Изучение трансгенных растений с гетерологичным геном, детерминирующим синтез двунитевой РНК

Коростылева, Татьяна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение трансгенных растений с гетерологичным геном, детерминирующим синтез двунитевой РНК
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение трансгенных растений с гетерологичным геном, детерминирующим синтез двунитевой РНК"

На правах рукописи

Коростылева Татьяна Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ С ГЕТЕРОЛОГИЧНЫМ ГЕНОМ, ДЕТЕРМИНИРУЮЩИМ СИНТЕЗ ДВУНИТЕВОЙ РНК

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

обязательный ¡платный

ЭКЗЕМПЛЯР

Работа выполнена в лаборатории генетики растений Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук Одинцова Татьяна Игоревна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Голденкова-Павлова Ирина Васильевна кандидат биологических наук Соловьев Александр Александрович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Кафедра генетики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «. .» ........ 2006г. в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01. при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095) 132 89 62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН. Автореферат разослан «....»_2006г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Полунина

J/f/ct

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Устойчивость к вирусным заболеваниям растений является одной из наиболее актуальных проблем современной генетики, биотехнологии и физиологии растений. Раскрытие сложных механизмов взаимодействия хозяина и патогена, процессов, приводящих к формированию иммунитета у растений, выделение генов, контролирующих разные этапы этих процессов - все это представляет не только теоретический, но и прикладной интерес. С применением методов генной инженерии удалось не только детально исследовать особенности физиологии вирусов растений, но и создать устойчивые к вирусным инфекциям формы: трансгенные растения с геном белка оболочки вирусов (Powell-Abel et al., 1986), геном транспортного белка (Malyshenko et al., 1993) и геном репликазы (Golemboski et al., 1990). Несмотря на определенные успехи и практические достижения в этой области, молекулярно-генетические процессы, отвечающие за формирование различных типов устойчивости изучены далеко не полностью. С 80-х годов прошлого века в поле научного интереса исследователей иммунитета растений попала двунитевая РНК. Было показано влияние двунитевой РНК, в том числе и синтетической (поли-l) на устойчивость растений к вирусам (Gat-Edelbaum et al., 1983; Бистрицкайте, 1986). Создание трансгенных растений, экспрессирующих антисмысловые последовательности вируса и обладающих устойчивостью к нему (как предполагалось, за счет образования дуплекса РНК с геномной РНК вируса) положило начало отдельной «антисмысловой» стратегии создания устойивости (Izant, Welntraub, 1984; Powell et al., 1989; Bejarno et al., 1992). В 1998-1999 г. В серии работ Гамильтон и Болкомб раскрыли механизм РНК-интерференции, показав ключевую роль рестрикции двунитевой РНК в ингибировании экспрессии генов, обладающих гомологией с последовательностью такой РНК (Hamilton A,J, Baulcombe D.C., 1999). Хотя нокаутная технология с использованием антисмысловых РНК при создании вирусоустойчивых растений нашла практическое применение еще до открытия молекулярной сути процессов, лежащих в ее основе, многие аспекты проявления РНК-интерференции у растений и ее влияние на экспрессию генома по настоящее время остаются неисследоваными. Поэтому нам представлялось интересным исследовать влияние эндогенно синтезируемой в растении протяженной двунитевой РНК, не имеющей гомологии с геномом растения и геномом вируса, на его устойчивость к вирусам. В качестве трансгенной кодирующей последовательности, экспрессирующей днРНК, для предотвращения эффекта замолкания генов растения был использован фрагмент бактериального гена. Цели работы:

Целью работы явилось изучение влияния гетерологичной конструкции, обеспечивающей в растении синтез двунитевой РНК, не несущей гомологии с геномами вирусов и растений, на устойчивость трансгенных растений к вирусным заболеваниям, а также исследование влияния ятпй гетврппогичнрй

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ гООбакт^З

вставки на морфофизиологические признаки однодольных и двудольных растений (Nicotiana tabacum и Triticum aestivum ).

Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

• получить путем агробактериальной трансформации трансгенные растения табака и пшеницы, несущие конструкцию, детерминирующую в растении синтез протяженной (0,35 тпн) двуцепочечной РНК;

■ провести изучение генетической стабильности данной вставки в трансгенных растениях;

• провести изучение вирусоустойчивости трансгенных растений табака к разным штаммам ВТМ;

• исследовать изменения в спектрах растворимых белков листьев трансгенных растений табака при инфицировании их вирусом;

• провести сравнительное исследование морфофизиологических признаков трансгенных растений с оценкой их наследуемости.

Научная новизна. Впервые показано влияние экспрессии вставки, детерминирующей синтез двунитевой РНК, не имеющей гомологии с геномами вируса и растений табака, на уровень устойчивости трансгенных растений к тобамовирусам. В инфицированных трансгенных растениях выявлен индуцируемый синтез двух новых, неизвестных полипептидов, предположительно имеющих отношение к системе антивирусной защиты растений. Также выявлено влияние такой вставки на протяжении поколений Т2-ТЗ на изменение отдельных морфофизиологических признаков трансгенных растений, не связанное с сомаклональной изменчивостью в результате культивирования in vitro.

Практическая ценность. Данные, представленные в работе, имеют практическую ценность для исследователей, занимающихся трансформацией растений, изучением экспрессии их генов с применением нокаутной технологии, основанной на синтезе двунитевых РНК. Практическая значимость работы состоит также в отработке методик трансформации растений, в первую очередь трансформации in planta с высокой эффективностью мягкой пшеницы, являющейся хозяйственно-ценной культурой.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на международном симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2004г.), межлабораторном семинаре «Молекулярные и клеточные основы генетических процессов» ИОГен РАН (2006г.).

Структура и обьем работы. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, выводы и список литературы. Диссертация изложена на ... страницах, содержит 8 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает.... наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ПО ГЛАВАМ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы. В первой части обзора рассмотрены основные стратегии создания трансгенных растений, устойчивых к вирусным заболеваниям, вторая часть посвящена функциям двунитевой РНК и особенностям РНК-интерференции в организме растений. ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований.

Штаммы бактерий и ппазмиды. Agrobacterium tumefaclens С158 Rif* , Esherichia со Ii K-12 TG1; плазмиды pSIR 42 (Смирнов, 1993), pGV 2260 (Andre, 1986), pRK 2013 (Лихтенштейн, 1988)

В качестве объекта трансформации были использованы следующие виды растений: табак Nicotiana tabacum cv. Samsun с генотипом пп (ген п обуславливает чувствительность к ВТМ по типу системного заболевания); мягкая пшеница Triticum aestivum L, линии Хакасская (2п=42).

Штаммы вируса табачной мозаики из коллекции лаборатории генетики растений ИОГен РАН: АТ-16 -аттенуированный слабопатогенный штамм; аукуба -сильнопатогенный штамм; А/22 - сильнопатогенный штамм; Агробактериальная трансформация растений табака проводили методом листовых дисков (Horsch et al., 1985) с использованием бинарного агробактериального вектора (Bevan, 1984). Регенеранты, укоренявшиеся в селективной среде подвергали дополнительной проверке на присутствие агробактерий. В условиях климакамеры "Fisons Fitotron 600Н" (Англия) -16 ч день, 24°С I 8 ч ночь, 20°С. у растений были получены семена путем самоопыления, с использованием изолирующих пергаментных колпаков.

Процедуру трансформации пшеницы проводили на кастрированных цветках при их опылении. На пестик принудительно опыленных цветов наносили суспензию ночной культуры А. tumefaclens С158 Rif" (pSIR42::pGV2260). В одной из повторностей опыта в среду для выращивания агробактерий добавлялся ацетосирингон до концентрации 200 мкМ. Колосья заключались в изолятор, семена полученные от растений Т0 высаживались для дальнейщего анализа. Тест на устойчивость к канамицину потомства трансформантов табака. Семена после стерилизации переносились в чашки с селективной питательной средой (соли по MS, Bi -1 мг/л, В2 -0,8 мг/л, сахароза -20 г/л , 0,8% агар), содержащей канамицин (Km) -100-150 мг/л. В случае пониженной всхожести после стерилизации проводили дополнительно стимуляцию прорастания семян в течение 1 часа следующим раствором : 2 % KNO3, гиббереловая кислота - 0,5 мг/л. Тест на устойчивость к канамицину потомства трансформантов пшеницы. Тест на устойчивость проводили на проростках пшеницы на стадии 3-4 листьев. На два верхних развернутых листа, поверхностно наносили р-р канамицина (2% сульфат канамицина, 0,2 % Twin 20) по 200 мкл на лист, распределяя по всей поверхности. Оценку проводили через 7-10 дней по окраске отрастающих верхних листьев.

Выделение нуклеиновых кислот.

Выделение плазмидной ДНК и геномной ДНК растений проводили по стандартным методикам (Maniatis et al., 1982; Дрейпер, 1991; Дорохов, 1997). Для выделения РНК применяли следующую методику (Chomczynski et al., 1987). nUP-амплификация.

Для детекции Т-ДНК использовали праймеры к 0,35тпн Hindlll-BamHI фрагменту pBR322: Ic - 5'GTCGCCATGATCGCGTAGTC3'; Не - 5'GCTTTAATGC GGTAGTTTAT3'.

При амплификации фрагмента из области ApR плазмиды pSIR42::pGV2260 (0,45 тпн) использовались следующие праймеры: Ampi 5'CGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGT3' , Ampli - S'TTGGGTGCACGAG TGGGTTACATCG 3

Гибридизация нуклеиновых кислот.

Гибридизация ДНК и РНК проводилась по стандартным методикам (Дрейпер, 1991; Херрингтон, 1999). В качестве зонда для ДНК-гибридизации использовали амплифицированный с праймеров (le, Ile) фрагмент плазмиды pSlR42, меченный биотином (био-11-dUTP) с реактивами и по протоколам фирмы «Силекс М» (Россия). Проявление проводили реактивами набора «Нерадиоактивное определение ДНК» этой же фирмы. РНК-дот-гибридизацию проводили на фильтре lmmob¡lon-Ny+ («Millipore»), в качестве зонда использовали Hindlll-фрагмент плазмиды pSIR42, меченный a-[32P]-dATP Исследование растений на вирусоустойчивость.

Исследование проводилась на трансгенных растениях табака поколения Тг, отселектированных на устойчивость к Km. Растения в возрасте 5-6 настоящих листьев инокулировали суспензией вируса табачной мозаики (0,01 мкг/мл 0,07М фосфатного буфера pH 7,8). Экспериментальные и контрольные группы состояли из 15-20 растений. Развитие заболевания оценивали по появлению мозаичных симптомов на листьях, учитывали время появления и степень выраженности симптомов. Биохимические изменения исследовали по спектрам водорастворимых белков листьев.

Экстракция белков листьев. Для экстракции использовали ткань (500 мг) верхних листьев, собранных с нескольких растений исследуемой группы. Ткань измельчали на холоду в буфере (0,5 M ацетат Na, 0,5 M сахароза, 0,3% Д-меркаптоэтанол, pH 6,8). Суспензию центрифугировали 25 мин при 12 тыс. об/мин и температуре 4°С, супернатант использовали для электрофоретического анализа. В экстракт добавляли коктейль ингибиторов протеаз для растительных клеток и тканей (р-р в DMSO, «Sigma»), 5мкл р-ра на 500 мкл белкового экстракта. Электрофорез растворимых белков листьев проводили с использованием неденатурирующей (по Дэвису) и денатурирующей (по методу Лэммли) систем разделения. Анализ белков.

Окрашенную зону белка вырезали из геля и гидролизовали трипсином in situ (Fraser et al., 1987). Пептиды элюировали 60% ацетонитрилом в 0,1% трифторуксусной кислоте, концентрировали и разделяли методом обращенно-фазовой хроматографии. Разделение триптических пептидов проводили на колонке Aquapore RP300 линейным градиентом концентрации ацетонитрила (0-50%) в 0.1% ТФУ. Секвенирование пептидов проводили на автоматическом секвенаторе фирмы Knauer (Германия) с автоматической детекцией фенилтиогидантоиновых производных аминокислот на ФТГ анализаторе. Статистическая обработка и компьютерный анализ.

Соответствие фактического расщепления теоретическому при наследовании устойчивости к канамицину оценивалось по критерию х1.

Достоверность различий по оцениваемым признакам между группами трансгенной и нетрансгенной растений оценивали, используя пакет программ статистического и биометрико-генетического анализа в растениеводстве и селекции AGROS, версия 2.10, 2000г. Поиск по банкам данных белковых и нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы BLAST 2.2.13. (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

1.1. Получение и исследование трансгенных растений табака.

В качестве источника Т-ДНК нами была использована плазмидный вектор р3^42, содержащий между 25-нуклеотидными Т-повторами последовательности двух генов, экспрессирующихся в растительной клетке: маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II (прМ) под контролем промотора гена нопалинсинтазы и рекомбинантный ген, обеспечивающий под контролем промотора 35Б вируса мозаики цветной капусты синтез двуцепочечной РНК (рис. 1). Данная плазмида была создана в лаборатории (Смирнов, 1993) на основе экспрессионного вектора рБТб (Смирнов, 1990) путем клонирования в него по сайту ВатН\ фрагмента рекомбинантной ДНК, содержащего протяженный инвертированный повтор. Последовательность повтора представляет собой дуплицированный НтсШ1-ВатН1-фрагмент гена устойчивости к тетрациклину плазмиды рВВ322 (350 п.н.).

BsmHI BomHI

Рисунок. 1 Функциональная структура Т-области плазмиды pSIR42:

RB, LB - правая и левая фланкирующие последовательности Т-ДНК; стрелками обозначены места посадки праймеров le и Ilc; Ampi и Ampli.

Хотя в качестве матрицы для синтеза дцРНК в растении при создании вектора использовалась последовательность бактериального происхождения, нами не исключалась возможность специфического взаимодействия днРНК с отдельными транскриптами генов растений, за счет их частичной гомологии. Для проверки возможности таких взаимодействий с нашей конструкцией был предпринят поиск гомологии последовательности инвертированного повтора с геномом растений с использованием программы BLAST (алгоритмы blastn, discontiguous megablast), по базам данных nr, est, refseq mrna. Хотя параметры поиска по длине гомологичной области были минимизированы (до 20 нуклеотидов), последовательностей, принадлежащих геномам пшеницы и табака обнаружено не было. Следовательно, экспрессия в трансгенных растениях двунитевой РНК, гомологичная фрагменту последовательности гена ТеР не должна вызывать замолкание собственных генов табака и пшеницы.

В результате трансформации нами было получено 10 независимых линий регенерантов табака, устойчивых к воздействию канамицина, прошедших процедуру контрселекции и проверку на отсутствие агробактерий. В качестве контрольных растений использовали регенеранты растений табака исходной

линии, не подвергавшиеся трансформации.

Проверка встраивания Т-ДНК проводилась молекулярными и генетическими методами. С индивидуальной ДНК растений "Л была проведена ПЦР-амплификация с праймерами 1с и 11с, а также отдельно с каждым из праймеров для подтверждения сохранения структуры инвертированного повтора. В амплификатах всех отобранных ранее канамицинустойчивых растений присутствовал фрагмент 0,35 т.п.н., соответствующий по длине фрагменту последовательности рВР322 из Т-области рЭ1К42 (рис. 2.А, рис 10). Гомология нуклеотидной последовательности этого фрагмента с последовательностью инвертированного повтора была подтверждена Саузерн блот гибридизацией с зондом, изготовленным на основе ВатИ\-фрагмента рЭ1Я42 (рис. 2.В.) По результатам анализа показано, что все 10 линий содержали Т-ДНК с последовательностью инвертированного повтора без делеций. Эффективность трансформации составила 23,3 %.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 тпн

Рисунок 2.

А - электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации ДНК растений табака с праймером 1с, 1,5 % агарозный гель. 1 -днк фага л, рестрицированная РэЛ, 11 - рестрицированная Н1пМ\, 2-7 амплификаты ДНК индивидуальных трансформантов Т1, 8 - контрольного табака, амплификат плазмиды р81К42,10- 0,5 мкг ДНК рв^ 42. В - Саузерн блот-гибридизация соответствующих продуктов амплификации (рис..2. А) с биотинилированным зондом из ВатН! фрагмента рБШ 42.

1.2. Изучение наследования трансгенной последовательности.

Характер наследования Т-ДНК оценивался по сегрегации сцепленного признака (устойчивость к канамицину) в потомстве трансгенных растений, полученном при самоопылении трансформантов Т, и Т2. У части линий семена, полученные от ^ оказались невсхожими (рис. 7). Полученные данные по линиям, обладающим всхожими семенами Т2, приведены в табл.1. От нескольких (3-5) растений Т2 каждой линии путем самоопыления были получены семена Т3, а с линиями Бр42 №9 и Эр42 №13 дополнительно были проведены анализирующие скрещивания. В целом, расщепление признаков в

потомстве Тз каждой линии соответствовало выдвинутым для Т2 гипотезам, однако линии Эр42 №2, Бр42 №9 и Бр42 №13 демонстрировали неоднозначные результаты, в потомстве единичных Т3-потомков этих линий наблюдалось отклонения от менделевского типа наследования, выражавшиеся в увеличении Км-неустойчивого класса (не представлено в автореферате). У линии Эр42 №9 выявлено присутствие последовательности агробактериального вектора (рис. 11).

Таким образом, было выявлено, что 7 линий (87% всхожих) несут единичную вставку Т-ДНК, 1 линия (13 % всхожих) - 2 независимых вставки. При этом 37 % всхожих линий (30 % всех линий) с данной вставкой проявляли нестабильную экспрессию трансгена (прЩ в потомстве Т2 и Тз.

Таблица 1. Результаты анализа генотипа трансгенных линий табака по признаку устойчивости к канамицину (на поколении Т2).

Трансгенная линия Кол-во проанализирова нных растений Кол-во зеленых проростков Количество желтых проростков Статистическая оценка расщепления

1 Эр42 №1 128 93 32 Х2з.1= 0,024

2 вр42 №2 193 147 46 Х2зи = 0,083

3 Эр42 №3 44 32 12 х2 3:1 = 0,121

4 Бр42 №4 162 129 33 Х2з:1 = 1,852

5 .. '#р42 №9 179 120 59 ; . - X2 3:1= 4,898 ; ■

6 Эр42 №13 162 152 10 X215:1= 0,002

7 Эр42 №14 105 80 25 Х23:1 = 0,079

8 8р42 №15 27 20 7 Х23:1 = 0,012

Критическое значение/2 при 5% уровне значимости равно 3,84 (для степени свободы = 1).

1.3. Исследование экспрессии РНК в транформантах табака.

Для определения экспрессии в растениях Т2 трансгенной дцРНК, нами были выделены препараты РНК суммарных усредненных проб листовой ткани из растений разных линий (для линии Эр42 №2 - и индивидуальных растений), используемых потом в эксперименте по изучению вирусоустойчивости. Был проведен анализ экспрессии интродуцированной последовательности методом РНК-дот-гибридизации. В качестве зонда была использована ДНК последовательности инвертированного повтора из Т-области плазмиды рЭ1Р42 (ВатН1 рестрикционный фрагмент). Данная последовательность в трансформированных растениях под контролем промотора 35Э СаМ\/ обеспечивает в растениях экспрессию днРНК.

По результатам проведенной гибридизации видно (рис. 3), что в пробах трансгенных растений присутствует РНК, гомологичная последовательности

инвертированного повтора плазмиды рБ^42. Это свидетельствует об экспрессии в трансгенных табаках поколения Т2 двуцепочечной РНК,

1, 1а - проба индивидуального растения линии Эр42 №2, по 2 и 20 мкг РНК соответственно,

2, 2а - суммарная проба растений линии Эр42 №

2, по 2 и 20мкг РНК,

3, За - суммарная проба растений линии Эр42 №

4, по 2 и 20мкг РНК,

4, 4а - «-» контроль, нетрансгенный табак, 2 и 20мкг РНК;

5, 5а,5в - «+» контроль, ДНК плазмиды рЭ1К42, по 0,001, 0,01 и 0,1 мкг.

Рисунок 3. Радиоавтограф результатов Нозерн-дот-гибридизации

образцов РНК, выделенных из трансгенных Табаков, с 32Р зондом, полученным из Н1псШ1- фрагмента плазмиды р8Ж42.

1.4. Исследование вирусоустойчивости трансгенных растений табака.

Исследования проводились на трансгенных растениях табака поколения Т2, отселектированных по признаку устойчивости к Кт. Изучали влияние вставки, экспрессирующей дцРНК, на уровень и характер устойчивости растений табака, чувствительного к ВТМ (генотип пп), а также биохимические изменения в этих растениях.

Использовались штаммы ВТМ, различающиеся по степени патогенности. После инокуляции растений вирусом регистрировалили динамику развития заболевания у разных экспериментальных групп. У зараженных трансгенных растений наблюдалось изменение сроков развития симптомов, а также изменение их характера. У трансгенных растений при заражении сильнопатогенными штаммами ВТМ (Л/22, аукуба) мозаика развивалась несколько позднее, чем у контрольных нетрансгенных рис. 4. (А и В): симптомы в группе трансгенных растений в среднем начинали проявляться на 7-й день после инфицирования, а не на 5-й, как в группе контрольных нетрансгенных. При инфицировании аттенуированным штаммом АТ-16 различий между опытными и контрольными растениями не наблюдалось (рис. 4, В). Характер проявления симптомов у трансгенных растений табака отличался от контрольных растений (рис. 4 а, б). При заражении трансгенных растенийштаммом Л/2г различия были менее выражены, а при заражении атеннуированным штаммом АТ-16 - различий в симптоматике заболевания не выявлено.

А. штамм Л/22

Б. штамм аукуба

В. штамм Л Г-7 6

—метр -о—тр 6р42-2 -Я-'Р 0р42-4

Рисунок 4. Динамика проявления симптомов заболевания на растениях табака при заражении разными штаммами ВТМ.

Оценивалась степень пораженное™ выборки в % ((число растений с симптомами / инокулированные растения) х100). Контроль - (нетр), линия Эр42 №2 - (тр 8р42-2), 8р42 №4 - (тр Эр42-4).

Рисунок 5. Симптомы, образующиеся после 4-х недель заражения штаммом ВТМ аукуба: А - верхние неинокулированные листья; В - общий вид пораженных растений, правый ряд - трансгенные растения.

Эти результаты позволили нам сделать вывод об увеличении устойчивости к заражению ВТМ у трансгенных растений табака, экспрессирующих двунитевую РНК. При этом наблюдалась дифференцированная реакция на разные штаммы.

1.5. Изучение спектра растворимых белков листьев.

Для изучения биохимических изменений в трансгенных растениях табака нами был использован электрофоретический анализ водорастворимых белков листьев в неденатурирующих условиях, а в случае необходимости определения молекулярной массы - в денатурирующих условиях по методу Лэммли, успешно применяемом для обнаружения белков, индуцирующихся при вирусной инфекции (РЯ-белков).

Анализ белковых экстрактов, полученных из здоровых, трансгенных и нетрансгенных растений, показал, что трансгеннные и контрольные растения не различаются по компонентному составу (рис.6.).

Рисунок. 6. Электрофоретическое разделение белков листьев табака в 10% полиакриламидном геле в присутствии ЭРв, линия Эр42 №2 :

1 - маркеры массы; 2,3 - здоровые неинфицированные растения, нетрансгенные и трансгенные; 4, 6, 8 - нетрансгенные растения, зараженные ВТМ, штамм аукуба, штамм А/22 , штамм АТ-16 , соответственно; 5, 7, 9 - трансгенные растения, зараженные ВТМ, штамм аукуба, штамм Л/22, штамм АТ-16, соответственно,

Для исследований изменений в белковых спектрах листьев в процессе развития инфекции у растений отбирались пробы на 3, 7 и 15 -й день после инфицирования вирусом. Изменения в компонентном составе были обнаружены в пробах, взятых на 7-ой день после заражения. При электрофоретическом исследовании в неденатурирующих условиях белков листьев растений Табаков, зараженных штаммом А/22 ВТМ, у трансгенных

растений были обнаружены два новых полипептида, не соответствовующих по элекгрофоретической подвижности ни одному из PR-белков, присутствующих в экстрактах инфицированных сверхчувствительных Табаков с некротической реакцией на ВТМ. Были определены молекулярные массы этих полипептидов - 25 и 30 кДа (рис. 6.). Обнаруженные полипептиды оказались крайне нестабильными, что, по-видимому, свидетельствует о том, что они являются индуцибельными короткоживущими белками. Следует также отметить, что в экстракте листьев трансгенных растений, пораженных штаммом А/22, белок оболочки ВТМ (17,6 кДа) содержался в значительно меньшем количестве, чем в нетрансгенном образце (рис. 6.), это свидетельствует об уменьшении накопления вирусных частиц в трансгенных растениях и повышенном уровне устойчивости этих растений. Поскольку компонент с молекулярной массой 30 кДа был преобладающим, именно он был подвергнут более детальному структурному анализу. На хроматограмме, полученной в результате разделения смеси пептидов после гидролиза этого белка in situ, удалось выявить 24 пика, 7 из которых преобладали в количественном отношении. Два из них (№6 и №18) был подвергнуты автоматическому секвенированию. N-концевые аминокислотные последовательности этих пептидов оказались следующими:

№ 6 Val-Leu-Pro-Val-Ala-Gln-GIrr, №18: Asp-Thr-Pro-lle-Gln-Ala-Phe.

Эти данные позволили осуществить поиск гомологичных последовательностей с помощью программы SRS-FastA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) в банках данных PIR и SWISSPROT. Оказалось, что пептид № 18 гомологичен (83,3 %) ксилоглюкан эндо-1,4-/?-D-глюканазе томата, содержащей 296 аминокислотных остатков (Okazawa et at., 1993). Среди гомологичных пептиду белков имелись также предшественники ксилоглюкан эндо-1 /hff-D-глюканазы арабидопсиса, однако степень гомологии в этом случае был ниже. Пептид № 6 обнаружил гомологию (66,7%) с глюкан эндо-1,3-Д-глюкозидазой сои длиной 315 аминокислотных остатка (Takeuchi et al., 1990). Среди найденных гомологичных белков не оказалось ни одного из известных белков табака, в том числе и PR-белков. Следует отметить, что белки, несущие гомологию с исследуемыми пептидами, относятся к одному функциональному семейству растительных р-эндоглюканаз, состоящему из 3-х групп (1,3-/?-глюканазы, 1,3-1,4-/?-гпюканазы и 1,4 -уЗ-глюканазы). Все они связаны с метаболизмом углеводных компонентов клеточной стенки: Биологические функции 1,3-^-глюканаз в высших растениях очень разнообразны и часть их связана с защитой от патогенов (Beffa et al., 1996). Большинство из них относится в группу так называемых PR-белков, индуцирующихся в растениях в ответ на заражение различными патогенами, в том числе и вирусными. Относительно недавно была показано, что одна из рл ,3-глюканаз, субстратом которой является каллоза, участвует в вирусном патогенезе, влияя на способность

растительной клетки пропускать вирусную РНК через каналы плазмодесм (Bûcher et al., 2001).

1.6. Исследование морфофизиологических характеристик трансформантов табака.

Для выявления возможных рецессивных генетических изменений, а также их наследуемости, оценка пров потомков.

По строению цветков и соцветий, а также п одилась на протяжении 3-х поколений (Т-гТз), при отборе трансгенных Km-устойчивых о срокам цветения трансгенные растения табака Ti, Т2 и Т3 не отличались от контрольной группы. Как видно из данных, представленных на рис. 7., в поколении Т2 у 90% трансгенных линий с данной вставкой наблюдались нарушения жизнеспособности растений, выраженные в пониженной всхожести семян, полученных при самоопылении трансформантов,, у 90% линий всхожесть семян Т? была не более 5%. У 8 из 10 линий всхожесть семян

О без обработки ГК □ после обработки ГК

Рисунок 7. Всхожесть семян Тг разных трансгенных линий табака (% от высеянных семян).

□ поколение Т2 р поколение Tj

Рисунок 8. Наследуемость уровня всхожести семян.

восстанавливалась при обработке их раствором гиббереловой кислоты. Всхожесть семян, полученных от этих растений была в среднем на уровне контрольных нетрансгенных (рис. 8). То есть нарушения всхожести не являлись наследуемыми.

При наблюдении за развитием трансгенных регенерантов Т1 не было отмечено визуально заметных отличий от морфотипа контрольных регенерантов. Однако среди потомков Т2-Т3 трансформантов нами наблюдались следующие множественные морфологические отклонения, проявляющиеся на разных стадиях развития:

- отрицательный гравитропизм корней у проростков;

- снижение апикального доминирования (образование боковых побегов

на ранних стадиях развития);

- появление аномальных форм при проращивании в культуральных условиях (рис.9.)

- изменение формы листовой пластинки (сужение и вытягивание);

Рис. 9. Проростки табака Т2 линии Зр42 №14 с аномальным фенотипом, отобранные на среде с Кт (150 мг/л). А -1 неделя после пересадки на среду без Кт: норма - трансгенный проросток с нормальным фенотипом, м -проростки с мутантным фенотипом; В - через 6 недель.

Таблица 2. Морфологические отклонения, встречающиеся у трансформантов табака Т2- Т3. ¡Цветом выделены данные линий, имеющие статистически значимые отклонения от контроля по по данному признаку.

Линия Тип наследования Т-ДНК Изменения формы листа,встреча емость (+/-) Образование боковых побегов (% от выборки] Отрицательный гравитропизм корней Потомки с аномальным фенотипом,% выборки

т2 Тз т2 Тз т2 Тз Т2 Тз

контроль - - 7,1 0 - - - -

Эр42 №1 моногенное - - 0 Не иссл - - - 5,43-0,48

вр42 №2 моногенное - - 12,5 Не иссл - - - -

Эр42 №3 моногенное + - 0 Не иссл - - - -

Эр42 №4 моногенное - - 25 Не иссл + - 4,65 4,12-0,71

Бр42 №9 моногенное - - 80 0 - + - +

Эр42№13 дигенное + - 0 Не иссл - + - -

вр42 №14 моногенное - - 33 0 + - 3,75 2,06

Эр42 №15 моногенное - - 67 7,1 - - 1,17

Следует заметить, что все отклонения, за исключением случаев снижения апикального доминирования, не выявлялись в группе нетрансгенных растений (табл. 2). Но по этому признаку показано, что частота появления растений с увеличенным боковым побегообразованием в трансгенных линиях Бр42 №9 и Эр42 №15 статистически значимо выше, чем в нетрансгенной группе (Р >0,05). Снижение апикального доминирования не может быть результатом стимуляции семян гиббереловой кислотой, так как в норме у табака обработка ею приводит к повышению апикального доминирования и подавлению образования боковых побегов (Гребинский С.О., 1961). У некоторых линий (Бр42 №9, вр42 №4, Эр42 №14) наблюдались изменения разного типа одновременно (табл. 2). Ненаследуемость всех наблюдаемых морфологических изменений в следующем поколениии отклоняет предположения как об их мутационном происхождении (в результате инсерции Т-ДНК), так и об их сомаклональной природе, и свидетельствует скорее об их эпигенетической природе. Обращает на себя внимание тот факт, что каждое морфологическое отклонение выявляется не у одной линии, а сразу у нескольких линий, проявляясь в разных поколениях. Однотипность наблюдаемых изменений предполагает воздействие на растения некоторого общего фактора, которым, по-видимому, является экспрессия трансгенной вставки.

2. Получение и исследование трансгенных растений пшеницы. 2.1. Получение трансгенных растений.

Применяемая нами методика трансформации пшеницы требовала использования достаточно большой выборки реципиентных растений. Проблему составлял и первичный отбор трансформантов, поскольку не существовало уверенности в корректной экспрессии маркерного гена npt в геноме пшеницы. Была применена ступенчатая система отбора: растения были объединены в группы, на первом этапе проведен анализ суммарных проб ДНК группы проростков (10-12 растений в группе) методом Саузерн-дот-гибридизации с [32Р] - меченным зондом, полученным из ДНК плазмиды рБИЗ 42., отбор «+» групп и процедура ПЦР-амплификации с пробами ДНК индивидуальных растений на заключительном этапе. Опыт был проведен в двух вариантах.

Так, в первом варианте опыта от 100 растений, подвергшихся процедуре трансформации в условиях теплицы, было получено 66 зерен (табл. 3). С «+» пробами для дополнительной проверки была проведена ПЦР-амплификация с праймерами 1с и Не, подтвердившая присутствие трансгенного фрагмента (рис.10). В конечном итоге нами было получено 11 растений, амплификаты ДНК которых показали присутствие 0,35 тпн фрагмента, от них путем самоопыления (с использованием изоляторов) были получены зерна следующего поколения.

Во втором варианте эксперимента, который проводился в полевых условиях, для увеличения вирулентности агробактерий использовалась стимуляция ацетосирингоном. Выращенные из зерен растения были проанализированы на

Рисунок. 10. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации ДНК растений пшеницы и табака с праймерами le и Ile, 2% агарозный гель.

1-5 пробы трансформированной пшеницы Ti групп 1, 2, 3, 5, 6; 6- проба трансгенного гибридного табака (Смирнов, 1993); 7 - проба контрольной пшеницы сорта «Хакасская»; 8-10 - пробы табака Т0 Sp42 №1, №3, №13; 11- проба контрольного табака сорта Samsun, 12 -ДНК фага ЛI Pstl

присутствие Т-ДНК по схеме, описанной выше, за исключением того, что для отбора использовали не Саузерн-дот-гибридизацию, а ПЦР-анализ. В результате суммарно в двух вариантах опыта было получено 80 линий трансформантов ТУ

2.2. Наследование трансгенной вставки.

Были проанализированы потомства Тг 47 (8+39) линий со всхожими семенами из 80 первичных трансформантов путем проведения ПЦР-анализа с праймерами le и Не, или только с праймером le на сохранение трансгенной вставки в виде инвертированного повтора. Исследуемые линии различались по количеству семян, полученных от растений Т0 - от 3 до 31 зерновки. Образцы, в которых искомый фрагмент не амплифицировался, подвергались повторной проверке для избежания выбраковки из-за случайных причин. Из 47 исследованных по индивидуальным пробам линий у 38 (7+31) линий все исследованные потомки несли трансгенную вставку. Расщепление в потомстве по признаку наличие/отсутствие трансгенного фрагмента обнаружили 8 (1+7) линий, была выявлена единственная линия, с18р6, у которой не наблюдалось сохранения вставки в Т2. Отдельно следует отметить отсутствие расщепления в потомстве у большей части проанализированной выборки. Отсутствие расщепления в случае линий с малочисленным потомством можно объяснить вероятностными причинами, при этом следует помнить, что вероятность выщепления потомков без трансгена в небольшой выборке значительно уменьшается у линий с двумя и более независимыми вставками.

2.3. Анализ растений на отсутствие агробактерий.

Поскольку в ряде работ сообщалось, что при агробактериальной трансформации in vitro и in planta существует возможность сохранения агробактерий в межклеточном пространстве растительных тканей, у части выборки трансформантов был проведен анализ на присутствие

агробактериапьного вектора. Для этого использовали следующий подход: присутствие агробактерий в предполагаемом трансформанте определялось по наличию в его ДНК-пробе последовательностей Ti-плазмиды, находящихся вне области Т-ДНК. Были подобраны 25-нуклеотидные праймеры Ampi и Ampli к последовательности гена устойчивости к ампициллину, локализованного в pSIR42 вне области Т-ДНК (рис. 1), длина амплификата с этих праймеров составляет 0,45 тпн. Последовательность, гомологичнную гену ApR (фрагмент

1 2345 6789 10 тпн

Рис. 11. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации ДНК с праймерами Ampi и Ampll, 1,6 % агарозный гель. 1,10 - ДНК фага Л, рестрицированная Hind\\\\ 2,3,4 - пробы табака трансгенных линий Sp42 №4, №9, №14; 5 -контрольная нетрансформированная пшеница; 6,7 - пробы пшеницы Т2, линии с28р4 и с28р5; 8 - проба плазмиды pSIR42; 9 - проба без ДНК.

0,45 тпн) была обнаружена у Зх линий пшеницы из 11 исследованных линий, проверенных ранее на присутствие инвертированного повтора, а также у одной линии табака (Рис. 11).

Однако при интеграции Т-ДНК в геном хозяина с довольно высокой частотой происходит встраивание прилегающих к ней векторных последовательностей (Филиппенко и др., 2000), поэтому делать однозначный вывод о присутствии агробактерий на основании полученных данных не вполне корректно. Но растения, пробы которых не дают сигнала на ApR последовательность, можно считать свободными от агробактериального вектора. Следовательно, как минимум у 8 растений (72,7 % исследованной группы) амплификация целевого гена шла с геномной ДНК растения.

2.4. Проверка устойчивости к канамицину.

Для проверки активности гена nptll, сцепленнного с трансгенной последовательностью, нами был проведен физиологический тест на устойчивость к канамицину. Исследовали потомства Т2 5 линий, у каждого растения наличие вставки проверялось ПЦР-анализом. Было выявлено, что желтый (неустойчивый) фенотип проявлялся как у нетрансгенных, так и у трансгенных потомков, в то время как зеленый фенотип (устойчивый) проявлялся только у трансгенных Это может объясняться нестабильностью экспрессии гена nptll в составе Т-ДНК, встроенной в геном пшеницы.

2.5. Эффективность трансформации пшеницы.

Трансформация злаков до настоящего времени остается достаточно сложным и трудоемким процессом. Методики трансформации растений in planta

лишены сложности культуральных процедур, успешно применяются на многих культурах (Feldmann and Marks, 1987; Clough and Bent, 1998; Ye G.N. et al, 1999; Bent, 2000). Для пшеницы методика in planta при оплодотворении была впервые применена группой немецких исследователей (Hess et al, 1990). Трансформация обеспечивалась внесением суспензиии агробактерий в колоски пшеницы в момент созревания пыльцы.

Наши данные по трансформации пшеницы in planta суммированы в таблице 3, Эффективность трансформации мы оценивали по числу линий, сохранивших трансгенную вставку в растениях поколения Т2. Наблюдаемая значительная разница в числе трансформантов между поколениями Ti и Т2 в значительной степени обусловлена невсхожестью семян Т2 , полученных от ряда «+»растений Ti - 33 (3+30). Из числа трансформантов мы также исключили линии, обнаруживающие последовательность векторной плазмиды pSIR42, не принадлежащую Т-области (3 линии). В конечном результате она составила 0,55 % в первом варианте опыта и 2,91 % во втором, с применением ацетосирингона. Наблюдаемое увеличение эффективности трансформации (табл. 3), по-видимому, объясняется тем,

Таблица 3. Результаты трансформации пшеницы.

вариа нты опыта число обработаны ых завязей число завязавши хся зерен % эавязы вания кол-во растений Ti с «+» сигналом число линий Т2 с «+» сигналом % трансформ ации

1 2000 66 3 11 8 0,55

2 1200 254 20,8 69 35 2, 91

что результативность примененной методики в большей степени зависит от условий при завязывания семян, чем от применения дополнительного стимулятора в виде ацетосирингона.

Эффективность агробактериальной трансформации in planta, проведенной по нашей методике, оказалась выше, чем описано в литературе для пшеницы (Hessetal, 1990).

2.6. Изменения признаков у трансформантов пшеницы Т2.

Изменения признаков трансформантов, обусловленные активностью перенесенных генов, часто, при доминантности генов проявляются уже в первом поколении трансформантов - T1t при использовании методик трансформации in planta, морфологические изменения, обусловленные мутациями, выявляются на растениях Т2 поколения. Визуально трансформанты пшеницы Ti не отличались от нетрансгенных растений контрольной группы. Однако известно, что большинство мутаций, связанных с инсерцией Т-ДНК, являются рецессивными и фенотипически проявляются только при гомозиготном статусе растения., В Т2 мы столкнулись с невсхожестью семян (41,25% всех «+» линий Ti, при 71,66% всхожести у контроля). Наблюдая за развитием растений поколения Т2, мы не выявили

О - Н N И П Р) СЧСОИПОООЯС^П

иииООииООО

■-средние значения признака у трансгенных линий

СИ; - средние значения признака у контрольной группы

□ - значения стандартного отклонения

И. средние значения признака в объединенном выборке трансгенов

Общее

Варианты

Ошибка

168.269 86 86.990 18 81.278 68

тэ

4.8328 1.1953

Средняя по опыту = 6.011

Стандартная ошибка = 0.523

Относительная ошибка = 8.693%

Средневзвешенная повторность = 4.377 Р-критерий Фишера = 4.043*

НСР =1.474

Рисунок 12. Изменчивость по признаку длина главного колоса у Т2.

А - диаграмма разброса средних значений признака по выборке, * - линии, значимо отличающиеся по критерию Дункана; Б - таблица дисперсионного анализа данных по признаку: *- различия значимы, ээ - сумма квадратов, сК - число степеней свободы, те - средний квадрат, НСР-наименьшая существенная разность

ББ df тэ Средняя по опыту =19.115

Стандартная ошибка = 3.250

Общее 8060.851 86 Относительная ошибка =17.005%

Варианты 4686.386 17 275.6698 Средневзвешенная повторность = 4.629 Ошибка 3374.464 69 48.9053 Р-критерий Фишера = 5.637*

НСР = 9.166

Рисунок 13. Изменчивость по признаку число зерен на главном колосе у Т2. А - диаграмма разброса средних значений признака по выборке; Б - таблица дисперсионного анализа.

вэ сК

Общее

Варианты

Ошибка

4090.595 3126.845 963.750

86 18 68

тэ

173.7136 14.1728

Средняя по опыту =14.648

Стандартная ошибка = 1.798

Относительная ошибка =12.273%

Средневзвешенная повторность = 4.386 Р-критерий Фишера =12.257*

НСР = 5.069

Рисунок 14. Изменчивость по признаку средний вес зерновки у Та.

А - диаграмма разброса средних значений признака по выборке; Б - таблица дисперсионного анализа.

Общее

Варианты

Ошибка

Эв сК

26.900 10.744 16.156

89 18 71

те

0.5969 0.2275

Средняя по опыту = 1.300

Стандартная ошибка = 0.224

Относительная ошибка =17.213%

Средневзвешенная повторность = 4.544 Р-критерий Фишера = 2.623*

НСР = 0.630

Рисунок 15. Изменчивость по признаку продуктивная кустистость у трансформантов Тг разных линий. А - диаграмма разброса средних значений признака по выборке; Б - таблица дисперсионного анализа.

явных морфологических отклонений. Однако в трансгенной группе было отмечено увеличение размаха изменчивости по некоторым количественным признакам, в первую очередь по продуктивному кущению. Для проверки неслучайности наблюдаемых различий, был проведен однофакторный дисперсионный анализ с использованием метода неорганизованных повторений и критерия Дункана для оценки разнородности групп. Оценивали изменчивость по группе признаков, связанных с продуктивностью растений, таких как: 1) продуктивное кущение (число колосьев на растение), 2)длина главного колоса, 3) число колосков в колосе, 4) число зерен на главном колосе, 5) средний вес зерновки.

В эксперименте было проанализировано потомство 18 независимых трансгенных линий. От каждой линии высаживали по 5-10 зерен. Контрольная группа состояла из 20-ти растений пшеницы сорта «Хакасская». Для каждой линии проводили ПЦР-анализ для подтверждения присутствия трансгенной вставки и выявления расщепления в потомстве Тг. Результаты исследования представлены на рис. 12-15 (кроме признака число колосков на колосе). По всем признакам у трансгенных растений выявлены следующие закономерности:

• изменение средних значений признаков (объединенных данных по всем линиям) по сравнению с контрольной группой при увеличении по ним стандартных отклонений, в разной степени по каждому признаку. За исключением признака число колосков на колос (не представлено в автореферате), разница средних значений признаков у трансгенной выборки и нетрансгенной значительно превышает 5% уровень случайной ошибки. По одному из признаков (продуктивное кущение) у трансформантов наблюдалось увеличение средних значений, по остальным четырем - их снижение.

• значительный разброс частных средних по каждому признаку между линиями независимых трансформантов.

Было показано, что по каждому из признаков группа трансгенных растений (потомства Т1 ряда линий) статистически значимо отличается от растений контрольной группы, значения Р- критерия выше критических для данных степеней свободы. Сводные данные представлены в табл.4.

Таблица 4. Результаты дисперсионного анализа различий потомств Т2 трансгенных линий от контрольной группы по признакам, связанным с продуктивностью.

Признаки Относи тельная ошибка, % Число степеней свободы Значение ?-критерия % линий, отличающихся от контроля

Продуктивная кустистость 17,23 18/89 2,623 16,17

Длина главного колоса 8,69 18/86 34,043 11,1

Число колосков на колосе 4,21 18/115 7,118 27,8

Число зерен на главном колосе 17,00 18/86 5,637 33,3

Средняя масса зерновки 12,27 18/86 12,257 61,1

Однотипность изменений, наблюдавшихся у разных линий, исключала инсерционный мутагенез. Для проверки влияния возможно сохранившихся агробактерий на изменение признаков пшеницы с группой растений был проведен ПЦР-анализ на присутствие векторной последовательности (рис. 11). В линиях, демонстрировавших отклонения, не обнаружено присутствия агробактериальной последовательности, за исключением линии с28р5. Для проверки наследуемости изменений исследовали потомства Т3 у 6-ти линий с наиболее выраженными отклонениями по 4 признакам. От каждой линии было высажено по 5-6 зерен, контрольная группа состояла из 18 растений. Выращенные потомки Т3 оценивались по тем же параметрам, что и родительские растения Т2. По результатам ПЦР-амплификации индивидуальной ДНК растений с праймером 1с была проведена селекция на сохранение вставки и отбраковка нетрансгенных экземпляров. Дисперсионный анализ данных, полученных по поколению Тз, показал, что из всех признаков достоверные различия между трансгенами Т3 и контрольной группой выявляются только по признаку продуктивная кустистость (увеличен у трансгенных линий с повышенным кущением в Т1). Таким образом, из всех отклонений наблюдавшихся в Т2, наследовались только изменения продуктивной кустистости.

Заключение

В результате проведенных экспериментов были получены 8 трансгенных линий табака и 43 линии трансгенной пшеницы, стабильно сохраняющие на протяжении 3-х поколений (до Т2) конструкцию, несущую экспрессируемую последовательность бактериального происхождения в виде протяженного инвертированного повтором. Данная конструкция обеспечивает синтез в трансгенных растениях РНК, имеющую шпилечную, двунитевую структуру, что было показано ранее (Смирнов и др.,1993), а также подтверждено в нашем эксперименте с трансгенными растениями табака.

Как известно, двунитевая РНК, экспрессируемая чужеродной последовательностью, вызывает в организме растений инициацию процессов РНК-интерференции, приводящих к выключению активности (на уровне РНК) как введенного гена, так и гомологичных ему генов хозяина. Нами было выявлено повышение уровня устойчивости к ВТМ у трансгенных растений табака разных линий, экспрессирующих днРНК, выражавшееся в задержке развития заболевания у инфицированных растений, изменения характера симптомов, а при заражении штаммом ВТМ N2* - уменьшении накопления белка оболочки вируса. Наблюдаемое у трансгенного табака повышение уровня устойчивости к вирусу нельзя отнести за счет интерферирующего действия днРНК, так как ее нуклеотидная последовательность не имеет гомологии с ВТМ. Можно предположить, что

конститутивный синтез днРНК в растении, индуцируя начальные стадии PTGS/PHK-интерференции, активирует и ряд участвующих в нем белковых факторов (или увеличивает их экспрессию). Их активное состояние, повышенный уровень содержания этих факторов в трансгенных растениях в момент начальных событий инфекции может обеспечивать наблюдаемое повышение уровня устойчивости.

Нами были выявлены неизвестные полипептиды, с молекулярной массой 25 и 30 Kfla, синтезирующиеся de novo в трансгенных растениях при вирусной инфекции. Проведенное исследование полипептида массой 30 кДа позволило определить аминокислотную последовательность фрагмента молекулы и выявить его гомологию с растительными Д-зкдоглюканазаш. Можно предположить, что индуцированный инфекцией в трансгенных растениях белок с молекулярной массой ЗОкДа является новым неизвестным представителем семейства 0-эндоглюканаз, в регуляции экспрессии которого участвует днРНК. Видимо, активация его синтеза зависит не только от присутствия днРНК, но требует участия некоторого вирусного фактора, т. к. данный белок обнаруживался только в зараженных трансгенных растениях. Это говорит о том, что его функции в растении, по-видимому, связаны с защитой или патогенезом. При этом следует отметить, что индукция этой /?-эндоглюканазы происходит не под контролем гена А/, как у известных глюканаз из группы PR-белков.

На двух видах растений - табаке и пшенице, на независимо полученных линиях, наблюдались множественные изменения морфологических, физиологических и количественных признаков, большинство из которых оказались ненаследуемыми. Использование способа трансформации in planta исключает обьяснения, связанные с сомаклональной изменчивостью (как результат культивирования организма в условиях in vitro). Сходство наблюдаемых нами отклонений у разных видов, повторяемость однотипных отклонений в разных линиях, (повышенное боковое побегообразование у Табаков и повышенная продуктивная кустистость у пшеницы; пониженная всхожесть семян, полученных от Ti) при разных способах трансформации указывает на роль общего фактора - экспрессии трансгенной вставки. Мы считаем, что наблюдаемые отклонения связаны с синтезом двунитевой РНК. Полученные нами данные по множественным морфофизиологическим отклонениям и нарушению всхожести семян у трансгенных растений мы связываем с неспецифическими влиянием процессов сайленсинга, запускаемых экспрессируемой в растениях дцРНК. С начала использования антисенс-технологии для изучения функций генов и решения прикладных задач достаточно регулярно поступают сообщения о нарушениях у нокаутных трансгенных растений морфологии, об отклонениях по признакам, связанным с генеративной сферой, с продуктивностью (Поройко и др., 2000; Xiao et al., 2003; De Ronde, 2004). Следует отметить, y растений существуют белковые факторы, участвующие в процессах РНК-интерференции, узнающие днРНК и способные влиять на морфогенез растений (Lu С., 2000; Vazquez F., 2004).

В заключение можно сказать, что по-видимому, при планировании исследований растительных обьектов с использованием антисенс-методов, как и для таких экспериментов на животных, необходимо минимизирование длины двунитевой РНК во избежание нежелательных вторичных эффектов. Также нежелательно использование конститутивных промоторов, конструкций в виде инвертированных повторов, обеспечивающих синтез чужеродной днРНК на эмбриональных и ранних стадиях развития растений.

Выводы:

1. Получены трансгенные растения табака Nicotiana tabacum cv. Samsun (8 линий) и трансгенной пшеницы Triticum aestivum L. (43 линии) несущие гетерологичную последовательность бактериального происхождения, организованную в виде инвертированного повтора и детерминирующую в растении синтез двунитевой РНК. Показано, что трансгенные растения табака и пшеницы сохраняют данную вставку на протяжении трех поколений (ТГТ3). На трансгенных растениях табака поколении Т2 показана экспрессия двунитевой РНК.

2. Впервые показано, что в трансгенных растениях табака с чувствительным к ВТМ генотипом, экспрессирующих гетерологичную двунитевую РНК, не несущую гомологии с геномом вируса, повышен уровень устойчивости при поражении ВТМ. Проявление устойчивости зависит от степени патогенности штамма ВТМ, при заражении слабопатогенным штаммом изменения уровня устойчивости не наблюдается.

3. Показано, что изменение уровня устойчивости трансгенных растений табака при инфицировании штаммом ВТМ N22 сопровождается синтезом cfe novo полипептидов с молекулярной массой 25 и 30 кДа, индуцирующихся до формирования выраженных симптомов заболевания.

4. Проведено автоматическое секвенирование аминокислотных последовательностей триптических пептидов белка с молекулярной массой 30 «Да. Компьютерным анализом установлена его гомология с ферментами семейства /?-эндоглюканаз растений. Гомологии с известными PR-белками растений рода Nicotiana не выявлено.

5. У потомства трансформантов поколений Т2 и Т3 выявлены множественные изменения как морфологических, так и количественных признаков, связанных с продуктивностью. У трансгенных растений табака (90 % линий) и пшеницы (41,25 % линий) показано нарушение всхожести семян, полученных от растений поколения Tt. Все изменения, кроме повышения продуктивного кущения у пшеницы, не являются наследуемыми. Для обоих видов наблюдаемые изменения, по - видимому, обусловлены экспрессией двунитевой РНК в растениях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Пухальский В.А., Смирнов С.П., Коростылева Т.В., Билинская E.H., Елисеева A.A. Генетическая трансформация мягкой пшеницы (Tríticum aestivum L.) с помощью Agrobacterium tumefaclens II Генетика. 1996. T 32. №.11. С. 1696-1500.

2. Коростылева Т.В., Петрова О.С., Андреева Э.Н., Одинцова Т.И., Смирнов С.П., Пухальский В.А. Устойчивость к ВТМ трансгенных растений табака, продуцирующих двунитевую РНК. Тезисы докладов VII международной конференции «Биология клеток растений In vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Москва, 1997. С. 268-269

3. Пухальский В.А., Смирнов С.П., Коростылева Т.В., Билинская E.H., Елисеева A.A. Генетическая трансформация мягкой пшеницы. Тезисы докладов VII международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Москва, 1997. С. 298299.

4. Коростылева Т.В., Одинцова Т.И., Козловская Г.В., Пухальский В.А. Исследование белков листьев трансгенных растений табака, экспрессирующих двунитевую РНК, при вирусной инфекции // Генетика. 2004. Т. 40. № 4. С. 531-537.

5. Korostyleva T.V., Kozlovskaya G.V., Pukhalskiy V.A. Morphogenetic changes in transgenic plants bearing the insertion expressing double stranding RNA. Сборник материалов международного симпозиума «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности». Москва, 2004. С. 13.

6. Korostyleva T.V., Kozlovskaia G.V., Pukhalskiy V.A. The alteration in several yield-contributing traits in transgenic wheat II Annual Wheat Newsletters. 2005. v. 51. p. 151-152.

¡Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510 от01.12.99 г. Подписано к печати 04.09,2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 579. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

ttesOfJL

/лг//

»218 M

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коростылева, Татьяна Викторовна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Подходы к изучению и созданию устойчивости.

Искусственно детерминированная устойчивость растений к вирусам. ^

1.1.1. Устойчивость, обусловленная встраиванием генов вирусного происхождения (pathogene-derived resistance). 10 1.1.1.1 Устойчивость, детерминированная встраиванием гена белка оболочки вируса.

1.1.1.2. Устойчивость, обеспечиваемая встраиванием гена репликазы.

1.1.1.3. Устойчивость, определяемая встраиванием гена транспортного белка.

1.1.1.4. Введение в геном растений вирусных нуклеотидных последовательностей.

1.1.1.5. Проблемы, связанные с использованием PDR-трансгенов, и перспективные направления PDR-защиты растений.

1.1.2. Устойчивость, основанная на использовании механизмов замолкания.

1.1.3. Создание устойчивости с использованием генов растений.

1.1.4. Устойчивость, обеспечиваемая встраиванием гетерологичных, «экзотических» генов.

1.1.4.1. Введение генов белков, инактивирующих рибосомы.

1.1.4.2. Введение генов нуклеаз.

1.1.4.3. Использование генов иммунной системы животных.

1.1.4.3.а. Введение генов интерферонов.

1.1.4.3.Ь Введение компонентов 2-5А системы.

1.1.4.З.С. Введение генов, кодирущие антитела.

1.2. Двунитевая РНК в организме животных и растений.

1.2.1. Важнейшие свойства PTGS.

1.2.2. Общий механизм PTGS.

1.2.3. РНК-зависимое метилирование ДНК и транскрипционное умолкание генов.

1.2.4. Микро РНК (miRNA) растений.

1.2.4.1. Происхождение и структура miRNA.

1.2.4.2. Механизм действия и функции микроРНК.

1.2.5. Генетический контроль процессов PTGS /РНК-интерференции и связанного с ними метилирования у растений.

1.2.6. Проблемы неспецифичности действия дцРНК.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Штаммы бактерий.

2.2. Плазмиды.

2.3. Растения.

2.4. Штаммы вируса табачной мозаики.

2.5. Ростовые среды.

2.6. Получение бинарного агробактериального вектора.

2.7. Получение трансгенных растений.

2.7.1. Трансформация табака.

2.7.2. Процедура трансформации пшеницы.

2.7.3. Отбор трансгенных растений табак, устойчивых к канамицину.^

2.7.4. Тестирование на устойчивость к канамицину потомства трансформантов пшеницы.^

2.8. Молекулярно-биохимические исследования.

2.8.1. Выделение ДНК и РНК из растительных тканей.

2.8.2. ПЦР.

2.8.3. Саузерн и Нозерн гибридизация.

2.9. Исследование растений на вирусоустойчивость.

2.9.1. Процедура заражения.

2.9.2. Оценка устойчивости.

2.9.3. Экстракция белков листьев.

2.9.4. Электрофорез растворимых белков листьев.

2.10. Анализ белков.

2.10.1. Гидролиз белка.

2.10.2. ВЭЖХ триптических пептидов.

2.10.3. Секвенирование пептидов.

2.11. Статистическая обработка и компьютерный анализ.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Трансформация растений табака и исследование трансгенных растений табака.

3.1.1. Характеристика Т-ДНК экспрессионноговектора.

3.1.2. Получение трансгенных растений табака.

3.1.3. Наследование трансгенной вставки.

3.2. Исследование вирусоустойчивости трансгенных растений табака.

3.2.1. Изучение фитопатологических характеристик трансгенных растений.

3.2.2. Изучение спектра растворимых белков.

3.3. Исследование морфофизиологических характеристик трансформантов табака.

3.4. Трансформация пшеницы.

3.4.1. Выделение трансформантов пшеницы.

3.4.2. Наследование трансгенной вставки.

3.4.3. Анализ на отсутствие агробактерий.

3.4.4. Тестирование на устойчивость к канамицину.

3.4.5. Эффективность трансформации пшеницы.

3.4.6. Изменения признаков у трансформантов пшеницы Т2.

3.4.7. Наследуемость изменения признаков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение трансгенных растений с гетерологичным геном, детерминирующим синтез двунитевой РНК"

Устойчивость к вирусным заболеваниям растений является одной из наиболее актуальных проблем современной генетики, биотехнологии и физиологии растений. Раскрытие сложных механизмов взаимодействия хозяина и патогена, процессов, приводящих к формированию иммунитета у растений, выделение генов, контролирующих разные этапы этих процессов - все это представляет не только теоретический, но и прикладной интерес. С применением методов генной инженерии удалось не только детально исследовать особенности физиологии вирусов растений, но и создать устойчивые к вирусным инфекциям формы: трансгенные растения, экспедирующие ген белка оболочки вирусов

Powell-Abel et al., 1986), геном транспортного белка (Malyshenko et al., 1993) и у генрЦ репликазы (Golemboski et al., 1990). Несмотря на успехи и практические достижения в этой области, молекулярно-генетические процессы, отвечающие за формирование различных типов устойчивости, изучены далеко не полностью. С 80-х годов прошлого века в поле научного интереса исследователей иммунитета растений попала двунитевая РНК. Было показано, что двунитевая РЖ, в том числе и синтетическая (поли-I) участвует в формировании устойчивости растений к вирусам (Gat-Edelbaum et al., 1983; Бистрицкайте, 1986). Создание трансгенных растений, экспрессирующих антисмысловые последовательности вируса и обладающих устойчивостью к нему (как предполагалось, за счет образования дуплекса РНК с геномной РНК вируса) положило начало отдельной «антисмысловой» стратегии создания устойчивости (Izant, Weintraub, 1984; Powell et al., 1989; Bejarno et al., 1992). В 1998-1999 г. В серии работ Гамильтон и Болкомб раскрыли механизм РНК-интерференции (Hamilton A.J, Baulcombe D.C., 1999), показав ключевую роль рестрикции двунитевой РНК в ингибировании экспрессии генов, обладающих гомологией с последовательностью такой же РНК. Хотя нокаутная' с использованием антисмысловых РНК при создании вирусоустойчивых растений нашла практическое применение еще до открытия молекулярной сути процессов, лежащих в ее основе, многие аспекты проявления РНКинтерференции у растений и ее влияние на экспрессию генов хозяина по настоящее время остаются неисследоваными.

Поэтому представлялось интересным исследовать влияние эндогенно синтезируемой в растении протяженной двунитевой РНК, не имеющей гомологии с геномом растения и геномом вируса, на устойчивость растений к вирусам. В качестве трансгенной кодирующей последовательности, экспрессирующей днРНК, для предотвращения эффекта умолкания генов растения был использован фрагмент бактериального гена.

Цели работы:

Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи: получить путем агробактериальной трансформации трансгенные растения табака и пшеницы, несущие конструкцию, детерминирующую в растении синтез протяженной (0,35 тпн) двуцепочечной РНК; провести изучение генетической стабильности данной вставки в трансгенных растениях; провести изучение вирусоустойчивости трансгенных растений табака к разным штаммам ВТМ; исследовать изменения в спектрах растворимых белков листьев трансгенных растений табака при инфицировании их вирусом; провести сравнительное исследование морфофизиологических признаков трансгенных растений с оценкой их наследуемости.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Коростылева, Татьяна Викторовна

Выводы:

1. Получены трансгенные растения табака Nicotiana tabacum cv. Samsun (8 линий) и трансгенной пшеницы Triticum aestivum L. (43 линии) несущие гетерологичную последовательность бактериального происхождения, организованную в виде инвертированного повтора и детерминирующую в растении синтез двунитевой РНК. Показано, что трансгенные растения табака и пшеницы сохраняют данную вставку на протяжении трех поколений (ТрТз). На трансгенных растениях табака поколении Т2 показана экспрессия двунитевой РНК.

3. Показано, что изменение уровня устойчивости трансгенных растений табака при инфицировании штаммом ВТМ N2 сопровождается синтезом de novo полипептидов с молекулярной массой 25 и 30 кДа, индуцирующихся до формирования выраженных симптомов заболевания.

4. Проведено автоматическое секвенирование аминокислотных последовательностей триптических пептидов белка с молекулярной массой 30 кДа. Компьютерным анализом установлена его гомология с ферментами семейства /3-эндоглюканаз растений. Гомологии с известными PR-белками растений рода Nicotiana не выявлено.

5. У потомства трансформантов поколений Т2 и Т3 выявлены множественные изменения как морфологических, так и количественных признаков, связанных с продуктивностью. У трансгенных растений табака (90 % линий) и пшеницы (41,25 % линий) показано нарушение всхожести семян, полученных от растений поколения TV Все изменения, кроме повышения продуктивного кущения у пшеницы, не являются наследуемыми. Для обоих видов наблюдаемые изменения, по - видимому, обусловлены экспрессией двунитевой РНК в растениях.

Заключение

В результате проведенных экспериментов были получены 8 трансгенных линий табака и 43 линии трансгенной пшеницы, стабильно сохраняющие на протяжении 3-х поколений (до Т3) конструкцию, несущую экспрессируемую последовательность бактериального происхождения в виде протяженного инвертированного повтора. Данная конструкция обеспечивает синтез в трансгенных растениях РНК, имеющую шпилечную, двунитевую структуру, что было показано ранее (Смирнов и др., 1993), а также подтверждено в нашем эксперименте с трансгенными растениями табака.

Нами было выявлено повышение уровня устойчивости к ВТМ у трансгенных растений табака разных линий, экспрессирующих днРНК, выражавшееся в задержке развития заболевания у инфицированных растений, изменения характера симптомов, а при заражении штаммом ВТМ N22 -уменьшении накопления белка оболочки вируса. Наблюдаемое у трансгенного табака повышение уровня устойчивости к вирусу нельзя отнести за счет интерферирующего действия днРНК, так как ее нуклеотидная последовательность не имеет гомологии с ВТМ. Можно предположить, что конститутивный синтез днРНК в растении, индуцируя начальные стадии PTGS/PHK-интерференции, активирует и ряд участвующих в нем белковых факторов (или увеличивает увеличивает уровень их экспрессии). Их активное состояние, повышенный уровень содержания этих факторов в трансгенных растениях в момент начальных событий инфекции может обеспечивать наблюдаемое повышение уровня устойчивости. Таким белком, к примеру, может быть так называемый антивирусный фактор (АВФ) табака, индуцирующийся в растениях при вирусном заражении и способный ограничивать репликацию ВТМ при экзогенном нанесении. Он активно изучался с 80-х годов, был клонирован (Akad, et al., 1999), по недавно полученным сведениям, гомологи АВФ у дрожжей, семейство генов ski, являются частью системы РНК-интерференции (Orban, 2005). Также возможно влияние на устойчивость со стороны протеинкиназы р68 (гл. 1.2.), синтез которой индуцируется двунитевой РНК. На основании полученных и имеющихся данных можно сделать заключение, что трансгенная экспрессия гетерологичной двуцепочечной РНК влияет на уровень устойчивости растений с разными генетическими системами защиты от вируса, однако повышенная устойчивость растений не обусловлена специфичным (основанным на гомологии транскриптов) действием РНК- интерференции на репликацию вируса.

Нами были выявлены неизвестные полипептиды, с молекулярной массой 25 и 30 кДа, синтезирующиеся de novo в трансгенных растениях при вирусной инфекции. Проведенное исследование полипептида массой 30 кДа позволило определить аминокислотную последовательность фрагмента молекулы и выявить его гомологию с растительными /3-эндоглюканазами.

На основании приведенных данных можно предположить, что индуцированный инфекцией в трансгенных растениях белок с молекулярной массой ЗОкДа является новым неизвестным представителем семейства /3 -эндоглюканаз, в регуляции экспрессии которого участвует днРНК. Видимо, активация его синтеза зависит не только от присутствия днРНК, но требует участия некоторого вирусного фактора, поскольку данный белок обнаруживался в зараженных трансгенных растениях только в случае инфицирования высокопатогенным штаммом

N2 . Это говорит о том, что его функции в растении, по-видимому, связаны с защитой или патогенезом. При этом следует отметить, что индукция этой /З-эндоглюканазы происходит не под контролем гена N, как у известных глюканаз из группы PR-белков.

На двух видах растений - табаке и пшенице, на независимо полученных линиях, наблюдались множественные изменения морфологических, физиологических и количественных признаков, большинство из которых оказались ненаследуемыми. Если морфологические отклонения, наблюдаемые достаточно часто при применении агробактериальной трансформации, обычно связывают с сомаклональной изменчивостью (как результат культивирования организма в условиях in vitro), то использование способа трансформации in planta исключает такое объяснение. Сходство наблюдаемых нами отклонений у разных видов, повторяемость однотипных отклонений в разных линиях, (повышенное боковое побегообразование у Табаков и повышенная продуктивная кустистость у пшеницы; пониженная всхожесть семян, полученных от Т0) при разных способах трансформации указывает на роль общего фактора - экспрессии трансгенной вставки. Мы предполагаем что наблюдаемые отклонения связаны с синтезом двунитевой РНК. Допуская роль дцРНК в формировании этих морфозов, можно предположить, что ненаследуемость может быть обусловлена непродолжительностью неспецифического воздействия экспрессии дцРНК. Согласно данным, полученным на трансгенных растениях, уровень синтеза мРНК, экспрессируемой конструкцией с инвертированными повторами, уменьшается на 50-100 % (подвергается умолканию) на протяжении жизни растения (Waterhouse et al., 1998; Wesley et al., 2001). Остается не вполне понятным факт наследственного закрепления признака увеличенной продуктивной кустистости у отдельных линий пшеницы.

Полученные нами данные по множественным морфофизиологическим отклонениям и нарушению всхожести семян у трансгенных растений мы связываем с неспецифическими влиянием процессов сайленсинга, запускаемых экспрессируемой в растениях дцРНК. С начала использования антисмысловой технологии для изучения функций генов и решения прикладных задач достаточно регулярно поступают сообщения о нарушениях у нокаутных трансгенных растений морфологии, об отклонениях по признакам, связанным с генеративной сферой, с продуктивностью (Поройко и др., 2000; Xiao et al., 2003; De Ronde, 2004;). Исследователи обычно интерпретируют эти факты как плейотропное действие выключения функции исследуемого гена, часто неожиданное и труднообъяснимое. В главе 1.2.6. подробно обсуждались причины, которые могут обуславливать неожиданные побочные эффекты при инициации процессов РНК-интерференции.

В заключение можно сказать, что, по-видимому, при планировании исследований растительных объектов с использованием антисенс-методов, как и для таких экспериментов на животных, необходимо минимизирование длины двунитевой РНК во избежание нежелательных вторичных эффектов. Также нежелательно использование конститутивных промоторов, конструкций в виде инвертированных повторов, обеспечивающих синтез чужеродной днРНК на эмбриональных и ранних стадиях развития растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коростылева, Татьяна Викторовна, Москва

1. Аравин А.А., Кленов М.С., Вагин В.В., Розовский Я.М., Гвоздев В.А. Рольдвуцепочечной РНК в подавлении экспрессии генов у эукариот // Молекулярная биология. 2002. Т. 36. № 2. С. 240-251.

2. Бистрицкайте Г.Б., Стасявичуте З.Б. Индукция устойчивости растений квирусу табачной мозаики и Х-вирусу картофеля двунитевыми РНК, выделенными из дрожжей-сахаромицетов // Труды АН Литовской ССР. Серия В. 1986. Т. 4(96). С. 3-8.

3. Гребинский С.О. Рост растений. Львов: Издательство Львовскогоуниверситета. 1961.

4. Дорохов Д.Б., Клоке Э.Быстрая и экономичная технология RAPD-анализарастительных геномов // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. С. 476-483.

5. Дрейпер Дж., Скотт., Армитадж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений.

6. Лабораторное рукводство. М.: Мир, 1991. 408 с.

7. Крашенинникова Л.В., Бабоша А.В., Хромова Л.М., Мусин С.М.

8. Ладыгина М.Е., Бабоша А.В. Физиолого-биохимическая природавирусного патогенеза устойчивости и регуляции антиинфекционной активности // Физиология растений. Физиология растений. 1996. Т. 43. №5. С. 729-742.

9. Огарков В.И., Атабеков И.Г., Каплан И.Б., Тальянский М.Э., Малышенко

10. С.И. Влияние интерферона человека на репродукцию фито- и миковирусов // Известия АН СССР. Серия биологическая. 1987. № 3. С. 341-345.

11. Ю.Озерецковская О.Л., Роменская И.Г. Олигосахарины как регуляторные молекулы растений // Физиология растений. 1996. Т. 43. №5. С. 743-752.

12. И.Поройко В.А., Рукавцова Е.Б., Орлова И.В., Бурьянов Я.И. Фенотипические изменения трансгенных растений табака с антисмысловой формой гена hmgl //Генетика. 2000. Т. 36. №9. С. 1200-1205.

13. Ралдугина Г.Н., Горелова СБ., Кожемякин А.В. Стабильность и наследование транстеяов в растениях рапса // Физиология растений. 2000. Т. 47. №3. С. 437-445.

14. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация пасленовых. Киев: Наукова думка, 1985. С. 43.

15. Смирнов С.П. Теверовская Э.Х., Крашенинникова JI.B., Пухальский В.А. Создание экспрессионного интегративного вектора и его использование для введение в растения гена рекомбинантного альфа-интерферона человека//Генетика. 1990. Т. 26. №12. С. 2111-2121.

16. Смирнов С.П., Крашенинникова Л.В., Пухальский В.А. Эффект синтеза молекул двунитевой РНК в трансгенных растениях табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики // ДАН. 1993. Т. 331. №2. С. 241245.

17. Степанова А.Ю., Терешенок Д.В, Осипова Е.С., Гладков Е.А., Долгих Ю. И. Получение трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) методом агробактериальной трансформации // Биотехнология. 2006. №2. С. 20-27.

18. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: Фэн, 2001. 448 с.

19. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. Москва: Наука, 2002. 294 с.

20. Р.Трифонова Е.А., Комарова М.Л., Сырник О.А., Кочетов А.В., В.К. Шумный. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum SRI, экспрессирующие ген, кодирующий нуклеазу Serratia marcescens II Генетика. 2002. Т. 38. № 2. С. 274-277.

21. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: Мир, 1999. 558 с.

22. Aaziz R.and Tepfer М. Recombination in RNA viruses and in virus-resistant transgenic plants // Journal of General Virology. 1999. V.80. P. 1339-1346.

23. Abbink Т.Е., de Vogel J., Bol J.F., Linthorst H.J. Induction of a hypersensitive response by chimeric helicase sequences of tobamoviruses U1 and Ob in N-carrying tobacco // Mol Plant Microbe Interact. 2001. V. 14(9). P. 1086-1095.

24. Agrawal N., Dasaradhi P.V., Mohmmed A., Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukherjee S.K. RNA interference: biology, mechanism, and applications // Microbiol Mol Biol Rev. 2003. V. 67(4). P. 657-685.

25. Ahlquist P. RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silensing // Science. 2002. V. 296. P. 1270-1273.

26. Akad F., Teverovsky E., David A., Czosnek H., Gidoni D., Gera A. and G. Loebenstein. A cDNA from tobacco codes for an inhibitor of virus replication(IVR)-like protein // Plant Molecular Biology. 1999. V. 40. P. 969976.

27. Anandalakshmi R., Marathe R., Ge X., Herr J.M.Jr., Май C., Mallory A., Pruss G., Bowman L., Vance V.B. A calmodulin-related protein that supresses posttrascriptional gene silencing in plants // Science. 2000. V. 290. P. 142-144.

28. Anandalakshmi R., Pruss G. J., Ge X., Marathe R., Mallory A. C., Smith Т. H., and Vance V. B. A viral suppressor of gene silencing in plants // PNAS. 1998. V. 95. P. 13079-13084.

29. Anfsats W., Mette M.F., Van der Winden J., Matzke E.A. and Matzke M. RNA -directed DNA methilation in Arabidopsis // PNAS.2002. V. 99. P. 1649916506.

30. Aufsatz W., Mette M.F., van der Winden J., Matzke M., Matzke A.J. HDA6, a putative histone deacetylase needed to enhance DNA methylation induced by double-stranded RNA // EMBO J. 2002. V. 21(24). P. 6832 6841.

31. Baulcombe D.C. Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants // The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1833-1844.

32. Baulcombe D.C. Replicase-mediated resistance: A novel type of virus resistance in transgenic plants? // Trends Microbiol. 1994. V. 2. P. 60-63.

33. Beck D.L. and Dawson W.O. Deletion of repeated sequences from tobacco mosaic virus mutants with two coat protein genes // Virology. 1990. V. 177. P. 462-469.

34. Beffa R., Meins F.J. Pathogenesis-related function of plant beta-l,3-glucanases investigated by antisense transformation a review // Gene. 1996. V. 179. P. 97-103.

35. Beffa R.S., Neunaus J.-M., Meins Jr. Physiological compensation in antisense transformants: Specific induction of an "erstatz" glucan endo-l,3-b-glucosidase in plant infected with necrotizing viruses // PNAS. 1993. V. 90. P. 8792-8796.

36. Bejarno E.R., Day A.G., Paranjape V., Lichtenstein C.P. Antisense genes sa tools to engineer virus resistanse in plants // Biochemical Society Transactions. 1992. V. 20. P. 757-761.

37. Bender J. A vicious cycle: RNA silencing and DNA methylation in plants // Cell. 2001. V. 106. P. 129-132

38. Bol J.F., Linthorst H.J.M., Cornelissen B.J.C. Plant pathogenesis-related proteinsindused by virus infection // Annu Rev Phytopathol. 1990. V. 28. P. 113-138.

39. Bucher G.L., Tarina C., Heinlein M., Di Serio F., Meins F.Jr., Iglesias V.A. Local expression of enzymatically active class I beta-1, 3-glucanase enhances symptoms of TMV infection in tobacco // Plant J. 2001. V.28. P. 361-369.

40. Bujarski J.J. and Kaesberg P. Genetic recombination between RNA components of a multipartite plant virus//Nature. 1986. V.321. P. 528-531.

41. Chapman E.J., Prokhnevsky A.I., Gopinath K., Dolja V.V., Carrington J.C. Viral RNA silencing suppressors inhibit the microRNA pathway at an intermediate step //Genes Dev. 2004. V. 18(10). P. 1179-86.

42. Chen J., Li W.X., Xie D., Peng J.R., Ding S.W. Viral virulence protein suppresses RNA silencing-mediated defense but upregulates the role of microrna in host gene expression // Plant Cell. 2004. V. 16(5). P. 1302-13.

43. Chen Y., Peumans W.J., Van Damme E.J.M. The Sambucus nigra type-2ribosome-inacivating protein SNA-1' exibits in planta antiviral activity in transgenic tobacco // FEBS Letters. 2002. V.516. P. 27-30.

44. Cheng M., Fry J.E, Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Duncan D.R., Conner T.W., and Wan Y. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens //Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 971-980.

45. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum tiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical Biochemistry. 1987. V. 162. P. 156-159.

46. Cillo F., Finetti-Sialer M.M., Papanice M.A., Gallitelli D. Analysis of mechanisms involved in the Cucumber mosaic virus satellite RNA-mediated transgenic resistance in tomato plants // Mol Plant Microbe Interact. 2004. V. 17(1). P. 98-108.

47. Cote F., Cutt J.R., Asselin A., Klessig D.F. Pathogenesis-related acidic beta-1,3-glucanase genes of tobacco are regulated by both stress and developmental signals // Mol. Plant. Microbe Interact. 1991. V.4. P. 173-181.

48. Cote F., Ham K.S., Hahn M.G., Bergmann C.W. Oligosaccharide elicitors in host-pathogen interactions. Generation, perception, and signal transduction // Subcell Biochem. 1998. V. 29. P.385-432.

49. Dalmay Т., Horsefield R., Braunstein Т.Н., Baulcombe D.C. SDE3 encodes an RNA helicase required for post-transcriptional gene silencing in Arabidopsis // EMBO J. 2001. V. 20(8) P. 2069-2078.

50. De Jaeger G., De Wilde C., Eeckhou D.t, Fiers E. and A. Depicker. The plantibody approach: expression of antibody genes in plants to modulate plant metabolism or to obtain pathogen resistance // Plant Molecular Biology. 2000. V. 43. P. 419-428.

51. Delp G., Palva E.T. A novel flower-specific arabidopsis gene related to both pathogen-induced and developmentally regulated plant beta-l,3-glucanase genes //Plant Mol. Biol. 1999. V. 39. P. 565-575.

52. De Ronde J.A., Cress W.A., Kruger G.H.J., Strosser R.J and Van Staden J. Fhotosynthetic response of transgenic soybean plants arabidopsis P5VR gene during heat and drought stress // J. Plant Physiol. 2004. V. 161. P. 1211-1224

53. Dickman MB, Park YK, Oltersdorf T, Li W, Clemente T, French R.Abrogation of disease development in plants expressing animal antiapoptotic genes / PNAS. 2001. V. 98. P. 6957-6962.

54. Djikeng A., Shi H., Tschudi C., Ullu E. RNA interference in Trypanosomabrucei: cloning of small interfering RNAs provides evidence for retroposon-derived 24-26-nucleotide RNAs // RNA. 2001. V. .7(11). P. 1522-1530.

55. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22- nucleotide RNAs // Genes Dev. 2001.V. 15. P. 188-200.

56. Elmayan Т., Balzergue S., Beon F., Bourdon V., Daubremet J., Guenet Y., Mourrain P., Palauqui J.C., Vernhettes S., Vialle Т., Wostrikoff К., Vaucheret H. Arabidopsis mutants impaired in cosuppression // Plant Cell. 1998. V. 10(10). P. 1747-1758.

57. English G., Mueller E. and Baulcombe D.C. Supression of virus accumulation intransgenic plants exhibiting silensing of nuclear genes // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 179-188.

58. Flor H. Current status of the gene-for-gene concept // Annu. Rev. Phytopath. 1971. V. 9. P. 275-296.

59. Fojtova M., Van Houdt H., Depicker A., Kovarik A. Epigenetic switch from posttranscriptional to transcriptional silencing is correlated with promoter hypermethylation//Plant Physiol. 2003. V. 133(3). P. 1240-50. .

60. Fraser C.M., Kerlavage A.R., Mariani A.P., Venter J.C. Structural analysis of purified beta-adrenergic receptors // Proteins. 1987. V. 2. P. 34-41.

61. Gal S., Pisan В., Hohn Т., Grimsley N. and Hohn B. Agroinfection of transgenic plants leads to viable cauliflower mosaic virus by intermolecular recombination //Virology. 1992. V.187. P. 525-533.

62. Gat~Edelbaum 0., Altman A., end Sela I. Polyinjsic- polycytidilic acid in association with cyclic nucleotides activates the antiviral factor (AVF) in plant tissues // J. Gen. Virol. 1983. V. 64. P.211-214.

63. Goldbach R., Bucher E., Prins E. Resistanse mechanisms to plant viruses: an overview // Virus Research. 2003. V. 92. P. 207-212.

64. Golemboski, D.B., Lomonossoff, G.P., and Zaitlin, M. Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus // PNAS. 1990. V. 87. P. 6311-6315.

65. Green A.E. and Allison R.F. Recombination between viral RNA and transgenicplant transcripts // Science. 1994. V. 263. P. 1423-1425.

66. Griffiths-Jones S. miRBase: the microRNA sequence database // Methods Mol Biol. 2006. V. 342. P.129-138.

67. Gurr S.J., Rushton P.J. Engineering plants with increased disease resistance: how are we going to express it? //Trends Biotechnol. 2005. V. 23(6). P. 283-290.

68. Haliloglu H. and Baenziger P.S. Response of wheat genoypes to Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation // Cereal Research Communication. 2003. V. 31. №3-4. P.241-248.

69. Hamilton A., Voinnet O., Chappell L. and Baulcombe D. Two classes of short interfering RNA in RNA silencing // EMBO J. 2002. V. 21. P. 4671-4679.

70. Hamilton A.J, Baulcombe D.C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 1999. V. 286(5441). P. 950-952.

71. Hammond J. and Kamo K.K. Effective resistance to potyvirus infection conferred by expression of antisense RNA in transgenic plants // Mol. Plant Microbe Interact. 1995. V. 5. P. 674-682.

72. Hammond J., Lecoq H. and Raccah B. Epidemiological risks from mixed virus infections and transgenic plants expressing viral genes // Adv. Virus Res. 1999. V.54. P. 189-314

73. Hannon G.J. RNA interference //Nathure. 2002. V.418. P. 396-400.

74. Heidel J.D., Hu S., Liu X.F., Triche T.J., Davis M.E. Lack of interferon response in animals to naked siRNA // Nature Biotechnology. 2004. V. 22. P. 1579-1582.

75. Hemenway С., Fang R.F., Kaniewski W.K., Chua N.H., Turner N.E. Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNA // EMBO J. 1988. V. 7. P. 1273-1280.

76. Hennig J., Dewey R.E., Cutt J.R., Klessig D.F. Pathogen, salicylic-acid and developmental dependent expression of a beta-l,3~glucanase Gus gene fusion in transgenic tobacco plants // Plant J. 1993. V. 4. P. 481-493.

77. Hess D., Dressier K., Nimmrichter R. Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into the spikelets of wheat (Triticum aestivum L.) // Plant sci. 1990. V. 72. Iss.2. P. 233-244.

78. Jones L., Hamilton A.J., Voinnet O., Thomas C.L., Maule A.J., Baulcombe D.C. RNA-DNA interaction and DNA methilation in post-transcriptionalgene silencing // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 2291-2302.

79. Kaido M., Mori M., Mise K., Okuno Т., and Furusawa. Inhibition of brome mosaic virus (BMV) amplification in protoplasts from transgenic tobacco plants expressing replicable BMV RNAs // J. Gen. Virol. 1995. V.76. P. 2827-2833.

80. Kalaitzis P., Hong S.B., Solomos Т., Tucker M.L. Molecular characterization of a tomato endo-beta-l,4-glucanase gene expressed in mature pistils, abscission zones and fruit // Plant Cell Physiol. 1999. V. 40. P. 905-908.

81. Kashkush K, Feldman M, Levy AA. Transcriptional activation of retrotransposons alters the expression of adjacent genes in wheat //Nat Genet. 2003.V. 33(1). P. 102-106.

82. Kidner, C.A. and Martienssen, R.A. The developmental role of microRNA in plants // Curr. Opin. Plant Biol. 2005. V. 8. P. 38-44.

83. Kisielow M., Kleiner S., Nagasawa M., Faisal A. and Nagamine Y. Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using small interfering RNA // Biochem. J. 2002. V. 363. P. 1-5.

84. Kollar A., Dalmay Т., Burgyan J. Defective interfering RNA-mediated resistanse against cymbidium ringspot tombusvirus in transgenic plants // Virology. 1993. V. 193. P. 313-318.

85. Kumar M. and Carmichael G.G. Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. V. 62 (4). P. 1415-1434.

86. Lapidot, M., Gafny, R., Ding, E., Wolf, S., Lucas, W.J., and Beachy, R.N. A dysfunctional movement protein of tobacco mosaic virus that partially modifies the plasmodesmata and limits vims spread in transgenic plants // Plant J. 1993. V. 4. P. 959-970.

87. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 II Cell. 1993. V. 75. P.843-854.

88. Lippman Z, May B, Yordan C, Singer T, Martienssen R. Distinct mechanisms determine transposon inheritance and methylation via small interfering RNA and histone modification // PLoS Biol. 2003.V. 1(3):E67.

89. Lim L.P., Lau N.C., Weinstein E.G., Abdelhakim A., Yekta S, Rhoades M.W., Burge C.B., Bartel D.P. The microRNAs of Caenorharbditis elegans II Genes Dev. 2003. V. 17. P. 991-1008.

90. Lindbo, J.A., Silva-Rosales, L., Proebsting, W.M., and Dougherty, W.G. Induction of a highly specific antiviral state in transgenic plants: Implications for regulation of gene expression and virus resistance // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 1749-1759.

91. Linthorst H.J., Melchers L.S., Mayer A., van Roekel J.S., Cornelissen B.J., Bol J.F. Analysis of gene families encoding acidic and basic beta-l,3-glucanases of tobacco. // PNAS. 1990. V. 87. P. 8756-8760.

92. Lipardi C., Wei Q., Paterson B.M. RNAi as a random degradative PCR:si RNA primers convert mRNA into dsRNA that are degraded to generate new siRNAs //Cell. 2001. V. 107. P. 297-307.

93. Llave С., Kasschau K.D., Rector M.A., Carrington J.C. Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 16051619.

94. Lodge J.K., Kaniewski W.K., Turner N.E. Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweed antiviral pbrotein // PNAS. 1993. V. 90. P. 7089-7093.

95. Lu C, Fedoroff N. A mutation in the Arabidopsis HYL1 gene encoding a dsRNA binding protein affects responses to abscisic acid, auxin, and cytokinin //Plant Cell. 2000. V. 12(12). P. 2351-2366.

96. Lynn K, Fernandez A, Aida M, Sedbrook J, Tasaka M, Masson P, Barton MK. The PINHEAD/ZWILLE gene acts pleiotropically in Arabidopsis development and has overlapping functions with the ARGONAUTE1 gene // Development. 1999. V. 126(3). P. 469-481.

97. Mallory A.C., Reinhart B.J., Bartel D., Vance V.B., Bowman L.H. A viral suppressor of RNA silencing differentially regulates the accumulation of short interfering RNAs and micro-RNAs in tobacco // PNAS. 2002. V. 99. P. 1522815233.

98. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edn). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press.

99. Mette M.F, van der Winden J., Matzke M., Matzke A.J. Short RNAs can identify new candidate transposable element families in Arabidopsis // Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 6-9.

100. Mitra A, Higgins DW, Langenberg WG, Nie H, Sengupta DN, Silverman RH. A mammalian 2-5A system functions as an antiviral pathway in transgenic plants // PNAS. 1996. V. 93(13). P. 6780-6785.

101. Mittelsten Scheid O, Paszkowski J. Transcriptional gene silencing mutants // Plant Mol Biol. 2000. V. 43(2-3). P. 235-241.

102. Nicholson A.W. Structure, reactivity, and biology of double-stranded RNA //. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1996. V.52. P. 1-65.

103. Nykanen A., Haley В., Zamore P.D. ATP requirement and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway // Cell. 2001. V. 107. P.309-321.

104. Obregon P., Martin R., Sanz A., Castresana C. Activation of defence-related genes during senescence: a correlation between gene expression and cellular damage // Plant Mol. Biol. 2001. V. 46. P. 67-77.

105. Orban T.I., Izaurralde E. Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome // RNA. 2005. V. 11(4). P. 459-469.

106. Papp I., Mette MF., Aufsatz W., Daxinger L., Schauer S.E., Ray A., van der Winden J., Matzke M., Matzke A.J. Evidence for nuclear processing of plant micro RNA and short interfering RNA precursors // Plant Physiol. 2003. V. 132(3). P. 1382-1390.

107. Park W, Li J, Song R, Messing J, Chen X. CARPEL FACTORY, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana // Curr Biol. 2002. V 12(17). P. 1484-1495.

108. Patrick M. Finnegan and Gregory G. Brown . Autonomously replicating RNA in mitochondria of maize plants with S-type cytoplasm // PNAS. 1986. V. 83. P. 5175-5179.

109. Peumans W.J., Hao Q., Van Damme E.J.M. Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? // FASEB J. 2001. V. 15. P. 1493-1506.

110. Pfeiffer P. Nucleotide sequence, genetic organization and expression strategy of the double-stranded RNA associated with the '447' cytoplasmic male sterility trait in Viciafaba II J. Gen. Virol. 1998. V. 79. P.2349-2358.

111. Powell P.A., Stark D.M., Sanders P.R., Beachy R.N. Protection aganst tobacco mosaic vims in transgenic plants that express tobacco mosaic vims antisense RNA // PNAS. 1989. V. 86. P. 6949-6952.

112. Powell-Abel, P., Nelson, R.S., De, В., Hoffmann, N., Rogers, S.G.,Fraley, R.T., and Beachy, R.N. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic vims coat protein gene // Science. 1986. V. 232. P. 738-743.

113. Prins M. Broad virus resistance in transgenic plants // Trends Biotechnol. 2003. V. 21. N 9. P. 373-375.

114. Provost P., DishartD., Doucet J., Frendewey D., Samuelsson B. and Radmark 0. Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer // The EMBO Journal. 2002. V. 21. No. 21. P. 5864-5874

115. Pruss G.J., Lawrence C.B., Bass Т., Li Q.Q., Bowman L.H., Vance V. The potyviral suppressor of RNA silencing confers enhanced resistance to multiple pathogens // Virology. 2004. V. 320. N 1. P. 107-20.

116. Reichman M., Devash Y., Suhadolnic R.G., Sela I. Human leukocyte interferon and antiviral factor (AVF) from virus-infected plants stimulate plant tissues to produce nucleotides with antiviral activity // Virology. 1983. V. 128. P.240.

117. Reinhart B.J., Weinstein E.G., Rhoades M.W., Bartel B. and Bartel D.P. MicroRNAs in plants // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 1616-1626.

118. Rhoades M., Reinhart В., Lim L., Burdge C., Bartel В., Bartel D. Prediction of plant microRNA targets // Cell. 2002. V. 110. P.513-520.

119. Rubio Т., Borja M., Scholthof H.B., Feldstein P.A., Morris T.J., Jackson A.O. Broad-spectrum protection against tombusviruses elicited by defective interfering RNAs in transgenic plants // Journal of Virology. 1999, V. 73 (6). P. 5070-5078

120. Sanford, J.C., and Johnston, S.A. The concept of parasite-derived resistance-Deriving resistance genes from the parasite's own genome// J. Theor. Biol. 1985.V. 113. P. 395-405.

121. Sano H. and Ohashi Y. Involvement of small GTP-binding proteins in defencesignal transduction pathways of higher plants // PNAS. 1995. V. 92. P. 41384144.

122. Sano Т., Nagayama A., Ogawa Т., Ishida I., Okada Y. Transgenic potato expressing a double-stranded RNA-specific ribonuclease is resistant to potato spindle tuber viroid//Nat. Biotechnol. 1997. V. 15. P. 1290-1294.

123. Savenkov E.I., Valkonen J.P. Silencing of a viral RNA silencing suppressor in transgenic plants. J Gen Virol. 2002. V. 83(9). P. 2325-2335.

124. Schauer SE, Jacobsen SE, Meinke DW, Ray A. DICER-LIKE 1: blind men and elephants in Arabidopsis development // Trends Plant Sci. 2002. V. 7(11). P. 487-491.

125. Schillberg S., Zimmermann S., Zhang M.Y., Fischer R. Antibody-based resistance to plant pathogens // Transgenic Res. 2001. V. 10. Iss. 1. P. 1-12.

126. Sher N., Edelbaum O., Barak Z., Grafi G., Stram Y., Raber J., Sela I. Induction of an ATP-polymerizing enzyme in TMV-infected tobacco and its homology to the human 2'-5' A synthetase // Virus Genes. 1990. V. 4(1). P. 27-39.

127. Shoelz J.E and Wintermantel W.M. Expansion of viral host range through complementation and recombination in transgenic plants // Plant Cell. 1993.V. 5. P 1669-1675.

128. Sijen T. and Kotel J.M. Post-transcriptional gene silencing: RNAs on the attack orthe defence // Bioassays. 2000. V.22. P. 520-531.

129. Sijen Т., Fleenor J., Simmer F., Thijssen K.L., Parrish S., Timmons L., Plasterk R.H., Fire A. On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing // Cell. 2001. V. 107(4). P. 465-476.

130. Sleds C.A., Holko M., de Veer M.J., Williams B.R.G. Activation of the interferon system by short-interfering RNAs // Nat. Cell Biol. 2003. V.5. P. 771-772.

131. Song E.K., Koh H.K., Kim J.K., Lee S.Y. Genetically engineered transgenic plants with the domain-1 sequence of tobacco mosaic virus 126 kDa protein gene are completely resistant to viral infection // Molecules and Cells. 1999. V. 9. Iss 6, P. 569-575

132. Schramke V, Allshire R. Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing // Science. 2003. V. 301(5636). P. 10691074

133. Stanley J., Frischmuth Т., Ellwood S. Defective viral DNA ameliorates simptoms of gemivirus infection in transgenic plants // PNAS. 1990. V. 87. P. 6291-6295.

134. Takeuchi Y., Yoshikawa M., Takeba G., Tanaka K., Shibata D., Horino O. Molecular cloning and ethylene induction of mRNA encoding a phytoalexin elicitor-releasing factor, beta-l,3-endoglucanase, in soybean // Plant Physiol. 1990. V. 93. P. 673-682.

135. Takeuchi Y., Yoshikawa M., Takeba G., Tanaka K., Shibata D., Horino O. Molecular cloning and ethylene induction of mRNA encoding a phytoalexin elicitor-releasing factor, beta-l,3-endoglucanase, in soybean // Plant Physiol. 1990. V. 93. P. 673-682.

136. Tang G., Reinhart B.J., Bartel D.P. and Zamore P.D. A biochemical framework for RNA silensing in plants // Genes Dev. 2003 .V. 17. P. 49-63.

137. Taraporewala Z.F., Culver J.N. Identification of an elicitor active site within the three-dimensional structure of the tobacco mosaic tobamovirus coat protein //Plant Cell. 1996. V. 8(2). P. 169-178.

138. Tavladoraki P., Benvenuto E., Trinca S., De Martinis D., Cattaneo A., Galeffi P. Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack // Nature. 1993. V. 366. P. 469-472.

139. Tenllado F., Martinez-Garcia В., Vargas M. and Diaz-Ruiz J.R. Crude extracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections // BMC Biotechnology. 2003. 3 : 3

140. Thomas P.E., Hassan S., Kanievski W.K., Lawson E.C., Zalewski J.C. A search for evidence of virus/transgene interactions in potatoes transformed with the potato leafroll virus replicase and coat protein genes // Mol. Breed. 1998. V. 4. P. 407-413.

141. Turner L.A., Harriman R.W. and Handa A.K. Isolation and nucleotide sequence of three tandemly arranged pectin methylesterase genes from tomato //PlantPhysiol. 1996. V. 112. P. 1398 1403.

142. Thomas P.E., Lawson E.C., Zalewski J.C., Reed G.L., Kaniewski W.K. Extreme resistance to Potato leafroll virus in potato cv. Russet Burbank mediated by the viral replicase gene // Virus Res. 2000. V. 71(1-2). P. 49-62.

143. Vaistij F.E., Jones L. and Baulcombe D.C. Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase // Plant Cell. 2002 V. 14. P. 857867.

144. Vazquez F., Gasciolli V., Crete P., Vaucheret H. The nuclear dsRNA binding protein HYL1 is required for microRNA accumulation and plant development, but not posttranscriptional transgene silencing // Curr Biol. 2004. V. 14(4). P. 346-351.

145. Wakarchuk D.A., Hamilton R.I. Partial nucleotide sequence from enigmatic dsRNAs in Phaseolus vulgaris // Plant Mol Biol. 1990. V. 14(4). P. 637-639.

146. Vargason J.M., Szittya G., Burgyan J., Tanaka Hall T.M. Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor // Cell. 2003. V. 115(7). P. 799-811.

147. Watanabe Y., Ogawa Т., Takahashi H., Ishida I., Takeuchi Y., Yamamoto M., and Okada Y. Resistance against multiple plant viruses in plants mediated by a double stranded-RNA specific ribonuclease // FEBS Lett. 1995. V. 372. P. 165168.

148. Waterhouse P.M., Graham M.W.and Wang M.-B. Vims resistance and gene silensing in plants can be indused by simultaneous expression of sense and antisense RNA//PNAS. 1998. V. 95. P. 13959-13964.

149. Whitham S., McCormick S., Baker B. The N gene of tobacco confers resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tomato 11 PNAS. 1996. V. 93. P. 87768781.

150. Wu H, Sparks C, Amoah B, Jones HD. Factors influencing successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat // Plant Cell Rep. 2003. V. 21(7). P. 659-668.

151. Xie Z., Johansen L.K., Gustafson A.M., Kasschau K.D., Lellis A.D, Zilberman D., Jacobsen S.E., Carrington J.C. Genetic and Functional Diversification of Small RNA Pathways in Plants // PLoS Biology. 2004. V. 2. Iss. 5. P. 06420652.

152. Xie Z, Allen E., Wilken A., Carrington J.C. DICER-LIKE 4 fonctions in transacting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase change in Arabidopsis thaliana // PNAS. 2005. V. 102(36). P. 12984-12989.

153. Yang S.J., Carter S.A., Cole A.B., Cheng N.H., Nelson R.S. A natural variant of a host RNA-dependent RNA polymerase is associated with increased susceptibility to viruses by Nicotiana benthamiana // PNAS. 2004. V. 101(16). P. 6297-6302.

154. Yepes L.M., Fuchs M., Slightom J.L., Gonsalves D. Sense and antisense coat protein gene constmcts confer high-levels of resistanse to tomato ringspot nepovirus in transgenic Nicotiana species // Phytopathology. 1996. V. 86. P. 417-424.

155. Zeng J.Z., Wang D.J., Wu Y.Q., Zhang J., Zhou W.J., Zhu X.P., Xu N.Z. Transgenic wheat plants obtained with pollen pathway method // Science in China. Series В Chemistry Life Sciences and Earth Sciences. 1994. V. 37. Iss. 3. P. 319-325.

156. Zhang L., French R., Langenberg W.G., Mitra A. Accumulation of barley stripe mosaic vims is significantly reduced in transgenic wheat plants expressing a bacterial ribonuclease // Transgenic Res. 2001. V. 10(1). P. 13-19.

157. Zilberman D., Cao X., Jacobsen S.E. ARGONAUTE4 controls of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methilation // Science. 2003. V. 299. P. 716-719.

158. Zimmermann, S., Schillberg, S., Liao, Y.-C. and Fisher, R. Intracellular expression of TMY-specific single-chain Fv fragments leads to improved virus resistance in Nicotiana tabacum //Mol. Breed. 1998. V. 4. P. 369-379.

159. Zoubenko O., Uckun F., Hur Y., Chet I, Turner N. Plant resistance to fungal infection induced by nontoxic pokeweed antiviral protein mutants // Nat. Biotechnol. 1997. V. 15, Iss 10. P. 992-996.

Информация о работе

Коростылева, Татьяна Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Изучение трансгенных растений с гетерологичным геном, детерминирующим синтез двунитевой РНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы