Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение трансгенных растений, устойчивых к Y-вирусу картофеля

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение трансгенных растений, устойчивых к Y-вирусу картофеля"

РГб о

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

- О 5 1 А п г Сл 1

2 и иЬГЕНВТИНЙ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

СОКОЛОВА МАРИАННА АЛЕКСАНДРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К V-ВИРУСУ КАРТОФЕЛЯ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1994 г.

Работа. выполнена в Лаборатории генетической инженерш! Нентра "Биошасенерия" РАН

Научные руководители:

К.Г.Скрябин О.Д.Шульга

Оффшшальные оппоненты; Доктор биологических наук,

профессор З.С.Пирузян

Кандидат биологических наук Н.О.Калинина

Ведущая организация: Институт Молекулярной Биологии им.В.А.Знгелъггрдта

Зашта диссертации состоится 99'- г. в

_часов на заседании ' Специализированного Ученого совета

- Д 098.12.01 при Научно-исследовательском' институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 112545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1

С диссертацией мскно ознакомиться в библиотеке НИИ генетики и селакшш промышленных организмов.

Автореферат разослан "<А?" .^^-¿■У ^994 г.

/

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук В.И.Щербакова

Доктор биологических Еаук, член-корр.РАСХН, профессор

Кандидат хткческих наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тепы.

Одной из сахных проблем, стоящих перед современной агропромышетюстыс, является получение растений, устойчивых к вирусным инфекциям. Ежегодно значительная часть урсиая ценнейших сельскохозяйственных культур гиОнет в результате поражения {"лтовирусами. однако, традиционные методы селекции вирусоустойчиБНх . сортоЕ не всегда эффективны, а методы с применением инсектицидов, уничтокавдих яереносчиков вирусов, опасны в экологическом отношении. Явление "перекрестной защиты", когда обработка слабым'птеммок вируса или виротгда загадает растения от последупций инфекции более вирулентным етеммом, также не ыо^ет служить универсальным средств ал борьбы с фитовирусами. Во-первых, пе всегда югно подобрать соответствующие пары вирусов; кроме того, слабый ктамм может мутировать в высоко вирулентный шташ или действовать в синергизме с с неродственным, вирусом. И, наконец, сам ивдуцируший вирус может привести к существенным потерям урожая.

Благодаря развитию методов генетической инненерш и методов трансформации растительных клеток стало "возможным получение трансгенннх растений, экспрессируюощх гетерологичные гены. В литературе имеется многочисленные примеры создания трансгенных растений, устойчивость которых к вирусной инфекции обусловлена экспрессией в них различных фрагментов геномной РНК вирусов. В настоящее время наиболее эффективный подход е создании трансгенных растений, устойчивых к фитовирусам, заключается в получении трансгоняых растений, синтезирующих белки оболочки вирусов ■ (ВО), их мРНК или антисмнсловые РНК (асРНК) капсаяных белкоз. Такие эксперименты были проведены для ряда вирусов, принадлежащих к различным вирусным группа!.!, В ТОМ ЧИСЛО И ДЛЯ ПОТКВИруСОБ (ВвасЬу вЬ а1., 1990). Хотя механизмы вирусоустойчивости у этих растений ёзе недостаточно изучены, и в разных системах "вирус-хозяин" могут быть задействованы раачнчные факторы, считают, что главную роль в создании вирусоустойчивости играет синтезируемый в растительной клетке вирусный белок оболочки или его мРНК. Кроме того, показало, что признак приобретенной вирусоустойчивости стабилен и наследуется в псследующих поколениях.

V-вирус картофеля (УВК) - представитель труппы потпвирусоз -является одним из наиболее патогеннах фитовирусов. Потери урожая.

вызываемые Y-вирусной инфекцией, могут достигать 80S (Shukla et al., 1989). в связи с этим представляется весьма важным создание трансгенных растений, устойчивых к этому вирусу. Креме чисто практического интереса, связанного с получением зирусоустойчивых растений, важна и теоретическая сторона этого подхода, поскольку он позволяет изучать роль отдельных вирусных генов и их продуктов в процессе развития вирусной инфекции в растительной клетке.

Настоящая работа посвящена изучении экспрессии в трансгенных растениях картофеля фрагментов кДНК геномной РНК Y-вируса картофеля, содержащих ген белка оболочки этого вируса, и исследованию влияния их экспрессии на устойчивость к Y-вирусной инфекции.

. Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в получении трансгенных растений картофеля сорта "Белорусский-3", экспрессирущих ген белка оболочки Y-вируса картофеля или его антисмысловую РНК, и изучение их влияния на устойчивость трансгенных растений к заражении YBK. В задачи исследования входило:

1. присоединение ATG-иншшрувдего кодона к кодирующей последовательности гена белка оболочки YBK,

2. создание конструкций для экспрессии в растениях гена белка оболочки YBK или его ангисмыеловой РНК, содержащих различные регуляторные элементы, обеспечивание эффективную экспрессию этих генов в растениях,

3. получение на основе решшиентного штамма LBM404 штаммов агробахтерий, несущих созданные кассеты экспрессии, для трансформации растений,

4. Трансформация растений КарТОфеЛЯ (Solanum tuberosum) и изучение экспрессии вирусных последовательностей в трансгенных растениях.

5. исследование устойчивости трансгенных растений к заражению YEK, получение клубней трансгенного картофеля, пригодных для дальнейшей селекции.

Научная новизна и практическая ценность работы.

С помощью метода полимеразной цепной реакции проведено присоединение атс кодона инициации трансляции к гену белка оболочки Y-вируса картофеля. Сконструированы кассеты экспрессии гена белка

о

оболочки Y5K или его мРНК под контролем регуляторных элементов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Создана кассета экспрессии гена БО YBK, в которой перед кодаруюссй частью гена встроена э'-лияерная последовательность геномной РНК Х-вируса картофеля, усилоакшая экспрессию гетерологичнпх гепов з растениях. Получензаэ конструкции

перенесенк В ШТаММ Ap-Gbacterium turoefasions LBA4404, ПСПОЛЬЗУвМЫЙ

для трансформации растений. Получены трансгеннкв растения S. tuberosum (сорт "¡.ЧЛОрусСКИЙ-З"), ЭКСЛр^-.СЕрУЮЩИе ГВп БО ИЛИ ого антисмысловую РНК. Показало, ч-^о траясгонаэ > растения, скзтоагрупшв только мРНК БО YBi:. являются наиболее устойчивыми к заражению Y-вирусом картофеля по сравнению с трансгенными растениями, аккумулирукшми эндогенный вирусной БО или его антасшсловую РКК. ПолучеЕН клубни трансгенных растений, устойчивых к уж, пригодные для высадки в почву и проведения дальнейшзй селекции.

Апробация работы.

Представленные в диссертации результаты были доложены и обсуждены на I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пушно, 1991), на и Российском симпозиуме "Нсзче методы биотехнологшш растений" (Пущино, 1993), на конференции "Биология культивируешх клеток растений и биотехнология" (Алма-Ата, 1993), на заседаниях коллоквиума лаборатории генетической ютенерии и Ученого Совета Центра "Еиоинкенерия" РАН.

Структура и объеи диссертации.

Диссертация состоит из введения. обзора литературы, зкеперимсптальной части, включашэй описание материалов и методов, изложение и обсуждение экспериментальных результатов,- выводов- и списка цитируемой литературы. Работа содержит S6. страниц машинописного текста, включает 13..рисунков и библиографический список из I?? названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные ыггйюы. В работе бкли использозанн штаммы е.coli HBioi ¡Bolivar et al. , 1979) И НЕ101 , СОДбрВИШИЙ ПВазМИД? pRK2013 (Figurski 'et al., 1979!, штаММ A.tumefaclens LBA4404, содержащий

плагмиду pla4404 (ноекеаа at al., 1983 1.

Плазшды- Для про^едашш клонирования использовались - следушие плазмидше векюшг p"JC19 (Vieira and Messing. 1982), pRTlOl ITopfer et al.. 1987), p3T101X5'del28 (Pooggin et al., 1992!, pBinl9 (Esvan et al., 1S84 ).

Ферменты. Бсльсшство ферментов, использованных в работе, полнено из НПО "Фермент". Вильнюс. Фрагмент Кленова ЛНК-пслимерагы i E.coii, ДНК-лигсза и голинуулеотидкиназа фага Т4 были получены от фирмы "АшвгзЬаа" (Великобритания).

Полиыеразная трпяая реакция. ПНР проводили в течение 30 циклов: денатурация - 1 ывн. при 94°С, отжиг - 1 ш. при 5сРс, спнтез - 30 сек. при 7ic. Условия реакции подбирались с учетом методик, описанных Arr.heiw ot al. (1990).

Генновнжинернде игшиулгщы с ЛПК, секвенировглио, выделение плазывдной ДНК проводили но стандартным мэтодякгм, изложенным в руководства Машатиса И др. (1234), Sanger et al.(1С77), Blrnbolm et al. "(1979).

