomaniec E., Burd S., Green P.J. 1998. Senescence-induced RNases in tomato. Plant Mol. Biol. 36: 439-449

108. Leung J., Fukuda H., Wing D., Schell J., Masterson R. 1991. Functional analysis of cis-elements, auxin response and early developmental profiles of the mannopine synthase bidirectional promoter. Mol. Gen. Genet. 230: 463-474.

109. Li J.-H., Naas N., Kusaba M., Dodds P.N., Treolar N„ Clarke A.E., Newbigin E. 2000. A genetic map of the N. alata S locus that includes three pollen-expressed genes. Theor. Appl. Genet. 100: 956-964.

110. Lin W., Anuratha C.S., Datta K., Potrykus I., Muthukrishnan S., Datta S.K. 1995. Genetic engineering of rice for resistance to sheath blight. Bio/Technology. 13: 686-691.

111. Lindbo J.A., Silva-Rosales L., Proebsting W.M., Dougherty W.G. 1993. Induction of a highly specific antiviral state in transgenic plants: implications for regulation of gene expression and virus resistance. Plant Cell. 5: 1749-1759.

112. Liu L., Kloepper J.W., Tuzun S. 1995a. Induction of systemic resistance in cucumber against fusarium wilt by plant growth-promoting rhizobacteria. Phytopathology. 85: 695-698.

113. Liu L., Kloepper J.W., Tuzun S. 1995b. Induction of systemic resistance in cucumber against angular leaf spot by plant growth-promoting rhizobacteria. Phytopathology. 85: 843847.

114. Lodge J.K., Kaniewski W.K., Turner N.E. 1993. Broad spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 70897093.

115. Loffler A., Glund K., Irie M. 1993. Amino acid sequence of an intracellular, phosphate-starvation-induced ribonuclease from cultured tomato (Lycopersicon esculentum) cells. Eur. J. Biochem. 214: 627-633

116. Lund P., Dunsmuir P. 1992. A plant signal sequence enhances the secretion of bacterial ChiA in transgenic tobacco. Plant Mol. Biol. 18: 47-53.

117. Lusso M. and Kuc J. 1995. Evidence for transcriptional regulation of 3-1,3-glucanase as it relates to induced systemic resistance of tobacco to blue mold. Molec. Plant Microbe Interact. 8:473-475.

118. MacFarlane S.A., Davies J.W. 1992. Plants transformed with a region of the 201-kilodalton replicase gene from pea early browning virus RNA I are resistant to virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 5829-5833.

119. Madamanchi N.R., Kus J. Induced systemic resistance in plants. The fungal spore and disease initiation in plants and animals. Eds.: Cole, T.G., Hoch, H.C. Plenum Press, New York. 347-362.

120. Malinovsky V.I., Zhuravlev Yu.N., Varfolomeeva L.A. and Seletskaya L.D. 1990. Aggregation and degradation of tobacco mosaic virus in the intracellular space of sensitive and hypersensitive tobacco leaves. Biologicheskie Nauki 4: 26-31 (in Russian).

121. Malyshenko S.I., Kondakova O.A., Nazarova Ju. V., Kaplan I.B., Taliansky M.E., Atabekov J.G. 1993. Reduction of tobacco mosaic virus accumulation in transgenic plants producing nonfunctional viral transport proteins. J. Gen. Virol. 74: 1149-1156.

122. Marchant R., Davey M.R., Lucas J.A., Lamb C.J., Dixon R.A., Power J.B. 1998. Expression of chitinase transgene in rose (Rosa hybrida L.) reduces development of black spot disease

123. Diplocarpon rosae Wolf). Molec. Breed. 4:187-194.

124. Matton D.P., Brisson N. 1989. Cloning, expression, and sequence conservation of pathogenesis-related gene transcripts of potato. Mol. Plant Microbe Interact. 2:325-331.

