Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии гена МТS1 в иммунокомпетентных клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии гена МТS1 в иммунокомпетентных клетках"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Р^Б О^ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

на правах рукописи УДК 575

ТАРАБЫКИНА Светлана Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА MTS1 В

ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТКАХ

\

. .специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАН ГЛЬГеоргиев; доктор биологических наук, проф. ЕЛОТугашипв

доктор медицинских наук, проф. АД-Альтигейя; кандидат биологических наук АЛ.Щилов

Ведушая организация: Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякиш

Зашита диссертации состоится " ¿¿¿ОиЛ- 1994г. в 40 час. Ор мин. на заседании Специализированного Совета Д.200.30.01 при-Институте биологии гена РАН по адресу: 117334 •Москва; ул. Вавилова,34/5. ...

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологи:; гена РАН.,

Автореферат разослан 1994г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета/> ^ О , ~ у^у кандидат фарм.наук СИу ЬоС$ ¿^и^ ^-С.Грабозская

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСлЪ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы одной из наиболее актуальных проблем в биологии и медицине остается изучение молекулярных процессов, лежащих в основе превращения нормальной клетки в опухолевую. Особое место занимает исследовсние механизмов становления метастатического потенциала опухолевых клеток.

При сравнительном изучении двух генетически блкзхпх линий адекосаркомы моло-люй железы мыши КСМЛ-100 и КСМЛ-0 [НЬ,-аКЙ2е,1989], оЗлалаюишх разным метастатическим потенциалом, в нашей лаборатории была клонирована кДНК транскрипта гена [Ти!сЫп2ку,1990]. Было показано, что гте! представляет. собой однокопийкый ген, продукт которого относится к семейству малых кальций-ейязквающйх белков 5-100. При анализе эксЗтрессйи та! в" различных опухолях било обнаружено, что уровень его экспрессии коррелирует с метастатическим потенциалом опухолевых клеток. Высокий уровень транскрипции наблюдается с мстасвзирующих клетках, з то время как в клетках неметастазпруюшмх опухолей гек молчит. Кроме того, тМ транскртпы обнаружены в хлетвх тимуса, селезенки, костного мозга, лимфоцитах крови. Основываясь на этих фактах, мы предполагаем, что некоторые свойства, присущие нормальным клеткам, могут вносить вклад в феркирование метастатического фенотипа опухолей. С этой точки зрения врсставляст несомненный интерес изучение экспрессии гена тк! в нормальных клетках.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явилось исследование экспрессии гена тШ в ' различных расфракционярованных тетках миелоидного происхождения и перевиваемых клеточных линиях мыши и человека; изучение влияния на функционирование гена ряда активаторов' иммунокомлегеитных клеток.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. Изучение экспрессии гена в Т- и В-лимфоцитах, предшественниках эритроцитов и гракулоцитах (нейтрофилах);

2. Изучение экспрессии гена тЫ в макрофагах на разных стадиях дифференцирозки ( макрофаги костного мозга, моноциты крови, резидентные псритонсальные макрофаги);

3. Изучение экспрессии гена тЫ в культивируемых клетках линий НЬбО (промяеаошпы человека), 1/937 (промоноциты человека), К562 (эритрояейкемия человека), НМ\|)2 (миелома человека), 8р2/0-А^14 (мислома мыши), Ри5-1.8 (моноциты/макрофаги мыши), \VEHl-3 {миеломонощпы мыши); \yHHH {тимома человека ), ■

4. Изучение влияния активаторов иммунокомпетентных клеток (бактериального липополисахарида, у-интерферона, конканавалина-А ) на уровень транскрипции гена тЫ в макрофагах;

5. Изучение влияния концентрации цитозольного кальция на экспрессию гена тШ в макрофагах.

НАУЧНАЯ ВОВИЗШ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. В настоящей работе мы исследовали экспрессию гена тЫ в расфракционироваиных клетках миелоидного происхождения, а также возможность модуляции экспрессии различными митогенами. Было

показано, что уровень транскрипции гена коррелирует со способностью иммунойомпетентных клеток к перемещению и "инвазии" и может изменяться под воздействием митогенов. Была проанализирована кальций-зависимая регуляция экспрессии гена. Обнаружена и охарактеризована перестройка гена mtsl в линии клеток WEHI-3, вызванная ипсерцисй ретровнрус-подобного элемента и приводящая к активации транскрипции гена.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены:

- на 4 Международном конгрессе Metastasis Research Society "Sciencc and Medicine in Cáncer Metastasis", Парик, Франция, 1992.

- на 2 Международном симпозиуме по молекулярной биологии рака (The Second International Cancer Molecular Biology Symposium ), Каир, Египет, 1993.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме работы имеются две публикации.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Работа изложена на /¿Устраницах машинописного текста. Она включает, введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение результатов, выводы и список цитированной литературы. Диссертация содержит 16 рисунков, 3 схемы, 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Экспрессия гена mtsl в клетках миелоидного происхождения.

Ранее было показано, что ген mtsl, экспрессия которого характерна для высоко 'метасгазирующих опухолей, активно транскрибируется также в нормальных лимфоидных тканях, таких как селезенка, тимус, костный мозг, лимфоциты крови lEbraiidze А., 1989]. В настоящей

работе мы изучали экспрессию гена в расфракционированных клетках миелоидного происхождения. Было показано, что эти клетки имеют разный исходный уровень РНК mtsl. На рисунке 1 представлены результаты бяот-гибридизации тотальной РНК из различных клеток'с mtsl-специфичной пробой. Относительное количество материала на дорожке оценивалось по флуоресценции рибосомальной 18S и 28S РНК, окрашенной бромистых« этцдием. Представленные данные показывают, что mtsl активно транскрибируется в нейтрофилах периферической крови и. промоноцитарной клеточной линии U937 человека. В моноцитах крови человека и линии мышиных моноцитов PuS-1.8 наблюдался низкий уровень экспрессии mtsl. Промежуточный уровень транскрипции был характерен для человеческих и мышиных Т-лимфоцитов, линии Т-лимфомы человека ц/ННН, промиелоцитарной линии HL60 и макрофагов костного мозга мышей. Очень низкий, едва" детектируемый уровень экспрессии mtsl мы наблюдали в мисломной клеточной линии HMvyZ mtsl транскрйпты не были обнаружены в В-лимфоцитах человека, эритроидной клеточной линии К562 и миеломной линии Sp2/0 даже после ПЦР-амплификации. По-видимому, в этих клетках ген является молчащим.

Эти результата позволяют предположить, что уровень экспрессии mtsl коррелирует с "инвазивным" фенотипом клеток миелоидного происхождения, поскольку максимальный уровень экспрессии наблюдался в Т-лимфоцитах, нейтрофилах, макрофагах, а именно эти клетки обладают инвазивносгао и способны к деградации компонентов внеклеточного матрихса, что характерно и для клеток метаеггазирующих опухолей.

00 0. В

I - .

I

РИС.1 Блот-гибридизация тотальной РНК. клеток человека ( верхняя панель ) и мыши ( нижняя панель ) с 32Р-меченной дДНК тЫ мыши: 1 - Т-лимфоциты; 2 - нейтрофилы; 3 - макрофаги; 4 - В-яимфошпы; 5 -•

предшественники эритроцитов; б - у ННН - Т-лимфома; 7 - 1)937 -

J

промоноциты; 8 - ИЬ60 - промиелошггы; 9 - НМ ч»2; ¡0 - К562 - линия эритролейкемии;

Г - Т-лимфоциты; 2' - нейтрофилы; 3' - макрофаги коспюго мозга; 4' -Ри5-1.8 - моноциты/макрофаги; 5' - Бр2/0 - ми слома.

— а —

Модуляция уровня экспрессии гена mtsl.

Мы проанализировали эффект трех митогенов иммунокомпстснтных клеток: бактериального липополисахарида (LPS), рекомбинажного человечесхого т-ингерферона (IFN-y), конканавалина-А (Con-А) на экспрессию mtsl в макрофагах мыши и человека. Макрофаги костного мозга мышей культивировались 4-5 дней, после чего обрабатывались 10 и кг/мл LPS. На рис.2 представлены результаты блот-гибридизации тотальной РНК из этих клеток с mtsl-специфичной пробой.

Количество mtsl мРНК значительно увеличивалось уже через 10 мин. после обработки клеток LPS, оставалось на таком уровне по крайней мере 2 часа и через S часов снижалось ниже исходного уровня.

В качестве модели для изучения модуляции экспрессии гена mtsl in vivo мы использовали мышиные перитонеальные резидентные макрофаги (РМ), воспалительные- перитонеальные макрофаги' С1М), • полученные из перитонеального экссудата на третий день после внутрибрюшинной инъекции LB-бульона, и активированные макрофаги (AM) перитонсального экссудата, выделенные на десятый день после внутрибрюшинной инъекции полного адьюванта Фрейнда.

В резидентных перитонеальных макрофагах не было обнаружено mtsl специфичных тронскриптов, в то время как в воспалительных макрофагах наблюдался довольно высокий уровень экспрессии mtsl. Максимальный уровень отмечался в активированных макрофагах.

В моноцитах человека,, обработанных LPS, уровень mtsl РНК снижался через 3 часа,1 восстанавливался до исходного уровня через 7 часов и вновь снижался к 24 часам после обработки.

Было обнаружено, что два других агента - iflFN и Con-А усиливают транскрипцию mtsl, т.о., оказывая противоположный LPS эффект.

In vitro LPS 10"" 40' 2h ih 2<h

«a m •

1

РИС.2 Блох-гибридизация тотальной РНК моноцитов человека ( верхняя панель ) и макрофагов костного мозга мыши ( нижняя панель, слева), обработанных LPS, Con-A, ylFN; перитонеальных (РМ), воспалительных ( IM ) и активированных ( AM) макрофагов мыши ( нижняя панель, справа ) с 32Р-меченной кДНК mtsl мыши.

—?-

Уровень mesI мРНК увеличивался через 24 часа после обработки моноцитов человека flFN и Con-А в противоположность его снижению при аналогичной обработке LPS (рис.2)

Клетки ' человеческой промиелошпарной линии HL60 были индуцированы к дифференцировке в гранулоциты обработкой ретиноевой кислотой (RA) или в макрофаги - форболмеристалацетатом (РМА) в течение 5 дней. Клетки линии промоноцитоз человека U937 дифференцировались в моноциты/макрофаги при обработке РМА. Обе клеточные линии затем были подвержены обработке LPS с целью изучения влияния этого агента на уровень транскрипции mtsl. На рис.3 представлены результаты блогг-гибридизации тотальной РНК, выделенной из этих клеток через 10, 40 мин., 2, 4, 8 и 24 часа после обработки LPS, с mtsl-специфичной пробой. LPS не оказывал заметного "влияния на уровень mtsl мРНК в недифференцированных клетках HL60 и HL60, дифференцированных в макрофаги под действием РМА. Однако, в клетках ' HL60, дифференцированных в гранулоциты при обработке RA, LPS вызывал снижение уровня мРНК mtsl-чсрез 8 часов и увеличение выше исходного уровня через 24 часа (рис.3).

Недифференцированные U937 клетки и U937, обработанные ретиноевой кислотой или форболмеристилацетатом, по-разному реагировали на обработку LPS. Уровень мРНК mtsl не изменялся при обработке клеток 13937 и U937+RA. Однако, в 1)937, дифференцированных в моноциты под действием РМА, уровень мРНК mtsl уменьшался через 40 мин, затем снова повышался к 2 часам, после чего снижался до едва детектируемого (рис.4). Эти данные показывают,

— S —

. РИС.3 Блот-гибридизация тотальной РНК обработанных LPS клеток линии HL60, тех асе клеток, дифференцированных в гранулоцита под действием ретиноевой кислота ( RA ) и в макрофаги - под действием форболмериегшлацетата ( РМА ), с 32Р-меченной кДНК mtsl мыши.

je» «о' » «ь «ь ац

□ СГЕЕЕП

В ЕВСЕЕВ

§ шм

____ i.._.L

• I

V

РИС.4 Блат-гибридизация тотальной РНК обработанных LPS клеток линии U937 и U937, индуцированных к дифференпировке RA и РМА, с пР-меченной кДНК mtsl мыши.

что модуляция уровня m tsl мРНК возможна лишь R дифференцированных гранулошггах и макрофагах.

Следует отметить, что паттерн экспрессии mtsl при обработке LPS различается в мышиных и человеческих макрофагах. Это может быть объяснено наличием в этих клетках различных систем регуляции транскрипции mtsl. В пользу такого предположения говорит тот факт, что регуляторные районы гена существенно различаются у мыши и человека [Tulchinsky Е.,1°92].

Влияние концентрации цитозальиого кальция па уровень nasi мРНК.

Клетки линии моноцитов/макрофагов мыши Pu5-l.S>, экспрсссирующие mtsl, обрабатывали 10 мкг/мл кальциевого ионофора А23187. Через 5 часов после такой обработки отмечалось снижение уровня мРНК mtsl практически до нулевого уровня (рис.5). При добавлении )0 мкг/мл циклогексимида эффект ионофора снимался. Сам по себе циклогексимид не оказывал влияния на уровень мРНК mtsl, по крайней мере, на протяжении 24 часов.

Было показано, что mtsl мРНК достаточно стабильна. Скорость ее распада оценивалась с помощью блот-гибридизации тогаиьной РНК, выделенной через различные промежутки времени после обработки клеток 5 мкг/мл актаношщина Д, блокирующего синтез РНК. Уровень мРНК mtsl не изменялся в течение 24 часов.

Исходя из этих данных можно предположить, что кальциевый ионофор индуцирует экспрессию некоторых нуклеаз, которые деградируют mtsl мРНК. Циклогексимид блокирует синтез этих нуклеаз, тем самым стабилизируя мРНК mtsl

-И-

к 1Ь 5Ъ 24Ь

I • Г"!

I.

А23187

ти!

САРЭН

К 5Ъ 24Ь

сусШехишйе

1Ь 5Ъ 24Ъ

В.

К 1Ь 5Ь 24Ь

I I

САРДН

ж

п.

сус1оЬехип1<1е + А23187 асЦпотусш Б

РИС.5 Бпот-гибрйдашция тотальной РНК клеток линии Ри5-1.8, обработанных кальциевым ионофором А23187 (А), циклогексимидом и ионофором (В), циклогехеимидом (С), акгиномицином Д (О), с замеченной хДНК га1£1....

Особенности экспрессии mtrl в клеточной линии WEIII-3.

Во всех исследованных ранее клетках присутствовал mtsl транскрипт длиной около 550 п.н., что соответствует описанному ранее [Ebralidze А.,1989]. Однако, в линии миеломоношггов мыши WEHI-3 детектировалось два типа mtsl транскриптов, размер которых оценивался как 550 п.н. и 800 п.н. (рис.б).

Чтобы выяснить структуру тяжелого транскрипта, была сконструирована библиотека кДНК WEHI-3 клеток. Два клона (р93 и р!71), давшие положительный сигнал при гибридизации с mts!-специфичной пробой, ' были отобраны для анализа нуклеотидной последовательности.

Было обнаружено, что эти два клона идентичны и содержат кодирующую часть гена mtsl (экзоны 2 и 3), а также 292 п.н. последовательность выше по течению от'экзона 2, отсутствующую в нормальном варианте гена. Сравнение этой последовательности с банком данных (EMBL Data Library) показало высокую степень гомологии (более 90%) с длинным концевым повтором (LTR) и 5'-нетранслируемой областью гена gag интрацистернальных А-частиц* (IAP).

Полная длина химерного транскрипта определялась методом достройки праймера, комплементарного началу зкзона 2 гена (праймер 1, см. рис.7). Было показано, что старт транскрипции удален примерно на 355 нуклеотидов от зкзона 2 (рис.8).

Анализ нуклеотидной последовательности клона р93 (рис.7) показал, что при инсерции А-частицы сохраняется основная открытая рамка считывания для MTS1 белка без возникновения дополнительной существенно длинной рамки считывания.

0.80 i Щ РИС.6

0.55 Блот-гибридизация тотальной РНК клеток линии

WEHI-3 с mtsl-слецифичной пробой.

РИС.7 Нукхсотидная последовательность кДНК клона р93. Подчеркнута последоватеиносп» 2 и 3 экзона mtsl.

5' TGA AGA TGT AAG AAA TAA AGC TIT GCC G CA GAA GAT 36 TCT GGT CTG TGG TGT TCT TCC TGG CCG GTC GTG AGA ACG 75 CGT CGA АЗА ACA ATT GGT GCC GAA ACC CGG GAC GAG AAA 111 АТС CGG GAC GAG AAA AAA CTC CGG ACT GGC G CA GGA 147 GGG ATA СГГ CAT TTC AGA ACC AGA ACT ACG GAT CAC GTT 186 TAT AAA GGT TCC CGT AAA G CA GAC TGT TAA GAA GGA TTC 225 AAC TGT A3G AAT TCA GAA CTT TCA G CT GGG GAA CGA GAG 264 TAC CAG TGA GTA CAG CTT TAC GAG GTC TCA ACG GTT ACC 303

prime!" £

ATO G CA AGA CCC TTG GAG GAG GCC CTG GAT GTA ATT 339 GTG TCC ACC TTC CAC AAA TAC TCA GGC AAA GAG GGT PAC 378 AAG TTC AAG CTG AAC AAG АСА GAG CTC AAG GAG СТА CTG 417 ACC AGG GAG CTG С CT AGC ITC CTG GGG AAA AGG АСА 453 GAT GAA GTT GCA TTC CAG AAG GTG ATG AGC AAC TTG GAC 492 AGC AAC AGG GAC AAT GAA GTT GAC ITC CAG GAG TAC TGT 531 GTC TTC CTG TCC TG С ATT GCC ATG ATG TGC AAT GAA TTC 570 TIT GAG GGC TGT CCA GAT AAG GAG CCC CGG AAG AAG 606 TGA AGA CTC CTC AGA TGA GTG TTG GTG TAG TTG CCA GTG 645 GGG ATC TTC CCT GTT GGC TGT GAG CAT AGT GCC TTA CTC 684 TGG CTT CTT CGC АСА TGT GCA CAG TGC TGA GCA AAT TCA 723 ATA AAA CGTTTT GAA ACT AAAAAA 3' 747

726,713.

553500'! — 427,417,413, _

311.

РИС.8 Определение У-концевого нуклеотида мРНК тв!. Радиоавтограф

электрофореза в денатурирующем

• Ч

6% ПААГ. 1-маркср молекулярного веса 0Л174-НтЛ; 2-ДНК фрагмент, полученный • 385 при достройке праймсра1, отожженного с мРНК из клеток линии )УЕН1-3. Слева и справа указаны размеры фрагментов.

249«

А ТАЛ.'

о.бтп*

РИС.9. ПЦР-амплпфикация фрагмента геномной ДНК клеток линии ЛУЕН1-3 (1) и КСМЛ-100 (2) в районе предполагаемого сайта интеграции 1АР; (3)-маркер молекулярного веса X (НикИН/ЕсоЩ).

Геномная организация mtsl локуса в клетках линии WE11I-3.

Геномная ДНК WEH1-3 клеток была фрагменпгрована рестришфуюшими эндонукл сазами и анализировалась методом Southem-блот гибридизации со 2 и 3 экзоном mtsl. Было обнаружена появление дополнительных EcoRI, Hindlll, Xbal фрагментов (рис.10), что указывало на наличие перестройки в одном аллеле гена и позволило картировать место интеграции LAP между Hindlll и Sacl рестриктными сайтами (рис.11).

Этот фрагмент амплифицировался с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров 2 и 3 (см. рис.П). Было идентифицировано два продукта - 0.6 т.п.н., соответствующий Hindlll-Sacl фрагменту неперестроенного аллеля гена, и 4 т.п.н. продукт, содержащий полноразмерную А-частицу, интегрированную в mtsl локус (lAP-mtsl) (рис.9).

Оба фрагмента были клонированы в плазмидный вектор pCR-11. На основании данных рестриктного картирования клона, содержащего А-частицу и прилегающие регионы' mtsl; а такУ.е результатов Söiithern-блот гибридизации, была составлена рестриктнзя карта локуса (рис.11).

Известно, что полный геном 1АР составляет 7,2 т.п.н. [Hawley R.G.,1984] и содержит ряд высоко консервативных рестриктных сайтов. 3,3 т.п.н. А-частица, встроенная в mtsl локус, представляет собой делегированный вариант с размером делении около 3,9 т.п.н. Сравнение рестриктных карт LAP-mtsl и полноразмерной А-часпшы [KufT E.L.,1988] позволяет заключить, что деления затрагивает часть гена gag, .ген pol и приводит, т.о., к слиянию gag-env регионов (рис.12). Размер делеции и паттерн рестриктных сайтов не позволяет отнести этот ■

123456789 10

т-

4268' 3530'

2027 1896

• w

РИС.10. Блсгг-гибридизация гидролизо ванной различными

рестрикгазами ДНК клеток WEHI-3 ( 2, 4, 6, 8, 10 ) и КСМЛ-100 (1,3, 5, 7, 9) с 32р.мечеНным фрагментом кДНК, содержащим 2-3 эхзоны mtsl.

1,2 - ДНК обработана рестриктазой EcoRI, 3,4 - SacI, 5,6 - Hindlll, 7,8 -Xbal, 9,10 - Hindlll и EcoRI. Слева указан молекулярный вес маркера ( ДНК фага X, гидролазованная HindHJ/EcoRI )

1 и>

АТС

ЕсоШ

БсГП

В. 5'

Н.пс! III 5лс! РгЙ

ЫсЫ

ЕсоГО

Н1п(1Ш Бас! Рб»|

Ш

Еас! Вд1 II

ЕсоП!

\ш

I I к.

Рэ« НтйШ

ВвтН1

РИС.11. (А)- Ресгриктная карта тЫ локуса. Штрихами отмечена предполагаемая область интеграции А-частицы; (В)- рсстриктная карта* перестроенного локуса в соответствии с результатами ресгриктного картирования ( см. рис. 10 ); (С) - реконструированная карта перестроенного в результате инсерции А-частицы т&1 локусп.

№

х с

Р Н ЕХ Э Б (В) В -ч^ ВС Н Р

1||| II I I 11 III I

дад

ро/' /сап'/

В.

ВХ Р НЕ,, Б

I 1111 I

Л 3. 3 кй

Б Н Р,Н

РИС.12. (А)- Структура полноразмерной А-частицы;

(В)- Структура А-частицы, интегрированной в шк! локус. Обозначения: Р - Ра1; Н - НнкШ1; Е - ЕсоИ; X - ХЬа1; Э - Бта!; В -ВатН1; в - В^И.

S'LTRIAP

A. S'gaggacatEtatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgTCjJTG G G AG CCG CCCCCACA-.....3'

B. 5' gaggttcatgtatgtgtgtgtgtgtg-------------------------------------------3'

C. 5' gaggttcatgtatgtgtgtgtgtgtg--------------------------------------------3'

_3'LTRIAP_

A. 5'..........CGTCCTAATAACAtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtEtaggttsgtgtg 3'

B. 5'---------------------------------tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtaggttcgtgtg 3'

C. 5'---------------------------------------------------------------------3'

A. 5' tetgtgtgtgtttttcacaagaatgaaaa" 3'

B. 5' tgtgtgtgtgtttttcacaagaatgaaaa 3'

C. 5'------gtgtttttcacgagaatgnann 3'

РИС.13. • Нуклеотидная последовательность районов слияния IAP-mtsI (А); соответствующего района в неперестроенном аялеле гена (В) в сравнении с описанной ранее последовательностью mtsl в клетках КСМЛ-100 (С).

— 2.0 —

элемент ни к одному из известных подклассов А-частиц. По-видимому,

(

lAP-mtsl представляет новый подкласс шпрацистернальных А-частии.

Для точной локализации места встраивания IAP мы определяли нуклеотадные последовательности районов, прилегающих к праймерам 2 и 3. Было обнаружено, что интеграция 3,3 т.п.н.-А-частицы произошла в интрон 1 гена mtsl на 92 п.н. выше по течению от SacI рестриктного сайта (рис.11). Нуклеотидная последовательность районов слияния mtsl и IAP, а также соответствующего района в неперестроенном аллеле WEHI-3 клеток в сравнении с описанной ранее последовательностью mtsl гена в клетках линий мышиной аденосаркомы KCMJ1-100 и КС МЛ-0 [Tulchinsky Е.,1990] приведена на рис.13. Оба LTR фланкированы 4 п.н. инвертированными повторами: 5' TGTT/ACAA 3', а место интеграции - 6 п.н. дупликациями последовательности гена ( S' TGTGTG 3' ). Интересно отметить, что в районе места интеграции А-частицы в обоих аллелях гена наблюдается 43 п.н. дупликация GT-богатого фрагмента интрона1. Однако; нет' достаточных оснований полагать, что такой внутривидовой полиморфизм дает какие-либо селективные преимущества для интеграции LAP.

Механизм образования химерного траиасрипта mtsl.

На основании данных рестриктного картирования 1АР-содержащего клона, компьютерного анализа нуклеотидной последовательности хДНК транскрипта IAP-mtsI и картирования 5'-конца химерной РНК, мы заключили, что LAP-mtsl имеет такую же транскрипционную ориентацию, как и ген mtsl. Старт транскрипции находится в 5' LTR А' частицы. Зрелый транскрипт образуете» в результате сплайсинга с участием донорного сплайс-сайта гена gag IAP и акцепторного сплайс-

— 2.1 —

РИС.14 А. Образование 1АР-тц1 химерного транскрипта в результате сплайсинга.

В. Структура мРНК 1АР-ти1.

сайта mtsl (рис. 14). В составе такого транскрипта присутствуют R и US области У-LTR А-часпшы, У-нетранслируемая область гена gag и кодирующая часть гена mtsl (экзоны 2 и 3). Основная открытая рамка считывания для белкового продукта mtsl сохраняется; последовательность участка, фланкирующего старт трансляции, совпадает с выведенной Kozak усредненной последовательностью данного района [Когзк,М.,1984]. Вероятно, эта рамка является функциональной.

Модуляция экспрессии mtsl в клетках линия WEIII-3.

Монослой клеток WEHI-3 обрабатывали 10 мхг/мл LPS. На рис.15 представлены результаты блот-гибридизации тотальной РНК этих клеток с mtsl-специфичной пробой. Было показано, что LPS по-разному действует на уровень нормальной и химерной mtsl мРНК. LPS вызывал снижение уровня нормальной mtsl мРНК в течение 3 часов после обработки, затем, через 6 часов, этот уровень резко повышался и снова снижался вплоть до недетектируемого к 24 часам. Качественно схожий, но гораздо менее выраженный эффект оказывал LPS на уровень химерной мРНК mtsl (рис.IS).

Обрабатывая клетки акгиномицином Д, мы сравнивали стабильность двух видов мРНК mtsl. Из рис.16 видно, что нормальная и химерная РНК одинаково стабильны, во всяком случае, в течении 13 часов ( исследовать стабильность РНК на протяжении более длительного периода времени не представлялось возможным из-за выраженного токсического эффекта актиномицина на эти клетки ).

Учитывая, что нормальная и химерная мРНК mtsl одинаково стабильны, мы предположили, что LPS может вызывать активацию

К 15'30' lh 3h 6h 8h 24h BBf ^Sii О mtsl

0.5

■ ■ I '

»a aeeeee GAPDH

РИС.15 Блот-гибридизация тотальной РНК клеток линии WEHI-3, обработанных LPS, с 32Р-меченной кДНК mtsl ( верхняя панель); количество материала на дорожке оценивалось по интенсивности сигнала гибридизации с кДНК гена GAPDH ( нижняя панель ).

к бк гк ^

тй!

вАРОН

РИС.16 Блот-гибридизация тотальной РНК клеток линии \VEHI-3 обработанных ахтиномицином Д. с 32Р.мсченной

панель) и с *ЦНК гена САРОН (нижняя панель).

специфических нуклеаз, деградирующих эту РНК, (что происходит практически сразу после внесения LPS в культуральную среду ), а также индуцировать активацию, транскрипции гена mtsl (6 час. точка). Поскольку снижение уровня нормальной РНК более выраженное, можно предположит^, что наличие дополнительной последовательности на 5'-конце химерного mtsl транскрипта вносит вклад в его стабилизацию.

Интересно отметить, что через 6 часов инкубации клеток с липополисахаридом увеличивался уровень обоих типов РНК mtsl. Вряд ли такая активация транскрипции связана с воздействием та промоторную облась гена, поскольку считывание двух типов транскриптов инициируется разными промоторами. Возможно, усиление транскрипции опосредовано энханссрным элементом, который расположен в первом интроне гена mtsl между SacI и НаеШ рестриктными сайтами ( Tulchinsky, Е., 1992).

Подробное изучение механизмов _ регуляции экспрессии mtsl . представляет предмет дальнейших исследований.

- 2Ь-

выводы.

1. Изучена экспрессия гена mtsl в расфракционированных клетках миелоидного происхождения. Показано, что ген активно транскрибируется в Т-лимфоцитах, нейтрофилах, макрофагах мыши и человека и соответствующих перевиваемых клеточных линиях. В В-лимфоцитах и предшественниках эритроцитов не выявлено транскриптов гена mtsl.

2. Уровень мРНК mtsl может модулироваться различными активаторами иммунокомпетентных клеток ( LPS, Con-A, ylFN ).

3. Транскрипция гена mtsl усиливается в процессе активации макрофагов.

4. Увеличение концентрации цитозольного кальция приводит к снижению уровня мРНК mtsl за счет усиления ее деградации.

5. Обнаружена и охарактеризована перестройка mtsl локуса в линии миеломоноцитов мыши WEHI-3, вызванная инсерцией интрацисгернальной А-частицы в первый интрон гена.

6. Охарктеризован дополнительный транскрипт гена mtsl в линии клеток WEHI-3. Показано, что старт транскрипции находится в 5" длинном концевом повторе А-частицы; транскрипт образуется в результате сплайсинга с участием донорного сплайс-сайта гена gag IAP и функционального акцепторного сплайс-сайта гена mtsl. Инсерция А-часгицы не нарушает открытой рамки считывания для белкового продукта гена mtsl.

COMEPXAIIKEAKCCEPIAHHH lJSJIOXEilO B OIEJiyjOWKX PAEOTAX:

1. Grigorian M., E. Tulchinsky, S. Tarabykina, N. Gural, O. Burrone and E. Lnkanidin. Expression of metaslalic-spccific mtsl gene in human and mouse immunocompetent cclls. / Clinical and Experimental Metastasis, Vol.10, suppl.l: 73. Abstract for 4th International Congress of the Metastasis Research Society, /991

2. Grigorian M., E. Tulchinsky, O. Uurrone S. Tarabykina, G. Georgiev, E. Lukanidin. Modulation of mtsl expression in mouse and human normal and tumor cclls./Electrophoresis, 1994, Yef. /S~ f>f+ Y6S~Y£&.

Подписано к печати Отпечатано на ротапринте в Производственной комбинате Литературного фонда России

" О У 1994 Г. Формат бумаги 30x42/4 Объем у п.д.

Тир. 1ВО