Перенос BeKTGJBKX тиааштд из E.coli в A. tumefaclens ПООВОДИЖ согласно Cheysen and Deplcker (19S7).

Трансформация растений кархофеля. Трансформацию сегментов стебля агробактериями проводили в соответствии с методом, описаникм Newaii et al. (1991 ).

Выделение ДНК ж РНК из трансгенных растений • картофеля проводили по методам, предлаюнньш Dellapora et al. (1983) И Chowczynski et al. (1987), соответственно. Геномную ДНК обрабатывали соответствугщиыи зндонуклеазаш рестрикции и проводили электрофоретическсе разделение фрагментов ДНК в ix агарозном гело в однократном трис-анзтатном буфере, рН 7,2. Электрофорез ЕНК для Злот-гибридизации проводили б IX агарозном геле в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,0, после обработки глиоксалэм и диметилсульфоксидом (Маниатис и др., 1985). Перенос ДНК И РНК на найлоновые мембраны Hybond (Amersham) и гибридизацию с меченным зондом осуществляли по протоколам, предлагаемым фирмой-изготовителем. Гибридизовали с меченой (а32Р)-пробой, синтезированной на однонитевей ДНК фага М13, содержащей ген Б0 *ВК, или с меченной (о32р)-пробсй, полученной с помощью шк-трзысляции фрагмента ДНЕ, содержащего ген БО УВК. Иимуно-блот суммарного клеточного белка из транс генных

растений картофеля проводили согласно методу Laeaall et al (1970) с некоторыми модификациями (Пугин и др., 1994). Концентрацию белка

определяли ПО методу Бредфорда (Bradford et al., 19"7«!. Заражение Y-вгрусом картофеля. Трансгеннне растения картофеля ьнрашсгали в течение 3 недель на среде с агаром, змем высаживали в грунт и вырадавата ешэ 4 недели в тешпгпшх условиях. Заражение проводили механическим способом: два листа с кагдого растения опудривалп карборундом и затем втирали по 25 мкл инокулята. В качестве инокулята использовали в 10 раз разведенный экстракт, тфигото?ленный из листьев YBK-инфецирозанного растения табака сорта 3PI: i г зеленой массы гомогенизировали в 1,5 мл 0.01Н калий-фосфатного буфера, рН 7,5. ,

liiMyho-^pepieEmrt анализ. ИВА проводили с . использованием стандартного иммуно-диагностического набора для определения вирусов, разработанным НПО картофелеводства (Норонево, Московской обл.-). Концентрацию вируса з экстрактах определяли с помощью ИФА в реакции с поликлональными анпггелаяя к YBK. Для приготовления экстрастов использовали по 4 листовых диска, полученных с системных листьев анализируемого растзния.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСУХДЕНИВ

1.Модификация фрагмента кДНК, содержащего ген ВО УБК.

Гэн белка оболочки YBK (русский изолят штамма N) выделяли из плазмиды рВ047.i, содержащей фрагмент кДНК РНК YBK длиной 1132 п.н., любезно предоставленной Н.Саарма (Институт Биотехнологии, Хельсинки). Извести-, что белок оболочки YBK синтезируется вначале в составе полипротеинового предшественника, а затем протеолитически вырезается из него с помощь:? вирусной протеизазы Кг.. Разрыв происходит по глутамкн-глицин дшептидной связи, и глицин является первым N-ганцовьш аминокислотным остатком гзпепдного белка YEK. Д?я обеспечения экпрессии гена БО YBK в растительной клетке, к кодирующей госледевательности БО было • необходимо присоединить ATG-инициирувдий кодоя. Для этого использовали метод полпмеразной цепной реакции (ПНР): синтезировали ¿FK-праймер длиной 29 п.н., включашпй: ЗашШ-сзйт рестрикции, Атс-иницигрухпш! колон, контскст Козак, повызаипий эффективность трансляции в эукарпотических системах, и перзые 15 нуклеотидоь гена БО. ПНР проводили, используя в качестве матрицы шазмщц' рШ47л. содеркацуы ген БО YEK, а в качество -второго цраймера - обратный пргЗмзр фага mis,

комплементарный последовательности ß-галакгозидазного гена, такие ВХОДЯШеГО В СОСТаВ ттляэдлпш рВ047.1 (рис.1).

АТС

БО YBK

ТСА

з'нто

рВ047.1

гшз

ПНР

BamHI

EcoRI....BamHI.

