Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение и применение 5'-лидера геномной РНК Х-вируса картофеля как усилителя экспрессии гетерологичных генов в растениях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение и применение 5'-лидера геномной РНК Х-вируса картофеля как усилителя экспрессии гетерологичных генов в растениях"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЗНГЕЛЬГАРПТА ЦЕНТР "БИОИНХЕНЕРИЯ"

На правах рукописи * УПК 577.218

Пугин Михаил Михайлович

ИЗУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ,5'-ЛИДЕРА ГЕНОМНОЙ РНК Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ КАК УСИЛИТЕЛЯ ЭКСПРЕССИИ* ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В РАСТЕНИЯХ.

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

\

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Центра "Биоинженсрия" РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор, чле.ч-корр. РАСХН К. Г. Скрябин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор П. М. Рубцои доктор химических наук, профессор Аг М. Копылов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Филиал Института биоорганической химик РАН

заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии ии. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, д. 32

/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института, молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН. .

Автореферат разослан ^ д/} 1994 г.

он

Зашита состоится '¿¿г

часов на

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для получения тра»сгея»ых растений кодирующую область гена гетерояогичного белка оЗично помешают с кассету слспрессии под контроль промотора я терминатора, обеспечивающих эффективную транскрипцию в растительной клетке (конститутивную или индуцируемую). Однако при этом посттранскрипционные процессы остаются за рамками контроля.

Транокрипт, претерпезея процессинг, попадает в цитоплазму клетки, где протекает синтез белка. Накопление гетерологичного белка в цитоплазме зависит, в частности, от стабильности

транскрипта (мРНК) и его трансляционной способности.

\

Известно, что эффективность трансляции а эукариотах определяется структурными особенностями мРНК. Кэп-структура на 5'-конце матрицы связывает рибосоииую субчастицу 40S в комплексе с факторами инициации, нуклеотидвое окружение инициирующего копой а влияет на эффективность инициации, кодоновый состав кодирующей области - на скорость элонгации, пол.и(А). стабилизирует мРНК и предположительно участвует в инициации трансляции. Особая роль в процессе трансляции отводится лидеру мРНК, или последовательности, предшествующей первом; функциональному инициирующему колону гена.

Было показано, что замена лидеров иРНК или внесение в них мутаций иоает приводить к резкому изменению уровня экспрессии (Gallie DR et stl., 1987, 1988). Tax, введение последовательностей лидеров некоторых РНК(+)-в«русов растений перед инициирующими кодонами различных «РНК (бактериальных, животных и растительных) вызывает значительное усиление экспрессии этих матриц в растительных трансляционных системах. Благодаря такому эффекту лидеры геномной РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) - омега-лидер, РНК4 вируса мозаика люцерны (ВИЛ) и некоторые другие были названы энхансерами трансляции (Gallie DR et al., 1987, Jobling SA i Gehrke L, 1987, Carrington JC i' Freed DD, 1990, Nicol&isen H et al., 1992). Механизм энхансер.ного эффекта, пока ке ясен. Прелвояагается, что благодаря низкой склонности к Формировав«. вторичной структуры, вирусные лидеры обеспечивают облегченное взаимодействие со сканирующей субчастипей рибосомы, в результате чего возрастает сксрость инициал*» трансляция

(Jobling SA к Gehrke L, 1987). Однако не исклпчается возможность существования растительных «акторов, связывавшихся с энхансерными последовательностями и участвующих в усилении трансляции (Galiie DR 4 Walbot V, 19D2, Leathers V et al., 1993).

Поиск u иэучеиие лидеров) обладающих энхансерным эффектом в растениях, призваны выяснить механизм усиленной экспрессии,

что позволит решить практические задачи, связанные с

ч

получением траисгенкых растений.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посаяпена изучение влияния лидера геномной РНК Х-вируса картофеля (Х-ВК) на экспрессию гетерологнчных генов в растительных клетках, а также применена» данного лидера для обеспечения экспрессии гена белка оболочки (БО) Y-вируса картофеля (штамма N (у"-ВК)) в трансгенных растениях картофеля.

В задачи исследования входили:

1) оценка предположительного энхансериого влияния лидера Х-ВК на транзжентиую экспрессию репортерного гена aptII в протопластах табак» путем сравнения с фрагментами полилинкеров различной длины и известными энхансерными последовательностями; 2) определение путем делециониого анализа последовательности внутри лидера Х-ВК, ответственной за предположительный анхансерный эффект; 3) конструирование кассет экспрессии гена БО У^-ВК, содержааих между 355-промотором вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) и инициирующим колонок последовательность лидера Х-ВК или контрольный полилинкеркый лидер; 4) получение трансгенных растений картофеля, несущих сконструированные кассеты; 5) анализ экспрессии гена БО У^-ВК в полученных трансгенных растениях и оценка роли лидера Х-ВК.

Научная новизна и практическая ценность. Показано, что лидер Х-ВК обладает энхансерныи влиянием на экспрессию гетерологнчных генов в протопластах табака и трансгенных растениях картофеля.

В протопластах энхансерный эффект лидера Х-ВК адвое превысил оФФект омега-лидера ВТМ и вчетверо - лидера РНК4 ВМЛ. Лелеционным анализом выявлена Функционально незначимая 3'-концеаая треть 84—нуклеотианого лидера Х-ВК. 28-нуклеотизная

СЛ-область люера Х-ВК сохракчла 20Х экхансерного потенциала (Роо881П ММ Ь БкгуаЬдл КС, 1992).

В трансренчцх растениях картофеля, несуяих кассету экспрессии рема БО У^-ВК с полилвнкеряим лидером, накапливалось крайне пало тракскрипта, в совсем не детектароаллся вирусный белок. Напротив, гри налички последовательности лидера Х-ВК в кассете экспрессии на порядок увеличилось количество транехрилта и появился белох оболочки У^-ВК. На основании полученных результатов, а также, исходя из анализа литературных данных, выдзинута гипотеза о стабилизирующем влиянии лидера Х-ВК на мРНК гена БО Т^-ВК (Пугин ММ с соаит., 1934).

Практическая ценность работы заключается в той, что полученные трансгенние растениях картофеля оказались устойчивыми к заражению У-вирусом картофеля. Исследование устойчивости выходит за ранки данной диссертааик. (Полученные результаты свидетельствуют, что степень устойчивости находится в обратно пропорциональной зависимости от уровня накопления мРНК гена БО УМ-ВК (Соколова МА с соавт., 1994)).

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты* были доложены и обсуждены иа 1-ом Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Путно, 1991}, на XI-ом Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пуцино, 1993), на заседаниях коллоквиума лаборатории генетической инженерии и Ученого Совета Центра "Биоинженерия" РАН.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов эксперимента, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материал изложен иа 175 стр., содержит 20 рисунков и библиографический список из 160 и&эааяжй.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Исследование энхансерной способности "лидера Х-ВК в протопластах табака.