125. Matton D.P., Mau S.L., Okamoto S., Clarke A.E., Newbigin E. 1995. The S-locus of Nicotiana alata: genomic organization and sequence analysis of two S-RNase alleles. Plant Mol. Biol. 28: 847-858

126. Mau S.L., Anderson M.A., Heisler M„ Haring V., McClure B.A., Clarke A.E. 1991. Molecular and evolutionary aspects of self-incompatibility in flowering plants. Symp. Soc. Exp. Biol. 45: 245-269

127. Mauch F., Mauch-Mani В., Boiler T. 1988. Antifungal hydrolases in pea tissue. II. Inhibition of fungal growth by combination chitinase and .-l,3-gIucanase. Plant Physiol. 88: 936-942.

128. Mauch F., Mauch-Mani В., Gaille C., Kull В., Haas D., Reimmann C. 2001. Manipulation of salicylate content in Arabidopsis thaliana by the expression of an engineered bacterial salicylate synthase. The Plant Journal. 25: 67-77.

129. McClure B.A., Haring V., Ebert P.R., Anderson M.A., Simpson R.J., Sakiyama F., Clarke A.E. 1989. Style self-incompatibility gene products of Nicotiana alata are ribonucleases. Nature. 342: 955-957.

130. McClure B.A., Gray J.E., Anderson M.A., Clarke A.E. 1990. Self-incompatibility in Nicotiana alata involves degradation of pollen rRNA. Nature. 347: 757-760.

131. McClure B.A. 2004. S-Rnase and SLF determine S-haplotype-specific pollen recognition and rejection. Plant Cell. 16: 2840-2847.

132. McCubbin A.G., Wang X., Kao T.-h. 2000. Identification of self-incompatibility (S-) locus linked pollen cDNA markers in Petunia inflata. Genome. 43: 619-627.

133. McKinney H.H. 1929. Mosaic disease in the Canary Islands, West Africa and Gibralta. Journal of Agricultural Research. 39: 557-578.

134. Metraux J.P. 2001. Systemic acquired resistance and salicylic acid: current state of knowledge. Eur. J. Plant Path. 107: 13-18.

135. Metraux J.P., Nawrath C., Genoud T. 2002. Systemic acquired resistance. Euphytica. 124: 237-243.

136. Metraux J.P., Singer H., Ryals J., Ward E., Wyss-Benz M., Gaudin J., Raschdorf K., Schmid E., Blum W., Inverardi B. 1990. Increase in salicylic acid at the onset of systemic acquired resistance. Science. 250: 1004-1006.

137. Midoh N., Iwata M. 1996. Cloning and characterization of a probenazole-inducible gene for an intracellular pathogenesis-related protein in rice. Plant Cell Physiol. 37: 9-18.

138. Moiseyev G.P., Fedoreyeva L.I., Zhuravlev Y.N., Yasnetskaya E., Jekel P.A., Beintena J.J. 1997. Primary structure of two ribonuclease from ginseng calluses. New members of intracellular pathogenesis-related plant proteins. FEBS Lett. 407: 207-210.

139. Murfett J., Atherton T.L., Мои В., Gasser C.S., McClure B.A. 1994. S-RNase expressed in transgenic Nicotiana causes S-allele-specific pollen rejection. Nature. 367: 563-566

140. Murfett J., McClure B.A. 1998. Expressing foreign genes in the pistil: a comparison of S-RNase constructs in different Nicotiana backgrounds. Plant Mol. Biol. 37: 561-569

141. Muthukrishnan S., Liang G.H., Trick H.N., Gill B.S. 2001. Pathogenesis-related proteins and their genes in cereals. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 64: 93-114.

142. Naito K., Iida A., Suzuki H., Tsuji H. 1979. The effect of benzyladenine on changes in nuclease and protease activities in intact bean leaves during ageing. Physiol. Plant. 46: 50-53

143. Neuhas J.M., Ahl-Goy P., Hinz U. et al. 1991. High-level expression of a tobacco chitinase gene in Nicotiana sylvestris: Susceptibility of transgenic plants to Cercospora nicotianae infection. Plant Mol. Biol. 16: 141-151.

