Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние нейрогормональной регуляции и структурная организация плазматических мембран гладкомышечных клеток аорты крыс при действии ионизирующего излучения

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состояние нейрогормональной регуляции и структурная организация плазматических мембран гладкомышечных клеток аорты крыс при действии ионизирующего излучения"

ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ

На правах рукописи

КАРМАЛЬКОВ Сергей Александрович

СОСТОЯНИЕ НЕЙРОГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК АОРТЫ КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

03.00.04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 1992

Работа выполнена в Институте радиобиологии АН Беларуси

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор, академик АН Беларуси, Конопля Е. Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Гадко Г. Г.

доктор биологических наук, профессор Мэрозкина Т. С.

Ведущая организация - Институт биохимии АН Беларуси

заседании специализированного совета Д 006.30.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Институте радиобиологии АН Беларуси по адресу: 220600, г. Минск, ул. Кодинская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института радиобиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан . 1992 года.

Защита состоится

ь^^еЛ 1992 года в

/V

»0

_часов на

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Ходосовская А. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В последние годы возросло количество исследований, посвященных изучению радиационноиндуцированных нарушений, возникающих в различных оптокинетически стабильных высоко-' дифференцированных тканях, условно называемых некритическими /Яр-моненко, 1989/. Данным нарушениям принадлежит решающая роль в развитии отдаленных последствий облучения.

Общепризнанно, что ионизирующее излучение, поралия сердечно-сосудистую систему, в первую очередь затрагивает сосуды. Отмечено, что сформированные в течении длительного времени малые и относительно малые дозы облучения вызывают развитие нейроциркулятор-ной дистопии /Москалев, 1987/. Считается, что данная реакция неспецифична и связана с нарушением нейрогормональных механизмов регуляции гемодинамики, в частности сосудистого тонуса, и изменением рецепторного аппарата сосудов.

В настоящее время общепризнанно, что клеточные мембраны, наряду. с ДНК. являются одной из основных мишеней действия радиации /Hoteles, 1979; Бурлакова, 1980, 1983/. Однако исследования, проведенные по изучению действия радиации на мембраны, в основном выполнены на изолированных органеллах и клеточных суспензиях с применением больших доз облучения /Фоменко, .1982, 1987/, что в определенной степени снижает значимость данных экспериментов при интерпретации развития радиационного процесса в целостном организме. Исследование действия малых и относительно малых доз ионизирующего излучения на мембраны клеток с различной радиочувствительностью остается практически не изученным.

Дели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение состояния нейрогормональной регуляции и структурной организации плазматических мембран гладкомышечных клеток сосудов при действии ионизирующего излучения в относительно малых и сублетальной дозах. При этом предусматривалось решение следующих задач:

1. Определить кинетические характеристики АТФ-зависимой Са^4 -транспортной функции и Са^4", Mg 2+ -АТФаэной активности плазматических мембран (ПМ) гладкомышечных клеток (ГШ) аорты крыс в различные сроки после тотального гамма-облучения в относительно малых (0,5 и 1,0 Г'р) и сублегаяьной

(4,0 Гр) дозах.

2. Оценить функциональное состояние ренин-ангиотенэин-альдо-стероновой системы (РААС) при аналогичных условиях.

3. Дать характеристику состояния мембраносвязанной аденидат-циклазной системы (АЦС) плазматических мембран гладкомы-шечных клеток аорты крыс после воздействия ионизирующего излучения в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр.

4. Провести сравнительный анализ физико-химического состояния изучаемых мембран при тех же условиях.

Научная новизна Впервые установлено, что гамма-облучение животных в относительно малых и сублетальной дозах (0,5; 1,0 и 4,0 Гр) вызывает изменение транспортной и гидролитической функции Са + -насоса плазматических мембран гладкомишечных клеток аорты крыс в первые 30 суток после воздействия ионизирующего излучения, при этом сродство данной системы к кальцию не изменялось, Механизм ра-диационноиндуцированной модификации насоса Ш ГМК зависит от

дозы облучения.

Обнаружено, что радиационное воздействие приводит к дозоза-висимой модификации активности аденилатциклазы через рецепторные структуры с одновременным изменением удельной плотности и сродства бета-адренорецепторов к адреноагонистам. ГТФ-и Г--зависимая регуляция аде ] 1 плат циклаз ной активности после облучения изменяется разнонаправленно.

Показано, что снижение секреции альдостерона корой надпочечников при воздействии ионизирующего излучения (ИИ) в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр обусловлено дозозависимой модификацией ренин-аягио-тензиновой и стресс-реализующей систем.

