Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие глюкокортикоидрецепторных комплексов с ядерными структурами клеток печени крыс при старении и внешнем гамма-облучении организма

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие глюкокортикоидрецепторных комплексов с ядерными структурами клеток печени крыс при старении и внешнем гамма-облучении организма"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

МОНТИК Всеволод Иванович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЛЮКОКОРТИКОИДРЕЦЕПТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С ЯДЕРНЫМИ СТРУКТУРАМИ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТАРЕНИИ И ВНЕШНЕМ ГАММА-ОБЛУЧЕНИИ ОРГАНИЗМА

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 1992

Работа выполнена в Институте радиобиологии АН Беларуси

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор, академик АН Беларуси Конопля Е.Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Пикулев А.Т., доктор биологических наук, профессор Лемешко В.В.

Ведущая организация - Институт экспериментальной и теоретической биофизики АН России

Защита диссертации состоится 1992 г.

в часов на заседании специализированного совета Д 006.30.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Институте радиобиологии АН Беларуси по адресу: 220600, г.Минск, ул. Жодинская,2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института радиобиологии АН Беларуси

Автореферат разослан "Зп Л^^и^1992 г.

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Несмотря на то, что сформулированы общие принципы взаимодействия глюкокортикоидов с тропными тканями, многие механизмы ответа клеток-мишеней на воздействие стероидного гормонального стимула остаются недостаточно изученными. Согласно общепринятым представлениям липофильные молекулы стероида проникают в клетку, где связываются с внутриклеточными рецепторами / Lan et ai, 1984/. Гормонрецепторные комплексы подвергаются сложной конформационной перестройке, в результате чего приобретают повышенное сродство к ядерным связывающим участкам. С точки зрения множественности акцепторных центров в клетках-мишенях такими"участками могут быть, кроме хроматина, ядерная оболочка /Smith and von Holt,i9Si / и ядерный матриксА1гзс)1 et al,1986 /, а также рибонуклеопротеидные частицы, содержащиеся как В ядре, так И В цитоплазме /Rossini,1984; Economidis and Rousseau,1985 /. По-видимому, глюкокортикоидрецепторные комплексы (ГРК) способны связываться с различными ядерными компонентами одновременно или последовательно, регулируя экспрессию генов на разных ее этапах.

Выяснению некоторых сторон процесса взаимодействия ГРК с субъядерными фракциями клеток Печени крыс и посвящена основная часть нашей работы. Кроме того, представлялось важным изучить особенности связывания ГРК с ядерными структурами при старении организма и воздействии на него такого повреждающего фактора как ионизирующее излучение. Выбор именно этих условий определялся прежде всего той важной ролью, которая отводится глюкокортико-идным гормонам в реализации процессов, протекающих при старении и пострадиационном восстановлении функций организма. В частности, имеющиеся в нашем распоряжении данные указывают на то, что механизмы действия кортикостероидов в. гормончувствителыпзх тканях претерпевают значительные изменения при старении /Г.Л.Лукша, Б.Ф.Ванюшин,1984; Konoplya et al,1986 ; Г.Н.Фильченков и др., 1991/. Однако, следует заметить, что при этом рассматривались в основном начальные циторецепторные этапы взаимодействия гормонов с клетками-мишенями, либо общее связывание глюкокортикоид-ных рецепторов с ядрами или хроматином. В нашей работе предпринята попытка сравнительного анализа взаимодействия ГРК с раз-

личными субъядерными фракциями клеток печени крыс - одного из основных органов-мишеней для глюкокортикоидных гормонов.

С другой стороны, показана существенная роль гормонов коры надпочечников в протекании пострадиационных процессов в организме /Г.А.Докшина, 1984/. К сожалению в литературе практически отсутствуют данные об особенностях взаимодействия ГРК с ядерными структурами при действии ионизирующего излучения в относительно малых и сублетальных дозах. Тем не менее, в последнее время получает распространение так называемый рецептороло-гический подход к исследованию радиационных повреждений, при котором различным рецепторным системам клетки отводится ключевая роль в реализации как краткосрочных, так и отдаленных адаптивных изменений метаболизма органов и тканей с разной радиочувствительностью /А.С.Соболев, 1989/. В связи с этим становится очевидной значимость изучения функционирования глюкокортикоидных рецепторов в условиях лучевой болезни для понимания первичных механизмов радиационного воздействия на организм.

Цель и задачи г следования. Целью настоящей работы явилось изучение характера и степени взаимодействия ГРК с различными ядерными структурами клеток печени крыс, а также влияние на эти процессы старения и однократного внешнего облучения организма. В ходе исследований предполагалось последовательна решать следующие задачи:

1. Охарактеризовать связывание ГРК с высокоактивной и потенциально активной фракциями хроматина печени крыс.

2. Провести анализ связывания частично очищенных и цитозоль-ных ГРК с нехроматиновыми компонентами ядер печени крыс, а именно, ядерным матриксом, ядерной оболочкой и рибонуклеопротеидными частицами.

3. Оценить влияние старения на процесс взаимодействия ГРК со связывающими участками в исследуемых ядерных фракциях.

4. Изучить способность к связыванию ГРК хроматином, ядерным матрикоом, ядерной оболочкой клеток печени крыс в различные сроки после острого гамма-облучения организма.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований показано, что коровые структуры ядра или ядерный матрикс являются важным участком взаимодействия ГРК с клеткой-мишенью. Определены параметры этого взаимодействия, кроме того, обнаружены ре-

цепторы глюкокортикоидов с умеренным сродством, устойчивые к . обработке нуклеазами и экстракции солью. Впервые показана возможность высокоаффинного взаимодействия ГРК с гетерогенными по размерам рибонуклеопротеидными частицами, содержащимися в нук-леоплазме.

Новыми являются данные по возрастным особенностям взаимодействия ГРК с отдельными ядерными структурами клеток печени 'крыс. Установлено, что при старении снижается величина связывания активированных глюкокортикоидных рецепторов с ядерной оболочкой и ядерным матриксом, причем это снижение обусловлено взаимным влиянием факторов как цитозольного, так и ядерного происхождения.

Анализ связывания ГРК с ядерными компонентами клеток печени облученных крыс позволил придти к заключению, что в течение 1-3 суток после облучения снижается способность мембранных структур ядерной облочки удерживать трансформированные рецеп-торные комплексы. С другой стороны, к отдаленным последствиям острого гамма-облучения в нелетальных дозах можно отнести увеличение уровня связывания ГРК с потенциально активными доменами хроматина.

Теоретическое и практическое значение работц. Полученные данные расширяют представления о клеточных механизмах действия стероидных гормонов. Результаты сравнительного анализа роли отдельных ядерных компонентов в акцепции ГРК позволяют -характеризовать ядерную оболочку, ядерный матрикс и рибонуклеопротеид-(РНП)-содержащую фракцию как потенциальные участки контроля генной экспрессии у эукариот со стороны стероидных гормонов. Данные по снижения степени взаимодействия трансформированных цитозольных глюкокортикоидных рецепторов с остаточными ядерными структурами при старении представляют практический интерес для понимания процесса возрастной эндокринной перестройки. Кроме того, в работе раскрываются особенности взаимодействия ГРК с ядерными структурам клеток-мишеней в различные сроки после острого внешнего гамма-облучения в относительно малых дозах, что весьма важно при оценке ранних и отдаленных последствий воздействия ионизирующего излучения на организм.

Положения выносимые на защиту.

I. Остаточные структуры ядра (ядерный матрикс и ядерная обо-

лочка), а также РНП-фракция наряду о хроматином являются важными участками взаимодействия ГЕК с ядрами клеток печени.

2. Старение организма сопровождается снижением способности ядерного матрикса и ядерной оболочки удерживать цитозольные ГРК.

3. Острое тотальное гамма-облучение в нелетаньных дозах вызывает снижение величины связывания ГРК с ядерной оболочкой в первые дни после радиационного воздействия.. Отдаленные эффекты облучения проявляются в увеличении степени взаимодействия глюкокор-тикоидных рецепторов с потенциально активной фракцией хроматина.

■ Публикации и апробация работы. Результаты исследований опубликованы в II научных работах, доложены и обсуждены на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза" (Харьков,1987), 5-м Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси,1988), 1-м Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва,1989), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллинн,1990).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 4 глав экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 5 таблицами,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на нелинейных белых крысах-самцах 6- и 24-мес. возраста, содержащихся на стандартном рационе вивария. Животных подвергали однократному общему внешнему облучению от кобальтового источника на установке УГУ-420 в дозах I и 3 Гр при мощности дозы 2,7- ДГ^Гр/с.

Цитозоль гепатоцитов получали из гомогената печени центрифугированием при 105000g в течение 60 мин, при атом для стабилизации белков рецепторной и нерецепторной природы использовали дитиотреитол и глицерин. Ядра из печени крыс выделяли, используя метод Г.А. Романова /1976/ с незначительными модификациями. Частичную очистку ГРК на ДНК-целлюлозе осуществляли по методу H.A. Романовой /1980/. Ядерную оболочку гепатоцитов выделяли согласно Leiebvre and Uorante/1982/, ядерный матрикс -Berezney and Coffey /1977/, РНП-фракцию - по методу О.П. Самариной /1965/,

фракции хроматина - в соответствии со схемой, предложенной Г.И.Чихиркиной с соавт. /1976/.

Исследование связывания ГРК с хроматином проводили с помощью метода осаждения ДНК-белковых комплексов сульфатом стрептомицина /Зре1зЬе^, 1983/. Величину связывания ГРК о РНП-со-держащей фракцией оценивали после мембранной фильтрации инкубационной смеси через фильтры ыиироге . В остальных случаях разделение свободных и связавшихся с ядерными структурами ре-цепторных комплексов достигалось путем осаждения (14000е в течение 5-10 мин) суспензии ядерных частиц с последующей их промывкой. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Лоури А1агкшге11 et а1,1978/ и спектрофотометрически,. ДНК и РНК - по А.С.Спирину /1958/. Статистическую обработку данных проводили методами вариационной статистики /П.Ф.Рокицкий,1977/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Взаимодействие глюкокортикоидрецепторных комплексов с хроматиновыми фракциями клеток печени

Интересной особенностью взаимодействия ГРК с хроматином явился сложный характер зависимости величины удельного связывания от концентрации преципитирующего агента (рис.1). По-видимому, это указывает на существование фрагментов хроматина, взаимодействующих с глюкокортикоидными рецепторами с более высокой эффективностью, чем основная масса ДНК.

Представлялось важным изучить влияние ионной силы на сте- • пень взаимодействия ГРК с исследуемыми фракциями хроматина. Ранее было показапо /Ноиозсаи,1975/, что связывание стероид-рецепторных комплексов с ДНК низкоспецифично и заметно снижается уже при физиологических концентрациях соли. Данные, приведенные на рис.2, свидетельствуют о том, что удерживающие ГРК участки в нуклеопротеидных фибриллах в основном,устойчивы к умеренным концентрациям ИиС1. При этом участок кривой, соответствующий предполагаемым солерезистентным сайтам, более вы-, ражен во фракции активно транскрибированного хроматина.

При титровании связывающих участков в хроматине возрастающими концентрациями гормонрецепторных комплексов обнаружено специфическое, но ненасыщаемое связывание глюкокортшсоидных

раси/мин-мкг ДНК 500 ©

0,5

1,0

2,0

Конц. сульфата стрептомицина, мг/мл

РисЛ. Связывание глюкокортикоидрецепторных комплексов с относительно неактивнымШ и активным(П) хроматином в зависимости от концентрации стрептомицина.

рецепторов с нуклеопротеидными фрагментами (рис.3). Несмотря на высокую связывающую ёмкость хроматина, оказалось, что уровень связывания ГРК с транскрипционноактивной фракцией примерно в два раза выше чем с относительно неактивной. Различия в степени взаимодействия определяются, скорее всего, белковым фактором, а именно, наличием большого числа негисгоновых белков во фракции постоянно активного хроматина.

Таким образом, анализ взаимодействия ГРК с хроматином позволяет придти к выводу, что рецепторные комплексы связываются с основной частью нуклеопротеидных фрагментов с невысоким сродством, поскольку не наблюдается насыщения связывающих участков при концентрации глюкокортикоидных рецепторов, соответствующих их клеточному содержанию. Тем не менее, некоторые данные (рис.1) указывают на существование в составе исследуемых фракций хроматина акцепторных центров, тлеющих гораздо более высокое сродство к гормонрецепторным комплексам. Уместно предположить, что они

расп/мин-мкг ДНК

О.

О—о

о (II)

(I)

од

0,2

0,3

0,4

КОНЦ.HaCl , М

Рис.2. Связывание глюкокортикоидрецепторных комплексов с относительно неактивным( I) и активным(П) хроматином в зависимости от концентрации Nací .

расп/мин • 10'

12

,-3

(II)

%-дексаме таз о нре-цепторные комплексы,

расп/мин - Ю-3

10 40 80

Рис.3. Связывание глюкокортикоидрецепторных комплексов с относительно неактивным(1) и активным(II) хроматином в зависимости от количества ^-дексаметазон-рецепторних комплексов.

шокируются большим количеством низкоаффинных связывающих участков, распространенных по всему хроматину, роль которых ещё неизвестна. Наиболее вероятным следствием массированного накопления ГРК в транскрипционноактивных доменах хроматина (рис.2 и 3) могла бы быть деконденсация его обширных участков, приобретение хроматиновыми петлями "открытой" конформации, способствующей усилению экспрессии сосредоточенных в них генов.

2. Сравнительная характеристика связывания глюкокортикоидре-цепгорных комплексов с нехромагиновыми компонентами ядер

Учитывая имеющиеся данные по связыванию стероидрецепторных комплексов с нехроматиновыми компонентами ядер, а также трудности в обнаружении хроматиновых участков, удовлетворяющих критериям высокоаффинных акцепторных центров, мы попытались исследовать характер и степень взаимодействия ГРК с нехроматиновыми фракциями ядер гепатоцитов крыс.

При инкубировании фрагментов ядерной оболочки с цитозолем, содержащим меченые -■ормонрецепторные комплексы, обнаружилось, что ^ 15-20% радиоактивности удерживалось во фракции ядерной оболочки (рис.4).

пмоль/мг белка

Рис.4. Связывание цитозольных ф ) и частично очищенных (ф ф ) глюкокортикоидрецепторных комплексов с ядерной оболочкой 6-(1) и 24-(П) мес. крыс.

Связывающие, участки ядерной оболочки оказались ненасыщаемыш, что указывает на невысокое сродство взаимодействия ГРК с данной фракцией ядер. Следует отметить более высокую степень связывания очищенных комплексов чем глюкокортикоидных рецепторов, содержащихся в необработанном цитозоле. Порученные данные, на наш взгляд, соответствуют приводившимся ранее доказательствам наличия в ци-тозольной фракции разнообразных факторов, ингибирующих процесс связывания стероидрецепторных комплексов с ядерным материалом. Обнаружение способности к взаимодействию с ядерйой оболочкой особенно важно для понимания клеточных механизмов действия глю-кокортикоидных гормонов, так как последние данные указывают все-таки на цитоплазматическое местонахождение их рецепторов и необходимость последующей транслокации ГРК в ядро через двухслойную ядерную мембрану / Gase et al,1989/.

Исследование взаимодействия ГРК с ядерным матриксом проводили путем обменного анализа in vitro , используя как частично очищенные комплексы, так и цитозоль, содержащий меченые х'люкокорти-коидные рецепторы. Установлено, что структуры ядерного матрикса способны акцептировать частично очищенные дексаметаэонрецептор-ные комплексы насыщаемым образом (рис.5). Связывающие участки тлеют сродство порядка 10® и емкость^ 2,5 тыс. сайтов на гаплоидное ядро, что совпадает с величинами, характеризующими связывание глгакокортикоидннх рецепторов с интактными ядрами. В результате инкубации возрастающих концентраций цитозольных рецепторов с ядерным матриксом также отмечено насыщение связывающих центров при содержании ГРК в среде Ю-9 !Л, что свидетельствует о высоком сродстве связывания (рис.6). Гораздо меньшая по сравнению с очищенными комплексами величина удельного связывания цитозольных рецепторов (50 и 12-20 пмоль/мг ДНК соответственно), возможно, объясняется присутствием в цитозоле агентов, ингибирующих либо куклеофильную трансформацию рецепторов, либо процесс их акцепции ядерным матриксом.

Исследование связывания глюкокортикоидннх рецепторов с рибо-нуклеопротеидными частицами проводили путем инкубации in vitro частично очищенных ГРК с нуклеоплазмой ядер печени крыс. При фильтрации инкубационной смеси через мембранные фильтры выявлено насыщаемое высокоаффинное связывание комплексов с акцепторными участками в нуклеоплазме (рис.7). Анализ данных в коорди-

0,25 0,5 0,75 1,0

Рис.5. Связывание частично очищенных глюкокортикоид-рецептор.лх комплексов с ядерным матриксом.

Рис.6. Связывание цитозольных глюкокортшсоидрецепторных

комплексов с ядерним матриксом 6-(1) и 24-(Н)мес. крио.

Таблица1. Свдзывание частично очищенных глюкокортикоид-рецепторных комплексов с ядерными фракциями клеток печени крыс

""\Показа-, ^\тель фракция\^ связ.ГРК1^ кол-во связ.уч. (на ranл.ядро) макс, кол-во связ. уч.(на гапл.ядро)

ядерная оболочка 0,65 пмоль/мг белка 325

ядерный матрикс 13,6 пмоль/мг ДНК 680 2500

РНП-фракция 2,6 пмоль/мг РНК 230 665

относительно неакт. хроматин 0,19 пмоль/мг ДНК 710

транскрипц. акт. хроматин 0,44 пмоль/мг ДНК 440

концентрация ГРК в среде 0,25 нМ

пмолъ

да РНК

О,

в/и

\ В, пМ

150 300 0.

Конц. ГРК, н.М

0,4 0,8 1,2

Рис.7. Связывание глвжоко:-икоядрецепторных к-::лтехчои с фракцией нуклеоплао./л ядер ¡игы.г.:.

натах Скэтчарда дал следующие значения для основных параметров связывания: Вмакс>= 7,4 пмоль/мг РНК и Кд~10-10 М.

Результаты, полученные при изучении взаимодействия глюкокорти-ковдных рецепторов о ядерными структурами, полезно рассмотреть в виде сводной таблицы (табл.1), характеризующей их связывающую емкость в пересчете на гаплоидное ядро гепатоцита крыс. Сравнивая роль различных нехроматиновых компонентов в связывании с . ГРК, можно заключить, что ядерный матрикс и РНП-содержащая фракция ядер являются важными участками глюкокортикоидрецептор-ного взаимодействия с тропными тканями. Об этом свидетельствует высокое сродство (Ю9-Ю10 М-1) и незначительная емкость, соответствующая физиологическому содержанию глюкокортикоидных рецепторов в клетках печени. Дополнительным доказательством значи-' мости исследуемых нехроматиновых компонентов для механизмов функционирования ГРК является обнаружение эндогенных глюкокор-тикоидсвязывающих участков в ядерном ^атриксе и нуклеоплазме, причем их количество в последней фракции значительно снижается в результате блокирования синтеза и созревания РНК актиномици-ном Д. Принимая во внимание способность ядерной оболочки удерживать значительное количество трансформированных.рецепторов (—'1/4 от связываемых хроматином в тех же условиях), нельзя исключить возможность осуществления ею регуляторных функций в отношении поступления комплексов в ядро и доступности для них вы-оокоаффинных акцепторных участков. В целом же, результаты измерений, приводимые в табл.1, вписываются в схему многоэтапного взаимодействия ГРК с ядерным содержимым клеток-мишеней.

3. Возрастные особенности взаимодействия глюкокортикоид-рецепторных комплексов с ядерными структурами

На рис.4 приведены данные по связыванию цитоэольных рецепторов с ядерной оболочкой у 6- и 24-мес. крыс. Характерно, что у

старых животных наблюдается уменьшение величины связывания, что,

вероятно, свидетельствует о снижении реактивности ткани печени

но отношению к кортикостероидам. Для более полного выяснения роли цитозольных и ядерных факторов при взаимодействии ГРК с

ядерными структурами проводились опыты по схеме перекрестного

связывания с внесением аликвот меченых цитозольных или частично

очищенных рецепторов. Из табл.2 видно5 что снижение у старых

животных уровня связывания цитозольных ГРК с ядерной оболочкой и ядерным матриксом вызывается взаимным влиянием факторов как цитозольного, так и ядерного происхождения.

Таблица 2. Влияние возраста животных на связывание цитозоль-ных и частично очищенных глюкокортикоидрецептор-ных комплексов с ядерными фракциями.

Возраст,мес. Количество связанных ^Н-ГРК

вдто-30 ль ядерная фракция ядерная ядерный отн.неакт. транскр. акт. оболочка матрикс хроматин хроматин

тасп мин-мкг белка расп/мин-мкг ДНК

6 6 125+10 1232+132 36+4 95+8

6 24 108+8 897+115 37+4 101+10

24 6 110+11 935+127 42+6 99+11

24 24 94+9* 790+128* 40+4 86+10

*- Различия достоверны по сравнению с 6-мес. крысами(Р<0105)

Отсутствие возрастных различий во взаимодействии ГРК с хро-матиновыми фракциями, возможно, объясняется тем, что большая часть связывающих участков, обнаруживаемых с помощью использованных нами методов, в хроматине являются кизкоаффинными. В то же время, обнаружено уменьшение степени связывания рецепторов с ядерной оболочкой и ядерным матриксом - двумя нехроматиновыми структурами, осуществляющими, тем не менее, ключевые функции в первичных механизмах ответа клеток-мишеней на действие гормона.

Меньшая степень "загруженности" связывающих участков в ядерной оболочке, оделяемой из 24-мес. крыс, по нашему мнению, в некоторой степени отражает угнетение с возрастом способности гормончувствительной ткани отвечать на воздействие гормонального стимула. Кроме того, существенное снижение связывания ци-тозольных ГРК с ядерным матриксом (рис.6), учитывая первоочередное значение матрикса для процессов ядерного функционирования, может оказывать негативное влияние на ход вза:а.;одействия стероидных гормонов с клеткамп-г.гаеняг.я и быть о;;» из проял-

лений общего дисбаланса стероидной регуляции в гормонокомпетент-ных тканях при старении.

4. Влияние внешнего облучения животных на связывание глюко-кортикоидрецепторных комплексов с ядерными структурами

В отличие от старения, представляющего собой естественный, долговременный процесс, отражающийся на жизнедеятельности всех систем организма, острое гамма-облучение даже в небольших дозах - непродолжительное и экстраординарное событие. Поэтому обнаруженные нами пострадиационные изменения в процессе взаимодействия ГРК с отдельными ядерными компонентами (табл.3) имеют по сравнению с выявленными при старении разнонаправленный характер. В частности, выраженные радиационноиндуцированные эффекты в ранние сроки после облучения (1-3 сутки) проявляются при связывании ГРК с ядерной оболочкой и ядерным матриксом. Тот факт, что пострадиационные изменения возникают и исчезают достаточно быстро (в течение 10-и суток) свидетельствует, по-видимому, о высокой лабильности мембранных структур и их способности к восстановлению нормального уровня стероидрецептор-ного связывания. На наш взгляд, одной из причин уменьшения связывания рецепторных комплексов с мембранами ядерной оболочки является то, что значительная часть акцепторных центров ядерной оболочки оказывается занятой эндогенными рецепторами. Такая ситуация могла бы возникнуть в результате стресса, вызванного острым облучением организма.

С другой стороны, в несколько отсроченный период после облучения происходят избирательные изменения в величине связывания ГРК с хроматином. Связывающая способность фрагментов относительно неактивного хроматина, выделенного из печени облученных животных, возрастает через 1-2 месяца на 20-25$, тогда как уровень связывания рецепторов с транскрипционноактивным хроматином не отличается от контроля. Предполагается, что в этот период может происходить некоторая деконденсация потенциально активных доменов хроматина, что оказывает влияние на величину связывания комплексов с этой хроматиновой фракцией. Не исключено, что усиление связывания ГРК с относительно неактивным хроматином отражает реализацию каких-то адаптивных изменений в гепатоцитах в ответ на облучение, принимая во внимание плас-

тичность печеночной паренхимы и ее значительную способность к регенерации.

Таблица 3. Влияние внешнего облучения на овязывание глюкокор-

тикоидрецепторных комплексов о ядерными фракциями (% по отношению к контролю)

Цоза, Гр ^\Срок после ^С^Обл. , Ядерная^\сутки фракция I 3 10 30 60 90 180

I ядерная оболочка 74+12 85+13 95+10 100 ¡100 100

I 3 ядерный матрико ядерный матрико 87+12 84+14 100 100 100 100 82+15 86+15 100 100 100 100

3 отн. неактивный хроматин 100 ! 100 | 100 :123+11 121+12 1 100

*- Различия достоверны по сравнению о контролем (Р<0,05) ВЫВОДЫ■

1. Связывание глюкокортикоидрецепторкых комплексов о различающимися по транскрипционной активности фракциями хроматина печени крыс ненаснщаемо, одной из причин чего является маскировка истинных акцепторных центров для глюкокортикоидных рецепторов.

2. Мембранные структуры ядерной оболочки способны удерживать значительную часть активированных глкдаокортикоидрецепторнш: комплексов. При этом величина связывания частично очищенных комплексов оущеотвенно выше чем глюкокортикоидных рецепторов, содержащихся в необработанном цитозоле,

3. Связывание глюкокортикоиднмх гормонов в глюкокортикоид-рецепторных комплексов с ядерным матриксом печени крио насыщаемо при физиологических концентрациях стероида и гормонрецеп-торных комплексов. Ограниченная емкость и виоокое сродство связывания глюкокортикоидных рецепторов с ядерным ыатрикоом свидетельствуют о том, что в гепатоцитах крыо коровне структуры ядра являются важным акцепторным участком для глюкокортикоидрецеп-торных комплексов.

4. Очищенные глюкокортикоидннв рецепторы способны к выооко-аффинному взаимодействию о нуклеоплазмой гепатоцитов крыс, со-

держащей гетерогенные do размерам рибонуклеопротеидные частицы. Кроме того, в составе компонентов нуклеоплазми обнаружены эндогенные глюкокортикоидовязывающие участки, выявление которых зависит от нормального протекания процессов синтеза и созревания РЖ.

5. При старении происходит снижение связывающей способности ядерной оболочки и ядерного матрикса, обусловленное взаимным . влиянием факторов как цигозольного, так и ядерного происхождения. Не наблюдалось возрастных изменений в процессе взаимодействия глюкокортикоидрецепторных комплексов с хроматином вследствие высокой его связывающей емкости.

6. Острое тотальное внешнее гамма-облучение животных в относительно малых дозах приводя^, к снижению уровня связывания глю-кокортикоидных рецепторов о ядерной оболочкой клеток печени крыс в течение 1-3 суток после радиационного воздействия.

7. В отдаленный период после внешнего гамма-облучения крыс в относительно малых дозах происходят избирательные изменения во взаимодействии глюкокортикоидрецепторных комплексов о потенциально активными доменами хроматина, тогда как уровень связывания рецепторов о высокоактивной фракцией хроматина не отличается от контроля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Конопля Е.Ф., Лукша Г.Л., Наумов А.Д., Саватеев С.К., Фильченков Г.Н., Монтик 1Г.И. Рецепция стероидных гормонов и функциональная способность клеток в онтогенезе // 7 съезд Белорусского общества физиологов им. И.П. Павлова: Тез.докл.- Витебск, 1987.-' С. 114.

2. Конопля Е.Ф., Лукша Г.Л., Хиткович А.В,, Монтик В.И., Наумов А.Д., фильченков Г.Н., Саватеев С.К., Попов Е.Г. Клеточная рецепция стероидов в онтогенезе // Респ. конф. эндокринологов, посвященная 25-дотию общества эндокринологов Лит.ССР: Тез. докл.- Вильнюо, 1987.- С. 85-86.

3. Конопля Е.Ф., Детинкин О.Н., Лукша Г.Л., Фильченков Г.Н., Саватеев С.К., Наумов А.Д., Попов Е.Г., Хиткович A.B., Монтик В.И. Механизмы действия стероидных гормонов в онтогенезе // Воес. симпоз. "Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза": Тез. докл.- Харьков, 1987.- С. 96-97.

4. 'КоньпляЕ.Ф., Детинкин О.Н., Ластовская Т.Г., Лукша Г.Л., Монтик В.И., Фильченков Г.Н., Науменко В.К., Попов Е.Г., Сава-геев С.К., Селявко В.В- Возрастные особенности действия стероидных гормонов в организме// 5 Всес. съезд геронтологов и гериатров: Тез. докл.- Тбилиси, 1988.- С. 188.

5.. Монтик В.И. Связывание глюкокортикоидрецепторных комплексов с ядерной оболочкой клеток печени крыс при действии малых доз внешнего облучения// Респ. научно-практ. конф. по радиобиологии и радиоэкологии: Тез. докл.- Минск, 1988.- С. 124.

6. Конопля Е.Ф., Монтик В.И. Связывание глюкокортикоидов и глюкокортикоидрецепторных комплексов с ядерным матриксом печени крыс// Проблемы эндокринологии.- 1989.- С. 50-54.

7. Монтик В.И. Возрастные особенности связывания глюкокортикоидрецепторных комплексов с ядерной оболочкой клеток печени крыс// Весц1 АН БССР. Сер. б1ял. навук.- 1989.- М.~ С. 80-83.

8. Лукша Г.Л., Попов Е.Г., Саватеев С.К., Наумов А.Д., Монтик В.И., Фильченков Г.Н., Гаврилин М.А. Система рецепции стероидных гормонов в условиях внешнего гамма-облучения в малых дозах// I Всес. радиобиол. съезд, Москва, 21-27 авг. 1989 г.: Тез. докл.- Т.5.- Пущино, 1989.- С. II53-II54.

9. Конопля Е.Ф., Лукша Г.Л., Детинкин О.Н., Киткович A.B., Гаврилин М.А., Монтик В.И., Фильченков Г.Н. Механизмы реализации эффекта глюкокортикоидов при старении// Физиологический журнал СССр им. И.М. Сеченова.- 1990.- Т.76, J6 9.- C.I224-I230.

10. Лукша Г.Л., Гаврилин М.А., Монтик В.И., Конопля Е.Ф. Пострадиационные нарушения в системе внутриклеточной рецепции глюкокортикоидов// Доклада АН БССР.- Т.34, МО.- С. 950-952.

11. Конопля Е.Ф., Лукша Г.Л., Гаврилин М.А., Монтик В.И., Селявко В.В. Внутриклеточный цикл кортикостероидных рецепторов// Всес. симпоз. "Биохимия рецепторных систем": Тез. докл.- Таллинн, 1990.- о. 30-31.

Подписано к печати 28.02.92 г.

Формат СО х 84 1/16. Усл. печ. л-. Тираж 100 экз.

Бесплатно. Заказ453.

ГШ БэлНИШТИ. 220004, Минск, ир. Машерова,23.