Характеристика яиаериой последовательности Х-ВК. Х-вирус картофеля принадлежит ко 11-ой группе РНК(+)-вирусов растений

(Cornelissen BJC, 1989). Его геномная РНК копирована и подиаденилироеаиа, подобно клеточнии мРНК р&стеиий. Первичная структура Х-ВК (шла полностью определена ранее (Skryabin KG et al., 1988).

5'—лидер геномной РНК Х-ВК представляет собой нетранслируемуо последовательность длиной 84 к., считая от 5'-кэпа до инианжруюкего кодона вирусной репликазы (165К). Пониженное содержание гуанозинэ (9) и тимипина (11), а" также наличие 28-нук«еотидной области цятозина и адеиозина- в позициях 15-42 (СА-область), определяют относительно низку» склонность последовательности лидера Х-ВК к формированию вторичной структуры. Компьютерный анализ 5'-проксимальной области геномной РНК Х-ВК, выполненный нами с помсыыо программы RNAfold (PCgene), предсказывает опноцепочечную природу начала лидера и его СА-области (рис. 1).

А С А

С А

А С С

А А . С

С I А Энергия структура - -26.i kcal

к о А

к € А

T.G С а С

G С а С

А к с С

А с т А с и

А л ь С G U

А 0 С С G

С А А А С С G

и А А А С С С G С- ССА U U G U U А АС- АС А

А U V U G G А G С G GGU А А С А А U U G UG А

С С CA С АА А А

С G С <—|

А U А инициярлоаий

А G А колон

U А

С . С

и

IUI А С i С Л С и С С А С С А С А А А-3'

Рис.1. Предполагаемая вторичная области геномной РНК Х-вируса нуклеотидов кодирующей области).

структура картофеля

5'-проксимальной (лидер плюс 50

Х-ВИРУС КАРТОФЕЛЯ

1 6 5 К

I 24.6К

1 2 К I

шг

25К

Лидер Х-ВК

СА-о^лвсть Х23\

С-ААААСиА-ААССАЦАСАССААСААСА-СААССАААСС—САССАСХ!СССААиид----ЧЧ АСАСАСССССииаСААААОиЛ/ПиСиЛАСА А.

* * ** *** ** ********** *** *«* * ** ** ***«*. ***** ******

СиАиииииАСААСМии-АССААСААСААСАААСЛА-САААСААСАииА-СААЦЧАСиАЧииАСА—................А-и-и-АСА-ЛОС.

мотив (САА|П .

Омеге-лидер ВТН )

ВИРУС ТАБАЧНОЙ НОЗАИКИ

1ЭЗК ( 1 2 6 К )

аок

ПК1

Гомологи» н«о»*д<1»»тмшоот«Л «ид«» К-вируе» .шц>те»«я» и емяг»-!1И*|»м »то* шпине« мвяаншь Схпматичвокн извбр&жвнц структуры Х-ВК и ВТМ. Пиперине последовательности выравнвны так( что гомологичные нуклоотиды пахад«тс« друг под другом (обозначены авеадочк&ни). СА-оЙлаоть лидера Х-ВК и мотне {САА)П подчеркнуты. Отметка Х28| соответствует З'-концевому нуклеотпду укороченного лидера Х-ВК в кассетах рПТ10Ш'с!е128Ыео и р353Х28УСР (см. ниже).

При сравнении первичных структур лидеров растительных вирусов была обнаружена высокая степень гомологии лидера Х-ВК и омега-лидера ВТМ. Интересно) что последний содержит так называемый мотив (САА)П, подобный СА-области лидера Х-БК (рис. 2).

К моменту начала работы (1989) омега-лидер ВТМ уже был охарактеризоваа как усилитель экспрессии гетерологичных мРНК (Gallie DR et al., 1987, Sleat DE et al., 1988). Гомология первичных структур лидера Х-ВК и омега-лидера предполагала сходство функций данных вирусных лидеров.

Для изучения энхансериой способности лидера Х-ВК мы выбрали систему транзиентной (от англ. transient - временный) экспрессии рспортерного гена неокицинфосфотрансферазы (nptll) в протопластах табака (Ar. t&bacum, SR-1). Эта система удобна для сравнительного исследования регуляторных последовательностей. Суть петода состоит в трансформации протопластов табака плазмисвой ДНК, содержащей кассету экспрессии гена nptll, культивировании трансформированных протопластов (от 4 до 24 ч) и определении неокицинфосфотранс-феразной активности в белковом экстракте из протопластов. При этом уровень транзиентной экспрессии репортерного гена отражает силу исследуемого регуляторного элемента.

Конструирование кассет экспрессии гена nptll с различными лидерами. Пл&зхпда. рХ250, содержащая кДНК 5'-проксимальной области геномном РЫК Х-ВК длиной 2S0 п.н. между сайтами EcoRI и Hindlll, была использована для получения 3'-концевых делеций в последовательности лидера Х-ВК. Для этого она была линеаризована рестриктазой.Hindlll и обработана экзонуклеазой В&131, способной последовательно отщеплять нуклеотяды с обоих концов линейное молекулы ДНК; Последующей рестрикцией по EcoRI был вычленен спектр фрагментов последовательности Х-ВК разной длины, но с фиксированным EcoRI-концом (5'-конец лидера Х-ВК). фрагменты в диапазоне длин от 60 до 130 п.н., бьлн экстрагированы-из 8Х-ного ПА А Г и встроены между сайтами EcoRI и Smal вектора pUC19.

Ссквенироаание на плазмидной- ДНК с использованием обратного М13-ораймера позволило с точность» до нуклеотива определить размеры прокаонированннх делеционных вариантов S'-

области Х-ВК. В 41-ном клоне был найден 21 фрсгмент уникальной дли ми в диапазоне от 5В до 1X5 п.н. Рекомбинактные плазмиды были названы pX5'del(N'j, где N - количество нуклеотидов, удаленных с 3'-ко::иа нетракслируемсй последовательности Х-ВК (считая от инициирующего кодона).

В качестве источника гена прtll Зыла использована плазикда pOS32Neod (Смирноэ 00 с соавт., 1987), BamHI-ФРагнент, содержащий кодирующую область гена nptll (772 п.н.) с прилегающей природной 2'-нетранелчруемой областью (183 п.н., схлючая cMeKi::'c сайты Sraal, BamHI) и пять« 5'-кетранслир>*:мыии нуклеотиднии (меящу сайтом BamJII :i иниаиируоиая кодоном), был пер-^клонкроьан чз pOS32Neod в уиикальний сайт 3amHI плазирд pX5'de'i(N). Конструкции, содержащие ген nptll в. прямой ориентации по стчоаецию к лидеру Х-ВК (подтверждено рестрихцпонным анализом) были названы pX5'del(N)Neo.