Установлено, что радиационноиндуцированное изменение клеточной и экстраклеточной регуляции сократимости ГМК аорты, осуществляющейся при участии плазматических мембран, в значительной мере обусловлено структурной реорганизацией их липидного и белкового компонентов.

Теоретическая и практическая значимость результатов. Установленные в работе радиационноиндуцированнье изменения структур-• но-функционального состояния Ш ГМК при действии ионизирующего излучения в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр являются необходимыми при построении общей теории радиационных нарушений мембранных структур,

становлении радиационной мембранологии, как самостоятельного раздела клеточной радиобиологии.

Обнаруженная в ходе работы модификация жирнокислотного состава, заключающаяся в увеличении общего содержания насыщенных корот-коцепочечных жирных кислот, может быть использована в качестве одного из тестов радиационного воздействия, а также для теоретического и экспериментального обоснования возможной коррекции структурно-функционального состояния мембран в пострадиационный период.

Представляют практический интерес полученные в работе данные о динамике изменеь,..< концентрации функциональных компонентов ренин- ангиотензин-альдостероновой системы, а также удельной плотности и сродства бета-адренорецепторов, стимуляции АЦ-активности 1Ш ГМК адреноагонистамл, что может быть использовано в клинической практике при выборе тактики лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, формирующихся в пострадиационный период.

Положения, выносимые на защиту . 1. Гамма-облучение экспериментальных животных в относительно малых и сублегальной дозах (0,5; 1,0 и 4,0 Гр) вызывает увеличение максимальной скорости транспорта ионов Са^+ через плазматические мембраны гладкомшечных клеток аорты крыс.

2. Радиационное воздействие в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр приводит к снижению секреции альдостерона корой надпочечников в первые 30 суток после облучения, что обусловлено радиационноиндуцирован-ной модификацией функционального состояния стресс-реализующей и ренин-ангиотензиновой систем.

3. Ионизирующее гамма-излучение (0,5; 1,0 и 4,0 Гр) вызывает несинхронные изменения функционального состояния мембраносвязанных компонентов аденилатциклазной системы плазматических мембран гладкомыиечных клеток аорты крыс.

4. Радиационноиндуцированная структурно-функциональная реорганизация изучаемых мембран в первую очередь обусловлена изменением фосфолипидного и жирнокислотного составов плазматических мембран гладкомышечных клеток аорты крыс.

Публикация и апробация работы. Основные положения диссертацг опубликованы в б научных работах и доложены на IV Всесоюном ст,. позиуме "Лилиды биологических мембран" (Пущино, 1989), V Всесога-

ной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллинн, 1990), конференции ИРБ АН БССР (Минск, 1990), конференции ИРБ АН БССР "Последствия аварии на Чернобыльской АЭС" (Минск, 1991).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуда-ния, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 217 источников (106 - отечественных и Ш - иностранных). Текст диссертации иллюстрирован 23 таблицами и 7 рисунками.

объекты и метода исследования

Исследования выполнены на белых нелинейных крысах-самцах стадного разведения в возрасте б, 7, 12 и 18 месяцев. Б процессе экспериментальной работы проведено 145 серий опытов, в которых использовано 600 животных.

В ходе опыта животных подвергали тотальному гамма-облучению, формирующему поглощенные дозы 0,5; 1,0 и 4,0 Гр, на гамма-установке УГУ-420 с мощностью дозы 2.7 Ю -4 Гр/с, фокусное расстояние 3 метра. В опыт животное брали через 3, 10 , 30, 180 и 365 суток после воздействия ионизирующего излучения. В качестве объекта исследований использовали сыворотку крови и плазматические мембраны гладкомшечннх клеток аорты крыс. В сыворотке крови изучали динамику изменения стресс-реализующего гормона АКТГ и компонентов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы - аяьдостерона, ангио-тензин-конвертирующего фермента, ангиотензина I. •

Фракцию плазматических мембран выделяли по методу предложенному Орловым (1980). Са^+-аккумулирующую способность обратно-ориентированных мембранных везикул гладкомшечных клеток аорты крыс определяли с помощью метода мембранной фильтрации. Расчет концентрации свободного в среде инкубации осуществляли с учетом констант связывания катионов с ЭГТА и АТФ /Fabiato, 1979/. Кир.

нетические характеристики работы Са -насоса - значение величин кажущегося сродства к Са2+ (Км) и максимальная скорость его аккумуляции (Ушах) - рассчитывались из концентрационных кривых зависи-

мости "активность - Г ССа Ч", линеаризированных в координатах Лайнуивера-Бер»<а

Тестирование бета-адренореценторов проводилось с помощью антагониста Н-дигидроальпренолол& Нестимулированную и стимулированную активность аденилатциклазы определяли, используя общепринятые рекомендации /[?ос1Ье11. 1974; Еалденков, 1979; Ткачук, 1983/.

Дня оценки структурного состояния гладкомыиечных клеток аорты крыс проводили изучение микровяэкости ПМ данных клеток с помощью флуоресцентного зонда - пирена /ДоСрецов, 1989/ и анализ фосфоли-пидного и жирнокис"отного составов исследуемых мембран.

В работе использовались следующие химико-аналитические методы: экстракция лшшдов из мембранных препаратов /ГоЗсЬ е. а , 1975/, выделение фосфолипидов /Кейте, 1975/, тонкослойная хромо-тография фосфолипидов /Новицкая, 1972/, количественное определения липидного Рн УЬЬгпззоп, ,1964/, анализ жирнокислотного состава липидов /Берчфилл, Сторрс, 1964/.

Концентрацию белка определяли по Лоури /Ьоу/гу е. ^ , 1951/ или по модификации этого метода для мембран и гомогенатов /МагкиеП, 1978/.

Расчеты и статистическая обработка данных проводили методами вариационной статистики /Рокицкий, 1977/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние гамма-облучения на Са^+-транспортную функиию ПМ ГМК аорты крыс

Анализ радиационноиндуцированной модификации функционального состояния Са -насоса плазматических мембран ГМК аорты крыс осуществлялся с помощью регистрации АТФ-эависимой аккумуляции Сг£+ в обратноориентированные везикулы мембран сарколеммы. Для оценки функционального состояния -насоса рассчитывались кинетические характеристики - максимальная скорость аккумуляции (Утах) и

кажущееся сродство Са^+-транспортной системы к данному иону (Км).

Значения величин максимальной скорости Са^+-аккумулирующей способности плазматических мембран изучаемых клеток в различные сроки после облучения в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр представлены

в таблице 1. Как видно из таблицы облучение в относительно малых

Таблица 1

Максимальная скорость Са2+-аккумулируюшей способности ПМ ГШ аорты крыс в различные сроки после тотального гамма- облучения .^ н^ ^ , (х+Бх)

Опок после облучения (сутки) Контроль 0,5 Гр 1.0 Гр 4,0 Гр

3 0,32+0,06 0,53Ю,09* 0,71+0,11* 0,33+0,06

10 0.32+0,06 0, ЗОН) ,05 0,21¿0,04 0,38+0,06

30 0,32+0,06 0,50+0,06* 1,67+0,31* 0,41+0,11

Примечание: количество экспериментов в серии п = 12; * -статистически достоверные различия (р<0,05)

дозах (0,5 и 1,0 Гр) приводит к значительной активации АТФ-зависимого транспорта ионов Са^а 3 и 30 сутки пострадиационного периода. Расчет значений константы Михаэлиса показал, что Км кальциевого насоса к данному иону оставалась неизменной во все изучаемые сроки. В то же время отмечается повышение активности Са^+, -АТ&зы на 3-е сутки после облучения, что возможно и является причиной увеличения транспорта иона Увеличение на 30-е сутки после радиационного воздействия транспорта кальция при отсутствии изменений функционирования Са^+ , Ме^-АТФазы может свидетельствовать о радиационноиндуци'рованных изменениях конформации кальций-связы-вающих участков изучаемой транспортной системы. Аналогичные результаты были получены и при исследовании действия рентгеновских

лучей в сублетальной и летальной дозах на кинетические характе-2+ 2+-

ристики Са , Ме -АТФазы препаратов плазматических мембран нервной ткани крыс /Матытевская, 1981; Васильев, 1982/. Авторы предполагают, что на раннем этапе лучевого поражения повышение данной ферментативной активности, возможно, связано с увеличением числа оборотов фермента в единицу времени. Изменение механизма, регулирующего активность изучаемого фермента, по мнению исследователей, связано с модификацией цАМФ-зависимого фосфорилирования мембранных

б •

белков, способных активировать Съг, Мг -АТЗазу /Соболев, 1987; Перцев, 1989/.

В последнее время показано, что ИИ приводит к повышению внут-рштеточной концентрации Са^ за счет увеличения проницаемости мембран к данному иону /Дворецкий, 1985, 1990/. Тогда пострадиационную активацию Са ^-транспортной функции ПМ ГМК сосудов модно рассматривать как адаптационно-компенсаторный механизм регуляции внутриклеточного гомеостаза после облучения.

Нами установлено, что ионизирующее излучение в сублетальной дозе (4,0 Гр) не приводило к изменению кинетических характеристик кальциевого насоса Ллш, Кт) в исследуемые сроки пострадиационного периода. При изучении АТФ- независимой сорбции ионов Са*-+ сарколеммой ГМК аорты крыс установлено, что лишь на 3- и 30-е сутки снижалось количество кальция, аккумулированного мембранами. При

р I р.

этом активность Са , Мв -АТФазы на 3-, 10- и 30-е сутки после облучения возрастала в 2-4 раза в сравнении с контрольными значениями. Увеличение гидролитической активности Са + -насоса, при отсутствии изменения его Са ^"-транспортной функции может быть связано как с радиаилонноиндуцированным разобщением гидролитической и транспортной функций данного насоса, так. и со спонтанной утечкой аккумулированного кальция из мембранных везикул вследствие формирования в данной клеточной структуре дефектов, вызванных воздействием ИИ /Орлов, 1987/. Необходимо отметить, что нормализация изучаемых процессов происходит, в течение первых месяцев после облучения.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение, .что радиационное воздействие в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр, вызывающее структурно-функциональную модификацию Са^+-насоса в течение первого месяца после облучения, можно рассматривать как адаптивную реакцию на радиационное воздействие, которая обычно протекает на протяжении аналогичного периода /Селье, 1977/. Молекулярный механизм радиационных нарушений функционирования -транспортирующей системы ГМК аорты крыс зависит от дозы облучения и, возможно, является одной из основных причин возникновения сосудистых нарушений,формирующихся после радиационного воздействия.

Состояние гипофиэарно-надпочечниковой и ренин-алгиотен-зиновой систем при действии ионизирующего излучения

Известно, что облучение приводит к развитию стресса /Селье, 1977; Меереон. 1984/. Исходя из этого определялась плазменная концентрация гормона гипофиза - АКТГ, которая является объективным показателем активации центральных звеньев стрессреализуицей системы. Шло обнаружено, что радиационное воздействие в дозах 0.5; 1,0 и 4,0 Гр вызывает увеличение содержания АКТГ в плазме крови в течение 10 суток после облучения. К 30-м суткам пострадиационного периода концентрация изучаемого гормона не отличалась от контрольных значений (.Табл. 2). Таким образом можно заключить, что тотальное гамма-облучение вызывает етрессорную реакцию в организме.

Таблица 2

Динамита концентрационных изменений АКТГ сыворотки -крови в различные сроки после тотального гамма-облучения, нг/мл, (х+Бх)

Срок после облучения (сутки) Контроль 0,5 Гр 1.0 Гр 4,0 Гр

3 57,8+12,5 183,0+47,8* 89,8+6,1* 207,1+34,3*

10 57,8+12,5 193,0+34,9* 57,7+0,04 170,6+27,9*

30 57,8+12,5 81,4+21,7 76,5+19,1 90,1+20,9

Примечание - см. табл. 1

В настоящее время установлено, что увеличение концентрации АКТГ вызывает ингибирование секреции альдостерона - минералокорти-коида, участвующего в регуляции сосудистого тонуса /Постов, 1987; Гикийа, 1987/. Нами обнаружено, что на 3 сутки после воздействия Ш содержание альдостерона достоверно ниже показателей контроля. Однако уже на 10 сутки пострадиационного периода концентрация данного гормона возрастала в 1,8 раза при облучении в дозе 0,5 Гр, нормаиизо валась при радиационном воздействии в дозе 1,0 Гр и по-прежнему оставалась сниженной при дозе 4,0Гр (Табл. 3). Данные результаты свидетельствуют о том, что реципрокные отношения АКТГ и альдостерона проявляются в первые сутки изучаемого периода, в теле сроки, когда наблюдается острая фаза стрессорной реакции /Ме-

Таблица 3

Динамика концентрационных изменений альдостерона сыворотки крови в различные сроки после тотального гамма-облучения, пг/мл, (х+Зх)

Срок после °р ¡да Контроль 0,5 Гр 1,0 Гр 4,0 Гр

3 243,0+25,8 152,5+31,5* 117+10* 108,4+11,1*

10 243,0+25,8 442,8+24,5* 209149 141,7+19,2*

30 243,0+25,8 231,1 +29, 9 190+42 0 190,3^34,2

Примечание - ем. табл. 1

ерсон, 1984; Лобанок, 1990/. Полученные экспериментальные даяние позволяют предположить, что к'10-м суткам после облучения в механизм секреции альдостерона вмешиваются и другие контролирующие факторы, к которым можно отнести функциональные компоненты ре-нин-ангиотензиновой системы - ангиотензин I и ангиотензин-конвертирующий фермент. Установлено, что изучаемые дозы ИИ, за исключением 3 суток после облучения в дозе 0,5 Гр, не вызывают достоверных изменений рениновой активности плазмы. При рассмотрении динамики изменения активности ангиотензин-конвертирующего фермента (АКФ) в плазме крови экспериментальных животных обнаружено, что радиационное воздействие (0,5; 1,0 и 4,0 Гр) приводит к снижению активности фермента (Табл.4). Нормализация изучаемого показателя

Таблица 4

Динамика концентрационных изменений ангиотензин конвертирующего фермента сыворотки крови в различные сроки после тотального гамма-облучения, отн. ед. , (х+5х)

Срок после облучения (сутки) Контроль 0,5 .Гр 1,0 Гр 4,0 Гр

3 271,7+25,5 115,3+48,1* 201,0+17,4* 107,1+11,0*

10 271,7+25,5 124,1+23,6* 277,7+23,6* 191,3+27,1*

30 284,7+27,1 243,2+26,9 248,1+27,5 268,6+37,9

Примечание - см. табл. 1

отмечается на ЗО-е сутки. Учитывая, что АКФ имеет эндотелиальное происхождение /Fajardo, 1989/, можно предположить, что снижение активности фермента является результатом радиационноиндуцированно-го повреждения эндотелия сосудов /Эйдус, 1990/.

Таким образом, модификация минералокортикоидной функции в первые сутки пострадиационного периода сопровождается увеличением концентрации стресе-реализующего гормона АКТГ, практически полным отсутствием изменений рениновой агаивности плазмы и снижением концентрационных уровней АКФ. Нормализация исследуемых параметров происходит на 30-е сутки после облучения.

Исходя из вышесказанного, можно предположить, что при внешнем тотальном гамма-облучении определяющее значение в регуляции концентрационных уровней альдоетерона в плазме крови, по-видимому, имеет синхронное взаимодействие функциональных компонентов ре-нин-англотензиновой системы.

Влияние гамма-облучения на состояние аденилатциклазной системы плазматических мембран гладкомышечных клеток аорты крыс

Сравнительный анализ удельной плотности бета-адренорецепторов ПМ ГШ аорты крыс в различные сроки после радиационного воздействия в относительно малых (0,5 и 1,0 Гр) и сублеталыюй (4,0 Гр) дозах показал, что на 3 сутки после облучения происходит достоверное уменьшение измеряемого параметра Необходимо отметить, что наибольшее снижение количества адренорецепторных структур наблюдается при воздействии Ш в дозе 4,0 Гр. На 10 сутки пострадиационного периода (0,5 и 1,0 Гр) плотность бета-адренорецепторов достоверно увеличивается, в то время как при облучении в дозе 4,0 Гр количество мест связывания не претерпевает значительных изменений по сравнению с 3 сутками после воздействия ионизирующей радиации (Рис. 1).

Обнаруженное нами уменьшение количества определяемых рецепторов на 3-сутки изучаемого периода, по-видимому, связано с развитием стрессорной реакции /Меерсон, 1984; Соболев, 1987; Лобанок, 1990/. Это предположение подтверждается полученными данными о достоверном увеличении в сыворотке крови в указанные сроки нзблк>-деяия стресс-реалиэующего гормона - АКТГ. Kaie известно, при массо-

вом выбросе АКТГ в кровь, происходит активация синтеза и секреции катехоламинов мс$вговнм слоем надпочечников. В свою очередь, повышение концентрации катехоламинов будет приводить к развитию процесса десенситизации адренорецепторов /Ткачук. 1983/, что мы и наблюдаем в проведенном .-эксперименте. Исходя из данного предположения можно заключить, что при облучении п дозах 0,5 и 1,0 Гр выход изучаемой системы из стрессорного состояния происходит уж к 10 суткам после воздействия ИИ. В то де время при сублетальной дозе (4,0 Гр) восстановления количества бета-адренорецепторов ПМ ГМК аорты в данные сроки не наблюдается.

Следует отметить, что на 30 сутки пострадиационного периода динамика изменения удельной плотности бета-адренорецепторов прямо противоположна динамика, наблюдаемой па 10 сутки после облучения. В более поздние сроки изучаемого периода (180 и 365 сутки) нами не было обнаружено достоверных различий числа мест связывания бета- адреноагониста - дигидроальпренолола с мембранами гладкомншеч-ных клеток. Аналогичная закономерность изменения количества бе-та-адренорецнггоров, как отмечалось ранее, была обнаружена и для ряда других тканей и органов /Слолкникина, 1980, 1985; Соболев, 1983; Edwards, 1984; Lank, 1989/.

Как известно, влияние симпатической нервной системы на сосуды осуществляется посредством вовлечения в процесс трансмембранной передачи регуляторних сигналов мембраноассоциированной аденилат-циклазной системы / Pfeufer, 1977; Lefkowit.z, 1987;' L.evilzkt, 1987/. Воспринимающим компонентом данной системы является бета-ад-ренорецепторы, сродство которых к агонистам, а такхе дальнейшая трансмиссия гормонального сигнала регулируется сопрнгаю'цими нукле-отидсвязнваюшими N-белками /Перцева, 1989/.

Исследования степени стимуляции АЦ через рецепторные структуры с помощью бета-адреноагониста - изолротеренола (ЮТ) показали, что после облучения в дозе 0,5 Гр происходит достоверное увеличение активности фермента в присутствии данного эффектора в первые 10 суток пострадиационного периода. В другие сроки наблюдения значения ИП-стимуляции не отличались от контрольных значений. То есть, при уменьшении количества бета-адренорецепторов плазмати ческих мембран ГМК аорты крыс после воздействия ИИ в дозе 0,5 Гр на 3 сутки изучаемого периода отмечается увеличение степени акт»

нации АЦ.

Совершенно иная картина наблюдается в данный период при облучении в дозах 1,0 и 4,0 Гр. Радиационное воздействие в дозе 1,0 Гр не вызывает изменение стимуляции аденилатциклаэы через рецепторные структуры, а сублетальная доза приводит к ингибированию ЙП-стимулированной активности фермента (Рис. 2).

Обнаруженные нами радишдионноиндуцированные эффекты усиления Ш-аотивации АД на 3 сутки после облучения в дозе 0,6 Гр при снижении количества Сета-адренорецепторов могут быть связаны с изменением степени сопряжения рецепторного и каталитического компонентов АЦС за счет модификации конформационного состояния Н-белков. Дня проверки Данного предположения нами исследовалась регуляция активности аденилатциклаэы, осуществляюшэяся через И-белки, с помощью специфических эффекторов - ГТФ и ионов Р (Рис. 3, 4). Оказалось, что после облучения экспериментальных животных в течение 10 суток в дозе 0,5 Гр стимуляция активности аденилатциклаэы ГТФ резко возрастает и приближается к величинам активации фермента ионами Р . В дальнейшем эффекты стимуляции действия ГТФ не отлича-лися от контрольных значений. Обнаруженная закономерность активации АЦ нуклеотидоы может являться свидетельством в пользу предположения, что данная доза облучения переводит И-белки в такое кон-формационное состояние, которое уменьшает их РТФазнута активность и тем самым увеличивает скорость оборота фермента и/или время нахождения комплекса М- бе лок-каталитическая субъединица (АЦ) в активном состоянии /Ьеу^Ьгк), 1984, 1988/.

Конформацюнная подвижность и степень сопряжения рецепторной и каталитической субъединиц аденилатциклазной системы (АЦС) во многом определяется липидным микроокружением нуклеотидсвязывающих И-белков /Воейков, 1984; Перцева, 1989; Милютин, 1990/. Исходя из сказанного можно предполагать, что одной из причин вызывающих модификацию Ы-белков могут быть радиационноиндуцированные изменения физического состояния лигшдного компонента ПМ ГМК аорты крысы.

Что кассетой изменения стимуляции АЦ-активности через рецепторные структуры при облучении в дозах 1,0 и 4,0 Гр, то в данном случае степень активации фермента прямо зависит от удельной плотности бета-адренорецепторов, что обычно отмечается и рядом других исследователей /Ткачук, 1983; Воейков, 1984; Соболев, 1987; /.

^ зг$

К

ТУ

* я 5

I

/о

I

ф -

' 60 сутги пас-

Рис. 1. Удельная плотность^-адренорецепторов в ПМ ГМК аорты крыс в различные сроки после облучения.

У *

£ а

1

/о

•30

о&лугеилл

Рис.2. Величины стимуляции изопротеренолом АД плазматических мембран ГМК аорты крыс в различные сроки после облучения

Г

„ к

Но 3,0

к

о

*

- г з * 1 1

/ « * 1_ш *■ * * ч

.3 10 _ 50

- после

* в, о

\

£ -4.0

I &

ь

О

¡¿гения

/23

-а

УО

*

.Зо >

оКлуеениЯ

Рис. 3. Величины стимуляции ГТФ АЦ плазматических мембран ГМК аорты крыс в различные сроки после облучения.

Рис. 4. Величины стимуляции НаР АЦ плазматических мембран ГМК аорты крыс в различные сроки после облучения.

К - контроль; облучение в дозах 1 - 0,5 Гр; 2 - 1,0 Гр; 3 - 4,С Гр. * -статистически достоверные различия (Р<0,05)

Таким образом, полученные результаты позволили предположить, что исследованные дозы ИИ вызывают модификацию функционального состояния аденилатциклазной системы ПМ гладкомышечных клеток аорты на уровне рецепторного и сопрягаюшлх И-белков.

Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод о том, что облучение экспериментальных животных в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр вызывает дозозависимое несинхронное изменение функционального состояния рассматриваемых мембраносвязанных компонентов аденилатциклазной системы,. которая, вероятно, непосредственно вовлекается в развитие предиатологических или патологических процессов в клетках. Это, в свою очередь, может приводить к изменению функционального ответа ГШ сосудов на нейрогормонадьное влияние и, возможно, является одной из причин развития радиационноиндуцированных■сосудистых нарушений.

Влияиие гамма-облучения на структурную организацию плазматических мембран гладкомышечных клеток - аорты крыс

Одной из причин изменений функциональных характеристик мемб-раноассоциированных Оа^+-насоса и АЦС может быть структурная реорганизация ПМ ГМК при действии ионизирующего излучения. В настоящее время рядом исследователей при изучении суспензии мембран, клеток крови, нейронов виноградной улитки, печени и других клеток установлено, что перестройка липидной компоненты биологических мембран является первичной при радиационном поражении клеток /1ап21п), 1984; У/оИегэ, 1984; Рыскулова, 1986; Дворецкий, 1990/.

Исходя из сказанного, нами был осуществлен анализ фосфолипид-ного и жирнокислотного составов, проведена оценка микровязкости липидного бислоя Ш ГМК аорты крыс в различные сроки после радиационного воздействия в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр. Установлено, что ионизирующее излучение в дозе 0,5 Гр не приводит к изменению определяемых показателей, тогда как облучение в дозах 1,0 и 4,0 Гр вызывает значительные изменения фосфолипидного состава исследуемых мембран в отдаленные сроки пострадиационного периода. Наблюдается снижение флефотиднлхолина, фосфотидилэтано.ламина • и повышение концентрации гфингомиелнна с одновременным увеличением количества ко-роткоценочечных и уменьшением содержания" ненасыщенных жирных

М

кислот. Необходимо отметить,> что в- отдаленные сроки пострадиационного периода стейвмь модификации жириокислотного состава прямо зависит от дозы облучения.

Обнаруженные нами изменения химического состава липидной компоненты Ш ГМК аорты крыс приводят к изменению физического состояния липидного бислоя. То есть, относительно мапые и сублетальная дозы способны вызывать модификацию структурной организации клеточных мембран сосудов, наблюдаемую также при облучении экспериме-тальных животных в летальных и сверхлетальных дозах.

Таким образом, подводя итоги вышеприведенных исследований, можно заключить, что относительно мапые и сублетальная дозы тотального гамма-облучения вызывают структурную реорганизацию Ш ГМК аорты крыс в различные сроки (3, 10, 30, 180 и 365 сутки) после радиационного воздействия, которая приводит к модификации функционального состояния мембраносвязанных ферментов и рецепторов, участвующих в экстра- и внутриклеточной регуляции кальциевого го-меостаза. . Это, возможно, приводит к изменению тонических сокращений гладкомыше'чних клеток. Обнаруженные изменения, по-видимому, могут являться одной из причин развития предпатологических и патологических состояний сердечно-сосудистой системы в условиях радиационного воздействия на организм.

вывода

1. Гамма-облучение экспериментальных животных в относительно малых (0,5 и 1,0) и сублетальной дозах (4,0 Гр) приводит к увеличению максимальной скорости транспорта ионов Са^ через плазматические мембраны гдадкомышечных клеток аорты крыс, а также гидролитической активности Са^+ -насоса в первые 30 суток пострадиационного периода. Сродство данной транспортной системы к ионам Са2+ не изменялось. Нормализация изучаемых процессов происходит в течение первого месяца после- воздействия ионизирующего излучения. Механизм радиационных повреждений функционирования Сг£+ ттранспортирующей системы изучаемых клеток аорты крыс зависит от дозы облучения.

2. Установлено, что ионизирующее излучение в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр приводит к снижению секреции альдостерона корой надпочечников в первые 30 суток после облучения, которое обусловлено радиа-

ционноиндуцированной модификацией функционального состояния ренин- ангиотензиновой и стресс-реализующей. систем. Обнаруженные изменения нормализуются в течении первого месяца

3. Показано, что только лишь в течении 30 суток после воздействия ионизирующего излучения происходит модификация конформа-ционного состояния бета-адренорецепторов плазматических мембран гладкомышечных клеток аорты крыс, заключающаяся в изменении удельной плотности рецепторннх структур с одновременным увеличением их сродства к адреноагонистам. Обнаруженные пострадиационные эффекты носят дозозависимый характер.

4. Тотальное гамма-облучение в течение первых 10 суток вызывает увеличение изопротеренол-стимулированной активности аденилат-циклачы при дозе 0,5 Гр, не изменяет ее при дозе 1,0 Гр и значительно снижает при сублетаньной дозе - 4,0 Гр.

5. Нулеотид- и ^-зависимая регуляция аденилатциклазной активности при действия ионизирующего излучения осуществляется разнонаправленно: ГТФ-стимулированная активность АЦ усиливается в течение 10 суток при дозе облучения 0,5 Гр и снижается на протяжении 30 суток при радиационном воздействии в дозах 1,0 и 4,0 Гр, в то время как Р"-зависимая регуляция активности аденилатциклазы, осуществляющаяся через М-белки, возрастает в течение 3 суток при облучении в дозе 0,5 Гр, 10-ти суток при облучении в дозе 1,0 Гр и тридцати суток при дозе 4,0 Гр.

6. В ранние сроки (10-е сутки) после облучения в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр обнаружены достоверные изменения физического состояния липидного бислоя и аннулярного липида В данный период микровязкость изучаемых мембран достоверно увеличивалась при всех выбранных дозах облучения, в то время как текучесть аннулярного липида при облучении в дозах 0,5 и 1,0 Гр возрастала, а при сублетапь-ной дозе уменьшалась.

7. В отдаленные периоды после действия ионизирующего излучения (180-е сутки) показано, что лишь радиационное воздействие ] дозе 4,0 Гр приводило к увеличению погруженности белков в мембргш и микровязкости аннулярного липида, в то время как относительн! малые дозы ионизирующего излучения (0,5 и 1,0 Гр) наблюдаемых из менений не вызываюг.

8. Установлено, что радиационное воздействие в дозах 0,5; 1,

и 4,0 Гр в течение 30 суток пиаыпает модификацию структурного состояния плазматических мемПраи ГМК аорты, заключающуюся в увеличении содержания мириотилоиой кислоты и снижении содержания ненасыщенных жирных кислот - пальмитоолеиновой, линолевой и арахидо-новой кислот.

9. Обнаруженная в работе структурно-функциональная модификация плазматических мембран, наблюдающаяся в течение первого месяца после облучения в дозах 0,5; 1,0 и 4,0 Гр, приводит к изменению регуляции метаболизма ГМК аорты крыс и, возможно, является одним из пусковых механизмов радиационноиндуцированных сосудистых нарушений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Конопля Е. Ф. , Милютин A.A., Кармальков С. А. Состояние ре-нин-ангиотензиновой системы и минералокортикоидная функция надпочечников крыс при действии малых доз ионизирующего излучения // Весц1 АН БССР. -1989. -N6. -С. 79-82.

2. Кармальков С. А. , Милютин А. А. Динамика функциональных изменений аденилатциклазной системы гладкомншечннх клеток аорты крыс при ^"-облучении // Физиология и биохимия медиаторных процессов: Тез. докл. V Всесоюз. конф. 16-18 окт. 1990 г. -М. , 1990.-С. 135.

3. Кармальков С. а. , Милкугин а. а. Радиационноиндуцированная модификация аденилатциклазной системы гладкомышечных клеток сосудов // Биохимия рецепторнмх систем: Тез. дот. Всесоюз. симпоз. 29 окт. - 2 нояб. 1990 г. -Таллинн, 1990. -0. 25.

4. Кармальков С. А. , Милютин А. А. Пострадиационны.? изменения плотностиу£-адренорецепторов гладкомншечных клеток аорты крыс // Тез. докл. Итоговой конференции ИРБ АН БССР, 20-21 декабря 1990 г. Минск, 1990. - С. 85.

5. Кармальков. С. А. , Милютин А. А., Конопля Е. Ф. Ближайшие и отдаленные эффекты ионизирующего излучения на кальций-аккумулирующую способность плазматических мембран гладкомышечннх клеток аорты крыс // Радиобиология.-1991.-Т. 31, N1.-C. 48-51.

6. Кармальков С. А. Влияние гамма-облучения на структурную организацию плазматических мембран гладкомншечных клеток аорты крыс // Последствия аварии на Чернобыльской АЭС: Тез. докл.' конф« 31 окт.-1 нояб. 1991 г.-Минск, 1991.- С. 50-51.