144. Nishizawa Y., Nishio Z., Nakazono K., Soma M., Nakajima E., Ugaki M., Hibi T. 1999. Enhanced resistance to blast (Magneporthe grisea) in transgenic Japonica rice by constitutive expression of rice chitinase. Theor. Appl. Genet. 99: 383-390.

145. Nozu Y., Okada Y. 1968. Amino acid sequence of a common japanese strain of tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 35: 643-646.

146. Orchansky P., Rubinstein M., Sela I. 1982. Human interferons protect plants from virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 2278-2280.

147. Palukaitis P., Zaitlin M. 1984. A model to explain the "cross protection" phenomenon shown by plants viruses and viroids. Plant microbe interactions: Molecular and genetic perspectives. Eds: Kosuge Т., Nester E.W. New York: Macmillan. 213-222.

148. Park C.-J., Kim K.-J., Shin R., Park J.M., Shin Y.-C., Раек K.-H. 2004. Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper functions as a ribonuclease in an antiviral pathway. The Plant J. 37: 186-198.

149. Pasonen H.L., Seppanen S.K., Degefu Y., Rytkonen A., von Weissenberg K., Pappinen A. 2004. Field performance of chitinase transgenic silver birches (Betula pendula): resistance to fungal disease. Theor. Appl. Genet. 109: 562-570.

150. Pieterse C.M.J., Van Loon L.C. 1999. Salicylic acid-independent plant defence pathways. Trends in Plant Science. 4:52-58.

151. Powell-Abel P., Nelson R.S., De B. et al. 1986. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science. 232: 738-743.

152. Price P.W., Bouton C.E., Gross P., McPheron B.A., Thompson J.N., Weis A.E. 1980. Interaction among three trophic levels: influence of plants on interactions between insect herbivores and natural enemies. Annu. Rev. Ecol. Syst. 11:41-65.

153. Prins M., Lohuis D., Schots A., Goldbach R. 2005. Phage display-selected single-chain antibodies confer high levels of resistance against Tomato spotted wilt virus. J. Gen. Virol. 86: 2107-2113.

154. Pruss G.J., Lawrence C.B., Bass Т., Li Q.Q., Bowman L.H., Vance V. 2004. The potyviral suppressor of RNA silencing confers enhanced resistance to multiple pathogens. Virilogy. 320: 107-120.

155. Raaijmakers J.M., Leeman M., Van Oorschot M.M.P., Van der Sluis I., Schippers В., Bakker P.A.H.M. 1995. Dose-response relationships in biological control of fusarium wilt of radish by Pseudomonas spp. Phytopathology. 85: 1075-1081.

156. Register J. C., Beachy R.N. 1988. Resistance to TMV in transgenic plants results from interference with an early event of infection. Virilogy. 166: 524-532.

157. Reimer P.J., Guo A., Leach J.E. 1992. Increased activity of a cationic peroxidase associated with an incompatible interaction between Xanthomonas oryzae pv. oryzae and rice (Oryza sativa). Plant Physiol. 99: 1044-1050.

158. Reiss В., Sprendel R., Will H. et al. 1984. A new sensitive method for qualitative and quantitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell extracts. Gene. 30: 211-218.

159. Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. 1990. Zeamatin, an antifungal protein from maize with membrane-permeabilizing activity. J. Gen. Microbiol. 136. 1771-1778.

160. Ross A. F. 1966. Systemic effects of local lesions formation. Viruses in plants. Eds.: Beemster, A.B.R., Dijkstra, J. North-Holland Publishing, Amsterdam.

161. Salganic R. I. 1984. Antiviral activity of nucleases: molecular mechanisms and applications. Curr.Trends in Life Sci. Biol. Macromol. 12: 115-123.

162. Sano Т., Nagayama A., Ogawa Т., Ishida I., Okada Y. 1997. Transgenic potato expressing a double-stranded RNA-specific ribonuclease is resistant to potato spindle tuber viroid. Nat. Biotechnol. 15: 1290-1294.

163. Sano Т., Nagayama A., Ogawa Т., Ishida I., Okada Y. 1997. Transgenic potato expressing a double-stranded RNA-specific ribonuclease is resistant to potato spindle tuber viroid. Nat. Biotechnol. 15: 1290-1294

164. Sarkar S., Smitamana P. 1981. A proteinless mutant of tobacco mosaic virus: Evidence against the role of a viral coat protein for interference. Mol. Gen. Genet. 184: 158-159.

165. Sassa H., Nishio Т., Kowyama Y., Hirano H., Koba Т., Ikehashi H. 1996. Self-incompatibility (S) alleles of the Rosaceae encode members of a distinct class of the T2/S ribonuclease superfamily. Mol. Gen.Genet. 250: 547-557

166. Sela I., Grafi G., Sher N., Edelbaum O., Yagev H., Gerassi E. 1987. Resistance systems related to the N gene and their comparison with interferon. Plant resistance to viruses. Ciba foundation symposium 133: 109-119.

167. Sela-Buurlage M.B., Ponstein A.S., Bres-Vloemans S.A. et al. 1993. Only specific tobacco (Nicotiana tabacum) chitinases and p-glucanases exibit antifungal activity. Plant Physiol. 101: 857-863.

168. Sherwood J.L., Fulton R.W. 1982. The specific involvement of coat protein in tobacco mosaic virus cross protection. Virology. 119: 150-158.

169. Sijacic P., Wang X., Skirpan A.L., Wang Y., Dowd P.E., McCubbin A.G., Huang S„ Kao T.-h. 2004. Identification of the pollen determinant of S-RNase-mediated self-incompatibility. Nature. 429: 302-305.

170. Sijmons P.C., Dekker B.M., Schrammeijer B. et al. 1990. Production of a correctly processed human albumin in transgenic planrs. Biotechnology. 8: 217-221.

171. Sirkorski M.M., Szlagowska A.E., Legocki A.B. 1995. cDNA sequences encoding for two homologues of Lupinus Iuteus (L.) IPR-like proteins. Plant Physiol. 110: 335-338.

172. Smigoski A.C., Wilson D. 2004. Pest and disease resistance enhanced by heterologous suppression of a Nicotiana plumbaginifolia cytochrome P450 gene CYP72A2. Biotechnol. Lett. 26: 1809-1814.

173. Snyder G.W., Belknap W.R. 1993. Plant Cell Repts. 12: 324-328.

174. Sorrentino S. 1998. Human extracellular ribonucleases: multiplicity, molecular diversity and catalytic properties of the major RNase types. Cell. Mol. Life Sci. 54: 785-794.

175. Stark D.M., Beachy R.N. 1989. Protection against potyvirus infection in transgenic plants: Evidence for broad-spectrum resistance. Bio/Technology. 7:1257-1262.

176. Sticher L., Mauch-Mani В., Metraux J.P. 1997. Systemic acquired resistance. Annu. Rev. Plant Pathol. 35: 235-270.

177. Tabei Y., Kitade S., Nishizawa Y., Kikuchi N. Kayano Т., Hibi Т., Akutsu K. 1998. Transgenic cucumber plants harboring a rice chitinase gene exibit enhanced resistance to gray mold (Botrytis cinerea). Plant Cell Rep. 17:159-164.

178. Таске E., Salamini F., Rohde W. 1996. Genetic engineering of potato for broad-spectrum protection against virus infection. Nat. Biotechnol. 14: 1597-1601.

179. Tavladoraki P., Benvenuto E., Trinca S., De Martinis D„ Cattaneo A., Gallefi P. 1993. Transgenic plants expressing a functional single-chain Fn antibody are specifically protected from virus attack. Nature. 366: 469-472.

180. Taylor C.B., Bariola P.A., del Cardayre S.B., Raines R.T., Green P.J. 1993. RNS2: a senescence-associated RNase of Arabidopsis that diverged from the S-RNases before speciation. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 90: 5118-5122

181. Taylor C.B., Green P.J. 1991. Genes with homology to fungal and S-gene RNases are expressed in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 96: 980-984

182. Teeri Т.Н., Lehvaslaiho H., Franck M., Uotila J., Heino P., Palva E.T., Van Montagu M., Herrera-Estrella L. 1989. Gene fusions to lacZ reveal new expression patterns of chimeric genes in transgenic plants. EMBO J. 8: 343-350.