Фпагменты EcoP.I-Smal плазмиц рХ5'deI(N)Neo, составгчнные из дениционных вариантов лидера Х-ЕК с прилегающей кодиг^сцей областью гена aptII, были встроены меклу уникальными сайтами EccEI и SesI полилиикера вектора pRTlOl (Topfer К et а 1., 1337) под контроль 35S-np0M0T0?a и терминатора ВМЦК. Отмети:-., что лаиннс регулаторные элементы обеспечивают

квазиконьтитути«ьуо транскрипции гогетерологччных кРНК в растениях.

Таким г»бр?ьоч были собраны кас«ти э.чспресскк гена jnptll pRTlOlXb' ciel(N)fieo, содержащие между точкой начала транскрипции и инициирусщим кодоном дслецлонные варианты лидера Х-БК (от 5S до 33 н.), олйчкаровакньге !3-нуклеотндными отрезкаки п^лилинкероа. Для количественной оценки транзиеитной экспрессии в протопластах были выбраны кассеты рЧТ101Х5'deilNeo, содержащая. практически целый як«ер Х-ВК, и рГ.Т101л5' del28Neo, содержащая укороченной на 28 нукл' О гидов с З'-конца лидер Х-ВК (рис. 3, В и Г).

APCrfR того был:г скинст>>улнояаны контрольные кассеты экспрессии, з когоркт лидер Х-ВГС отсутствовал. Путем прямой «итеграляк БашКХ-фрагмеита плазмой pOS22.Meo-i г унчкальиый сайт BamllT Оекто1>и б^ла получена кассета pUTlOlNcc,

имьюиия ЗЭ-н; клесть.ьннй пол>:лиихс:ркый лидер (рас. 3, А). Пг-тст.

по^лег.него за счет 4 7-нуг.лестк£ко;*о пс»».яинуг.га' 'pBluebcrip*. SK бил» лилуче.ча кассета pR7101?LNeo,

Рио.З. Структуры лидеров химерных мРИК гена пр1П в кассетах экспрессии, исследованных в протопластах табака.

ВаШИ

8аа1,ВоаН1

353-прокотор\ м. лрШ

Терн.

Л. рШОШео

ACctcgagaattcgagc;tcggtacccggggatccggcgcДI<2ATT.

ТАВЛЧНА 1. Введэнная плазмчл.чая Ш1К: Относитоаьпын уровень экспрессии в протопластах'.

рПТ101Ыео рВТ101РШео рКТ101Х5Ме128Нео рНТЮШМеШео рВПОиСАМм р1»Т101ТМУНбО рВТ101А1ИУ4Нео 1 0.37 4-0.07 4.0 4-0.8 4.0 4-0.в 0.18 4-0.и 2.0 4-0.4 1.0 4-0.2

в. ртаггшо

ACctcgagoattcTGCAGCCCGGGCGATCCЛCTЛOTTCTAGЛOCGCCCGCCЛCCGCGGTGGAGCTCGGTACCC;ggggatccggcgcШATT...

<-------—фрагмонт полизинкера рВ1исвсг!рЬ---------------->

0. рВТ10115'(1е128Ысо

АСсЬс<айааЫсСААААСТАААССАТАСАССААСААСАСЛАССЛЛАСССЛССАСССССААТТ0ТТАСАйййКаЬсС1гксКсАТ0АТТ...

<--------------укороченный лидер Х-ЕК------------------>

Г. рПТЮШМвПНоо

ЛСс Ьсеагва Ь tcGAAAACTAAACCATACACCAACAACACAACCAAACCCACCACGCCCAATTGTГACACACCCGCTTGGAAЛAGTAAGTCTAACAg^?tftfa 4сс8гс?сДТПАТТ.

<--------------------------лидер Х-ВК--------------------------------------------->

Д. рВТ101ХСАМео

АСсЬсйадАСАССААСААСАСААССАААСССАССЛСййЬасссййййаЬссййсйсАТОАТТ... <—СА-обхасть лидера Х-ВК—>

Е. рПТЮШ'.УНео

АСсЬсда1сйааСТАТТТТТАСААСААТТАССААСААСААСАААСААСАААСААСАТТАСААТТАСТАТТТАСААТТАСА1гдгЬасссйй<йаЬссЛйСйсАТ0АТТ...

<-----------------------омега-лидер ВТН-------------------------7—>

X. р!Ш01АШ4Нео

ACctcgatcgagTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCATCggtacccggggatccggcgcAIGATT...

<---------лидер РНК4 вял---------->

f

лидер которой приблизительно равнялся по длине лидеру в кассете pRT101X5'del28Neo (рис. 3, Б).

Для получения кассет экспрессии pRTlOlXCANeo, pRTlOlTMVNeo И pRT101AlMV4Neo (рис. 3, Д, Е а X), содержащих перед инициирующим кодоном гена nptll последовательности 28-нуклеоткдкой СА-области лидера Х-ВК, 68-нуклеотндного омега-лидера ВТМ и 35-нуклеотидного лидера РНК4 ВНЛ соответственно, данные последовательности были синтезированы в виде олиронукдестидов и клонированы между уникаяьныии сайтами Xhol и Kpnl полилинкерного лидера кассеты pRTlOlNeo.

Структуры лидеров химерных мРНК гена врО.1, приведенные на рисунке 3, были, подтверждены секвенированием кассет экспрессии со стороны ЗбЭ-лромоторд с помокьв синтетического олигонуклеотида.

Анализ транэиеитной экспрессии гена npfcll Р протопластах табака. Дтя трансформации протопластов. паазмиднэя ДНК, содержащая полученкие кассеты экспрессии гена nptll (рис. 3), выделялась из Е. coli з препаративных количествах и"очкаалась с использованием полиэтиленгликоля (ПЕГ) и ацетата аммония. Степень очистки и - концентрация ДНХ определялись спектрооотомстр;гчески (Маниатис Т с соавт., 1Ч85). С;< перекрученная плазмидная ДНК вводилась в протолласты (20 мкг на 1-2 млн протопластов а 1 мл суспензии) метоьок ПЕГ-зависимой трансиелйии (Negrutiu X et аI. , 1987) без использования ДНК-иосителя. Результата неомиаинфосфотранс-Феразного теста (Reiss В et ai. , 1984) белковых экстрактов из трансформированных протопластов показаны на рисунке 4. Каждая киссета экспрессии была тестирована как минилум три раза (в протопластах разкь.л выделений). Усредггенные урозни экспрессии для каткдой кассеты относительно контрольной (pRT101Nor>) сьедены я габлиау х (рис. 3), а такие представлены в вкле дгаграммы- на рисунке 4, В. Отметим, что в эксперипегта:: относительные уровне экспрессии отличались не белее чем на «0% от среднего значения.

- Выяснилось, что лидер Х-IiK. находись пс^ред инициирующим подокон гена nptll, обеспечивает максимальный уровень тр^чзиечтной экслрессит*. При срычнениии с 39—нуклеот.гяным

К Х28 Х28 XI к Х28 XI XI

ИРТИ

Рис. 4| А. Весирьюнфосфотрансверазная активность (КРТИ) а белковых экстрактах (50 мкг) из протопластов табака через сутки после трансформации ллазмидными конструкциями рКТ101Ыео (К), рЕТ101Х5'йе11Ыво (XI), рИТ101Х5'ае128Ыео (Х28). Показаны результаты трамзкентной экспрессии в протопластах двух независимых анделемий. В каждом случае одна из кассет экспресии с последовательностью лидера Х-ВХ исследована ь двух аликвотах протопластов.

К Х28 ТИУ РЬ Х28 ХСА Л1МУ4

1 2 3 4 б" 6 7

Рис. 4, Б■ Результаты гранзиентной экспрессии кассет рВТ101Нео (К), РЙТ101Х5 Ме128Ыео (Х28), рЯТ101ТЬ№1ео (ЮТ), рЮГ101РШео С РЬ), р ЯТ101ХС АКео (ХСА), р11Т101А1МУ4Ыео (А1МУ4) в протопластах двух выделений.

П И 11 П п II И

К XI Х28 ХСА РЬ ТМУ А1МУ4

Рис. 4. В. Диаграмма относительны» уровней # транзиснтной экспрессии гея* пр£11, опосредованной кассетами рйТ101Кео (К), рйТ101Х5Че11Вео (XI), рГ.Т101Х5 *йе128^о (Х28), р!1Т101ХСАМб.о (ХСА), рР.Т101РЦ<ео (РЬ), р!1Т101ТМУЫео (ТМУ), рПТ101А1М\'4Ыео (Л1М\Ч). Числовые значения сведены о табл. 1 (рис. 3).

полилинкером энхансерный эффект лиаера Х-ВК оказался 4-кратным (рКТ101Х5'бе11Мео/рЯТ101Кео, рис. 4, А).

Удлинение полцлинкерногс лидера вызвало паление уровня экспрессии в 2.8 раза (рНТ101№о/рЯТ101Р1ЛНео, рис. 4,. Б, дорожка 4). Такой негативный Эффект связан, вероятно, с увеличением плотности вторичной структуры на 5'-г.окце нРНК гена лр£11. Компьютерный анализ, представленный иа рисунке 5, выявил, что энергия вторичной структуры 5'-области мРНК (лидер * Ь2 колируются* нуклеотида) увеличивается на 25 ккал при удлинении полилиакерного лидере с 39 до 82 нуклеотидоз (рис. 5, А и Б). Согласно принятой сканируоцей новели трансляции вторичная структура внутри лидера мРНК препятствует связывани». субчастицы 40Б рибосомы и дальнейшему сканировании (Когак М, 1689, 1991).

В этой связи заметим, что введение последовательности лидера Х-ВК перед инициирующим кодоном гена лрШ увеличивает обцую длину лидера в кассете рПТ101Х5 'йеНЬ'ео до 109 н., однако энергия зторичной структуры при этэя увеличивается незначительно (рис. 5, В).

Укороченный на 28 нуг.леотидов с 3'-конца лидер Х-ВК в кассете р!гт101Х5 '<Зе128^о не утерял усилительной способности в протопластах (рис 4, А). По всей видимости этп 28 нуклеотидов, вовлеченные в формирование слабой ыпнлечной структуры на 3' -конце лидера (рис. 1 и рис. 5, В и Г), не несут функциональной нагрузки. Этот результат соответствует данном делециокного анализа лидера Х-БК в лизате из ретикулоцитов кролика (Томаиенския ОЛ с соавт., 1992, ТотавНе*вкауа ОЬ еЬ а!., 1923).

Дальнейшее усечение последовательности лидера Х-ВК привело К снижению урос.чя экспрессии гека прЬII в протопластах тс-бака. 28-нукл«;от15дная СА-область сохранила 20* усилительной способности целого лидера (рис. 4, Г>, дорояка 6).

Подобное наблюдение было сделано ранее при изучении омега-лпп'арр ВТК. Было показано, что :тотив (САА)Л сохраняет ЗС% энхансерногс влияния целого лидера на экспресса© гена 1ис е протопластам морковг. ¿5-иуклеотидный -котив (САА)П расс: ятривается кск наиболее существенная часть ^ороэого регглятпрмого элемента омега-лидера, в который кроме того входит одна копия 8-нуклеотидного прямого повтора, трикды

i. »¡паи« ми toll

is

t ^

5, „U ЦЛгАлгг5

I !

8BC-5

i. ttruiiiVtHiw мы Ы1

i'-icc.

jfflHiii'fclillM /-111 tail

w

Li

m

i. >И1ИШя 1-й.» >uii

I. «ИИНИЬ» HIJ tei|t

tunim

*c n1 4 f

ШШШ8ГКШ-3

Leiei.v

l iminttw Ha.t ttiii

^'-иасшсшппшшшибп^ядЧ.в!

¡'-шжшшшшш

ii-з

IBM«"

I. iKHHCUw l-U.i toll

Рис. 5. Предполоптлыте вторичнив структур« 5'-обмети химерных мРНК гена nptll (лидер + 52 и. кояируааей области).

встречавшегося в лидере (рис. 2). Предполагается, что коровий регуляторный элемент связывает белковый «актор растения, участвующий в усилении трансляции (Gallie DK 4 Walbot V, .1992).

Можно предположить, что СА-область является часть» регуляторного элемента лидера Х-ВК, в который входят также вирусные нуклеотиды, фланкирующие СА-область в укороченном лидере (рис. 3, В). Однако фланкирующие вирусные нуклеотиды могут выполнять и альтернативную функцию спейсеров, сохранявших одноцепочечную природу СА-област». Тогда, удаление спейсеров влечет за собой проявление негативного эффекта отрезков полилинкеров фланкирующих вирусную последовательность в кассетах pRT101X5'del(N)Neo и pRTIOIXCANeo (рис. 3, В, Г и Д). Согласно альтернативной гипотезе однояепочечная природа СА-области облегчаёт движение субчастицы 4CS вдоль лидера в поисках триплета AUG.

При сравнении энхансерных эффектов лидера Х-ВК и омега-лидера ВТМ в кассетах pRT101X5'del28Neo и pKTlOlTMVNeo наблюдается двукратное преимущество первого ^ (рис. 4, Б, дорожки 2, 3), несмотря на очевканув рамологир последовательностей (рис. 2).

• Интересно, что аналогичное наблюдение было сделано ранее (Gallie DR et al., 1987): омега-лидер ВТМ ох&зывал в 1.5 раза большее энхансериое воздействие на экспрессию гена GUS в протопластах табака, чем лидер штамма SPS В"ПС, хотя эти лидеры имеют весьма незначительные отличия в первичной структуре.

Следует отметить, что омега-лидер в кассете pRTIOlTMVNeo отделен от инициирующего коаона отрезком ползлинкера большей длины (20 п.), чем лидер Х-ВК в кассетах pRTlOlXF 'del(N)Neo (13 н., рис. 3, Е и В, Г). Удлинение G-богвтого полилинкера как уже было показано, может негативно влиять на экспрессию.

Так как энергия вторичных структур хяяерных мРНК гена nptll, содержащих лидеры Х-ВК и ВТМ, приблвзительно равны, а последовательность ВТМ столь же слабо структурирована (рис. 5, Е),• двукратное различие в энхансерной саособности трудно ^ объяснить согласно постулатам сханируювей модели трансляции.

Другой энхансер трансляции - 35-нуклеотилный лидер РНК4 BMJ] - проявил вдвое меньший энхансерный ээдект, чем омега-лидер я вчетверо меньший - чем лидер Х-ВК (рже. 4, П, дорожка

7), что вполне соответствует литературным данный об относительно низкой усилительной способности данного лидера в протопластах табака (Gallie DR et ai., 1987, Sktizetsky TM et ai., 1990).

Таким образом, полученные результаты показали, что лидер Х-ВК и его укороченный вариант являются наиболее эффективными усилителями экспрессии гена nptll в протопластах табака.

II. Применение лидера Х-ВК для обеспечения экспрессии гена БО YN-BK,

Перед нами стояла задача получения трансгенных растений картофеля, устойчивых к заражению Y-вирусом картофеля. Эффективным средством достижения вирусоустойчивости является конститутивная экспрессия гена белка оболочки соответствующего Фнтовируса в клетках растения. К моменту начала работы считалось, что степень устойчивости прямо пропорциональна накоплению вирусного белка оболочки. Отсюда возникла идея применения лидера Х-ВК в качестве усилителя экспрессии.

Конструирование кассет экспрессии гена БО Y^-BK. Белок оболочки Y-вируса картофеля, не имея собственного инициирующего кодона, транслируется в составе полипротеинового предшественника. Для независимой трансляции, в трансгенных растениях мы поместили в начало кодирующей области белка оболочки с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) недостающий триплет ATG.

В качестве матрицы для ПЦР была использована пдазмида NPB047, содержащая кДНК 3'-области геномной РНК русского изолята YM-BK между сайтами Hindlll и EcoRI вектора pBluescript SK (согласно опубликованным данным (Puurand V 4 Saarma И, 1990) белок оболочки начинается с 6333 кДНК и состоит из 267 аминокислот). 29-нуклеотидный модифицирующий праймер 5'-G GGATCC АСС ATG G(33a)GA ААТ GAC АСА АТС G-3* синтезированный ала ПЦР, содержал сайт BamHI, триплет ATG и 16 нуклеотидов, сответствующих началу кодирующей области белка оболочки. Нуклеотлдное окружение триплета ATG (ССАСС ATG G) было выбрано в соответствии с оптимальным контекстом инициирующего ходона согласно сканирующей модели трансляции (Kozak М, 1986). Модифицирующий праймер и обратный М13-праймер

в процессе [IUP вычленяли фрагмент ДНК длинной 1266 п.н., состоящий из кодирующей области гена БО Y^-BK (801 п.н.), Фланкированной с э'-конца сайтам BamHI и ATG (13 п.н.) и с 3'-конца . З'-нетранслнруемой область» Yn-BK (330 п.н.) с прилегавшим участком вектора pBluescript, такие содержании сайт BamHI (рис. 6, А).

Продукт ПНР был клонирован в сайт S mal вектора pUC19 и полностью секвенирован с помощью М13-праймеров, а также трех олигонуклеотиаов, соответствующих позициям 54S-5S1, 753-769, 1081-1097 кДНК. В результате било подтверждено введение искусственного АТС в начало кодирующей области гена ВО т"-ВК. Следует отметить i что сехвенирование выявило некоторые несоответствия с опубликованной последовательностью кДНК (Puurand U 4 Saarna M, 1990): А вместо G в позиции 427, Т вместо А в позиции 627, ТА вместо АС в позициях 1119-1120 и А вместо АА в позициях 1353-1354. Замены нуклеотидов в позициях 627 и 1119-1120 привели к аминокислотным заменам: Val вместо Glu (97 аминокислота о N-конца) и Leu вместо His (261 аминокислота с N-конца) соответственно.

BamHI-фрагмент, содержащий модифицированный ген ВО y"-BK, был переклонирован из pUC19 под контроль 35S-np0M0T0pa и терминатора ВМЦК в плазмиды pRTlOl'n pRT101X5'del28Neo, причем" из последней была предварительно удалена последовательность гена nptII (ВашН1-фрагмент). Полученные кассеты экспрессии p35SPLYCP и p35SX28YCP отличались последовательностями между точками начала транскрипции и трансляции (т.е лидерами) (рис. 6, Б). Первая кассета содержала 37-нуклеотидный поднлинкерный лидер, вторая - 8.0-нуклеотидный лидер, состоящий из укороченнго лидера Х-ВК (56 н.), фланкированного отрезками полилинкеров длиной 13 и 11 н. Данные лидеры практически идентичны лидерам а кассетах pRTIOlNeo и pRT101X5'del2BNeo (рис. 3, А, В), исследованных в системе транзиентной экспрессии. Единственное отличие - в участке между сайтом BamHI и инициирующим коаоном: accATG вместо ggcgcATG.

Получение трансгенных растений. Для введения кассет экспрессии гена БО YN-BK в геном растений картофеля сорта Белорусский-3 был использован метод агробактериальной

А.

Модифицирующий: б-ЙбЙАТСОАООдайАААТЙАОАОААТСС-З' 5-УСР-праймер ВатН!

Козах

0та1

НииНП

ИРВ047:

5*УСР-праймер \ATtJ__

рри

ЕсоИ

пшсг

БО У-ВК

[гаг:— З'НТО

Напало кодирующей области бавз оболочки г

М13-прайме

(ШАбАЙЙАбОяааНсс^саесссёёйеакг

1. ГГЦР, клонирование

2. Секвснвроаанис

3. ВашН1, клонирование

ЕсоИ Р(Ш рта] ВатШ

Б.

Нш<1Ш

ЕсоШ ВатН!

ВатШ НЫШ

35$' аР™0™^ БО У-ВК З'НТО Терм.

р35£?РЬУСР: ACctcgagaattcgagctcggtacccggggatccaccATGGGA,

ЕсоШ

ВатН!

ЕсоМ

. ВгтсШ

Лидер Х-ВК:

СА-обласгь

трансформации сегментов стебля, являющийся модификацией известного метода (Horsch RB et а1., 1985).

Кассеты экспрессии гена БО Y^-BK были переклонированы как HindiIT-фрагменты из плазмид p35SPLYCP и p35SX28YCP (рис. 6) а сайт Hindlll бинарного вектора Binl9 (Bevan М, 1984). Полученные.' плазииды pBin35SPLYCP и pBin35SX28YCP были перенесены из Е. ' coli в штамм LBA4404 Agrobacteriva tuaefaciens путем трехродительского скрещивания (Gheysen D к Depicker А, 1987).

В результате агробактериальной трансформации было получено несколько десятков независимых регенерантов картофеля, укоренившихся на селективной среде (50-100 мкг/л канамицина). Анализ регенерантов методом ДНК-блотгибрипизации (Southern ЕМ, 1975) показал высокуо эффективность переноса кассет экспрессии гена БО YH-BK в геном растений. Из 12 проанализированных регенерантов 11 содержали в геномах кассету 35SX28YCP (рис. 7, дорожки 2-7, 9-10). При этом EcoRI-Фрагмент гена БО y"-BK, выщепленный из геномной ДИК, соответствовал ожидаемой длине 1209 п.н. (75 п.н. лидера, 804 п.н. кодирующей области гена БО YS-BK, 330 п.н. З'НТО).

В Другой' серии растений 10 *з '11 Регенерантов содержали кассету 35SPLYCP (данные не показаны). Для•дальнейшего анализа мы отобрали по 8 независимых трансгенных растений картофеля из двух трансформационных серий.

<-------------------------------------------------------------

Рис. 6. Схема конструирования кассет экспрессия гена БО УК-ВК. А. Фрагмент кДНК 3'-концевой области геномной РНК У^-вк между НхпёШ и ЕсоЯ1 сайтами плазмиды НРВ047". Стрелкой показан сайт разрезания вирусной протеиназой. Справа от сайта - кодирующая область гена БО У"-ВК о прилегающей З'НТО У"-ВК. Модифицирующий 5*ТСР-праймер и обратный М13-праймер, использованные для ПЦР, изображены в соответствующих местах отжига. Последовательность 5'УСР-праймера показана в верхней части, сайт ВашН1 и нукхеотмпное окружение инициирующего кодона подчеркнуты. Б. Структурные элементы кассет экспрессии гена БО У"-ВК. 5'-лидеры мРНК БО Т14-ВК показаны под конструкцией. Мелкам врифтом выделены полилинкерные нуклеотиды, крупным — вирусные нукдеотиды. Последовательность лидера Х-ВК приведена в нижней части. Прямоугольником очерчен укороченный вариант этого лидера, содержащий СА-область (подчеркнута).

123456789 10 11

Рис. 7. ДКЕ.-блотгкбрядкзационкый авали? растений картофеля, регенерированных после трансформация кассетой ЗББХ^вУСР. Дорожка 1: ЕсоШ-фрагмент плазкиды рЗбЭРЬУСР (обозначен строчкой), 5 копий гена БО У^-ВК в пересчете на тетраплоидкый геном картофеля - положительный контроль. Далее нанесены по 20 мкг обработанной рестрг'ктазой ЕсоЧХ геномной ЦНК из регенерированных растений (дорожки 2-10), а также Из нетраксформнрованногс картофеля (отрицательный контроль, дорожка 11).

Ачатиз экспресси БО в трднегенчых растениях:

роль дилера мРЯК. Экспрессия гена БО У^-ВК в тр"\нсгенных растенигг; была проанализирована методами иммуноблотаналкза белковых экстрактов и блот-гибридиэации суммарной РНК. Для вестерн-Слоттинга были использованы моноклональные антктела к белку оболочки У-яируса, любезно предоставленные М. Сааркзи. Проба для нозерн-блоттинга была поаго'.овлена на -Фрагменте гена ЕО у"-ВК с помоеьо статистической затравки.

Все оосемь растений, несущих кассету . 352Х2£УСР, экспрессировалк белах обо-точкк не гровне О.ОО'-О.Огх от суммарного экстрагируемого белка, ил»; 1-ь нг на. 25 мкг (рис 8, дорогки 8-11). Экспрессия вирусного белка оболочки в рис-ениях, несущих .кассету ¿53ГЬУСР, оказалась нихе порога чувствительности катода, которой ссставлгл приблизительно 0.5 нг о-.11щенного белка. оболочки (рис. 8, дорожки 4-7).

Таким образом, наличие укороченного лидера Х-ВК в кассете экспрессии гена БО Т'^-ВК привело к значительному увеличение количества вирусного белка оболочки.

БО ->

Рис. 3. Иммуноблотанализ белковых экстрактов из трансгенных растений картофеля. Дорояки 1, 2: 50 к 10 нг очипенного белка оболочки Y^-BK - полоиительный контроль. Далее нанесены по 25 мкг суммарных белков, выделенных из трансгенных ..растений картофеля, содержащих: антисмысловус последовательность гена БО Yn-BK (отрицательный контроль, яорожка 3); кассету 35SPLYCP (дорожки 4-7); кассету 35SX28YCP (дорожки 8-11).. Вирусный белок оболочки показан стрелкой.

Анализ суммарной РНК из трансгенных растений картофеля выявил, что транскрипт гена БО y"-BK с полилинкерным лидером присутствует в крайне маленьких количествах (5-10 пг на 10 мкг суммарной РНК, рис. 9, дорожки 3-6). Напротив, уровень транскрипта с укороченным лидером Х-ВК достигал 50-200 пг (рис. 9, дороккп 8-11).

Подсчет интенсивности сигналов показал, что усреднений вклад лидера Х-ВК в накопление мРНК гена БО Y^-BK а трансгенных растениях является 10-кратным.

Размеры трансхриптов гена БО Y^-BK несколько отличались от ожидаемой длины 1401 и 1444 н. (5*-лидер (37 и 80 н.), кодируошая область (804 н.), 3!НТ0 Y^-BK (330 н.) и терминатор BMIIK (230 н.); без учета лоли(А)) и мигрировали в агарозиом геле приблизительно ка>^ 1200- и 1250-нуклеотидные Фрагменты (рис. 9). • Это мозно объяснить, во-первых, наличием потенциального сайта полча?«?килиросання внутри З'НТО Y^-BK на

123456789 10 11

+ + - 35SPLYCP 35SX28TCP

расстоянии 190 н. oi терминирующего кодона, и , во-вторых, несответствием поавижностей глиоксилированных молекул РНК и ДНК (положительный контроль) равной длины в агароэном геле.

123456789 10 11

Ркс. &• Блотгибриаизационный анализ суммарной РКК, выделенной из трансгенных растений картофеля. Лорожка 1: 5 пг глиоксилировакного EccKI-Фрагмента плазмияы p35SPLYCP положительный контроль. Далее нанесены по 15 мкг суммарной РНК из трансгенкых растений, содержащих либо кассету 35SFLYCP (дорожки 2-G), либо кассету 35SX28YCP (дорожки 8-11); а чакпе из »^трансформированного картофеля (отрицательней контроль, дорожка 7). Стрелками показаны гетсрологичные мРНК гена ВО Y'"4'-ВК.с лидером Х-ВК и-полилинкернкм лидером, а такае контрольный Фрагмент.

Суммарная РНК одного из 8 растений с кассетой 2 5SPLYCP содержала несколько фрагментов разной длилк, гибридизующкхся с меченной ДНК-пробой к гзну БО Yw-Bl'. (ркс. 9, дороика 2), что, вероятно, является артефактом.

Из полученных экспериментальных данных не ясно на каком уровне проявляется энхаксерчый Эффект лидера Х-ВК. Увеличение количества мРНК БО Y^-BK в трансгенных растениях иоенс" объяснить влиянием последовательности Х-Т!К на транскрипцию с 35£-промотора. Однако, если учесть, что Х-ВК прздетаеляет собой РНК-вирус, не имеющий ка^ой-либо ДНК-Формы в жизненном цикле, то последовательность лидера X-BIC монгсг оказаться энхинсером транскрипции to.4l.ko воле» случая. Более того, пока не существует достоверных данных об экхансерном влиянии • последовательности, непосредственно прилег-аюыей г. точк* инициации транехрипции, на процесс транскрипции в растениях.

Тот »акт, что лидер Х-ВК при сравнении с короткими полилинкерными лидерами обеспечивает более Эффективную экспрессии SPS-транскриптов различных генов (nptl, nptll, G US, эндотоксина из В. thucingiensis) в бескяеточнык трансляционных системах in vitro (Smirnyagina EV et al., 1991, Zelenina - DA et al., 1992), свидетельствует в пользу посттранскрипционного эффекта.

Вывод об усилении трансляции лидером Х-ВК (Smirnyagina EV et al., 1991), сделанный по аналогии с омега-лидером ВТМ, пока не подкреплен доказательством отсутствия влияния лидера Х-ВК на стабильность гетерологичных мРНК, как это было показано для омега-лидера (Gallie DR et al., 1989).

Если постулировать равную эффективность транскрипции гена БО YN-BK в кассетах 35SPLYCP и 35SX28YCP, то отличие на порядок в уровне накопления транскриптов свидетельствует как раз о стабилизирующем влиянии последовательности лидера Х-ВК. Хотя нельзя исключить возможность повышения стабильности за счет увеличения эффективности трансляции.

Относительная нестабильность траискрипта БО Y^-BK с полилинк'ерным лидером объясняется, по-видимому, тем, что он представляет собой искусственно полученный 3'-проксимальный фрагмент " геномной РНК Y-вируса,- Лишенный природного' нуклеотидного контекста 5*-конец такого транскрипта может подвергаться деградации. Последовательность лидера Х-ВК, присоединенная к нестабильному 5*-концу, вероятно, обеспечивает целостность структуры матрицы и ее стабильность.

При анализе литературных ленных о попытках получения трансгенных растений, экспрессирующих вирусные белки оболочки, мы обнаружили закономерности, косвенно подтверждающие стабилизирующую роль лидера Х-ВК.

Так, введение а геном растений табака и картофеля кассет экспрессии генов белков оболочки вируса скручиваемости листьев и Y-вируса картофеля не привело к накоплению детектируемых количеств вирусных белков в трансгенных растениях (van der Wilk К et al., 1991, van der Vlugt R et al., 1992, Farinelli L Ь Malnoe P, 1992, Farinelli L et al., 1993). В этих работах были использованы кассеты экспрессии, содержащие 35S-tipomotop с прилегающими полилинкерными лидерами. Поскольку в полученных нами трансгенных растениях картофеля, кассета экспрессии гена

с полилинкеркым лидером танке не сбеспечивает накоплении вирусного Белка оболочки, можно заключить, что лолплинкёрные лидеры не способны обеспечить достаточную стабильность и (или) трансляционную способность химерных мРНК.

й наоборот, в случаях, когда при конструировании кассет экспрессии использовались эффективные лидеры, удалось достичь накопления белков оболочки вируса скрытой нозе.!1г.к сливы (Eaveionsndro М et al,, 1992, кспользоаан лидер субгеномной РНК белка оболочки ВТН), Х- и У-вируо.-. каргосэля (итамча О) (Lawson С et al.., 1S90, фрагмент лидера BMUK), вирусе сим6::диума (Chía T-F et al., 1992, «р-гиент лкд~ра BKUK), Y-вяруса кагтооеля (русск5.-й «золят штампа N) (н&стояцсх работа, укороченный л-:дер Х-ВК).

Иктерзснч, что кассета о::спресл:и, содержащая усиленный 35Б-промстор с прилегающим 25-нуклеотидным 5'-концевым Фрагментом лгдьра ВМЦК, была успешно применена с кескольхкг. работах (см. выше) и, з честности, для обеспечении ухспьессии гена эндотоксина из В. thuringicns.5 s, траьскрипт которого крайне лвстабллен в растительных клетке- (Carrozzi КЕ et ai., 13921. Васно отметить, что существует соицется'ст'гво о , окладе 5'-концевой области лмде'г* В5ЩК я накопление мРНК гена' CAT в протопластах О. violsceus, полученное г результате далеиио'нпого сналхгза (Futterer J et" al., 1990). 1

Lawson с соавторами (1390), :;спользОРаыД1.е кассету с осиленным ЗББ-промотором и прилеганием фрагментом ли tapa BtllIK, показали, чт? белок оболочки Y^-BK накаплииеется п тр&нсгенн^^ растениях картофеля соота Russet Burbanic на уровне 0.01-0.05% от cjKíiapHoro экстрагируемого болка; npi; пакоплзнии 500-2500 пг транскриптг. на 12 лкг суммарной РНК. Соответственно в полученных нами трансгенных растениях картофеля сорта 5елорусский-3 белег. оболочки Y^-EK ьак&пг.кЕзлся на урсс.че 0.004-0.02%, а его транскрипт - на уровне 50-200 nr. 2ядно, что в .lattux растениях оболочки приблизительно в 2.5 раза

меньше, тогда как его тренскр;:ита ме: ыае ь 10 раз.

Можнг* предположить, что различие на порядок величины а к^хопленки TpaHCKpi.nTOB б-глка оболочки полностью определяется различной ас-фиктивностью усиленного и природного 35S-промоторов (г.оследни». ь^гтользоотн HdKTi), пак .что было похязг.но ранее (Кг/ R eí ai., 1ЭВ7). Tí,-Et. фрагмент лидера BMIIK >.

укороченный лидер Х-ВК обладают равной стабилизирующей способностью, 1 но лидер Х-ВК обеспечивает в 4 раза более эффективную трансляцию мРНК вирусного белка оболочки. Оговоримся, что такое сравнение является весьма приблизительным. •

Согласно сканирующей модели трансляции 5"-лидеры в кассетах ЗоБРиГС? и 35БХ28УСР обладают различными потенциалами.

Показано, что эффективность инициации трансляции пропорциональна длине лидера в пределах от 20 до 84 н. в протопластах моркоои (Са111е Рй & Ма1ЬоЬ V, 1992). Лидер, содержаний укороченный вариант лидера Х-ВК, в кассете 35БХ28УСР имеет длину 80 н., тогда как контрольный полилинкерный лидер в кассете ЗЗЗРЬУСР вдвое хороче (37 н.) (рис. б. Б) и, следовательно, менее эффективен.

Вторичная структура внутри лидера, как известно, снижает спорость инициации трансляции. Проведенный нами компьютерный анализ вторичной струхтуры 360-нуклеотидкого ..5'-конца транскрибируемой области кассет ЗбвРЬУСР и 35БХ28УСР выявил, что транскрипт с полилинкеррым лидером. имеет . более структурированную 5'-область (-107.2 ккал), чем_ транскрипт с укороченный лидером Х-ВК (-96.9 ккал). Более того. 30-нуклеотидный участок внутри лидера Х-ВК (позиции 5-34) оказался невовлеченным в комплементарное взаимодействие, тогда как лолклинкеркый лидер был полностью структурирован.

Таким образом, лидер мРНК гена БО т"-ВК в кассете 353Х28)ГСР с точки зрения длины и вторичной структуры должен быть более эффективным стимулятором трансляции, чем контрольный полилинкерный лидер в кассе.те 3£5РЬТСР.

Эффективная трансляция мРНК гена БО У^-ВК с укороченным лидером Х-ВК, гипотетически, может делать ее более стабильной в тренсгенных растениях картофеля по сравнению с мРНК, имеющей полилиикерный ''лидер. Это верно, если предположить, что рибосомы, покрывающие матрицу в процессе трансляции, способны выполнять защитную функцию от воздействия нухлеаз. Однако в определенных, случаях транслирующие рибосомы наоборот дестабилизируют мРНК. Наконец, существует гипотеза, согласно которой отсутствует прямая связь мемду эффективностью трансляции и стабильностью мРНК. Она находит подтверждениие

при анализе данных о влиянии различных лидеров на трансляцию матриц. Показано, что даже при значительных изменениях в скорости инициации трансляции, Благодаря введению мутаций в лидер или замене лидера мРНК, стабильность матрицы остается практически неизменной в процессе трансляция (Кога1: IS, 198S, 1989, Carrington JC ft Freed CD, 1900). В' частности, такие наблюдения были сделаны при изучении омега-л::дера ВТК и лидера FHK4 ВНЛ в растительных трансляционных системах (Gallie DR ct al, 1989, Jobling SA Ь Gehrke L, 1987).

Итак, остается неясной взаимосвязь меилу эффективностью трансляции и стабильностью мРНК.

Мы предполагаем, что введение укороченного лидера Х-ВК перед инициирующим кодовой гена БО YN-BK стабилизирует мРНК. БО YN-BK в трансгенных растениях картофеля независимым от трансляции образом. Наблюдаемое усиление экспрессии различных генов в присутствии лидера Х-ВК in vitro (Zelenina DA et al. , 1992), в протопластах табака и трансгенном картофеле, вероятно, складывается из приращения количества белка как за счет стабилизации мРНК, так и благодаря более эффективной трансляции. При атом влияние лидера Х-ВК на стабильность и на трансляционную способность, по всей видимости, меняется в . зависимости от прилегающей кодирующей области и от трансляционной система. '

выводи

1. Обнаружена, что лидер геномной РНК Х-еируса картофеля обладает способностью усиливать экспрессию гетерологичных генов в протопластах табака и трансгенных растениях.

2. Энхансерное влияние лидера Х-ВК на транзиентную экспрессию гена пр1Х1 в протопластах табака вдвое превышает эффект омега-лидера ВТМ и вчетверо - лидера РНК4 ВМЛ.

3. Удаление 28 нуклеотидов с 3'-конца лидера Х-ВК не

влияет на э:1хансерный эффект. Дальнейшее усечение

/

последовательности, оставляющее нетронутой СА-область лидера Х-ВК, снижает энхансерный эффект до 20*.

4. Укороченный лидер Х-ВК успешно применен для получения трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген БО у"-ВК.

5. Обнаружен вклад лидера Х-ВК в накопление мРНК гена БО У^-ВК, предполагающий стабилизирующую роль данного лидера. -

Результаты диссертации изложены в следующих статьях:

1. Pooggin MM, Skryabin KG: The 5'-untranslated leader seqiicnce of potato virus X RNA enhances the expression of a heterologous gene in vivo. Mol Gen Genet 234: 329-331 (1992).

2. Пугин MM, Соколова MA, Шульга OA, Скрябин КГ: Влияние .5'-лкдера Х-вируса картофеля на экспрессии гена бедка оболочки

Y-вируса картофеля в трансгенных растениях Solanum¡ tuberosum. Молекулярная биология, 1994, т. 28, вып. 3 (в печати).

3. Сохолова МА, Пугин ММ, Шульга OA, Скрябин КГ: Получение трансгенных растений Solanum tuberosum, устойчивых i Y-вирусу картофеля. Молекулярная биология, 1994, т. 28, вып. 4 (в печати).

и представлены в виде следующих докладов и постерных сообщений:

1. Пугин ММ, Скрябин КГ: 5'-нетракслнруемый лидер РНК X-внруса картофеля - усилитель экспрессии гетерологичного гена in vivo. - Тез. докл. 1-ого Всесоюзного симпозиума "Новые

'методы биотехнологии растений" (Йущино, 1991).

2. Пугин ММ, Соколова МА, Шульга OA, Скрябин КГ: Влияние 5'-лидера РНК Х-вируса картофеля на экспрессию гена, белка, оболочки Y-вируса картофеля в трансгенных растениях картофеля. Тез. докл. 11-го Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений" (Пушино, 1993).