Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локализация факторов эксцизионной репарации нуклеотидов на повреждённой ДНК

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Локализация факторов эксцизионной репарации нуклеотидов на повреждённой ДНК"

005010772

На правах рукописи

КРАСИКОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФАКТОРОВ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ НА ПОВРЕЖДЁННОЙ ДНК

03.01.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 мар тг

Новосибирск - 2012

005010772

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

д.х.н., профессор, член-корр. РАН Лаврик Ольга Ивановна

к.х.н.

Речкунова Надежда Ивановна

д.х.н., профессор Громова Елизавета Сергеевна

к.х.н.

Малыгин Алексей Аркадьевич

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Защита состоится «16» марта 2012 г. в 09:30 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: Новосибирск, 630090, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан <ИО» февраля 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Действие эндогенных

реакционноспособных метаболитов и экзогенных факторов приводит к различным повреждениям клеточной ДНК. Генетическая стабильность организмов обеспечивается широким спектром механизмов репарации, среди которых важное место занимает эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН). Характерной особенностью системы ЭРН является способность удалять очень широкий спектр повреждений ДНК, в частности этот путь репарации является основным в клетках млекопитающих для удаления повреждений ДНК, образующихся под воздействием УФ-излучения, а также объемных ДНК-аддуктов, возникающих под действием химических канцерогенов либо в результате применения химиотерапевтических средств. Дефекты в системе ЭРН приводят к тяжелым заболеваниям, в том числе некоторым формам рака. Полный цикл процесса ЭРН включает в себя несколько стадий - узнавание повреждения, раскрытие ДНК-дуплекса вокруг повреждения, вырезание одноцепочечного повреждённого участка ДНК, застройка образовавшейся бреши и лигирование разрыва. На сегодняшний день точный механизм процесса в целом и отдельных его стадий окончательно не установлен. Не выясненной остаётся как последовательность сборки факторов ЭРН на повреждённой ДНК, так и роль отдельных белковых факторов в этом процессе. В связи с этим актуальным является определение состава и топографии ДНК-белковых комплексов, формирующихся на поврежденной ДНК на отдельных стадиях процесса. Применение физических подходов к изучению системы ЭРН ограничено размерами объекта и сложностью подготовки образцов, а исследования in vivo сопряжены с трудностями интерпретации наблюдаемых явлений. Перечисленные факты определяют актуальность использования химических методов исследования, в частности, метода аффинной модификации, как наиболее перспективного для исследования сложных белок-нуклеиновых комплексов, в том числе комплекса ЭРН.

Целью данной работы было определение локализации белковых факторов эксцизионной репарации нуклеотидов на поврежденной ДНК в процессе узнавания повреждения. В ходе исследования планировалось решить следующие задачи:

• Сконструировать модельные ДНК-субстраты, имитирующие интермедиаты этапа узнавания повреждения системой ЭРН.

• Исследовать комплексообразование факторов ЭРН XPC-HR23b, ХРА, RPA с созданными ДНК-структурами.

• Определить места контактов указанных факторов ЭРН с ДНК.

Научная новизна. С использованием модельных ДНК-структур, имитирующих интермедиа™ различных этапов процесса ЭРН, исследовано взаимодействие ключевых белковых факторов ЭРН - XPC-HR23b, ХРА и RPA - с поврежденной ДНК на стадиях узнавания повреждения и формирования предрасщепляющего комплекса. Впервые показано совпадение мест контакта XPC-HR23b и его дрожжевого ортолога Rad4-Rad23 с поврежденной ДНК. Данные по локализации белков, полученные методом фотоаффинной модификации, согласуются с результатами рентгеноструктурного анализа комплекса Rad4 с фрагментом повреждённой ДНК. Установлена положительная корреляция между углами изгиба повреждённых ДНК-структур и константами диссоциации комплексов ХРС-HR23b с этими ДНК. Выявлены места контактов RPA и ХРА с частично раскрытым повреждённым ДНК-дуплексом: впервые напрямую показано, что ХРА располагается с 5'-стороны от повреждения, а основным местом контакта RPA является участок неповреждённой цепи напротив повреждения. Показано, что расположение RPA и ХРА на повреждённом ДНК-дуплексе и частично раскрытом повреждённом ДНК-дуплексе совпадают.

Практическая значимость работы. Данные по взаимодействию XPC-HR23b, ХРА и RPA с различными ДНК-структурами позволяют определить локализацию на поврежденной ДНК и взаимную ориентацию этих белковых факторов на стадии узнавания повреждения, а также в составе предрасщепляющего комплекса, формирующегося на этапе, предшествующем выщеплению поврежденного фрагмента эндонуклеазами. Решение фундаментальных вопросов о роли каждого фактора в процессе узнавания и удаления повреждения ДНК системой ЭРН может позволить перейти на уровень решения практических задач по поиску мишеней для лекарственных средств, направленных на преодоление как нарушений системы ЭРН, так и на снижение активности этого процесса репарации в раковых клетках.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: I международном конгрессе студентов и молодых учёных «World of Science» (Алма-Ата, Казахстан, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); 33-ем конгрессе FEBS и 11-ой конференции IUBMB (Афины, Греция, 2008); «United Kingdom Environmental Mutagen Society, 32nd Annual Meeting» (Лидс, Великобритания, 2009); V международной школе «DNA and Chromosomes: Physical and Biological Approaches» (Каргезе, Франция, 2009); Российско-Швейцарском семинаре «Regulation of genome stability by DNA replication and repair» (Санкт-Петербург, 2010); «EEMS 40th Annual Meeting , 2010: Environmental

2

mutagenesis in the North» (Осло, Норвегия, 2010); Международной конференции «Responses to DNA damage: from molecular mechanism to human disease» (Эгмонд-ан-Зее, Нидерланды, 2011); II Международной конференции, посвященной 85-летию Академика Д.Г. Кнорре «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2011).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, трёх разделов, заключения, выводов и списка литературы. Она изложена на 13^ страницах и включает 47 рисунков, 3 таблицы и список цитируемой литературы из 27¿y наименований. Работа выполнена в рамках программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и гранта РФФИ № 10-04-00837.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Первичное узнавание поврежденного участка ДНК белковым фактором XPC-HR23b

Основным претендентом на роль фактора, осуществляющего первичное узнавание повреждения, в настоящее время признан гетеродимер XPC-HR23b (Sugasawa К. el al. 2001; Batty D. et al. 2000). Определение локализации XPC-HR23b на повреждённой ДНК и зависимости его сродства от дестабилизации ДНК необходимо для более полного понимания роли этого белка в процессе ЭРН.

1.1. Исследование топографии комплекса ХРС-Н1123Ь с повреждённой ДНК методом фотоаффинной модификации. Сравнение результатов с данными рентгеноструктурного анализа комплекса дрожжевого ортолога ХРС -1^4 - с фрагментом повреждённой ДНК.

Для определения локализации белка на поврежденной ДНК необходимо выявить контакты белка с различными участками ДНК-

дуплекса.

Название олигонук-леотидов

Fg или Е'а

Нуклеотидная последовательность ДНК

Y Т W Т Y

-СГАТ GGCG AGGC GATT AAGT TGGG СААС GTCA GGGT СТТС CGAA CGAC-3' -GATA CCGC TCCG СТАА ТТСА АССС GFÏC CAGT COCA GAAG GCTT GCTG-S'

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности использованных в работе фотоактивных 48-мерных ДНК-структур. Здесь, Р - Р1и-сШМР; позиции 5МиМР обозначены стрелками и номерами.

Для решения этой задачи был использован

метод фотоаффинной модификации. В качестве фотоаффинных реагентов были использованы сконструированные 48-мерные ДНК-дуплексы,

5'-CTAT GGCG AGGC GATT AAGT TGGG TAAC GTCA GGGT CTTC CGAA CGAC-3' 3' -GATA CCGC TCCG CTAA TT CA ACCC ATFG CAGT CCCA GAAG GCTT GCTG-S'

содержащие повреждение в виде флуоресцеин-замещенного производного сШМР (5-{3-[6-(карбоксиамидофлуоресцеинил)амидокапромоил]аллил1}-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфата (РЪ-сЩМР)) и фотореакционноспособный остаток 51-сШМР (5-йодо-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфата) в различных положениях повреждённой и неповреждённой цепей ДНК-дуплекса (табл.1).

На рис.1. А представлены результаты электрофоретического разделения продуктов модификации ХРС-НЯ23Ь фотоактивными ДНК-

дуплексами, содержащими повреждение. Исследуемый белок д ГГГ/71/и1и

кда ^/Гд^ 2/ТдЗ/?ъ «/Уд Ь/Уд 6/Уд М/П^И/пгы/ИЗИ/ИД

250150-

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ХРС-НЯ23Ь, . л »л л ш » и а ю л ш ситат^юшюа ш

гчо сч о о сч о N о сч о

О о СЧ

"ГГ Г/7

2-ой комплекса 1-мй комплекс^

ХРС-НК23Ь-

-лнк

12 3 4

ХРС-Н1!23Ь, " № л о -7 о о г* о|

+ ХРС-НК23Ь.

М

ХРС-НК23Ь 0,9*10" М ХРС-тегЗЬ 2,5*10"

ДНК: белок = 1:1 ДНК:белок = 1:2

Рис. 1. Фотоаффинная модификация ХРС-Н1ШЬ поврежденными ДНК-дуплексами. (А) Радиоавтограф 10% БВЗ-ПААГ (акриламид : бис-акриламид = 60 : 1). На схематично представленных ДНК-структурах: позиции 51-сШМР обозначены черточками, числами обозначены его позиции относительно повреждения. Треугольником обозначен остаток К1и-сЩМР. (Б) Относительные уровни модификации, полученные усреднением данных трех экспериментов. Верхняя часть гистограммы соответствует модификации неповрежденной цепью ДНК, а нижняя - поврежденной. (В) Анализ комплексообразования ХРС-НЯ23Ь с повреждённым ДНК-дуплексом методом задержки в геле. Радиоавтограф 5% нативного ПААГ (акриламид : бис-акриламид = 60 : 1). (Г) Схема расположения ХРС-Н;К23Ь на поврежденной ДНК.

модифицируется обеими цепями ДНК-дуплекса (дор. 1-12 на рис. 1.А соответствуют неповреждённой цепи ДНК, а дор. 13-20 - повреждённой), и профиль максимумов интенсивности модификации зависит от концентрации белка и положения фотоаналога (гистограмма рисЛ.Б).

Результаты экспериментов по комплексообразованию показывают, что модификация XPC-HR23b при концентрации белка 0,9*10"7 M происходит в комплексе, соответствующем связыванию одной молекулы белка с ДНК (дор. 2 на рис. 1.В). Для такого типа комплекса наибольший выход белок-нуклеиновых аддуктов получен для ДНК-структуры 4/Fg, содержащей фотоаналог в «0»-позиции неповреждённой цепи, т. е. прямо напротив повреждения (дор. 7 на рис. 1.А). ДНК-структуры, содержащие фотоаналог в «+»-направлении от повреждения (положения «+4» и «+10» в неповреждённой цепи и «+5 »-положение в повреждённой), не модифицировали XPC-HR23b при этой концентрации. При этом белок модифицировался структурами, содержащими фотоаналог в «-»-позициях. После связывания второй молекулы XPC-HR23b с ДНК (при концентрации 2,5* 10"7 М) уровень модификации в «0»-позиции не изменяется (сравнить дор. 7 и 8 на рис. 1.А), что предполагает существование постоянного контакта белка с этим нуклеотидом и подтверждает гипотезу о его важности для узнавания повреждения.

Данные по зависимости интенсивности модификации XPC-HR23b от положения 5I-dUMP в ДНК (гистограмма на рис. 1.Б) позволяют сделать вывод, что белок связывается с неповреждённой цепью дуплекса с 5'-стороны от повреждения (рис. 1.Г). Дополнительные пики модификации, появляющиеся при увеличении концентрации XPC-HR23b (дор. 10, 12 и 20 на рис. 1.А), указывают позиции связывания второй молекулы белка с ДНК (рис. 1.Б и Г). Наиболее вероятно, что вторая молекула связывается неспецифически с неповреждённым участком ДНК-дуплекса.

Полученные данные по локализации XPC-HR23b на повреждённой ДНК согласуется с предположением о том, что XPC-HR23b узнаёт не само повреждение, а участок неспаренных оснований в ДНК, возникающий вследствие дестабилизации дуплекса из-за наличия повреждения (Buterin Т. et al. 2005; Maillard О., Solyom S. and Naegeli H. 2007). Это предположение было подтверждено данными рентгеноструктурного анализа комплекса Rad4, дрожжевого ортолога ХРС, с фрагментом поврежденной ДНК (Min J Н. and Pavletich N.P. 2007).

Чтобы применить принцип укладки доменов Rad4 на ДНК для объяснения данных по фотоаффинной модификации XPC-HR23b, нужно было выяснить, как согласуются результаты этого метода с данными РСА. Для решения этой задачи была проведена модификация Rad4-Rad23 теми же фотореакционноспособными ДНК-структурами. Препарат Rad4-Rad23 был полностью идентичен белку, использованному для кристаллографии. При

5

формировании комплекса с соотношением белок : ДНК =1:1 максимумы интенсивности модификации 11ас14-11ас123 расположены с 5'-стороны от повреждения. Как и в случае ХРС-НЯ23Ь, наибольший уровень модификации соответствует положению фотоаналога непосредственно напротив повреждения (рис. 2).

Rad4-Rad2 3 1*10 M ДНК:белок =1:1

Рис. 2. Фотоаффинная модификация Яас14-Ка<123 поврежденными ДНК-дуплексами. (А) Относительные уровни модификации, полученные усреднением данных трех экспериментов. На схематично представленных ДНК-структурах позиции фотоаналога 51-<ЩМР обозначены черточками, числа соответствуют его положению относительно повреждения. Треугольником обозначен остаток Ни-сШМР. (Б) Локализация 1^4-11ас123 на поврежденной ДНК.

Позиции фотоаналога, в которых были получены максимумы интенсивности модификации Яас14-11ас123, совпадают с местами контакта 11а<14-Кас123 с ДНК по данным РСА.

Локализация Rad4-Rad23 по данным рентгеко-структурного анализа

Локализация Rad4~Rad23 по данным фотоаффинной модификации

ГТ

Локализация XPC-HR23b по данным фотоаффинной кодификации

Рис. 3. Данные по локализации XPC-HR23b и Rad4-Rad23 на поврежденной ДНК, полученные методом фотоаффинной модификации, согласуются с результатами РСА комплекса Rad4-Rad23 с фрагментом поврежденной ДНК (Min J.-H. and Pavletich N.P. 2007). Обозначения: чёрточки - позиции фотоаналога 5I-dUMP, треугольник — остаток Flu-dUMP, «Т-Т» - ииклобутанпиримидиновый димер.

Основываясь на данных по структуре Rad4 и результатах модификации дрожжевого и человеческого ортологов, можно говорить о совпадении характера взаимодействий и, следовательно, о применимости

предлагаемой модели расположения ХРС-НЯ23Ь на повреждённой ДНК (рис. 3).

Одинаковая локализация белков ХРС-НЛ23Ь и Яас14-11ас123 на повреждённой ДНК говорит об универсальности принципа структурной организации факторов, «сканирующих» ДНК на наличие повреждения. Можно предположить, что позиционирование этих факторов с 5'-стороны на неповреждённой цепи задаёт последующую ассиметрию предрасщепляющего комплекса, формирующегося на повреждённой ДНК перед выщеплением повреждённого фрагмента.

1.2. Связывание ХРС-НЯ23Ь с поврежденной ДНК

Предполагается, что особенности структуры Яаё4/ХРС позволяют этому белку сканировать ДНК на наличие дестабилизации двойной спирали, возникающей вследствие наличия повреждения. Были проведены детальные исследования влияния отдельных нарушений структуры дуплекса, таких как объемное повреждение и/или область неспаренных оснований - «пузырь» (табл. 2) - на связывание ХРС-НЯ23Ь с ДНК.

Название

Нуклеотидк&я последовательность ДНК

олигокук леотидо»

Иш 48с

Нш

Fg

в

48с

fg

5'-СТАТ GGCG AGGC GATT ЛАСТ TGGG CMC GTCA GGCT СТТС ССАА CGAC-3' З'-САТА CCGC ТССС СТАЛ ТТСА АССС СТТС САСТ СССА GAAC ССТТ GCTC-5'

-СТАТ GCCС АССС САТТ ААСТ TGGG СААС СТСА GGGT СТТС ССАА CGAC-3' -GATA CCGC TCCG СТАЛ ТТСА АССС с£Тв CAGT СССА GAAC GCTT GCTC-5'

5' -СТАТ GGCG AGGC САТТ А"ГСА АССС ATTG CAGT 3' -GATA CCGC TCCG СТАЛ фСА АССС CTTfl CAGT

GGGT СТТС CGAA CGAC-3' СССА GAAC GCTT GCTG-5*

5' -СГАТ GGCG AGGC CATT ! 3' -GATA CCGC TCCG CTAA 1

l ACCC ATTG CAGT i ACCC GFTC CAGT

GGGT CTTC CGAA OSAC-3' CCCA GAAC GCTT GCTG-5'

Таблица 2.

Последовательности использованных в работе 48-мерных ДНК-дуплексов. Здесь, Г -остаток Р1ичШМР; рамкой выделена область неспаренных оснований размером 15 н.о. -«пузырь».

Эффективность комплексообразования ХРС-НК23Ь с ДНК анализировали методом задержки в геле. Реакционные смеси, содержащие меченую ДНК, титровали увеличивающейся концентрацией ХРС-НЯ23Ь в отсутствие и в присутствии пятикратного избытка немеченого неповреждённого 48-мерного ДНК-дуплекса (рис. 4.А и Б). Самую низкую эффективность связывания ХРС-НЯ23Ь демонстрирует с неповреждённым ДНК-дуплексом (дор. 1-6 на рис. 4.А и дор. 1-5 на рис. 4.Б). Для ДНК, содержащей повреждение, уровень комплексообразования в присутствии конкурентной ДНК приблизительно в 2 раза выше (дор. 6-10 на рис. 4.Б). Следующими в ряду увеличения сродства ХРС-НЯ23Ь находятся ДНК-структуры, содержащие «пузырь». Наибольшая разница в сродстве наблюдается между неповреждённым ДНК-дуплексом №п/48с и ДНК-дуплексом ВЛ-^, содержащим повреждение в области «пузыря» - уровни связывания в присутствии конкурентной ДНК составляли 15 и 85% соответственно (рис. 4.Б).

10 14 18 ХРС-НК23Ь, *10"' М

ХРС-НЙ23Ь, *1<Г' м

Б В присутствии конкурентной ДНК

Рис. 4. Связывание ХРС-НЯ23Ь с различными типами ДНК-структур (А). В случае (Б) связывание проводилось в присутствии пятикратного избытка неповрежденного немеченого 48-мерного ДНК-дуплекса. Радиоавтографы 5% нативных ПААГ (акриламид : бис-акриламид = 60 : 1). Представленные в пунктах (А) и (Б) графики были построены по усредненным данным из трех экспериментов.

Эксперименты по связыванию 11ас14-11ас123 с теми же ДНК-структурами показали, что оба ортолога имеют общий ряд увеличения сродства: неповреждённая ДНК < повреждённая ДНК < ДНК, содержащая «пузырь» < ДНК, содержащая «пузырь» и повреждение.

1.3. Количественные характеристики взаимодействия ХРС-НЯ23Ь с различными типами ДНК-структур

Константы диссоциации комплекса ХРС-НЯ23Ь с исследуемыми ДНК-структурами (табл. 2) были определены по анизотропии флуоресценции. В качестве репортерной группы выступал остаток флуоресцеина, моделирующий объёмное повреждение. Анализ данных проводился в рамках модели, предполагающей эквимолярное связывание ХРС-НК23Ь : ДНК. На рис. 5.А представлены типичные кривые титрования повреждённого ДНК-дуплекса и ДНК-дуплекса, содержащего повреждение в составе «пузыря», увеличивающейся концентрацией ХРС-НЯ23Ь. Значения констант диссоциации для использованных ДНК-структур приведены в таблице на рис. 5.Б.

§

(5 ± 2) *10~9 (5 ± 2) *10"10 (2,5 ± 0,6)*10_1 (8 ± 1) *10~11

Угол изгиба

180° 140 ± 3" 124 ± 3" 116 ± 2"

о 0 2 4 6 8

Ь ХРС-НК23ЬГ *10"9М

Рис. 5. (А) Изменение анизотропии флуоресценции в процессе связывания ХРС-НК23Ь с 1 нМ поврежденным дуплексом или ДНК, содержащей повреждение в составе «пузыря». Каждая точка получена как среднее значение анизотропии из трех экспериментов. Отклонение от среднего значения составило < 5%. (Б) Константы диссоциации комплекса ХРС-ШШЬ с ДНК-структурам и и угол изгиба этих ДНК. Значения констант для нефлуоресцентных ДНК определены из данных по конкурентному титрованию. Ошибки являются отклонением от среднего значения.

Наиболее высокое сродство ХРС-НЯ23Ь демонстрирует к ДНК-структуре, содержащей повреждение в составе «пузыря» - Кв~ 8*10 М. Константа диссоциации комплекса с повреждённым ДНК-дуплексом Ыт/Р^ приблизительно в 6 раз выше - Кв ~ 5* Ю"10 М.

Константы диссоциации комплексов для ДНК-структур, не содержащих флуоресцеин, были получены из экспериментов по конкурентному титрованию. Сродство к неповреждённому ДНК-дуплексу (]Мт/48с) примерно в 10 раз ниже, чем к ДНК-дуплексу, содержащему повреждение (ЫтЛ^). В случае ДНК-структур, содержащих «пузыри» (В/48с и ВЛ^), сродство ХРС-НЯ23Ь к структуре с повреждением (ВЛ^) в 3 раза выше. Количественные характеристики, полученные методом флуоресцентного титрования, соответствуют ряду увеличения сродства белка к ДНК:

Неповреждённая ДНК

Повреждённая ДНК

ДНК < ДНК

с спузырём» с <пузырём» и

повреждением

Для того чтобы понять, насколько сродство белка отражает природу повреждения, было необходимо сопоставить полученные константы диссоциации XPC-HR23b с параметрами ДНК-структур, которые могли бы отражать степень их дестабилизации. Одной из таких характеристик показывающих, в какой степени дестабилизирована двойная спираль, является угол изгиба ДНК-дуплекса.

В работе авторов {Thompson J.F. and Landy A. 1988; Виноградова O.A. и др. 2009) было показано, что электрофоретическая подвижность ДНК-дуплекса в нативном ПААГ пропорциональна расстоянию между концами

этого дуплекса (его контурной длине). Исходя из этого предположения и простых геометрических соображений авторы (Thompson J.F. and handy А. 1988) вывели формулу для расчёта угла изгиба (у):

у =180°-а'

а = 2*arccos (M/N),

где а' - величина угла а в градусах; M - электрофоретическая подвижность ДНК-дуплекса, содержащего повреждение в центральной позиции; N - электрофоретическая подвижность ДНК-дуплекса, содержащего повреждение на одном из концов (вводится для исключения эффекта увеличения массы за счёт повреждения). Описанные алгоритмы были использованы для расчёта угла изгиба ДНК-дуплексов. Результаты расчётов представлены в таблице на рис. 5.Б. Полученные данные показывают, что сродство XPC-HR23b напрямую зависит от характера повреждения. Эта закономерность может быть проиллюстрирована следующим рядом: больше дестабилизация дуплекса -» больше угол изгиба —* больше сродство белка.

1.4. Влияние RPA и ХРА на взаимодействие XPC-HR23b с ДНК

Белки RPA и ХРА обладают повышенным сродством к нарушениям двойной спирали. Тем не менее,. их сродство к повреждённой ДНК на порядок ниже, чем у XPC-HR23b (Hey Т., Lipps G. andKrauss G. 2001, Hey T. et al. 2002). Однако существуют повреждения, которые не вносят сильных искажений в структуру двойной спирали и потому плохо узнаются ХРС-HR23b (Mocquet V. et al. 2007). Возможно, узнавание таких повреждений обеспечивается комплексом XPC-HR23b, ХРА и RPA, в котором специфичность к повреждённой ДНК повышается благодаря аддитивному эффекту (Reardon J.T. and Sanear А. 2003). В связи с этим представляло интерес исследовать влияние факторов RPA и ХРА на взаимодействие ХРС-HR23b с повреждённой ДНК. Результаты экспериментов по связыванию показывают, что RPA стимулирует формирование комплексов XPC-HR23b с ДНК. Из литературных данных известно, что ХРА физически взаимодействует с XPC-HR23b (You J.-S., Wang M. and Lee S.-H. 2003), а при совместном присутствии ХРА и XPC-HR23b в реакционной смеси наблюдается синергизм во взаимодействии этих белков с ДНК.

Эксперименты по фотоаффинной модификации показали, что RPA и ХРА стимулируют образование ковалентных аддуктов ХРС-НЯ23Ь-ДНК и влияют на расположение XPC-HR23b на повреждённой ДНК (рис. 6).

g ! _ BxPC-HR23b

I I s " .....i___________ШХРС-!Ж23Ь

S « , J ___il_tfe......(В прису*-

K в- „ Ш Ц Ш_i ствии ХРА)

" S 7 CI-it-'я-i

g «7fT2 H7FT3 Я/fxi O S7FÍ2 N7FÍ3 «Í7íü

1 X / á ¡ l Á l

Рис. 6. Влияние RPA (А) и ХРА (Б) на фотоаффинную модификацию XPC-HR23b. На гистограммах представлены усредненные количественные данные из пяти экспериментов по модификации.

Можно предположить, что эффект стимуляции модификации ХРС объясняется повышением специфичности контакта белка с поврежденным участком ДНК и, как следствие, увеличением общего сродства. Появление пиков модификации ХРС в «+4»-положении неповреждённой цепи в присутствии RPA и «+5»-положении повреждённой цепи в присутствии ХРА может говорить о появлении дополнительных контактов ХРС с ДНК в присутствии этих белков. Возможно, XPC-HR23b переходит в более компактную (или «сжатую») конформацию за счёт белок-белковых взаимодействий.

Стимулирующее влияние ХРА и RPA на связывание и модификацию XPC-HR23b показывает универсальность механизма последовательной сборки комплекса ЭРН и говорит о важной роли кооперативных взаимодействий в его формировании.

2. Белки ХРА и RPA - основные структурные элементы предрасщепляющего комплекса

Согласно модели «двойного узнавания субстрата», после первичного узнавания места дестабилизации двойной спирали происходит проверка этого участка на наличие повреждения и определение повреждённой цепи ДНК (Hess М.Т. el al. 1997). Предполагается, что в верификации обнаруженной XPC-HR23b области дестабилизации ДНК участвуют белковые факторы ХРА и RPA. В экспериментах in vitro было показано, что эти факторы привлекаются на ДНК-интермедиат, представляющий собой дуплекс с -15 неспаренными нуклеотидами (Tapias A. et al. 2004). Предполагается, что узнавание повреждённой цепи ДНК происходит уже в таком частично раскрытом ДНК-дуплексе. Таким образом, исследование взаимодействия ХРА и RPA с ДНК-структурами, имитирующими этот

ДНК-интермедиат, необходимо для понимания механизма формирования предрасщепляющего комплекса, обеспечивающего удаление поврежденного участка и сохранение целостности нативной цепи ДНК.

2.1. Взаимодействие RPA и ХРА с различными типами ДНК-структур

Для определения того, насколько селективно ХРА и RPA способны взаимодействовать с ДНК, содержащей повреждение в составе «пузыря», относительно такой же, но неповреждённой, были проведены эксперименты по связыванию этих белков с модельными ДНК-дуплексами в присутствии избытка конкурентной ДНК (рис. 7).

Наибольшая разница в сродстве наблюдается между дуплексными ДНК (дор. 0-10 на рис. 7.А и Б) и ДНК-структурами, содержащими «пузырь» (дор. 11-20 на рис. 7.А и Б). Уровни комплексообразования с этими типами ДНК-структур отличаются на 50% для ХРА и на 60% для RPA. Разница в уровне комплексообразования между структурами с «пузырём» составляет около 10% для ХРА и 20% для RPA (дор. 11-15 и 1620 на рис. 7.А и Б). При этом ХРА демонстрирует высокую селективность в связывании с повреждённым ДНК-дуплексом относительно нативной ДНК - разница уровней комплексообразования составляет более 20% (дор. 0-5 и 6-10 на рис. 7.А).

RPA, ♦10"'

RPA, «10"' M

Рис. 7. Связывание ХРА (А) и ИРА (Б) с поврежденными и неповрежденными ДНК-дуплексами в присутствии пятикратного избытка неповреждённого немеченого 48-мерного ДНК-дуплекса. Радиоавтографы 5% нативных ПААГ (акриламид : бис-акриламид = 60 : 1). На представленных в пунктах (А) и (Б) графиках каждая точка была получена как среднее значение из пяти экспериментов.

Высокое сродство ХРА и ЯРА к ДНК-структурам, содержащим «пузырь», может свидетельствовать о том, что эти белковые факторы локализованы на одноцепочечных участках, составляющих «пузырь». Чтобы выяснить, с какой из цепей «пузыря», повреждённой или неповреждённой, взаимодействуют ХРА и ЯРА, было исследовано связывание этих белковых факторов с одноцепочечными нативной и повреждённой ДНК, повреждённым дуплексом и ДНК, содержащей

О 1 234 5676 9 1011 121314151* 1718 1920 _ NHNnONHn^OnHNAONHNUO * 10 Mo н о о о

Рис. 8. Связывание ХРА (А) и ЯРА (Б) с различными типами ДНК-структур. Радиоавтограф 5% нативного ПААГ (акриламид : бис-акриламид = 60 : 1). Представленные кривые построены по усредненным данным из трёх экспериментов.

В этих экспериментах ХРА демонстрировал наибольшее сродство к ДНК-дуплексу, содержащему повреждение в составе «пузыря» (дор. 16-20 на рис. 8.А). Сродство к повреждённому дуплексу (дор. 11-15 на рис. 8.А) было выше, чем сродство к неповреждённой одноцепочечной ДНК (дор. 1-5 на рис. 8.А.). Ряд увеличения сродства ХРА к ДНК имеет следующий вид:

ДНК Нативкая Повреждённая . Повреждённая

с «пузырём» и ^ одноцепочечная ~ ДНК ^ одноцепочечная

повреждением ДНК ДНК

В ряду исследованных ДНК-структур RPA имеет самое высокое сродство к нативной одноцепочечной ДНК (дор. 0-5 на рис. 8.Б), а самое низкое - к повреждённому дуплексу (дор. 11-15 на рис. 8.Б):

Нативная Повреждённая ДНК Повреждённая

одноцепочечная ^ одноцепочечная / с <пузырём> и ^ ДНК

ДНК ДНК повреждением

Кроме того, с повреждённым дуплексом RPA связывается высококооперативно, о чем свидетельствует одновременное присутствие свободной ДНК и нескольких комплексов белок-ДНК с различной электрофоретической подвижностью (дор. 11-15 на рис. 8.Б).

Таким образом, можно заключить, что для связывания ХРА важно наличие разветвлённых участков в ДНК, а именно, перехода одноцепочечная-двуцепочечная ДНК, а эффективность связывания RPA зависит от присутствия одноцепочечных участков, к которым RPA имеет намного большее сродство, чем к двуцепочечной ДНК. Полученные результаты подтверждают существующее в литературе предположение о том, что ХРА и RPA включаются в комплекс ЭРН уже на стадии частично раскрытого дуплекса.

2.2. Локализация ХРа и RPA на ДНК-дуплексах, содержащих повреждение

Для определения локализации ХРА и RPA на частично раскрытом повреждённом ДНК-дуплексе было проведено картирование расположения этих белков на ДНК методом фотоаффинной модификации. Полученный результат сравнивался с аналогичными данными для повреждённого ДНК-дуплекса. Использованные ДНК-структуры содержали

фотореакционноспособный аналог нуклеотида в различных положениях повреждённой или неповреждённой цепей (табл. 3). На рис. 9 представлено схематичное расположение ХРА и RPA на ДНК, суммирующее результаты фотоаффинной модификации и экспериментов по связыванию.

Название олигонук-леотидов

1-6

ГЬ

Нуклеотидная последовательность ДНК

ю

I

-СТАТ GGCG AGGC GATT i -GATA CCGC TCCG CTAA '

AGT TGGG CAAC GTCA

GGGT СГГС CGAA CGAC-3'

iGT TGGG FAAC GTCA: CCCA GAAG GCTT GCTG-5'

-CTAT GGCG AGGC GATT -GATA CCGC TCCG CTAA

ifTCA ACCC ATTG CAGT ÉTCA ACCC ATFG CAGT *--------Jp-;i

GGGT CTTC CGAA CGAC-3' CCCA GAAG GCTT GCTG-5'

Таблица 3.

Последовательности использованных в работе 48-мерных ДНК-дуплексов. Здесь, Р -остаток Ни-сШМР; позиции 5МиМР обозначены стрелками и номерами; рамкой выделена область «пузыря».

Сопоставление позиций, для которых наблюдаются максимумы модификации, с картой расположения 51-(ШМР в ДНК показывает, что ХРА локализован с 5'-стороны от повреждения вблизи перехода одноцепочечная-двуцепочечная ДНК (рис. 9). Полученный результат впервые напрямую показывает локализацию ХРА на ДНК-структуре, содержащей повреждение в области неспаренных оснований. В литературе существуют данные о том, что ХРА взаимодействует с фактором ERCC1,

являющимся субъединицей структурно-специфичной эндонуклеазы XPF-ERCC1, которая расщепляет повреждённую цепь с 5'-стороны от повреждения (Li L. et al. 1994). Белок-белковые взаимодействия между ХРА и ERCC1 абсолютно необходимы для процесса ЭРН (Orelli В. et al. 2010). Можно предположить, что представленное на рис. 9 расположение ХРА необходимо для корректного расположения XPF-ERCC1 на ДНК в составе предрасщепляющего комплекса.

Наиболее высокий уровень фотопришивок RPA демонстрирует с ДНК-структурами, содержащими фотоаналог в неповреждённой цепи напротив повреждения и с 5'-стороны от него (рис. 9). Результаты экспериментов по связыванию (дор. 11-15 для повреждённого ДНК-дуплекса и дор. 16-20 для ДНК, содержащей повреждение в составе «пузыря», на рис. 8) показывают, что в использованном диапазоне концентраций с повреждённым дуплексом формируется комплекс белок-ДНК, содержащий четыре молекулы RPA, а с ДНК, содержащей повреждение в составе «пузыря», - две молекулы RPA. Исходя из этих данных можно предположить, что в формировании предрасщепляющего комплекса участвуют две молекулы RPA: одна молекула взаимодействует с одноцепочечным участком неповрежденной цепи, а вторая молекула RPA расположена вблизи перехода одноцепочечная-двуцепочечная ДНК с 3'-стороны от повреждения. Такое расположение RPA согласуется с литературными данными о полярном связывании этого белка с ДНК, содержащей бреши (Kolpashchikov DM. et al. 2001). Предполагается, что полярное связывание является необходимым условием для позиционирования высокоспецифичных нуклеаз XPF и XPG (De Laat W.L. et al. 1998).

ХРА

5'_I 8 » (№\i<_3'

3'-1-p^p-1*5 <

RPA

5'—

3 ;■ -W0f

Рис. 9. Схематичное расположение максимумов модификации ХРА и ЯРА на поврежденной ДНК.

Сравнивая расположение максимумов интенсивности модификации ХРА и RPA на повреждённом дуплексе и на ДНК, содержащей повреждение в составе «пузыря», можно говорить о совпадении характеров локализации исследуемых белковых факторов на указанных ДНК-структурах.

Полученный результат демонстрирует способность ХРА и ЯРА к правильному позиционированию в отсутствие других участников процесса.

2.3. Взаимодействие факторов ЯРА и ХРА при связывании с ДНК

Из литературных данных известно, что комплекс ЯРА-ХРА может быть выделен иммунопреципитацией любого из этих белков из экстракта клеток НеЬа (МсньиЛа Т. е/ а\. 1995) и вместе эти два белка имеют гораздо большее сродство к повреждённой ДНК, чем каждый из них по отдельности (Не 2. е/ а! 1995; П I. е/ а1. 1995). Кроме того, ЯРА оказывает сильное стимулирующее действие на способность ХРА связываться с ДНК-дуплексами, несущими повреждение, а делеционные мутанты ХРА, не способные взаимодействовать с ЯРА I, не поддерживают реакцию ЭРН Щ Ь. е! а1. 1995). Этот комплекс организует ядро предрасщепляющего комплекса за счёт белок-белковых взаимодействий со всеми участниками процесса.

Название

олигокук-леотидов

ЗП

П^ЗС

48с

Нуклеотидная последовательность ДНК

-СТАТ GGCG AGGC GATT AAGT TGGG СААС GTCA GGGT 3' -TTG CAGT СССА

СТТС CGAA CGAC-3' GAAG GCTT GCTG-5'

-СТАТ GGCG AGGC GATT AAGT TGGG СААС GTCA GGGT СТТС CGAA CGAC-3' -GATA CCGC TCCG СТАА ТТСА АССС G-5'

5' -СТАТ GGCG AGGC GATT AAGT TGGG СААС GTCA GGGT 3' -GATA CCGC TCCG СТАД ТТСА ACCC G

TTG CAGT CCCA _

5' -CTAT GGCG AGGC GATT AAGT TGGG CAAC GTCA GGGT 3' -GATA CCGC TCCG СТДА TTCA ACCC GTTG CAGT CCCA

CTTC CGAA CGAC-3' GAAG GCTT GCTG-5'

CTTC CGAA CGAC-3' GAAG GCTT GCTG-5'

Таблица 4.

Последовательности использованных в работе 48-мерных ДНК-структур. Здесь, Р - остаток Р1и-аиМР; позиции 51-ёЦМР обозначены стрелкой.

На рис. 10.А представлень! результаты сравнительного анализа эффективности образования комплекса ЯРА-ХРА-ДНК при совместном связывании этих белков с различными ДНК-структурами (табл. 4). При использовании ДНК-дуплексов, содержащих выступающие одноцепочечные участки (дор. 8 и 12 на рис. 10.А), образуется продукт с меньшей электрофоретической подвижностью, чем комплексы, образующиеся при взаимодействии ЯРА и ХРА по отдельности. Были получены подтверждения того, что данный продукт является тройным комплексом ЯРА-ХРА-ДНК, причём для ДНК-структуры с З'-выступающим одноцепочечным участком полоса, соответствующая тройному комплексу КРА-ХРА-ДНК, наиболее интенсивна (дор. 8 на рис. 10.А). В случае ДНК-дуплекса, содержащего разрыв, количество предполагаемого комплекса КРА-ХРА-ДНК крайне мало и находится на грани чувствительности метода обнаружения (дор. 16 на рис. 10.А). Взаимное влияние ЯРА и ХРА на образование контактов белков с ДНК (структуры представлены в табл. 4)

исследовали методом фотоаффинной модификации. Для ДНК-структур, содержащих выступающие одноцепочечные участки, наблюдается усиление интенсивности модификации субъединицы ЯРА 1 в присутствии ХРА.

А

1сяободнаи * ДНК

ХРА, • 10"' X -ИРА, „ •10"® М

, и1т II пае

ХРА, ♦10"' М -ЙРА, . •10"'

Рис. 10. Взаимодействие КРА и ХРА в процессе связывания различных ДНК-структур (А) и в процессе связывания ДНК, содержащей повреждение в структуре «пузыря» (Б). Радиоавтографы 5% нативных ПААГ (акриламид : бис-акриламид = 60:1).

Исследование взаимодействия ЯРА и ХРА в процессе связывания ДНК, содержащей повреждение в составе «пузыря», показало, что при эквимолярном соотношении концентраций КРА : ДНК регистрируется слабая полоса продуктов комплексообразования ЯРА-ХРА-ДНК (сравнить дор. 12-15 с дор. 3 и 7-11 на рис. 10.Б). Однако уже небольшой избыток ЯРА приводит к формированию интенсивной полосы, соответствующей комплексу ЯРА-ХРА-ДНК (сравнить дор. 16-20 с дор. 5 и 7-11 на рис. 10.Б).

Результаты экспериментов по комплексообразованию ЯРА и ХРА с ДНК, содержащей повреждение в составе «пузыря», указывают на то, что комплекс ЯРА-ХРА-ДНК, по-видимому, формируется на фрагменте ДНК-структуры, содержащем дуплекс с выступающим одноцспочечным участком.

Исходя из данных по локализации ЯРА и ХРА (рис. 9) и результатов экспериментов по совместному связыванию этих белков (рис. 10), для детального исследования взаимодействия между ЯРА и ХРА была использована ДНК, содержащая повреждение в составе «пузыря», и фотоаналог 51-сШМР в «+5»-положениях повреждённой и неповреждённой цепей дуплекса (рис. 11). Из представленного на рис. 11.А радиоавтографа геля видно, что эффективность модификации ЯРА и ХРА зависит как от концентраций белков, так и от соотношения их количеств. В присутствии эквимолярного по отношению к ДНК количества ЯРА эффективность модификации ХРА обеими цепями уменьшалась. По мере увеличения концентрации ХРА росла эффективность модификации ЯРА (сравнить дор. 1 с 6-8 и дор. 12 с 17-19 на рис. 11). В присутствии небольшого избытка ЯРА, наблюдалось ингибирование модификации обоих белков неповреждённой цепью ДНК (дор. 9-11 в сравнении с 2 и 3-5 на рис. 11),

тогда как для повреждённой цепи (дор. 20-22 в сравнении с 13 и 14-16) наблюдается ингибирование модификации ХРА, а интенсивность модификации RPA оставалась на прежнем уровне. Ингибирование модификации в этих условиях может быть связано с конкуренцией избыточного количества молекул RPA с комплексом RPA-XPA за связывание с ДНК.

кДа

150 —

(5/гь)

Ж7

...i

(ХРЛ

RP1, •10"' М

i ! !

Я КРА/ДНК=1/1 Ш RPA/ДНК=1/1 (в присутствии ХРА)

ш

+4

+5 +S

(5/РЬ) (B/FHI (5/ГЬ) (B/FIÍ)

Рис. 11. Взаимодействие RPA и ХРА в процессе связывания с ДНК, содержащей повреждение в составе области неспаренных оснований. (А) Фотоаффинная модификация. Радиоавтограф 10% SDS-ПААГ (акриламид : бис-акриламид = 60 : 1). На схематично представленных ДНК-структурах: позиции фотоаналога 5I-dUMP обозначены черточками. Треугольником обозначен остаток Flu-dUMP. (Б) На гистограммах представлены усреднённые количественные данные из пяти экспериментов по модификации.

Для подтверждения данных фотоаффинной модификации по локализации RPA и ХРА на повреждённых ДНК-структурах и получения дополнительной информации о взаимодействии этих белков был использован метод нуклеазного расщепления ДНК в присутствии RPA и/или ХРА. Попытки выявить локализацию ХРА на дуплексной части по участку ДНК, защищаемому от расщепления ДНКазой I, не увенчались успехом - участки специфической защиты отсутствовали, что согласуется с литературными данными (Wakasugi М. and Sanear А. 1999). Однако при использовании нуклеазы ЕхоШ удалось получить специфическую картину защиты от расщепления для RPA, ХРА и их комбинации. Для подтверждения локализации RPA и ХРА внутри области неспаренных оснований в частично раскрытом ДНК-дуплексе была протестирована

18

способность этих белков защищать ДНК от расщепления нуклеазой Mung Bean. Показано, что RPA и ХРА защищают одноцепочечную часть ДНК от расщепления эффективнее, чем дуплексную, а одновременное присутствие RPA и ХРА в реакционной смеси приводит к кооперативной защите ДНК от расщепления.

Результаты исследований взаимодействия ХРА и ЯРА с частично открытой повреждённой ДНК позволяют предположить локализацию и взаимную ориентацию этих белковых факторов в составе предрасщепляющего комплекса (рис. 12).

Рис. 12. Схематичное представление локализации ЯРА и ХРА на ДНК в составе предрасщепляющего комплекса ЭРН. Стрелками обозначены предполагаемые места контактов специфичных нуклеаз ЭРН - ХРР-ЕШХ1 и ХРО

Полученные результаты в сочетании с литературными данными позволяют заключить, что ЯРА и ХРА необходимы как для привлечения, так и для правильного позиционирования и координации других факторов ЭРН в составе предрасщепляющего комплекса.

XPF

XPG

выводы

1. Методом фотоаффинной модификации показано, что ключевой белок, узнающий повреждения ДНК - XPC-HR23b - взаимодействует с неповреждённой цепью с 5'-стороны от повреждения и с участком неповреждённой цепи напротив повреждения. Результат согласуется с данными фотоаффинной модификации по расположению на повреждённой ДНК дрожжевого ортолога ХРС - Rad4 - и с литературными данными по РСА комплекса Rad4 с фрагментом повреждённой ДНК.

• Одинаковый принцип локализации белков XPC-HR23b и Rad4-Rad23 на повреждённой ДНК свидетельствует об универсальности структурной организации факторов, «сканирующих» ДНК на наличие повреждения.

2. Установлена положительная корреляция между углом изгиба ДНК-дуплекса и сродством к нему XPC-HR23b.

3. Обнаружено стимулирующее влияние белковых факторов ХРА и RPA на связывание с ДНК и модификацию XPC-HR23b, демонстрирующее вклад белок-белковых взаимодействий в узнавание повреждения и формирование предрасщепляющего комплекса.

4. Установлены места контактов ХРА и RPA с частично раскрытым повреждённым ДНК-дуплексом:

• ХРА располагается с 5'-стороны от повреждения вблизи перехода одноцепочечная-двуцепочечная ДНК. Такое положение ХРА согласуется с его функцией по привлечению и позиционированию эндонуклеазы ERCC1-XPF, расщепляющей поврежденную цепь с 5'-стороны от повреждения.

• В формировании предрасщепляющего комплекса участвуют две молекулы RPA: одна молекула взаимодействует с одноцепочечным участком неповрежденной цепи в частично открытом ДНК-дуплексе, а вторая молекула RPA расположена вблизи перехода одноцепочечная-двуцепочечная ДНК с З'-стороны от повреждения.

5. Контакты ХРА и RPA с повреждённым ДНК-дуплексом и ДНК, содержащей повреждение в составе «пузыря», практически совпадают, что свидетельствует о способности этих белковых факторов к правильному позиционированию в отсутствие других участников процесса.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Красикова Ю.С.. Речкунова Н.И., Мальцева Е.А., Петрусёва И.О., Сильников В.Н., Зацепин Т.С., Орецкая Т.С., Шерер О.Д., Лаврик О.И. Взаимодействие факторов эксцизионной репарации нуклеотидов ХРС-HR23B, ХРА, и RPA с повреждённой ДНК // Биохимия. -2008. -Т. 73. -С. 1101-1113.

2. Dickson A.M., Krasikova Y.. Pestryakov P., Lavrik O., Wold M.S. Essential functions of the 32-kDa subunit of yeast Replication Protein A // Nucleic AcicfcResearch. -2009. -V. 37. -P. 2313-2326.

3. Krasikova Y.S.. Rechkunova N.I., Maltseva E.A., Petruseva I.O., Lavrik O.I. Localization of xeroderma pigmentosum group A protein and replication protein A on damaged DNA in nucleotide excision repair // Nucleic Acids Research. -2010. -V. 38. -P. 8083-8094.

4. Речкунова Н.И., Красикова Ю.С.. Лаврик О.И. Эксцизионная репарация нуклеотидов: узнавание повреждений ДНК и формирование предрасщепляющего комплекса // Биохимия. -2011. -Т. 76. -С. 32-45.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Красикова, Юлия Сергеевна, Новосибирск

61 12-2/575

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ

МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

Красикова Юлия Сергеевна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФАКТОРОВ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ НА ПОВРЕЖДЁННОЙ ДНК

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научные руководители: д.х.н., профессор, член-корр. РАН О.И. Лаврик

к.х.н. Н.И. Речкунова

Новосибирск - 2012

Оглавление

Принятые сокращения....................................................................................4

Введение........................................................................................................6

Раздел 1. Литературный Обзор........ .......................................................................8

1.2. Генетические заболевания, ассоциированные с нарушениями в работе системы ЭРН..8

1.3. Группы комплементации Xeroderma pigmentosum..............................................................9

1.4. Реконструкция реакции ЭРН in vitro..................................................................................10

1.5. Особенности субстратов системы ЭРН..............................................................................12

1.6. Механизм узнавания повреждения: от модели «двойного узнавания субстрата» к пошаговой дискриминации повреждения.................................................................................13

1.7. Порядок сборки факторов в процессе ЭРН........................................................................15

1.7.1. Репарасомная модель...............................................................................................16

1.7.2. Модель кооперативного (случайного) связывания................................................16

1.7.3. Модель последовательного связывания.................................................................18

1.8. Узнавание повреждения факторами ЭРН..........................................................................20

1.8.1. Комплекс XPC-HR23b...............................................................................................19

1.8.1.1. Модель последовательного связывания «ХРС первый»................................19

1.8.1.2. Субъединицы комплекса XPC-HR23b-Cen2....................................................21

1.8.1.3. Доменная организация структуры ХРС...........................................................23

1.8.1.4. Взаимодействие ХРС с ДНК.............................................................................25

1.8.1.5. Локализация ХРС на повреждённой ДНК.......................................................26

1.8.2. Комплекс RPA-XPA...................................................................................................29

1.8.2.1. Модель последовательного связывания «первый комплекс RPA-XPA»......29

1.8.2.2. РольКРАвЭРН..................................................................................................31

1.8.2.3. ХРА - сенсор изгибов в структуре ДНК...........................................................32

1.8.2.4. Локализация факторов RPA и ХРА на повреждённой ДНК..........................35

1.8.3. UV-DDB необходимый помощник или основной участник?.................................37

1.8.3.1. Взаимодействие UV-DDB с ДНК......................................................................40

1.8.3.2. Роль UV-DDB в процессе убиквитинилирования...........................................39

1.8.4. TFIIH— сенсор изменений природы нуклеотидов.................................................40

1.8.4.1. Роль геликаз ХРВ и XPD в процессе ЭРН.......................................................41

1.8.4.2. Взаимодействие TFIIH с другими факторами ЭРН........................................42

1.8.4.3. Взаимодействие TFIIH с ДНК...........................................................................43

Заключение...................................................................................................................................45

Раздел 2. Экспериментальная часть.................................................................46

2.1. Материалы......................................................................................................46

2.2. Методы исследования.............................................................................................52

2.2.1. Гель-электрофорез белков и нуклеиновых кислот в ПААГ.............................52

2.2.2. Введение [32Р] -метки по 5'-концу олигонуклеотида.....................................53

2.2.3. Получение ДНК-дуплексов.......................................................................54

2.2.4. Введение фотореакционноспособной группы в 3'-конец праймера (удлинение ДНК-праймера, катализируемое Pol /3).....................................................................54

2.2.5. Изучение комплексообразования белков с ДНК методом задержки в геле.......54

2.2.6. Определение доли активного белка в его препарате...................................55

2.2.1. Определение степени связывания (Е0) XPC-HR23b с ДНК методом

флуоресцентного титрования................................................................................57

2.2.8. Изучение комплексообразования белков с ДНК методом флуоресцентного

титрования и определение констант диссоциации комплекса XPC-HR23b с ДНК...........58

2.2.9. Фотоаффинная модификация белков.........................................................60

2.2.10. Определение места специфического контакта белка с ДНК с помощью нуклеазного расщепления ДНК в присутствии исследуемых белков...............................60

2.2.11. Определение угла изгиба повреждённого ДНК-дуплекса..............................61

Раздел 3. Результаты и обсуждение.......................................................................63

3.1. Первичное узнавание поврежденного участка ДНК гетеродимером XPC-HR23b.......63

3.1.1. Исследование топографии комплекса XPC-HR23b с повреждённой ДНК методом фотоаффинной модификации. Сравнение результатов с данными РСА дрожжевого ортолога ХРС - Rad4...........................................................................64

3.1.2. Связывание XPC-HR23b с поврежденной ДНК............................................71

3.1.3. Количественные характеристики взаимодействия XPC-HR23b с различными типами ДНК-структур...........................................................................................77

3.1.4. Влияние ХРА на взаимодействие XPC-HR23b с повреждённой ДНК...............81

3.1.5. Влияние RPA на взаимодействие XPC-HR23b с повреждённой ДНК...............83

3.2. Белки ХРА и RPA - основные структурные элементы предрасщепляющего комплекса........................................................................................................88

3.2.1. Взаимодействие ХРА с повреждённой ДНК................................................88

3.2.2. Локализация ХРА на ДНК-дуплексе, содержащем объёмное повреждение в составе области неспаренных оснований..................................................................91

3.2.3. Связь структуры ХРА с его местом локализации на частично раскрытом ДНК-дуплексе........................................................................................................93

3. 2.4. Взаимодействие RPA с различными типами ДНК-структур.........................95

3.2.5. Влияние RPA на эффективность комплексообразования XPC-HR23b с ДНК-дуплексом, содержащим повреждение в составе области неспаренных оснований.........98

3.2.6. Локализация RPA на частично раскрытом ДНК-дуплексе.............................99

3.2.7. Взаимодействие RPA с ДНК-дуплексами, содержащими выступающие одноцепочечные участки.......................................................................................102

3.2.8. Взаимодействие ХРА и RPA при связывании с ДНК.........................................105

Заключение..............................................................................................................112

Выводы................................................................................................................114

Список литературы.............................................................................................115

Принятые сокращения

а. о. - аминокислотный остаток БС А - бычий сывороточный альбумин БШД1-3 - Р-шпилечные домены ДСД - ДНК-связывающий домен

ДТТ - 1,4-димеркаптобутан-2,3-Диол (дитиотриитол) н. о. - нуклеотидный остаток

ОВ-домен - олигонуклеотид/олигосахарид связывающий домен ПААГ - полиакриламидный гель

Пигментная ксеродерма (Xeroderma pigmentosum, ХР) -заболевание кожи Предрасгцепляющий комплекс, ПРК - белок-нуклеиновый комплекс, формирующийся на поврежденной ДНК на этапе ЭРН, предшествующем выщеплению поврежденного фрагмента ДНК

РСА - рентгеноструктурный анализ Т-Т-димер - тиминовый димер УФ-свет - ультрафиолетовый свет

Цисплатин - фармакологическое название препарата г^с-платины (цис-

дихлордиамминплатина (II))

ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидов

ЭРО - эксцизионная репарация оснований

(6-4)-фотопродукт - тиминовый димер (пиримидин-(6-4)-пиримидон) 5I-dUMP - 5-йодо-2'-дезоксиуридин-5 '-монофосфат AAF-dGMP - ]Ч-(гуанин-8-ил)-ацетиламинофлуореновый аддукт CS - синдром Коккейна

CSA - фактор синдрома Коккейна комплементационной группы А

CSB - фактор синдрома Коккейна комплементационной группы В

DDB1 и DDB2 - субъединицы белка UV-DDB, связывающего УФ-повреждённую ДНК

ERCC - ген группы перекрёстной комплементации

Flu-dUMP - 5-{3-[6-(карбоксиамидофлуоресцеинил)амидокапромоил] аллил1}-2'-

дезоксиуридин-5'-монофосфат

Сеп2 -центрин-2

HR23A - человеческий гомолог А белка Rad23 S.cerevisiae HR23B - человеческий гомолог В белка Rad23 S.cerevisiae PCNA - ядерный антиген клеточной пролиферации

11ас14 - дрожжевой ортолог ХРС из Е.сеге\1$1ае ЯРА - репликативный белок А 808 - додецилсульфат натрия

84-с1иМР - 4-(тио)-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат 84-сШТР - 4-(тио)-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат ТРПН - фактор транскрипции ПН ТТЕ) - трихотиодистрофия ХР25ШЭ - линия клеток ХР-А

ХРА - фактор пигментной ксеродермы комплементационной группы А

ХРВ - фактор пигментной ксеродермы комплементационной группы В, 3'—>5' АТФ-

зависимая геликаза, субъединица кора ТРПН

ХРС - фактор пигментной ксеродермы комплементационной группы С

ХРО - фактор пигментной ксеродермы комплементационной группы Б, 5'—>3' АТФ-

зависимая геликаза, субъединица кора ТБИН

ХРЕ - фактор пигментной ксеродермы комплементационной группы Е ХРБ - фактор пигментной ксеродермы комплементационной группы Р, структурно-специфичная эндонуклеаза, в процессе ЭРН делает одноцепочечный разрыв с 5'-стороны от повреждения

ХРО - фактор пигментной ксеродермы комплементационной группы в, структурно-специфичная эндонуклеаза, в процессе ЭРН делает одноцепочечный разрыв с 3'-стороны от повреждения

ХРУ - фактор пигментной ксеродермы комплементационной группы V

Введение

Передача генетической информации в неискаженном виде необходима как для выживания отдельной клетки, так и для сохранения организма в целом. Однако целостность ДНК, являющейся основным носителем генетической информации, постоянно находится под угрозой из-за огромного числа внешних и внутренних агентов, повреждающих ее структуру. Воздействие этих агентов может привести к накоплению большого числа повреждений в ДНК и появлению мутаций, что может стать причиной развития раковых и других заболеваний. Живыми организмами в процессе эволюции было выработано несколько механизмов восстановления поврежденной ДНК. Одним из таких путей является система эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН). Характерной особенностью системы ЭРН является способность удалять широкий спектр повреждений ДНК; в частности, этот путь репарации является основным в клетках млекопитающих для удаления повреждений ДНК, образующихся под воздействием УФ-излучения, и объемных ДНК-аддуктов, возникающих под действием факторов окружающей среды, таких как химические канцерогены, либо в результате применения химиотерапевтических средств [1,2,3].

В клетках эукариот существует два пути ЭРН: транскрипционно-зависимая репарация, которая восстанавливает цепи ДНК активно транскрибируемых генов, и общегеномная репарация, обеспечивающая восстановление ДНК в нетранскрибируемых частях генома [4]. Различие путей ЭРН проявляется на этапе узнавания повреждения. Остановка РНК-полимеразы II на повреждении служит сигналом для сборки транскрипционно-зависимого репарационного комплекса [5, 6]. На сегодняшний день нет полного понимания того, как происходит узнавание повреждений системой общегеномной репарации, и какой из факторов первым узнаёт повреждение. Неизученной остаётся и последовательность сборки факторов ЭРН на повреждённой ДНК. Широкая субстратная специфичность этого пути репарации делает актуальным вопрос о механизме узнавания поврежденных участков ДНК определенным набором белков в контексте огромного массива неповрежденной ДНК. Другой ключевой момент процесса ЭРН - сборка предрасщепляющего комплекса, обеспечивающего удаление поврежденного участка с сохранением целостности нативной цепи ДНК-дуплекса.

За долгую историю изучения процесса ЭРН были использованы различные методы для исследования этого пути репарации. Совершенствование подходов для наблюдения за процессом репарации in vivo привело к получению значительных результатов. Однако необходимость учитывать большое количество факторов при работе с живыми системами

приводит к сложности интерпретации полученных данных. Применение физических методов к исследованию биополимеров упрощает описание изучаемых образцов, но в то же время накладывает дополнительные ограничения на полученные этим методом результаты. В частности, на сегодняшний день неясно, насколько применимы данные о структуре биополимерных систем, полученные для кристаллов методом рентгеноструктурного анализа, к тем комплексам, что существуют в растворах и in vivo. Кроме того, исследование крупных белковых и белок-нуклеиновых комплексов этим методом ограничено трудностями их кристаллизации. По этой причине основная часть данных РСА получена для фрагментов белков, содержащих только хорошо структурированные участки. Применение ЯМР-спектроскопии ограничено размерами исследуемого объекта и используется только для небольших фрагментов белков.

Из-за ограничений физических исследований и методов in vivo большая часть работ ведётся с применением биохимических подходов in vitro. Одним из таких подходов является метод фотоаффинной модификации. Этот метод основан на введении в молекулу ДНК реакционноспособной группы, которая практически не влияет на специфическое связывание ДНК с белком. Преимуществом метода является то, что он позволяет ковалентно фиксировать полипептиды, находящиеся в непосредственном контакте с химически активной группировкой в ДНК, в том числе за счет слабых белок-нуклеиновых взаимодействий, которые часто являются решающими в протекании многих биологических процессов. Ранее в нашей лаборатории была показана возможность применения олигонуклеотидов, содержащих объемные фотореакционноспособные аналоги нуклеотидов, в качестве субстратов, узнаваемых системой ЭРН. Использование фотореакционноспособных групп в качестве повреждения дало возможность получать аддукты ДНК с полипептидами, находящимися в непосредственном контакте с повреждением в ДНК. Однако в этом случае остался нерешенным вопрос о том, какие из белковых факторов системы ЭРН находятся в контакте с неповрежденной фрагментами ДНК в процессе узнавания повреждения. В представленной работе были использованы ДНК-дуплексы, содержащие фотореакционноспособный остаток 5I-dUMP в различных положениях как повреждённой, так и неповрежденной цепей дуплекса, и остаток Flu-dUMP в качестве модельного повреждения, удаляемого системой ЭРН [7].

Целью данной работы было определение локализации белковых факторов эксцизионной репарации нуклеотидов на поврежденной ДНК в процессе узнавания повреждения. Исходя из поставленной цели, планировалось решить следующие задачи: • Сконструировать модельные ДНК-субстраты, имитирующие интермедиаты этапов

узнавания повреждения системой ЭРН.

Исследовать комплексообразование факторов ЭРН ХРС-НК23Ь, созданными ДНК-структурами.

Определить места контактов указанных факторов ЭРН с ДНК.

ХРА, RPA с

Раздел 1. Литературный Обзор

1.2. Генетические заболевания, ассоциированные с нарушениями в работе системы ЭРН

Свидетельством о важности нормального функционирования системы ЭРН в организме является ряд генетических заболеваний, обусловленных мутациями в генах участников системы ЭРН. Для этих заболеваний характерна повышенная чувствительность к солнечному свету. В зависимости от типа генетических нарушений наблюдается различная картина клинических проявлений заболевания.

Пигментная ксеродерма - Xeroderma pigmentosum (ХР)

Заболевание впервые описано как кожное в последней четверти XIX века. Его симптомами является специфическое состояние кожи (похожа на пергамент) и её аномальная пигментация (что отражено в названии). Все пациенты демонстрируют высокую чувствительность к солнечному свету и повышенную предрасположенность к раку кожи (более чем в 1000 раз по сравнению со здоровыми людьми) и внутренних органов [8]. Во многих случаях (-20%) данные заболевания сопровождаются дегенерацией нейронов и появлением новообразований в раннем детстве [9]. Указанные симптомы, кроме нейродегенеративных процессов, объясняются дефектами в обоих путях системы ЭРН. Причины возникновения нейродегенерации до сих пор остаются неясными [10].

Синдром Коккейна - Cockayne Syndrome (CS)

Заболевание названо именем человека, впервые его описавшего в начале XX века. Кроме повышенной чувствительности к УФ-свету синдром Коккейна сопровождается задержкой умственного и физического развития. Характеризуется рядом дополнительных симптомов: низким ростом, недорозвитием половых органов и некоторым количеством неврологических отклонений - разрушением зубов, катарактой, нарушения скелета

(«птичье» лицо и др.) и демиелинированием. Среди пациентов, страдающих этим заболеванием, средний срок жизни около 12 лет, однако в отличие от ХР не наблюдается явной предрасположенности к заболеванию раком кожи. Синдром возникает вследствие нарушений в транскрипционно-зависимом пути ЭРН, при этом нарушения не затрагивают общегеномную репарацию [11]. Существует гипотеза о том, что у СБ-пациентов транскрипционные комплексы накапливаются на повреждениях, в результате чего у клеток с продолжительным жизненным циклом, находящихся в пост-митотической фазе (например, нейронов), проявляются симптомы, указывающие на нарушения транскрипции [12].

Трих