183. Thompson R.D., Kirch H.-H. 1992. The S locus of flowering plants: when self-rejection is self-interest. Trends Genet. 8: 381-387

184. Truve E., Aaspollu A., Honkanen J., Puska R., Mehto M., Hassi A. 1993. Transgenic potato plants expressing mammalian 2'-5' oligoadenylate synthetase are protected from potato virus X infection under field conditions. Bio/Technology. 11: 1048-1052.

185. Truve E., Kelve M., Aaspollu A., Kuusksalu A., Seppanen P., Saarma M. 1994. Principles and background for the construction of transgenic plants displaying multiple virus resistance. Arch.virol. (Suppl.), 941-950.

186. Turner N.E., O'Connell K.M., Nelson R.S., Sanders P.R., Beachy R.N., Fraley R.T. 1987. Expression of alfalfa mosaic virus coat protein confers cross-protection in transgenic tobacco and tomato plants. EM BO J. 6: 1181-1188.

187. Ursin V.M., Shewmaker C.K. 1993. Demonstration of a senescence component in the regulation of the mannopine synthase promoter. Plant Physiol. 102: 1033-1036.

188. Ushijiama K., Yamane H., Watari A., Kakehi E., Ikeda K., Hauck N.R., Iezzini A.F., Tao R. 2004. The S-haplotype-specific F-box protein gene, SFB, is defective in self-compatible haplotypes of Prunus avium and P. mume. Plant J. 39. 573-586.

189. Van der Krol A.R., Mur L.A., Beld M., Mol J.N.M., Stuitje A. 1990. Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression. Plant Cell. 2: 291-299.

190. Van Loon L.C. 1997. Induced resistance in plants and the role of pathogenesis-related proteins. Euro. Jour. Plant Path. 103:753-765.

191. Van Loon L.C. 1999. Occurrence and properties of plant pathogenesis-related proteins. Pathogenesis-related proteins in plants. Eds.: Datta, S.K., Muthukrishnan, S. CRC Press, Boca Raton, FL. 1-19.

192. Van Loon L.C., Pierpoint W.S., Boiler Т., Conejero V. 1994. Recommendations for naming plant pathogenesis-related proteins. Plant Mol. Biol. Rep. 12: 245-264.

193. Van Loon L.C., Van Strien E.A. 1999. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiol. & Molec. Plant Pathol. 55: 85-97.

194. Vera P., Conejero V. 1988. Pathogenesis-related proteins of tomato. P-69 as an alkaline endoproteinase. Plant Physiol. 87: 58-63.

195. Vigers A.J., Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. 1991. A new family of plant antifungal protein. Molec. Plant Microbe Interact. 4: 315-323.

196. Voinnet O. 2005. Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. Nature Rev. Genet. 6: 206-220.

197. Voinnet O., Lederer C., Baulcombe D.C. 2000. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benlhamiana. Cell. 103: 157-167.

198. Voinnet O., Pinto Y.M., Baulcombe D.C. 1999. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 14147-14152.

199. Walter M.H., Liu J.-W., Wunn J., Hess D. 1996. Bean ribonuclease-like pathogenesis-related protein genes (YprlO) display complex patterns of developmental, dark-induced and exogenous-stimulus-dependent expression. Eur. J. Biochem. 239: 281-293.

200. Walter M.H., Liu J.W., Wunn J., Hess D. 1996. Bean ribonuclease-like pathogenesis-related protein genes (YPR-10) display complex patterns of developmental, dark-induced and exogenous stimulus-dependent expression. Eur. J. Biochem. 239: 281-293.

201. Walter M.H., Liu J.W., Wunn J., Hess D. 1996. Bean ribonuclease-like pathogenesis-related protein genes (YPR-10) display complex patterns of developmental, dark-induced and exogenous stimulus-dependent expression. Eur.J.Biochem. 239: 281-293.