атс

ТСА

БО YBK

З'НТО

Праймер для ПОР, содержащий ATG-иЕиииируший кодон: S'GGGATCCACCATGCGAAATGACACAATCG 3'

Рис.1 Схема полимеразной цепной реакции.

Ашлифицпрованный с помощью ПОР фрагаент ДНК, содержащий ген белка оболочки YBK и з*-нетранслируемую область (З'НТО) РНК YBK был клонирован между Hindi и Saal сайтами рестрикции вектора puci9. Нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента определялась методом секвенирования с использованием универсального и обратного праЯмеров из, а также на основании раннее опубликованной последовательности гена БО YBK (русский изолят штамма N> (Puurand et ai., 1990) . Результаты секвенирования подтвердили присутствие атс-инициирующего кодона с контекстом Козак, открытой рамки считывания (804 п.н.) гена БО YBK с tga-терминирупшм кодоном и З'-НТО (ззо п.н.) (рис.2).

2.Конструирование кассет экспрессии БО YBK.

Для обеспечения экспрессии гетерологичннх генов в растениях, их необходимо поместить под контроль растительных регуляторных элементов, эффективно работающих в растениях. Известно, что 35S

б

А й С Т

Рис.2 Фрагмент нуклеотиднбй последовательности гена БО УВК, ВКЛОТаШЩЙ АТС-ЩИШИруЩИЙ кодон с контекстом Козак.

промотср 'зируса мозаики цветной капуст» (ЕКЦК) язляется одним из самых сильных среди выделенных на сегодняшний день растительных промоторов (Забеге э! а1, 1987, ЬнЛоп е! а1, 1987). поэтому для достижения эффективной экспресии гена БО УВК в растениях, ВашН1-фрагмент, содержащий последовательность этого гена с синтезированным лта-кодовом и з'-нто, был клонирован в прямой и обратной ориентация?, з ВашН1-сайт плазьзкы р^7101 между зьб промотором и поли(А) сигналом БМЦК, а таккз путем замещения гена иртп в плазмиду рКП01У5'йв12& (рис.3). Полученные кассеты экспрессии рнтки уср и рнпотуср отличались от рнтз01усрх5'ав128 только 5'-нетранслируемыки последовательностями; первые две кассеты содержали 37-нуклеотидннй ггатилинкер в качвстзэ -лидера мРНК БО УВК, югда как третья - 80-нуклеотидный 5'-Еетранслируемый комоинированшй лидер. Последний включал С6 п.н. зга 5'-лидера геномной . ПЕС Х-вируса картофеля (ХВК), способного усиливать экспрессии гетерологичннх генов в растениях, 13-вуклеотидного

гтолилинхера (с 5'-коша) и 11-нуклеотидного спенсера (с з1-конца).

рис.з. Кассеты экспрессии гена бо увк и асРНК бо УВК.

Полученные кассеты экспрессии Сыли перенесены в оинарный вектор для трансформации растений pBi.ni 5. Из плазмщщой ДНК рЯТ101ус?. рКТ1 о 1 еус? и рнт101х5'ав123уср выделяли Н1.пй1 п-фрагменты, содержащие соответствующие кассеты экспрессии и клонировали их в ветп'ср рВ1г.19. обработанный: рестриктазой К1шШ1 . Ориентация клонированных клонов относительно маркерного гена пр-ън была

в

определена с помощью рестрикшганного анализа. Полученные плазмшш Сыли названы: pB35YCP, pB35RYCP И pB35LYCP (рис.4).

35S.

БО YBK

З'НГО

J?- Т -xnptn

псе

- рВ35УСР

--{j5Sy>-<^3-НГ0

БО YBK

nptll

UO£- pB35RYCP

бо ybk

з'нго/1— т

nptll

KQ2- pB35LYCP

Рис.4. Клонирование кассет экпрессии гена БО YBK в вектор pBini9

3. Получение штаммов агробактсрий для трансфоркгции растений и трансфориадия растений картофеля.

Плазмиды pB35YCP, pB35EYCP И pB35LYCP ПврвНЗСИЛИ ИЗ E.coli (штамм НВ101 ) в A.tumefaciens (ПГГаММ JJ3A4404J. С ПОМОЩЬЮ МвТОДа трехрохтгельского скрещивания шташов. При этом использовали штамм E.coli НВ101 с плазыидой pRK20i3 в качестве помощника при конъюгационном переносе. Частота конъюгации составша приблизительно 2.7x1 СГ2. Наличие кассет экспрессии в агробактериашшх штампах было подтверадено методом Саузерн-блот анализа суммарной ДНК, выделенной из агрсбактерий (рис.5).

Для введзшя кассет экспрессии гена БО YBK в геном растений картофеля сорта "Белорусский-3" использовали метод агробактериальной трансформации. Из асептически • выращиваемых растений картофеля нарезали сегменты стебля и инкубировали их с трехдневной культурой • агробактерий на среде кокультивирования • два дня. Затем экспланты переносили на среду для каллусообразования Р1, содержащую 100 мг/л капамицина и 100 мг/л цефотахсима. Спустя месяц на концах оетаентов стебля образовывалась, каллусная ткань. Далее эжсалантн ежемесячно пассировали на среде для побегообразования, содержащей прежнее количество антибиотиков. Побзги, регенерирсвавшв из каллусной ткани, срезали и переносили для укоренения на среду si, не

о*-"

Рис.5 Блот-гибпцшзапионный анализ плазмидной ДНК, выделенной из ПОЛучеВЕЫХ ВТЕМЮВ агрооактсрий. 2, 3, 4 - ДНК рВ35НУСР, рВ351-УСР и рВ35УСР, обработанная Н1пйШ. 6 - ДНК рВ1п19, ооргзот&аная ННиЦП. 5 - ЕсоМ, НХпсПП-фраП.ШНТ ДНК рВ047.1

содержащую гормонов и антибиотиков. Укоренившиеся побеги переносили на среду с канамщгнок (100 мг/л). В среднем процесс регенерации занял 5-8 месяцев.

4. йзученже акспрессии гена БО УВД в трансгенных растениях картофеля.

Интеграция гена БО УВК в геном нескольких независимых регенерантов, укоренившихся на селективной среде, была подтверждена методом ДНК-ггбрпдизашш. На рис.6 показан результат анализа геномной ДНК из регеяерантоз каргофеля, полученных в результате трансформации штаммом агробактерии. несущим кассету экспрессии гена БО УВК с 5'-лидером ХВК. ЕсоЯ1-фрагмент геномной ДНК, гибрвдизутадийся с меченным зондом , соответствовал ожидаемой длине 1.2 Т.Н.П.: 80 н.п.5'-лидер ХБК + 804 п.н. - гон БО + 330 н.П. -"'-КТО. В качестве зонда использоезли меченную («'Р)-пробу. синтезированную на одвонитевой ДНК фага М13, содержащей ген БО УВК. Подобный анализ был проведен для растений, несущих другие кассеты экспрессии гена БО УВК. с помощью ДЩ-блот анализа была произведена оценка числа копий гона БО, интегрировавших в клеточный геном. Для дальнейшего анализа были отобраны трансгенныо растения картофеля, содержащие по 1 копии гена БО на гоном.

ю

Рпс 6 гиошшзацаоЕНка анализ суммарной ДНК, выделенной из тванст'енных растений. Препарат сумматкой ДНК (20 акт). обработанной ЕсоЫ 2-10 - из тцансгенних растений, 11 - из нгтрагсфср.сгрозашшго растения. 1 - Есой1-фрагмент плазшдной ДКК из рВ35УСР.

Полученные трапсгонные растения гнализирсзалз методом имкуно-Олот анализа. Ни 2 одном из растений, несушх кассету экспрессии с 5'-полилинкерным лидером, нэ удалось обнаружить Смок оболочки УВК (рис.7). При этом порог чувствительности метода составлял примерно 0.5 кг контрольного белка оболочки. Аналогичные результаты получены другими авторами при создании тразсгенных растений табака и картофеля, экспрэссирушкх ген БО УВК (РагШеШ а1., 1992, Раг1пв111 вЬ а1., 1993. Ивпв ot а1., 1992). Однако ВО всех трансгенных растениях, содержащих последовательность 5'-лидера ХВК, экспрессия белка оболочки составила 0,004-0,02 * или 1-5 кг на 25 мкг суммарного клеточного белка (рис.7). Так™ образом, полученный результат подтверждает энхансернкй эффект 5 * -нетранслируемого лидера ХБК на экспрессию гегэрологичных генов з

растительной метке.

При проведении РНК-блот анализа размера транскриптоз соответствовали ожидаемым: 1401 н. (37 н..- 5'-лидер + 304 н. - ген БО УВК + 330 к. - З'-НТО + 230 н. - лоли(А) сигнал БМЦК - для траяскрипта с полшшакерЕЫМ 5'-лидером з 1444 н. (ВО н. - 5'-лидер + 804 Н. - ген БО УВК + 330 н. - З'-НГО + 230 н. - поли(А) сигнал ВМЦК - для транскряпта с комбинированным (ХВК-) лидером (ряс.8). Одеэот накопление транскриптов оказалось разным. В растениях, несушх кассету экспрессии с полилинкерным 5'-лидером, уровень накопления

п

Рес.7. Определение БО в травсгенных растениях. 1 - БО *ВК 10 нг. 2, 3, 4, 5, - 25 мкг суммарного белка из трансгенных растений 1-30, 1-40 1-70, 1-80, несущих кассеты экспрессии с полшшнкерным 5'-лидером. 7, 8, 9, 10 - 2Ь мкг суммашого белка из трансгенных вастении 3-80, 3-90 , 3-110 , 3-130, содеркгшх 5• -лидер ШТ. 6 - суммарный белок из ^трансформированного растения.

транскрипта составлял 5-10 нг на 10 мкг суммарной РНК, тогда как в растениях, несущих кассету экспрессии с полилинкернкм 5'-лидером уровень мРНК был на порядок выше , или 50-100 нг на 10 мкг суммарной РНК. Возможно, что стабильность транскриптоз в данном случает прямо пропорциональна их трансляционной способности. В процессе трансляции рибосомы, оккупируя матрицу, могут • препятствовать разрушению нРНК клеточными нуклеагами. Учитывая большую трансляционную способность мРНК, содержащей 5'-нетранслируемую лидерную последовательность ХЕК, можно цредположить, что эти мРНК оыстрее вовлекаются в процесс трансляции, и, поэтому, их стабильность в растительной клетке выше. Не исключается также

возможность-, что 5 • -лидерная последовательность ХВК способна каким-либо образом стабилизировать мГНК БО УВК не зависимо от своего вклада в эффективность трансляции.

12 2 4 5 5 7 6 9 1С II

12 13 14 15 16 17 18 19 20

Рпс.8. Анализ мРНКовых траяскшптов в трансгенных растешь. 10 13 - суммарная РНК из неттансформированных растения картофеля, г. 3 4, 9, 14, 15, 16 - сушашая ЕЙК из трансгешшх тастеый с полшпшкершш 5'-лидером: 1-7,-1-30, 1-40,

5 6 7 8 11. 17, 18, 19. 20 - суммарная мРНК из трансгенных растений с З'-щером ХЕК: 3-20, 3-40, 3^-90, 3-110, З-ЙО. 3-10. 3-80, 3-90, 3-130; 1, 12 - ЕсоШ-фрагмент рВ35УСР.

5. Анализ устойчивости трансгенных растений к У-вирусу картофзля. *

Трансгенные растения были расчеронксЕаны и после укоренения на агарззозанной среде перенесены в грунт. Устойчивость трансгенных растений картофеля к УБК определяли с помощью метода иммуно-фе рентного анализа.. ИФА проводили леред заражением и ' в течение 1 месяца после механического заргаения растений У-вирусом картофеля. Для анализа Сыло отобрало 18 независимы:: линий ^ трансгенных растений (по 6 растений для каадой конструкции). 3 качестве отрицательного контроля использовали зетрансфо]хярованш«е растения картофеля сорта "Белорусский-з". До механического инокулировандя УВК ни контрольные, ни трансгенные растения картофеля не давали положительного ответа, за аоликлональпие антитела к УВК при проведении иммуно-ферментного анализа. Этот результат не явился неожиданным в случае трансгенных растений, в которых эндогенный БО был ранее обнаружен с помощью метода иммуно-блотгибттщшзации, поскольку чувствительность последнего более чем на порядок превышала чувствительность иммуно-ферментного анализа. Из 6 растений, содержащих ген БО УВК без 5'-лидера ХВК, экспрессиругшх низкий уровень ыРНК БО УВК и не накапливашнх БО ("Б0~"-растения), 4 растения были устойчивы к УБК, и на них не наблвдалось никаких признаков развития вирусной инфекщл. Уровень накопления УВК в этих растениях на 25 день после инокуляции составил от 14,3 до 28,5 % от концентрации вируса в неграцсформировапных контрольных растениях. У других растений, несущих данную конструкцию, цролвлялась сильная задержка в развитии симптомов вирусной инфекции. Уровень накопления вируса на 25 день после инокуляции в зтих растениях составил 40 — 57.1 г (рис.9).

Только 2 из 6 растений, синтезирующих эндогенный БО УВК ("Б0+"-растения), были устойчивы к УВК на 25 день после инокуляции (уровень накопления УВК — 20 и 37 х). у остальных растений развитие вирусной инфекции зачеркивалось в различной степени. Так, на ю день после инокуляции уровень накопления УВК в этих растениях составил 43,5 — 56.4 г , на 18 день после инокуляции — 52 — во г от уровня накопления УБК в контрольных растениях. Еа 25 день после инокуляции данные трансгенные растения проявляли отчетливые симптомы вирусной инфекцеи: мозаику, некрозы, пожелтение листьев. Уровень накопления

вируса составил 42,8 — 94 х от контрольного уровня (рис. 10).

Из приведенных результатов видно, что растения, экспрессирунше мРНК и БО УВК на относительно высоком уровне, проявляет меньшую устойчивость к У-вирусу картофеля. Напротив, трансгенные растения картофеля без з•-лидерной последовательности ХВК, у которых уровень мРНК БО УВК в ю раз ниже, и белок оболочки не детектируется, обладают высокой устойчивостью к УВК. Возможно, что эндогенные, синтезируемые в клетках грансгенных растений молекулы ыЕНК БО УВК, гибридизуются с цепями вирусной РНК, образующимися в процессе

VI

Ьс?1 81

ф §

ф

В

о §

ж

I ( I I I

1-7 1-30 1-40 1-70 1-80 1-&0 К

□ Ю В1В Ш2о дни после инокуляции ■

Рис.э. Диаграмма накопления УВК в "БО" "-трансгенных растения

репликации вирусного генома, тем самчм пгра-мчивач синтез новых "+" РНК УВК. Это задершшает образование новых вирусных частиц к распространение вирусной инфекции в растении: Не исключается такг.е, что эндогенные мРНК УВК конкурируют с РНК инокулируе^о:-о рнруса за Еирусные и щгеточные факторы, неооходимне для осуществлена* рэпликахрта и трансляции, вызывая аттенюацию вирусЕОй " инфекции. Остается неясным, почему растения с более высоки/л уровнем экспрессии мРНК БО '■ВК являются мене о устойчивыми к вирусной инфекции, чзм растения с низким (в ю раз нкхе) уровном накопления мРНК БО УВК,

; Ою И1В Я26

дпз после иноирицеи

Рис.10, Диаграмма накопления УВК в "Б0+"-трансгенных растекмх.

Мсшао предположить, что образование -*/-" двухцепочечного участка ЕЖ в клетках трансгенных растений, экспрессирухдах мРНК БО УЕК, каким-то образом препятствует РНК-цолимеразе осуществлять синтез "+" цэпк РЫК, т.е. недет к ограничении синтеза полноразмзрных мРНК на "-"цепи РНК и к появлению укороченных мРНК (без ' последовательности гена БО) и, таким образом, к уменьшению сжтеза вирусного БО в растительной клетке. В клетках трансгенных растений с достаточно высоким уровнем эндогенного БО такие события не сильно бы отразились на дальнейшем. развитии вирусной инфекции. Полноразмерные вирусные "+" мРНК могли Зы использозать снлогенный БО для формирования Еирусных частиц, распространяющихся далее по другим клеткам растения. Напротив, для трансгенных растений с нбдетэктарубмым уровнем эндогенного БО образование "+/-" • РНК-дуплекса и недостаток синтезируемого вирусного БО (вследствие синтеза укороченных молэхул мРНК) могли бы играть решающую роль з блокировании развития вирусной ЕЕфекции.

У трансгенных растений, экспрессирупцих антисмысловую РНК БО УВК ("аС'-растения), отмечали ослабление развития вирусной инферкции на протяжение первых 20 дней после инокуляции (уровень накопления УВЯ составил в среднем 46 х и 52 г от контрольного уровня на ю и 18 день после инокуляции, соответственно). Однако на 25 день после инокуляции почти все растения, содержащие асРНК БО УВК, ничем не отличались как по внешнему виду, так и по уровню накопления вируса от контрольных ^трансформированных растений, инокулировашых УВК (рис.11). Антисмысловые РНК БО УВК могли бн образовывать "+/-" РНК-дуплексы с "+" РНК инокулируемого вируса, затрудняющие связывание вирусной РНК-зависимой РКК-полимеразы и препятствующие синтезу "-" цепи. Однако, уровень асРНК БО УВК в трансгенных растениях, по-видимому, не достаточен для полного блокирования процесса репликации, а вызывает лишь его замедление на ранних стадиях инфекции.

После проведения заражения трансгенных растений картофеля УВК, растения продолжали выращивать в тешшчшх условиях до образования клубнзй. Следует отметить, что клуйш трансгенного картофеля не отличались по величине и количеству от клубней ^трансформированных растений картофеля, которые не заразили У-Еирусом картофеля. Полученные клубни будут высалены в грунт для проведения дальнейшей

селекции вирусоустсигсивих фор.1 картофеля.

Такш.; образом, получены трапсгенные растения хартофелл сорта "Еелорусский-3", обладающие различной степень» устойчивости к У-вирусу картофеля. Тот факт, что трансгенные растения, пайаплиЕаише эндогенный вирусннй белок, проявляют меньшую степень зашиты от вирусной ИЕфекшш по сравнению с растениям, у которых эндогенный БО не обнаружен, говорит о том, что в давно" системе, по-видимому, главным фактором, определяющим вируссустойчнвость, является синтезируемая в трансгенноЗ растительной клетке мРКК БО

4-10 4-20 4-40 4-Б0 4-В0 4-20. К

□ 10/ В18 Н2Б

дни после инокуляции Рис.11. Диаграмма накопления УЕК в иас"-трансгенных растениях.

УВК, а не капсшшый вирусный белок. Дальнейшее изучение экспрессии различных вирусных последовательностей в трансгенных растениях позволит расширить наш представления о развитии и распространении фитовирусной инфекции, а также о возможных способах создания вирусоустойчивых растений. Полученные трансгенные растения картофеля, устойчивые к УВК, могут быть использованы для дальнейших полевых испытаний и селекции.

выводы

1. Созданы генно-инженерные конструкции для экспрессии в растениях модифицированного гена белка оболочки у-вируса картофеля или его антисмысловой РНК. На основе реципиентного штамма ивл4404 получены штаммы агроОактерий, несущие данные кассеты экспрессии, которые могут быть использованы для трансформации растений.

2. С помощью агробактериальной трансформации осуществлен перенос вирусных последовательностей в растения картофеля сорт "Белорусский-3", и получены трансгенные растения "картофеля, экспрессирущие ген белка оболочки или его антисмысловую РНК.

3. Подтверждена роль 5■-нетранслируемого лидера Х-вируса картофеля как усилителя экспрессии гетерологичных генов в растениях.

4. Установлено, что трансгенные растения, экспрессируюцие только мРНК БО и не аккумулирупцие вирусный капсидный белок, являются более устойчивыми к заражению У-вирусом картофеля по сравнению с трансгенными растениями, накапливающими эндогенный БО УВК.

5. Показана задержка в развитии симптомов вирусной инфекции в трансгенных растениях картофеля, экспрессирующих антисмысловую РНК гена БО У-вируса картофеля.

6. Получены клубни трансгенного картофеля, устойчивого к У-вирусу картофеля, которые могут использоваться для дальнейших полевых испытаний и селекции.

Список работ, опубликованных по тепе джсэртглии:

1. Соколова М.А., Пугин K.M., П'ульга O.A., Скрябин К.Г. - Получение трансгенных растения Nicotiana trbacum, экспрессируших ген белка оболочки Y-вируса картофеля. Тез.докл. i Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Путано, 1991 ,с.42.

2. Пугин М.М., Соколова М.А., Шульга O.A., Скрябин К.Г. - Влияние 5'-лидера РНК Х-вируса картофеля на экспрессии гена белка оболочки Y-зируса картофеля в трансгенаых растениях картофеля. Тез.докл. и Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993, с.41.

3. Соколова Т.А., Шульга O.A., Пуган U.U., Скрябин К.Г. - Получение трансгенных растений картофеля, устойчивых к Y-вирусу картофеля. Тез.- докл.конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология", Алма-Ата, 1993, с.121.

4. Пугин М.М., Соколова H.A., Шульга O.A., Сзфябин К.Г. - Влияние 5'-лидера Х-вируса картофеля на экспрессию гена белка оболочки Y-ВИруса КарТОфеЛЯ В ТраНСГеННЫХ растениях Solanum tuberosum. Молекулярная биология, 1994, т.28, вып.2, в печати.

5. Соколова H.A., Пугин М.М., Шульга O.A., Скрябин К.Г. - Получение трансгенных растений Solanum tuberosum, усТСТГЧИВЫХ К Y-ВИрусу картофеля. Молекулярная биология, 1994, т.28, вып.З, в печати.