Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ трансгенных животных (кролики. свиньи, рыбы)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ трансгенных животных (кролики. свиньи, рыбы)"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

ГРАЩУК Марина Александровна

УДК 577.21

АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ НМВОТНЫХ ( КРОЛИКИ, СВИНЬИ, РЫБЫ ) 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии им. Энгельгардта АН СССР.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, академик АН СССР Г.П.Георгиев

кандидат биологических наук Г.Н.Ениколопов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, чл.-кор. АН СССР Ю.В.Ильин

кандидат биологических наук С.Д.Набирочкин

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной генетики АН СССР.

Защита состоится ^Лг/гх^Л/' 1991 г. в " часов на

заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

А.М.Крицын

Развитие методов генетической ¡нненеркк, молекулярной биологик, эмбриологии позволяет в ¡оследнее время успеино осуществлять введение кнтересуюцих кас юследовательностей ДНК в клетки зародышевого пути шшек л [ругнх млекопитающих (Ра1ш11ег et а1.,13Е6). Включившись е геном ¡анного организма, такие чуверодные последовательна"-. 1азываеные трансгеками, устойчиво наследуются «5 ряду юколений. Весьма важное значение имеет тот факт, что трансгены [асто экспрессируются к при этом вызывают изменения в системе 'каневой специфичности, физиологических реакциях, а иногда во ¡сей программе развития организма (РаЗлШ;ег еЪ а1.,1935; Еашег а1.,1985). Следовательно, открывается путь к изучению функциональной роли и регуляции экспрессии интересующих нас тонированных генов на уровне целого организма.

Эксперименты по получению и изучению трансгенных животных фоводятся во иногнх странах ккра. Однако, несмотря на шогочксленность и многообразие этих исследований, многие закторы, определяющие эффективность трансформации клеток (ародышевого пути, эффективность экспрессии чунеродных геяп; -метках целостного организма, остаются недостаточна изученными. 5 связи с этик, обнаружение встраивания гетерологичной ДНК в ■енои клеток сивотнкх и рыб и изучение экспрессии введенных ■енов является актуальной биотехнологической задачей.

. Ц?СЬ.е _з .¡12сс5й0вавкя, Целью настоящзй работы явилось ¡ыявлекие наличия введенной генетической информации в геноме 1лекспитаюцю: и раб, а также исследование транскрипционной истинности чужеродных генов у трансгенвкх особей.

В задачи исследования входило:

- скрининг образцов ДНК млекопитающих и рыб, родившихся после шкроиньекций рекомбикантных конструкций в оплодотворенные шцекяеткЕ;

- анализ ДКК траясгекнюс особей для выяснения количества и юрядка встраивания гетерелогичных генов;

- транскрипционный анализ РНК трансгенкш: особей с помощью зуклеазы Б1.

Б качестне инъецируемого чукередного генетического материала

использованы рекомбинанткае ДНК, содержащие гены гормона роста человека ({1(21), гормона роста быка (Ь(Ш) и ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека (НВзА§) под контролем регуляторных элементов гена металлотионеина. Ожидалось получить животных и рыб, экспрессирувщих белковые продукты указанных генов.

Црнчяноя выбора этих генов, является медицинское и -.днохозяйственное значение, которое могут иметь продукты их экспрессии.

Получение необходимо для создания чувствительных

тест-систем при детекции азти-НВзА§ антител в крови пациентов, для создания эффективной вакцины против вируса гепатита В человека. Использование трансформированных бактериальных культур в целях наработки НВвА^ невозможно по причине отсутствия ферментативных систем, обеспечивающих пссттрансляционные модификации, протекающие в процессе созревания полноценных белков.

Значение ШН и ЬСЖ определяется влиянием, которое они могут оказать на скорость роста млекопитающих и рыб и на продуктивность сельскохозяйственных животных. Так, у свиней под влиянием экзогенного соматотропина на 10-15% увеличивается

среднесуточный правее, на 16-183 улучшается эффективность усвоения корма, уменьшается содервание нира (РигБе1 Т.О.,1959). У рыб действие экзогенного гормона роста приводит к увеличению размера до 20% по сравнению с нетрансгекаыми особями (МасЛеап N., 1990).

.Научная..новизна..и..5рактич§ска.з_._це.чнрсть_.работы,. Данное исследование представляет собой одну из первых в СССР работ по получении травегенных животных и рыб. В результате экспериментов были выявлены трапегеняые кролики, свиньи, вьшк и зеркальные карпы. Интеграция и экспрессия чужеродных генов была доказана методами блот-гибридизацяи по Саузерну, Б1-анализа и подтверждена иммунофериектнвми и радиоиммукологпчееккми исследованиями.

.¿врдбаш'д.рабдты^ Материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых Института молекулярной биологии

/Москва, 1987 г./, двустороннем советско-германском симпозиуме /Дубровицы, 1991 г./.

.иу^ШШЦШ* По материалам диссертации опубликовано 5 работ. -Объек.ДДОсерт&иий, Диссертация излонена на 142 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов, выводов и включает 16 рисунков и 8 таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает 178 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.. Бы§др. g _ ддлузезве.. рееоибгвтии:. КОЗСТРУ^ЯШЁ.. Первым этапом этой работы было создание рекомбинантных конструкций для проведения микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки животных и рыб (Рис.1 а,6,в)

В лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот ИМБ АН OTP старшин научным сотрудником Енкколоповым Г.Н. была получена первая серия рекомбинантных векторов, содернащих 1) просторную область гена металлотипнеина-1 мыши длиной 662 а.к. (Serillng Е.,1985), которая включает энхаясер, собственно промотор, участок кэяирования кРНК и 5'-концевую нетранслируемую область мРНК; 2) донорный и акцепторный участки сплайсинга и участок полиаденилкровакик кРНК из ранней области генома вируса SV40 длиной 2650 п.е.; 3) а/ комплементарную ДНК гена соматотропног-о гормона человека длиной 700 л.е.(Рубцов П.М., 1935), которая была проклонировака, изолирована при помоги рестриктаз ВалШ к Smal и введена в состав векторной конструкции pMTSV, б/ комплементарную ДКК гена сокатотрояного гормона быка длиной 800 п.н., в/ ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека (штамм aYW3) длиной 2300 п.п. (Galibert F.,1979), который был изолирован при помощи рестриктаз BglH и введен е состав векторной конструкции pMTSY. Eglll - фрагмент (координаты 198G-2838) содержит участок, ксдируюцкй зрелый белок HBsAg и область pre-S2 белка.

Ирокотор гкна металлотионеина относится к разряду кндуцкбельных промоторов. Регулирование экспрессии клонированных генов, введенных в клетки млекопитающих или зиготу под контролем

bi, р „ н а н р в р ei

lUJLl ' ' \ А_!-1

е1 в в в н н н р в р е1

'I'!_!_н

нг авслс увхэга

Рис. 1. а) Физическая карта плазмиды рМГБУ с геном соматотропного гормона человека (р5},-Ж9);

б) физическая карта плазмиды рМГБУ с геном соматотропного гормона крупного рогатого скота;

в) физическая карта плазмиды рМГБУ с геном поверхностного антигена вируса гепатита В человека (рШНВ5).

! 7 J V 3

917?

JSJß

?02<f

fJ7S~ SV7-<TJZ-

S£<f-

Рис. 2. Гибридизационный анализ интеграции гена hGH в ДНК транс-генного кролика N'44. Порядок нанесения образцов ДКК, обоаботанных разным» реетриктазами, на агарозный гель:1- НincJ III, 2-'Pst!, 3- Hindi II+EcoRI, 4- Pst I-BamH 1, 5- BamH I+EcoRI+BglII.

¡того промотора, осуществляется путем добавления ионов тяжелых 1еталлов.

Элементы вируса SV40 были выбраны потому, что в «ногочисленных экспериментах показано влияние сплайсинга на ;табкльность мРНК в клетках животных (Gruss Р.,1979; Earner D.H., {979), в том числе и в трансгенных организмах (Brlnster R.L., 1988).

Участок полиаденилирования РНК необходим, так как юследовательности комплементарных копий генов соматотропина зеловека или быка, а также вирусный геном HBsAg, используемые в экспериментах, сами по себе неспособны приводить к обрыву гранскрибирувщейся цепи РНК в нужном сайте и ее солиаденилированию. Необходимость присутствия поли(А) района важна для эффективной экспрессии (Plärr D.S.,1986)

В первой серии созданных нами конструкций была использована комплементарная ДНК гепа соматотропина человека и. быка, в дальнейшем использовались клонированные хромосомные гены, так как - в настоящее время существует множество данных, свидетельствующих о валкости последовательностей в интронах для производства стабильной мРНК (Нашег D.H., 19796, Brlnster R.L., 1988).

Рекомбянаптную плазиидкув ДНК после выделения к очистки растворяли в буфере: ЮкМ трис-НС1,рЫ7,4; 0,1-0,25мМ ЗДТА. При кикрояньекциях в пронукдеус вводили 1-2 пкл раствора ДНК в концентрации 1-5 мкг/шх (приблизительно 500 копий клонированного фрагмента ДНК среднего размера 5000 п.н.). В этих условиях частота интеграции ДНК достигает оптимума, то есть 20-40% (Brlnster R.L., 1985).

2..Полу^essе.травсгенных.крозгвоб,

Совместно' с лабораторией эмбриогекетикк ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии нами была проведена работа по получению трансгенных кроликов (Oryctolagus) после -микрсаньенции ракобкнантных конструкций с геном гормона роста человека в зиготк кроликов. Инъецировано и перенесено б организм нивоткых реципиентов 467 эмбриона; ¿6 перенесенных эмбрионов нормально

развилось и/или родилось (в случаях мертворождения для анализа брали плоды).

Среди родивяихся кроликов по данным блот-анализа и иммуноферментного анализа экспрессии гена, обнаружены трансгенные особи. Пять еивотных из 44 содержали последовательности введенной ДНК (Ш 36, 41, 43, 44, 45), у 4 особей ген соматотропииа экспрессировался и белок синтезировался в количествах, достаточных для его достоверного обнаружения (N 36-3,5нг/мл; Н 41-37нг/мл; Н 43-68нг/мл; N 44-29нг/мл). Уровень эндогенного гормона роста у кроликов не более 1нг/мл.

Первичный скрининг возможных интеграционных событий проводили при помощи рестрикционной эндонуклеазы Pstl. Полояительные сигналы были получены у 5 животных, причем у одного них (ДНК печени N44) полосы точно соответствовали контрольным. Длины этих фрагментов были равны 2800, 24-50 и 1800 п.н. У другого кролика (ДНК печени N45) гибридизационные полосы после обработки ДНК рестриктазой Pstl находились на другом уровне, длены фрагментов соответствовали 3600 и 3000 п.н.. Подробный рестрикционный анализ трапсгеноя был проведен при помощи набора рестрикцнонних эндонуклеаз: Hlndlll, Pstl, Hlndlll+EcoRI, Pstl+BamHI, BamHI+EcoPJ+Bglll. Данные показывают, что у кролика 1Т44 (Рис. 2) введенные материал не претерпел каких-либо заметных перестроек и что копии гена, по всей видимости, соединились при интеграции в ориентации "голова к хвосту". В пользу интеграции говорит и то, что нерестрицированная ДНК па автографе дает сильный сигнал на уровне клеточной ДНК. Сравнение интенсивности гибридизационных сигналов с

интенсивностью в опыте по реконструкции показывает, что количество копий интегрированной рекомбинантной ДНК в расчете на диплоидный геном достигает 150-200. Высокая яркость сигналов от фрагментов из внутренней части тандема генов не позволяет увидеть сигналы от крайних членов тандема.

У животного N45 сходный анализ выявил множественные перестройки при интеграции (рис. 3); соответственно, у этогс зивотного не была обнаружена экспрессия гена.

У кроликов N36, N41, N43 чуверодные гены несколькс

/ Z J V f

ff//-SfJ£-

wm-rm-

fJ7f-

Pec. 3. Гийркдгзационньй анализ интеграции гена i£fi в ДЕН. анггенЕого кролика N45. Шрядок нанееениг образ nas ДНК, заСатанЕых разными. рестриктазами, на гель: 1- Htoälll, 2- Fstl, Kindlll+EcoRI, 4- tetI+ВашЕИ, 5- ВагШ+£саЙ1+ВгШ.

iZTr 517'

т-

JJi~

Ркс. 4. Анализ- транскрипции гена hGH у твагсгеннсго kdojeke 4. 1- мечаные фрагменты i&f. рВН32£, обработанное рестсикггзой all, Е-исходнга Ib.-. ёонда, 3-гангрола СгкЭридизгцхя с мыши) 5»£-Рлг; печэнх трансгенного кролика К44 (10, 20, 40ед. Еуклзазы ссотне-гсгЕеЕно), 7- Рлг! еедезеккк, 8- Fbr, мозга, S-PEK сердца, - сестр^гровгннь'е (EcoKI+Hindlll) меченые <£рал£нтк ЛЗК фага'ч.

перестроены, хотя наблюдалась экспрессия на низком уровне. Этс можно объяснить тем, что перестройки могли произойти в 3' области конструкции и не оказать заметного влияния на cai. структурный ген.

Для изучения тканеспецифической экспрессии гена был проведе! транскрипционный анализ интегрированных последовательностей npj помощи нуклеазы SI. Для этого фрагмент Bglll-Kpnl, меченый пс 51-BglII-концу 7-згР-АТФ полинуклеотидкиназой фага Т4, разделял! электрофорезом, очищали и гибридизовали с РНК, выделенной к: разных органов животного. Данные анализа (рис. 4) говорят о( интенсивной транскрипции, проходящей только в печени. Разме! меченого фрагмента. (580 нуклеотидов) в точности соответствует инициации транскрипции в положении +1 промоторного элемента генг металлотионеина мыши. Различные концентрации нуклеазы SI не даюч положительных полос. Данные получены на животных, не стимулированных введением ионов тяжелых металлов как индукторо! для МТ промотора.

Отметим, что частота получения трансгенных кроликов малс отличается от таковой в суммированных экспериментах пс получению этих животных при использовании других рекомбинантнш конструкций (Эрнст JI.K.,1987; Hanmer R.E.,1985b).

3. .ио^ееае.трзддгещгых.сЕтоей,.

Совместно с ВНИИ животноводства проведена работа пс получению трансгенных свиней (Sus) после микроинъекций в мужско$ пронуклеус зиготы конструкций с dGH и HBsAg.

Было использовано 83 донора,, от которых получили 112£ эмбрионов на ранних стадиях развития. 1051 эмбрионов был! оценены как пригодные для дальнейших манипуляций, из них 55' эмбрион был на стадии зиготы; 446 эмбриона на стадии 2-J бластомеров; 54 эмбриона на стадии нескольких бластомеров.

В ходе выполнения эксперимента 48 реципиента! трансплантировали 1012 ранних эмбрионов свиней, 958 из которю подвергали микроинъекции чулеродной ДНК. В результате у 3( реципиентов родилось 209 поросят, среди которых (по данню блот-анализа по Саузерну, анализа экспрессии гено;

щмукоферментным методом, гибридизации In situ) были обнаружены грансгенные особи. Всего было проанализировано 173 поросенка, i3 них 109 - родившихся после кикроинъекций конструкций с геном 3GH и 64 - после микроинъекций конструкций с геном HSsAg.

Среди 5 трансгенных поросят, у которых были найдены 4укеродные последовательности с геном HBsAg, 3 были ыертворонденные. .Проведен подробный гибридизационный анализ ДНК грансгенного поросенка Н8: хромосомная ДНК была выделена из печени, бржейки, мышцы, лимфоузла, сердца, мозга, легких, почки, селезенки. Далее ДНК из мозга анализировали при помощи набора рестрикционных зндонуклеаз: Hlndlll, PstI, HinOIII+EcoRI, Pstl+BamHI, EcoRI+BamHI+Bglll (рис.5).

На рисунке 6 приведены данные растрикционного анализа ДНК траксгенного поросенка N49. Каждая дороика соответствует рестрицированной по PstI ДНК, выделенной из разных органов: печени, эпидермиса, семенника, селезенки, соединительной ткани, слизистой, мыицы, лимфоузла.

й в том, и в другом случае данные исследования показывают, что встраивание гена носило, по-видимоку, мозаичный характер, так как число копий трансгена монет быть оценено как 0.3-0.5 для ИЗ и 0.1 для N49 на диплоидный геном. Аналогичные данные часто встречаются в работах других исследовательских групп (Pursel V.G., 1988; 1989).

Интенсивность гибридизационных полос в ДНК обоих поросят из разных органоЕ была различна. Вероятно такке, что кодирующая и регудяторние части рекомбинактной конструкции (в случае поросенка N8) не претерпели значительных изменений, так как гибридизационный анализ выявляет характеристические фрагменты из зтой области. Сочетание ■ рестркктаз HlnclIII+EcoRI выщепляет фрагмент раьный 1150 п.н. из области, захватывающей МТ промотор и собственно. ген HBsAg; а при рестрикции Pstl+BarnHI и EcoRI+Bglll+BamHI вырезаются фрагменты по 800 п.н. из области, кодирующей HBsAg. На рисунке 6, где представлен автограф рестрицированной ДНК из органов поросенка N49, заметны гибридизационкые сигналы в печеЕгк, мъшщах и лимфоузле, причем длины фрагментов (3600, 3200 и 2600 п.к.) не соответствуют

- ю -

2 3

Ъ 6 7

7 МУ

о»»-

й»с. 5. ГиСрвдгаацетнвкй ззашз интеграции гена ЕВгАг -з ЛЕЗ ■^взЕсгеянсй свиньи N3. 1- ДНК шззгтды р1ЕКС9, обработанная рэстргятззой Рз11 з количестве, соответстзущгм 3 колену яа дшшждный генсм; 2- та за, 0.3 копии; 3- хтожссмная ЛЕК рестрщкрсвзнвзя К£гх1131; 4 - Рг«; 5 - Н1гкЗШ+ЕооН1; б - Рэ«+ *8аяШ; 7- ЕссННЗагШ+ВгШ.

1 »

д

и

? V

I (

4 I

•Я

Рис. Б. ГибрягизащизнЕЫй гнали яетегрваки гена КВбАз в ЛЕН трансгенного поросенка ?54Э. ЛНХ инлелека та разньз органов и отработанна рестриктэзсй РзЫ. 1- ЛЕЗ печени, 2- зпилеруиса.З-ееывЕВЕка, 4- селезенки, 5- соэдлинтэлънсй т:~э.ни, 5- слжззютсй, 7- ггпца,' 8- лимфоузла.

характеристическим. Похогенге сигнала в исходной, не обработанной рестриктазами ДНК, совпадает с иолсгенпЕК клеточной ДНЕ, что дает основание полагать, что введенный генетический катериал интегрирован в хрошзсокы свиней. Окончательный ответ кокет быть дан после подробного аяагиза гютскства трансгеаинх жиботяек.

Ез-за козагчиости интеграции трансгеиа в накен эксперименте ks не uosew сделать выбор мевду двукя возможностями: I) интеграцией нескольких копий гена, Epeiepnesissx перестройку во вспокогательнах участках конструкции по типу "голова к хвосту*" и 2) интеграцией \-2. копии гена, что пишет давать сигналы с длиной, отхи^ащеися от предсказуемой ко рзстржкционЕСЙ карте конструкции из-за выявления на авторадиограике областей гелока свиньи, драдегвдщих к трансгену.

Даиные нюдгаоферкеЕтного анализа (ESA) сыворотки крови поросят ЕЗ е 349, полученные в Институте вирусологии ДИН СССР, говорят о наличии у них белков, реатрупцих с антиталаки к поверхностному антителу Екруса гепатита В.

У поросенка ЕВ пряма« Екмунофлуоресцгнтньм методом гнахгзирозатж гистшюггчесхие среза печени, хик^оузлоз и конечной ткани. Специфическое связывание с ыоноклодальными актителаки бдло обнаружено в цитоплазме клеток печени .и лггк фоузхоз.

Результаты ДЕК/РНК гибридизации на срезах tjihbsü поросенка 1749, салучанЕыг в Институте биологии развития, подтаергдггт газика ДЕЗ/ДЕК блат-гибридизации. 3 незначительной части клетск печени, xsnni, селезенки и лхк^оузла обпарухен радиационной сггкал.

Но литературах данным, для свиней усиеззгигн сказались только кикрзиЕьекцш: в ирспуклеусы зигот или ядра клеток; не дали результатов ки ретрогнрусная инфекция, ни ьклдчекне траисуОрхгрсвгннгз стззлозын клеток в блаетсципту (Parsal et al.,1933). ЗсфектЕвкость получения траасгеизыл сзиеэи низка по срсзгЕЕЕ!) с получением трансгенных кхееп п других еивотеых (Pursel et al.,1989).

- 12 -

4..Солузеэи?.травссевтег.ры§

Одной нз привлекательных моделей для проведения генетической трансформации являются рыбы в силу изученности эмбриогенеза и сравнительной простоты методических подходов.

Конструкция с геном соматотропного гормона человека под НТ промотором была использована для микроиньекций в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток вьюна (Mlsgurnus iossllls L.). Объем инъецированного раствора составлял 20 нл. Использование гена соматотропного гормона представляет интерес, поскольку показано влияние экзогенного гормона роста (в том числе гетерологичного) на ускорение темпов роста (Maclean et al., 1990). Работа по введению рекомбинантной конструкции и выращиванию рыб была проведена на кафедре эмбриологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова.

В результате проведенных исследований стадии выклева достигло 90% интактных зародышей, 72.5% - в группах активного контроля (в яйцеклетки вводили среду без ДНК) и 52.5-62.5% - з группах подопытных зародышей. На основании этих наблюдении можно предпологгять,. что введение плазмидной ДНК, также как и увеличение ее количества, влияет на заверпающие стадии эмбриогенеза у вьюнов, вызывая их гибель. В табл.1 представлены данные о ЕЫЖЕвании вьюнов и результатах блот-гибридизации.

Таблица 1. Эффективность введения чужеродного генетического материала в оплодотворенные яйцеклетки вьюна.

Инъекции Исходное Число особей Из них

плазмидной число в зозрасте трансгенных

ДНК мкг/мл зигот сеголетка

2 0.2 0.02

40 40 40 40

10 9

гибель 17

б 2

интактннй контроль

О

Проведенный скрининг ДНК показал, что 42.2% подопытных сеголеток (или 10% от исходного числа зародьшей) содеркали последовательности микроиньецированной конструкции. Вероятно, рекоибкнантные конструкции не претерпели заметных перестроек после введения в оплодотворенные яйцеклетки вьюна и при интеграции соединились в ориентации "голова к хвосту". Об этом свидетельствует данные рестриктного анализа: размеры фрагментов ДНК, обработанных рестрнктазани PstI и EcoRI, в точности соответствуют длине аналогичных фрагментов исходной конструкции, выявляется все фрагменты, которые могут быть предсказаны по рестрикционной карте (Рис. 7). Рестрикций по PstI приводит к образайанив 3 фрагментов длиной 2800, 2450 и 1800 п.н., а рестриктаза EcoRI линеаризует конструкцию и приводит к въецепленкв одного фрагмента длиной 7050 п.н..

Количество копий интегрированной рекомбинантной ДНК при сравнении с интенсивностью сигналов в реконструкционных опытах оценивается как 2-30 копий.на геном (табл. 2).

Таблица 2. Количество копий рекомбинантной

конструкции MT-ñGH, интегрировавших в генов! вьшов.

Номер рыбы 2/2 2/4 0.2/7 2/8 2/10 2/3 2/6 0.2/8

Количество копий 2 2 2 30 15 20 5 5

При более детальном анализе ДНК трансгенных вьюное с использованием комбинаций различных рестриктаз были выявлены все фрагменты рекомбиканткой конструкции. Отмеченная иктактность введенного генетического материала наблждалась во всея изученных случаях; при долгих экспозициях видны отдельные слабые полосы, различавшиеся по размеру и, по-видимому, соответствующие сигналам от крайних членов тандема.

Для выяснения формы существования введенных генов (интегрированных в хромосомную ДНК или присутствующих в виде кольцевых нинихромосом) анализировали трансгенных вьяяов ;:а

присутствие экзогенных последовательностей в исходной, не обработанной рестриктазамя ДЕЕК отдельных рыб. йз рисунка Т следует, что положение сигнала совпадает с подаяеняеи клеточной ДНК. Однако, зга не является валкостью однозначным доказательством ее нктеграцЕИ. В то же время бальная часть известных сегоЕня данных: говорит в пользу встраивания згеденгой ДНЕ в геном рыба (СЪеп et al.,tS90>.

Для определения интенсивности транскрипции у трансгенных, выгаов внделеннув РНК подвергали транскрипционному гкзлззу прк помощи нугслеазы S1. В качестве радиоактивного зонда

использовали фрагмент Sstl-BglU, дефосфорядираванньй по В£111--канцу и игченЕЙ при пакащз г—згР-АТФ к псшгнушгеатгдкиказа фага Т4. Результата анализа, предстаалгннне на рисунке 3, говорят о достаточно интенсивной транскрипция чужеродного гена, в организма трагсгеняшс нысноз. Разкер неченвзс фрагментов (575 нуюгеотидов), в точности соответствует инициации транскрипции з положении -И проиоторного элемента гега ИТ sonnt. 3 то же врекк у особи 2/4 наблюдалось повышение интенсивности полоса на азторадио грамма, соответствущей исходному зонду, что может свидетельствовать о существовании точки (точек) инициации транскрипции, расположенной перед участком расщепления рестрихтгзой Sstl. Для уточнения этого вопроса мк провела эксперимента по транскрипционному картирозашго при помощи нуклеазы SE, используя в качестве зонда меченый фрагмент PvuT-Bglll (сайт Рта! находятся в составе шгалмвдиси ДНЕ). Результата экспериментов, представленные. на рас. 9, зеказызазт, что, действительно, при использовании РНК особи 2/4, помимо полосы, длиной окало 575 нуклеатидоз , выявляется полоса длиной около 950 нуклеогидоз. Длина выявленного фрагмента говорит о старте транскрипции з участках перед трансгенок (помимо положения -И).

При сравнении интенсивности транскрипции трансгена (исходя кз интенсивности полос на азгорадиограмме) у отдельных вьшзоя с массой тела, можно закетигь явное соответствие интенсивности экспрессия гена СТГ ускоренному росту особи, йаесы группы тргнсгеяназс зьеяоз, расположенные в соответствия с

- 15 -

113 4 i Ь 1 i ч /г i! i; ■} !V

t

ис. 7. ГиЗридизационный анализ интеграции гена hSH з ДЕК рансгенкых вьюнов. 1- ДНК пдазмиды pSMHS9, обработанная есткестазой Pstl. в количестве, соответствующем 72 копиям на еном; 2- то же, 24 копии на геном; 3-то же, 8 копий на геном; 4- ДНК трансгенной оыбы N2/2, обработанная разными рэстриктазаш: 4- Pstl, 5- EcoRI, * б-интактная ДНК); 7-9 -'ДНК рыбы N2/4; 10-12-iffit рыбы N 0. 2/7; 13-15 - ДНК рыбы N2/8; 16-18 - ДНК рыбы N2/10.

м> ^ 2 3~ V * 5 6 7.8 3 10

, О C5Z9 «S» шзг» СЭ е*»

S22—

5Z7- О

о — С2>

404- о

О

CD

г'кс 8. Анализ транскрипции гена |-йН у транегенкых вьюков, (меченый ДНК-зонд Беи-В^Ш). Порядок нанесения образцов РНК: 1,10 - меченые фрагменты ДНК рВК2225 обработанные рестриктазаой НоаП; 2 - исходная ДНК зонда; 3 - кстроль (гибридизация с РНК нётрансгенного вьюна); 4- РНК трансгенных особей К2/10; 5- К2/8; б - N 0. 2/7; 7 - N2/2; 8 - N2/4; 9 - N 0.2/8.

интенсивностью транскрипции, образуют следующую

последовательность, мг: 2522-1995-1719-1202-1754-724. Отметим, что наименьией массой (724 иг) обладает особь, у которой не удалось обнаружить какой-либо транскрипционной активности трансгена. Такая корреляция ускоренного роста рыб и транскрипции гена сокатотропЕсго гормона сочетается с явным отсутствием связи между числом копий траясгена и размером особей. Сходный вывод следует из экспериментов с млекопитамшии (Palraiter et al. ,1982; РаImiter et al.,1933).

Средние размерные показатели подопытных и контрольных сеголетков представлены в табл.3 (расчеты сделаны на кафедре эмбриологии биологического факультета ИГУ).

Проведенный блот-анализ ДНК из органов 4 вьюнов в следующей серии экспериментов показал, что рекокбкнантная конструкция с генок гормона роста человека детектируется не во всех тканях рыб. Это явление обусловлено встраиванием чужеродных генов на стадии 2, 4 и более бластокеров. Мсзаицизи довольно часто встречается при изучении трансгенных гивотных а рыб (Jaenlsch R.,1988; Chen et al., 1990).

Табл. 3. Размерные показатели 22.5-нэдельннх подопытных (с интегрированным геном MS) к контрольных сеголеток вьюна. Первую группу рыб составляют подопытные особи с интегрированным геном соматотропного гормона роста человека; вторую группу рыб составляет подопытные особи, не вкючкзипе чуагеродкыи ген; третью - контрольные особи.

Нсмэр группы Число особей Длина тела, мм Масса, мг

1 8 61.1*8.59 1553.0*607.71

2 11 50.1*4.36 839.0*256.93

3 17 52-7*9.49 1016.9*456.63 Примечание: различие ра.заернпх показателей 1 ~л 2 достоверны с ?<0.С1; 1 и 3 - с Р<0.05.

Вторая часть проекта по получению травсгеккых рыб была проведена на зеркальных карпах (Cyprinus carpió) совместно с сотудниками ЕБР на базе рыбоводческого хозяйства в г. Дмитрове.

Б проведенных экспериментах было микроиньедировано всего 400 яйцеклеток. Б первой группе (200 яйцеклеток) для работы была использована рексмбинантная ДНК с геном KBsAg, во второй (200 яйцеклеток) - с генок hSL В ходе эмбриогенеза наблюдали гибель зародъшей. В итоге, б первой^ группе вылупились и достигли взрослого состояния 64, во второй - 45 особей.

S результате анализа сыворотки крови рыб было выявлено б особен из первой зксперикентальной группы с детектируемым количеством чужеродного белка. Скрининг ДНК ло Саузерну выявил, что только 3 карпа из шести (П34, IJ84, U75) содержали последовательности введенного гена. Еа рисунке 10 представлен анализ ДНК этих рыб после обработки рестриктазаки PstI, EcoBI+PstI, ВатДТ.

Рекомбикантлая конструкция не претерпела заметных перестроек косле введения з яйцеклетку карпа II 75 (количество копий - 20, уровень экспрессии 4 нг/мл). Копии генов, по всей видимости, соединились в ориентации "голова к хвосту".

При анализе рестрицированной ДНК карпа 1784 (количество копий

1, уровень экспрессии 4нг/мл) крэке отдельных характеристических фрагментов из внутренних районов конструкции детектируются дополнительные полосы. Скорее всего это фланкирувзке фрагменты, образующиеся на границе с геномной ДНК при интеграции одной копии траксгека.

При анализе рестрнктов, образовавшихся при обработке ДНК карпа IÍ34 (количество копий - 5, уровень экспрессии 4нг/мл) кроке оггидгекьж фрагментов на автографе видны дополнительные полосы, которые образовались либо в результате небольшой перестройки реконбинантной ДЕК, либо из-за наругенкя порядка встраивания "голова к хвосту".

При долгих экспозициях во всех 3-х образцах ДНК kosko видеть отдельные слабые полосы, разлкчасцкеся по размеру, к, по-видимому, соответствующие сигнала!.! от крайних членов тандека. Этот факт и то, что нерестрицкроаанная ДНК всех 3-х рыб при

kb

- 18 -

1 2 3 1 ' 5 ■

HS7

567- —

404-

Рис. 9. Анализ транскрипции гена ШН у трансгеяных вьюнов, (меченый ДНК-зонд РуиЬВ^Ш). Порядок нанесения проб: 1-исходная ДНК зонда; 2- контроль (гибридизация с РНК нетрансгекного вьюна); 3 - РНК рыбы N2/4; 4- РНК рьйы N 0.2/7; 5 - меченые фрагменты ДНК рВЯ322, обработанные рестригсгазой НраП.

V Ц

1 2

___. MafHSI

•ЩЙЩ

Ш

¿Я

3 Э Ю Н

¿тщ

12 15 14

Рис. 10. Гибридизационньй анализ'интеграции гена HBsAg в ДНК тпансгеннах каипов. Порядок нанесения пгюб: 1- ДНК плазмиды 0KSHC3, рестрицйоозанная PstI в количестве 3 копий на геном; 2-то vra, 1 копия на геном. 3-5 - ДНК трансгенного карпа N34, обработанная разными рестриктазами (3- PstI; 4- EcoRI+PstI; 5-Bariil): 5-8 - ДНК N34 ли повторном выделении; 9-11 - ДНК карпа N84; 12-14 - ДНК карпа N75.

злектрофоретическом разделении движется вместе с клеточной ДНК, зозволяет с больпой вероятностью предполагать, что рекомбинантная !ЩК встроилась в геном рыб.

Отсутствие факта интеграции рекомбинантной конструкции в геном карпов N27, N23 и N51 можно объяснить недостаточной чувствительностью гибридизационного метода в случае встраивания грансгеяа не во все клетки организма. Разревить эту проблему мы сможем после исследования ДНК потомков этих рыб. В настоящее время продолжается работы по получению и изучению следующих генераций трансгенкых карпов.

.Б560ДЫ.

1. В результате точных михроиньекций в мужской пронуклеус зигот кроликов рекомбннантных конструкций с геном гормона роста человека были получены 5 трансгенных животных (у 4-х из них отмечена экспрессия чужеродного гена). Количество копий встроившихся чужеродных последовательностей колебалось от 0.5 до 200 на геном. Только у одного кролика введенная конструкция не претерпела при встраивании заметных перестроек.

2. Впервые получены трансгенные рыбы (вьюны) с опереваюпим темпом роста вследствие экспрессии в них рекомбинантной конструкции с гетерологичным геном гормона роста. Число копий встроившихся чужеродных последовательностей варьировало от 1 до 30 на диплоидный геном. Введенная ДНК, как правило, не претерпевала закатных изменений при встраивании. Еысокая выживаемость (более 50% зародышей, достигших стадии выклева) к высокая эффективность процесса трансформации (более 40% подопытных сеголеток) позволяют надеяться на универсальность примененного подхода для получения трансгенных особей других видов рыб, а чувствительность представителей этого класса к введенному гормону роста, б том числе к гетерологичному, - на опережающий рост трансгенных особей.

3. Получены трансгенные зеркальные карпы, экспресскрушше поверхностный антиген вируса гепатита В человека. Из 64 вылупившихся мальков касть имели детектируемое количестве чужеродного белка в крови, у троих из б подтвержден факт

интеграции рекомбикаятнок конструкции. Количество копии трансгена колеблется от 1 до 20. В настоящее время проводится работа по получении потомства трансгеяных карпов.

4. Нами были'получены н проанализированы трансгенные-свиеьи в количестве 5 особей, содержаниях, вероятнее всего, в составе своего генома ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека (эффективность получения трансгенных свиней составила около 7.8%). Во всех изученных случаях наблюдалось мозаичное встраивание чужеродной ДНК, сопровождающееся ее перестройками. В эксперименте показан детектируемый уровень экспрессии этого гена (200 нг/мл) и выход продукта в сыворотку крови, тем самым продемонстрирована возможность использования трансгеяных сельскохозяйственных еивотных для получения биологически активных продуктов.

5. Точная транскрипция гена и синтез белкового продукта демонстрирует возможность использования рекомбинантных копий комплементарной ДНК гена с добавленными регулягорндаи последовательностями, обеспечивающими ' правильный процессинг и стабильность РНК.

.ШИ5.РАМТ..0ШГБШ0БШИ.00.ТБ№-ЖСБеТ4Ш»

1. Г.Н.Ениколопов, В.И.Захарчеяко, К.А.Гращук, Н.М.Сураева, Г.П.Георгиев, Е.А.Тиняеза, П.Н.Рубцов, К.Г.Скрябин, А.А.Баев, Л.К.Эрнст. Получение трансгеяных кроликов, содерзацих и экспрессирувщих ген соматотропина человека.- Доклады АН СССР, 1988, т.299, Н 5, с.1246-1249.

2. Г.Н.Ениколопов', А^О.Бенвмов, В.А.Барминцев, И.А.Зеленина, Л. А.Слепцова, В.К.Дсронин, В.А.Голиченков, М.А.Гра1цук, Г.П.Георгиев, П.М.Рубцов, К.Г.Скрябин, А.А.Баев. Опережающий рост трансгенных рыб, содержащих ген соматотропина человека.-Доклады АН СССР, 1988, т.301, И 3, с.724-727.

3. И.М.Васильев, Т.В.Васильева-, Г.П.Георгиев, М.А.Градук, Г.Н.Ениколопов, В.А.Кузин, А.А.Кущ, О.В.Маслова, Т.В.Мичурина, А.А.Некрасов, Т.М.Нкконова, М.С.Слезингер, Н.Г.Хрутцов, И.Я.Зихов, Л.К.Зрнст. Получение траксгенных свиней, содернащих

и экспрессируюцих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека.- Доклада АН СССР, 1989, т.306, Н 1, с.206-205.

. А.О.Бенамов, Г.Н.Ениколопов, В.А.Бариинцев, И.А.Зеленина, Л.А.Слепцова, Ю.К.Доронин, В.А.Голичеиков, М.А.Гращук, Г.П.Георгиев, П.Н.Рубцов, К.Г.Скрябин, А.А.Баев. Интеграция и экспрессия гена соматотропного гормона человека у костистых рыб.- Генетика, 1989, т.ХЭТ, N 1, с.24-35.

'). Л.К.Эрнст, Б.А.Кузин,., Г.Н.Еникологое, М.С.Слезингер,

Г.П.Георгиев, И.Я.Шихов, И.Н.Васильев, К.А.Грачук, А.А.Некрасов, А.А.Кущ, О.В.Масалова, Т.В.Васильева, Т.В.Мичурина, Н.Г.Хрущов. Перенос гена поверхностного антигена вируса гепатита В человека в зиготу свиньи и исследование тканеспецифичности его экспрессии. - Доклады ВАСХНИ1, 1990, Ш 9, с.45-49.