202. Wang J., Chen Z., Du J., Sun Y., Liang A. 2005. Novel insect resistance in Brassica napus developed by transformation of chitinase and scorpion toxin genes. Plant Cell Reports.

203. Wang P., Zoubenko O., Turner N.E. 1998. Reduced toxicity and broad spectrum resistance to viral and fungal infection in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein II. Plant Mol. Biol. 38: 957-964.

204. Wang Y., Wang X., Skirpan A.L., Kao T.-h. 2003. S-RNase-mediated self-incompatibility. J.Exp. Botany. 54: 115-122.

205. Warmke H.E., Overman M.A. 1972. Cytoplasmic male sterility sorghum. Callose behavior in fertile and sterile anthers. J. Hered. 63: 103-108.

206. Warner S.A.J., Scott R., Draper J. 1992. Characterization of a wound-induced transcript from the monocot asparagus that shares similarity with a class of intracellular pathogenesis-related (PR) proteins. Plant Mol. Biol. 19: 555-561.

207. Watanabe Y., Ogawa Т., Takahashi H., Ishida I., Takeuchi Y., Yamamoto M., Okada Y. 1995. Resistance against multiple plant viruses in plants mediated by a double stranded-RNA specific ribonuclease. FEBS Letters. 372: 165-168.

208. Wei G., Kloepper J.W., Tuzun S. 1991. Induction of systemic resistance of cucumber to Colletotrichum orbiculare by select strains of plant growth-promoting rhizobacteria. Phytopathology. 81:1508-1512.

209. Whitham S., McCormick S., Baker B. 1996. The N gene of tobacco confers resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tomato. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 8776-8781.

210. Wildermuth M.C., Dewdney J., Wu G., Ausubel F.M. 2001. Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature. 414: 562-565.

211. Wilson C.M. 1975. Plant Nucleases. Annual Rev. Plant Physiol. 26: 187-208.

212. Wilson T.M.A. 1993. Strategies to protect crop plants against viruses: Pathogen-derived resistance blossoms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 3134-3141.

213. WolfJ.D. 1991. KlingerP4016483.7

214. Xu B.B., Mu J.H., Nevins DL, Grun P., Kao Т.Н. 1990. Cloning and sequencing of cDNAs encoding two self-incompatibility associated proteins in Solanum chacoense. Mol. Gen. Genet. 224:341-346

215. Yang H., Yie Y., Zhu F., Liu Y., Kang L., Wang X., Tien P. 1997. Ribozyme-mediated high resistance against potato spindle tuber viroid in transgenic potato. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 4861-4865.

216. Ye Z.H., Droste D.L. 1996. Isolation and characterization of cDNAs encoding xylogenesis-associated and wounding-induced ribonucleases in Zinnia elegans. Plant.Mol.Biol. 30: 697-709

217. Yen Y., Baenziger P.S. 1993. Identification, characterization, and comparison of RNA-degrading enzymes of wheat and barley. Biochemical Genetics. 31: 133-145

218. Yen Y., Green P.J. 1991. Identification and properties of the major ribonucleases of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 97: 1487-1493.

219. Yoo B.-C., Kragler F., Varkonyi-Gasic E. et al. 2004. A systemic small RNA signaling system in plants. The Plant Cell. 16: 1979-2000.

220. Yoshikawa M., Tsuda M., Takeuchi Y. 1993. Resistance to fungal diseases in transgenic tobacco plants expressing the phytoalexin elicitor-releasing factor, P-l,3-endoglucanase, from soybean. Naturwiss. 80: 417-420.

221. Zhang L., French R., Langenberg W.G., Mitra A. 2001. Accumulation of barley stripe mosaic virus is significantly reduced in transgenic wheat plants expressing a bacterial ribonuclease. Transgen. Res. 10: 13-19.

222. Zhu H., Krishnaveni S., Liang G.H., Muthukrishnan S. 1998. Biolistic transformation of sorghum using a rise chitinase gene. J.Genet. Breed. 52: 243-252.

Информация о работе

Трифонова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены гетерологичных секреторных нуклеаз, как модель для изучения вирусоустойчивости - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы