Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение регуляции транскрипции области W-29 ДНК бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение регуляции транскрипции области W-29 ДНК бактериофага Т4"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ нхбЯЕ М.ВЛомоносова

В8 ЩЯ8ЙХ ДОСОПЯШ УЖ 578*233.422

ОШШЖО ВАСИЛИЙ ВИКТОРОВИЧ

■ ИЗУЧШШ РЕШЩИК ТЕАНШШШИ ОБЛАСТИ ^ -29 ДЕК 5ШЕЯЮФАП Т4

03.00.03 - Ыавакудярвая йяшюгвя

А в то р е ф е р ат диссертации на соискания ученой стешяш кандвдата биологических неук

Москва - ЕЭ8В

Работа выполнена в Институте Молекулярной Генетики АН СССР

Научные руководители: _

Кандидат биологических наук |Зограф Ю.Н.

Доктор биологических наук, профессор Гвоздев В.А.

Официальные оппоненты: . Доктор биологических наук Пирузян Э.С. Кандидат биологических наук Патрушев Л.И.

Ведущая организация: Институт физиологии и биохимии микроорганизмов АН СССР, Пущино

Защита диссертации состоится "6 " ¿■■ьсл^.к. 1938 г. в/тучас на заседании Специализированного совета Д.053.50.70 при московском государственном университете, им. М.В.Ломоносова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультет" ЮТ по адресу: ПЭ899, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет /.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

) и л<' . у!

.1988 г.-

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1Т Актуальность проблемы.. Проблема регуляции активности генов является одной из основных в молекулярной биология. Четные Т-фаги - классический объект, на котором была открыта и до сих пор изучается системная регуляция транскрипции, обеспечивающая переключение работы больших груггп генов. Системная регуляция при развитии четных Т-фагов затрагивает сам транскрипционный аппарат клетки. Это проявляется в химической модификации РНК-полимеразы бактерии а присоединении к ней целого ряда фагоспе-цифических белков, изменяющих свойства фермента. Исследование изменений свойств РНК-полимеразы, вызванных фаговой инфекцией, существенно для понимания процессов регуляции транскрипции.

Свойства матрицы могут также играть важную роль в регуляции транскрипции. В этом отношении четные Т-фаги представляют особый интерес, поскольку их ДНК глюкозялирована, а цитозин в ней полностью заменен на 5 -гидроксиметилцитозин. Кроме того, при развитии четных Т-фагов включение поздней транскрипции зависит от процесса репликации фаговой хромосомы. Природа возникающего при этом свойства "компетентности" ДКК-матрипы, разрешавшем позднюю транскрипцию, до сих пор остается неясной. Для понимания регуляции процесса транскрипции необходимо изучил., каким образом изменения в свойствах ДКК сказываются на ее взаимодействии с ЕНК-полимеразой.

2. Цель и задачи исследования. Данная работа является частью исследований, проводимых в Лаборатории Молекулярных Основ Генетики Института Молекулярной Генетики АН СССР /зав»лаборато-рией д.б.н. Никифоров В.Г./, целью которых является выяснение, механизмов регуляции транскрипции при развитии четных Т-фагов.

Была поставлена задача исследовать, какую роль в транскрипции отдельных клонированных генов фага Т4 играют изменения в РНК-полимеразе, а также свойства ДНК-матрицы / степень свврх-спирализации и химическая модификация/.

3. Научная новизна и практическая пенностьт При исследовании клонированных генов фага Т4 показано, что для транскрипции поздних генов модифицированной РНК-полимеразой в целых клетках необходима сверхспирализация ДНК. Это может объяснять давно известный факт необходимости репликации ДНК для включения поздних генов Т4.

Показано, что транскрипция средних генов фага практически не зависят: от сверхспирализашш ДНК. -

Установлено, что"средние промоторы фага функционируют в отсутствие фагоспэцифических белковых факторов на цитозинсодер-жащей,- но на на модифицированной фаговой ДНК.

Определена нухлеотидная последовательность области фаговой ДНК, соответствующей поздним генам 25,26,51. Обнаружены поздние промоторы в необычной ориентации, обеспечивающей транс- | криттлшо .ранней / / нити ДНК Т4.

.4. Агобация. Материалы диссертации докладывались на 16-й конференции ФЕБО /Москва, 1384/• 6-м симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и функция генома" /Ленинград,1985/, конференции "Вирусы микроорганизмов и растений" /Ташкент,1985/, 7-м съезде всесоюзного микробиологического общества / Алма-Ата, 1985/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Область генов ^ -29 фага Т4: экспрессия в составе фаговой хромосомы и рекомбинантной шгазшдн.

Для работы нами была выбрана область ^ -29 генома фага Т4, клонированная в нашей лаборатории в векторе рв£322 по £«>4Г сайту. Эта область занимает около 6 т.н.п. и содержит поздние гены 25,26,51,27,28 и 29, продукты которых участвуют в морфогенезе базальной пластинки фаговой частицы; 'а также включает участ вупцие в процессах генетической рекомбинации и репарации гены ««У и «•^ч-', принадлежащие к классу "задержанных ранних" / генов, иначе называемых средними генами.

Сопоставление рестрикционной и генетической карт исследуемого участка генома приведено на рис.1 / данные Ю.Н.Зогра^а/.

Ддя того, чтобы исследовать транскрипцию данной области, необходимо было избирательно следить за транскрипцией поздних и средних генов. Исходя из известного факта, что поздние и ран-нве/вклвчая средние/ гены транскрибируются с разных нитей фаговой ДНК, было проведено клонирование всего фрагмента -29 ДНК фага Т4 в однобитовом векторе в обеих ориентация*.

В результате были получены ДНК-зонда, с помощью которых можно было отдельно следить за транскрипцией € -нити / ранней / и у- -нити / поздней / изучаемого фрагмента генома вируса.

Гибридизация РНК, меченной на разных стациях заражения бактериальной клетки фагом Т4, с такими ДНК-зондами, показыва-

uvs

W Y 25 26 51 27 28 гвныТ/,

ff.ff TT.O__ÍL_^ ,

A SS

о^ ч_i (>мнз

, EcoRl t У'^сЦЛ o EcoRV д />S¿J

IVc.I. Генетическая i: рестрикпионная катеты клонированной области Да", ''¡ara Т4 w -zq . Плазгдада />>» ИЗ получена рестрикцией aws гл?з:л;ды р/ч23. Плазг/дды и отличаются отзпектйпрег клонированного 'орагглента по отноненшо к вектору.

7 Г ¿TüñTüñTftTTüñúCñüñTññññCTüCñGCTQüCTTCCñGTñftiRGRGTRTRRTúCTTTCñC

-3S

QTTñFiFiñCúTüüüTfiTñfiTGfiñTCTññüTCCflTCCñflTfiñCñftCCññTññCflñTTGñflTflGflGñ

-/o

A

ñCHñTñTCiñüRT i ñüñHúftTCT

B?Í2

НЕМЕДЛЕННЫЙ РРННИЙ

TTGñCfi ¿0 BF TRTfifiT

СРЕДНИЙ

(¿.0+ -£>*) TRñTÚCTT БРУ TRTRRT

103ЛНИЙ '

TRTRRftTe

_ 55 -Ю

Pite.2. А.Последовательность ^глгкента содержащего промотор гена У . Подчеркнуты -G5 и -10 области промотоа, сайты зестго'кциг. к начало открытой тэамни считывания.

Г. Усгецкешже послезовательности разных промоторов ¿ara Т4.

ет, что на ранней стадии развития фага происходит транскрипция лишь ¿"-нити исследуемой области ДЕК 14. РНК, комплементарная ' клонированное фрагменту, составляет 1,7% всей фагоспецифической ГГ^Д-аол.!/'. Как я следовали ожидать, такая транскрипция не идет при добавлении до заражения хлорамфеникола, то есть, в отсутствие .синтеза фагоспецифических белков/табл» I/, Это подтверждает, что данная транскрипция отражает экспрессию средних генов.

. На поздней стадии инфекции включается транскрипция поздней нити исследуемой области /она составляет 0,7% всей фагоспецифической РНК/, а также в 1,5 раза возрастает транскрипция ранней нити.

Транскрипция г -нити, как и ожидалось, подчиняется позднему типу регуляции, поскольку для ее включения необходимы как ассоциированные с РНК-полимеразой фагоспецифические регуляторные голипедтиды, продукты генов 33 и 55, так и репликация ДНК вируса / см.данные об использовании амбер-мутантов по генам 33,55 и гену фаговой РНК-полимеразы 43 в табл„1/.

В то же время транскрипция ранней нити ведет себя не совсем характерно: она повышается на поздней стадии инфекции, такого повышения не происходит при выключении репликации фаговой ДНК, а в случае заражения мутантом по генам 33 и 55 это повышение, наоборот, выражено сильнее/см.табл.1/.

Экспрессия исследуемого фрагмента изучалась также, когда он наодился в составе рекомбинантных плазмид рмгъ и р^Ч в ' бактериальной клетке /см.рис Л/.

Оказалось, что в незараженной клетке с рекомбинантнай" плазмидой транскрипция фагового фрагмента наблюдается, хотя для его транскрипции в составе фаговой хромосомы необходим синтез вирусоспецифических белков. Транскрипция поздней нити в составе, плазмвды оказывается существенно ниже транскрипции ранней,.но как и ранняя, ока наблюдается при любой ориентации вставки/табл.2/

Причины такого поведения фагового фрагмента в составе рекомбинантной плазмиды могут определяться двумя изменениями в свойствах ДНК: тем, что ДНК плазмиды содержит цитозин и не глюко-зилирована, а также ее сверхспиральностью. Последующие эксперименты показали, что эти изменения по-разному сказываются на транскрипции разных нитей.

Таблица I. Синтез ГШ, соответствующей области оо -29 в клет-

ках, зараженных Т4 дикого типа и амбер-мутантами.

ДНК на РНК из клеток, зар^гонных фатом Т4

фильтре Т4+ 43- 33-55-

ранняя ранняя-KJAM поздняя поздняя поздняя

MI3 0,06 0,1 0,14 0,15 0,15

MI3-24 1,7 0,13 2,5 1,5 4,7

MI3-23 0,06 0,И 0,7 0,12 0,138

рМ23 1,8 — 3,8 2,2 6,9

Клеткипметили на 3-8/ранняя РНК/ или 20-25/поздняя/мин. инфекции при 37 С. Возрастающие количества меченной РЫК гибридизовали с фильтрами, содержащими ДНК М13-24/ зонд на транскрипцию ранней' нити /, .М13-23 / зонд на транскшпцию поздней нити/ или дНК Т4. Приведено отношение меченной РНК, гибридизующейся с соответствующей ДНК на фильтре к РНК, гибридизующейся со всей Т4 ДНК /в % /

САМ - хлорамфеникол,'добавленный за 5 мин. в кол-ве 170 мкг/мл

43" - амбер-мутант Т4 по гену ДНК-полимеразы

33"55~- амбер-мутант Т4 по генам регуляторных полипептидов

рМ23 - проба, содержащая двунитевой фрапиент -29

Таблица 2. Синтез РНК, соответствующей области -29 в незара-женных клетках с рекомбинантными шгазмидами.

ДНК на РНК из клеток с плазмидой

фильтре рМ23 рМ4 рМНЗ

МДЗ 0,005 0,004 0,005

р8£Ш 0,18 0,23 0,14

MI3-24 0,068 0,16 0,019

MI3-23 0,033 0,023 0,017

Клетки растили до концентрации Ю8/мл., метили в течение 5 мин.

Гибридизацию проводили, как описано в табл.1.

М13-24 - зонд на транскрипцию ранней нити.

М13-23 - зонд на транскрипцию поздней нити.

^£322. - зонд на транскрипцию векторной части плазмиды.

2.Роль сверхспирализации и модификации ДНК-матрицы в транскрипции средних генов и^У и

Средние гены фага "Т4 / или же ¿е/аугЛ е<гг1у -2 , , гены / имеют промоторы, которые отличаются по структуре -35 области от "немедленных ранних" промоторов Т4 /см.рис.2б/ и при .. нормальной инфекции для их включения требуются фагоспецифические белки, в частности, продукт гена , 7^5'/.

Действительно, как было показано в предыдущем разделе, тра» криппця средних генов ^ и и***/ в зараженной клетке без синтеза белка не идет. Она не идет также в условиях *■>/<.<> , когда РНК-полимераза из незараженных клеток добавляется к зрелой глюкозилированной ДНК фага Т4 /см.табл.З/.

Однако, если для транскрипции <« -■//*« взять цитозинсодер-жащую, немодифицированную ДНК мутанта фага Т4 по генам 56,42, о/с,то синтез РНК, комплементарной нашей ранней нити, происходит с высокой эффективностью/см.табл.3/.

Как было показано в разделе I, эта нить транскрибируется также и в составе рекомбинантной плазмиды в условиях -Л-*/см. разд.1/. Поскольку транскрипция идет и на линейной цитозинсо-' держащей ДНК фага, то сверхспирализация матрицы, видимо, не играет здесь существенной роли, а определяющим является замена глюкозилированной матрицы на цитозинсодержащую.

Это вывод был подтвержден в опытах по влиянию степени сверхспирализации плазмидной ДНК на транскрипцию фагового фрагмента. В/этих опытах использовали -мутант 3 по ДКК-гира-зе и следили за транскрипцией ранней нити изучаемого фрагмента в составе рекомбинантных плазмид* и/»-^ в мутантных и не-мутантных клетках при нопермиссивных условиях./За понижением степени сверхспирализации плазмиды следили с помощью электрофореза с хлорхинином/. Из таблицы 4 видно, что тогда как при подавлении функции ДНК-гиразы общий синтез РНК и транскрипция векторной части плазмиды /взятой в качестве внутреннего контроля/ падают примерно в 2 раза, транскрипция ранней нити остается на том же уровне.

Таким образом, в тех пределах, которых можно достичь, используя мутацию по ДНК-гиразе, изменение сверхспирализации мат- рицы не сказывается на транскрипцию исследуемых средних генов, хотя и подавляет транскрипцию других генов в клетке. Данный

Таблица 3. Синтез РНК т и/ />-<= РНК-полимеразой из незара-генных клеток на ДКК Т4.

ДНК на ДНК-матрица для синтеза РНК

фильтре Т4+ /глюкозилированная/ Т4 56"42~ /цитозинсодержащая/

MI3 0,13 0,11

MI3-24 0,17 0,92

MI3-23 0,13 0,19

Гибридизацию проводили, как описано в табл.1. Приведена доля фагоспецкфической РНК, гибридизующейся с соответствующей ДНК на фильтре / в процентах к ДНК Т4 /. •

Таблица 4. Влияние сверхсшрализации Д2К на синтез ранней, поздней и "векторной" РНК на рекомбинантных плазми-дах.

ДНК на фильтре РНК из клеток, рМ4 содержащих шгазмиду рМ23

ЗУ'34* ОА d%h6is ОА

MI3-24 0,031 0,067 1,1 0,022 0,05 1Д

MI3-23 0,011 0,009 0,41 0,015 0,02 0,66

рВИ522 0,06 0,048 0,4 0,05 0,06 0,6

клетки инкубировали при 42°С 30 минут, метили и выделяли РНК, как описано в табл.2, гибридизовали, как описано в табл.1. Приведено количество метки, гибридизующейся с ДНК на фильтре / в процентах/. ОА - отношение активности транскрипции данной РНК в клетках мутанта и дикого типа с учетом того, что общее включение метни в РНК в мутантных клетках снижается в 2 раза.

* факт может иметь определенное функциональное значение. На ранней стадии. инфекции ДНК фага Т4 находится в клетке в линейном виде, и значит, вся дорепликативная транскрипция /'к которой относится и транскрипция-со средних промоторов / должна, видимо, осуществляться с достаточной эффективностью и на редактированной ДНК-' матрице. Это предположение подтверждается тем обнаруженным наш фактом, что функция ДНК-гиразн не требуется для ранней транскрипции

3. Исследование работы среднего промотора гена У ,

Из приведенных данных- следует, что замена глхжозилированной ДНК-матрицы на цитозинсодержащую приводит к ослаблению специфичности РНК-полимеразы, так что-ей уже не требуются фагоспецифи-ческие факторы для транскрипции средних генов «и.Р и .

Важен вопрос: в чем именно выражается такое изменение специфичности? Начинают ла действительно работать средние промоторы, или же в силу высокого содержания АТ-пар в ДНК Т4 происходит ее неспецифичная транскрипция РНК-полимеразой?

В пользу того, что наблюдаемая наш транскрипция идет с тех же промоторов, что и в норме, свидетельствуют следующие данные.

Во-первых, в составе плазмиды, как и в цитозинсодержащей фаговой ДНК ранняя нить транскрибируется существенно сильнее, чем поздняя.

Во-вторых, эту транскрипцию следует отнести исключительно к области генов V и ^, так как на плазмиде рмнъ , в кото-,рой эти гены отсутствуют, обе нити / и ранняя и поздняя / транскрибируются одинаково слабо/см. табл.2 и рис.1/.

В третьих, транскрипция ранней нити не зависит от сверхспи-рализашш ДНК, что также подтверждает ее специфический характер.

Для получения более прямых доказательств была изучена работа среднего промотора гена ««К , На примере этого промотора, были также подтверждены данные о роли сверхспирализации ДНК в транскрипции ранних генов. ■

" Последовательность области ДНК, содержащей средний ген и<пУ была" определена независимо в нескольких лабораториях. Нами также были получены клоны, содержащие этот ген целиком или его промо-торную часть, и была определена последовательность промотора гена /см.рис.2а/, которая оказалась соответствующей каноническому среднему промотору фага Т4, отличающемуся от"немедленного

Рас.З. Рвкомбинанткые плазмидн ц. рис 8 .

pU С И го лучена встраиванием фрагмента в век-

тор рис 1<), ^исв получена удалением мента из плазмидн рйсН,

раннего "промотора структурой - 35 области/рис. 2(3/.

Первые указания на то, что такой промотор работает в составе рекомбинантной плазмидн, были получены непосредственно нри его клонировании в векторе При этом была получена плаз-

мида ркСв /рис.3/, которая неожиданно дала éae + фенотип. Анализ последовательности шгазмиды показал, что это обусловлено экспрессией рекомбинантного белка, ¿"-конец которого происходит от о/ -пептида jB -галактозидазы, а м -конец от «"^белка. В отдельных опытах было показано, что эта экспрессия не зависит от количества -Ряс. -репрессора в клетке, и по-видимому, идет не с векторного -промотора, находящегося за 500 н.п. до рекомбинантного гена, а со среднего промотора, который, следова-

ч

12 3 4 567

Рис.4. ^/-анализ работы промотора гена У в составе фаговой хромосомы и на плазмиде

1 - РБК, выделенная на 5 мин. заражения при 30°С.

2 - РИС, выделенная на 20 мин. заражения при 30 С.

3 - то же, что и I, с добавленным за 5 мин. хлорамфениколом 4,5 - частичное расщепление фрагмента, использованного

для Л -анализа, по гуанинам.

6 - РЕК, выделенная из клеток с плазмидой . .

7 - то же, что и 6, обработанное в 10 раз меньше » 1 .

тельно, работает на плазмиде.

Наиболее прямо доказать, что исследуемый промотор работает в составе рекомбинантной плазмвды в незараженной клетке, удалось, локализовав точки инициации транскрипции с помощью метода ,/7 -■картирования. При этом проводилось сравнение 5''-концов РНК, синтезирующееся с фаговой хромосомы при нормальной инфекции и РНК, инициирующейся на плазмиде рисвъ незараженной клетке.

На рис.4 видно, что промотор гена работает на ранней

А

1 z з ч s б ?

Рис.5А Влияние новобиошша на работу промоторов «мУ и . FHK из клеток с плазмидой /кобыла отожжена с фрагментом зонд на

-«-» v /-дор.2, о гёр-том

зонд на /-дор.6 с обоими шр-тами /3,4,5/. 4 -клетки предварительно обработаны новобио-шшом/100 мкг/ш1,30 мин./, 5 - клетки предварительно обработаны хлорамфениколом /170 мкг/шг.,30 мин/ 1,7 -частичное расщепление фрагментов и mw/a*

; по гуанинам.

5Б. Денситограша электро-■ фореза 5А. +Н -дорожка 4, I -Н - дорожка 3. Стиелками ' отмечены основные сигналы, соответствующие промоторам Y а .. денсито-

граша для промотора взята с авторациограммы болыпей экспозиции.

uvsT

я поздней стадиях развития фага /дорожки I и 2/, но только при наличии синтеза фагосшцифических белков /дорожка 3/. РНК, инициирующаяся с этого промотора, совпадает по своему 5 -концу с транскридтом, синтезирухдщшся на илазмиде />ис&/дор. -6/.

'.С помощью Л -картирования изучалось также влияние сверхспи-ральности ДНК на транскрипцию промотора гена ипУ . Для подавления функции ДНК-гиразы в этом случае использовали новобиоцин. В качестве контроля следили за -промотором, находящимся в составе той же плаэмидн /рис.3/. Как видно на рис.5, ко-

личество РНК,.инициирующейся с -промотора, действительно падает при обработке клеток антибиотиком. В то же время количество РНК, соответствующей промотору .остается неизменным. Эта результаты еще раз подтверждают, что сверхсшрализация ДНК не является определяющим фактором в транскрипции данного промотора.

, Таким образом, можно утверздать, что исследованные нами средние промоторы фага Т4 работают на цитозинсодержащей ДНК. Изменения в Химической структуре ДНК, свойственные для Т4, приводят, видимо, к такому изменению взаимодействия РНК-полимера-зы с ДНК, что эти промоторы / в отличие от немедленных ранних/ перестают функционировать в отсутствие фагоспецифических белковых факторов.

В то же время транскрипция с исследованных нами средних промоторов не зависит от степени сверхсшрализация плазмиды. Возможно, что оба эти необычные свойства/средних промоторов имеют под собой общую структурную основу.

. 4.Условия, необходимые для эффективной транскрипции клонированных поздних генов фага Т4.

Как было показано в разделе I, транскрипция поздней нити в рекомбинантной илазмиде в незараяенной клетке происходит с низкой эффективностью. Однако, если заразить клетку с плазмидой фагом Т4,. то транскрипция поздней нити в составе рекомбинантной шгазмиды значительно усиливается /табл.5/. В этом опыте использовали мутант фага 43 по гену ДНК-полимеразы, у которого с фаговой хромосомы транскрипция не идет /см. раздел I и табл.5/, так что все наблюдаемое повышение транскрипции следует отнести за счет рекомбинантной плазмиды. Такое усиление не происходит.

Таблица 5. Синтез РНК в клетках с рекомбинантяой шгазмидой, зара-кенннх фагом Т4. .....

ДНК на РНК из клеток, зараженных фагом Т4

фильтре с плазмидой рМ4 - без плазмиды-

без зараж. 43" 33"55~ 43" 33~55~

М13 0,004 0,007 0,005 0,019 0,02

0,23 0,12 0,2 — —

М13-24/ран/ 0,16 0,55 1,2 0,61 2,1

М13-23/позд/ 0,023 0,056 0,022 0,017 0,02

Т4 — 13,8 20,6 17 21

24/Т4 — 4$ 5,9$ 3,6$ 10$

23/Т4 — а, 4$ 0,1$ 0,1$ 0,1$

РНК метили и гибрздизовали, как описано в табл.1, на 15-й мин» инфекций' при 30°С. Приведено количество метки, гибрядизующейся с ДНК на фильтре/в процентах/ и отношение его к гибридизации данной РНК со всей ДНК Т4. Описание мутантов Т4 дано в табл.1

Таблица 6. Влияние сверхсшрализацаи ДНК на транскрипцию поздних, генов в клетках, зараженных двойным мутантом фага Т4 42~39~

ДНК на РНК из клеток, зараженных фагом Т4 43~39~ фильтре с плэзмВДой РМ4 без шгазмиды _в*

М13-24 0,154 0,87 0,23 0,22

М13-23 0,035 0,019 0,009 0,013

рв&ъгг 0,023 0,001 — —

Т4_23_38_20_19

24/Т4 0,73$ 2,25$ 1,2$ 1,26$

23/Т4 0,16$ 0,05$ ' 0,04$ 0,07$

РНК метили на 15 мин. инфекции после инкубации 30 мин при 42°С остальное как в табл.5.

если, заразить клетку фагом, мутантным по генам 33 и 55, кодирующим регуляторные полипептиды.

.Таким образом, когда мы создаем в клетке ситуацию, при которой с РНК-полимеразой взаимодействуют фагоспецифические регуляторные полипептвды, этого оказывается достаточным для включения поздних генов, находящихся в составе плазмиды. В то же время, для включения транскрипции поздних генов в хромосоме фага требуется еще и репликация ДНК вируса.

В чем же отличие регуляции транскрипции одних и тех же поздних генов в составе шгазмиды от их транскрипции в нерепли-цирующейся хромосоме фага? В данном случае это различие не связано, видимо, с химическими особенностями ДНК Т4, так как на зрелой цитозинсодержащей ДНК (фага поздние гены области ьи -29 считываются ферментом из незараженных клеток столь же слабо, как и на глюкозилированной ДНК фага дикого типа, содержащей 5'-гидроксиметилцитозин. Поэтому нам представлялось вероятным, что в данном случае определяющим свойством ДИК рекомбинантной плазмиды является ее сверхспирализаиия.

Чтобы проверить эту возможность, изучали влияние сверхспи-рализации ДНК плазмиды на транскрипцию поздней нити исследуемой области в зараженных фагом клетках. Для этого использовали бактериальный мутант по ДНК-гиразе, как и в разделе 2. Клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду, заражали мутантом по гену 43 /аналогично опытам, приведенным в табл.5/. Так как фаг индуцирует собственную топоизомеразу типа Л , то в данном случае был использован специально сконструированный двой -ной мутант фага Т4, несущий в дополнение к мутации в гене 43 еще и мутацию в гене 39, который кодирует одну из субъединиц фаговой топоизомеразы.

При заражении таким мутантом фага Т4 синтез поздних РНК • в клетках без плазмиды не включается, так как не происходит репликации ДИК вируса/табл.б/. В то же время, если таким фагом заразить клетки дикого типа с рекомбинантной плазмидой, то наблюдается значительный синтез поздней РНК, соответствующей клонированной области. При релаксации плазмидной ДНК синтез поздней РНК, соответствующей клонированной области, в зараженной клетке резко снижается, достигая фонового уровня/ табл.6/.

Эти результаты подтверждаются данными, полученными в системе /« Ю.Н.Зографом. Вся совокупность наших данных по-

{ т н. п.

25

26

5"!

6,,!« Pi.il \ 1

Х«Л

№

г ¡У

?Р2

ОЯР I

ВЗ Р/6Г2

Рр1

Рис.6. Карта области, содержащей гены к^У" , 25 и предположительно 26 и 51.

Открытые рамки считывания обозначены линиями со стрелками. Промоторы обозначены прямоугольниками. Выделена область, последовательность которой определена в работе.

Наверху указаны стратегия определения нуклеотидной последовательности, масштаб и расположение генов 25 и предположительно 26 и 51.

СП

называет, что как в целой клетке, так и в бесклеточной системе транскрипция поздних генов РНК-полимеразой из зараженных клеток сильно зависит от сверхспирального состояния ДНК. Особенно это четко видно по сравнению с транскрипцией ранней нити /табл.6/. Все это позволяет считать, что сверхспирализация плазмидной ДНК и является в данном случав определяющим свойством матрицы, разрешающем транскрипцию поздней нити в составе рекомбинантной плазмиды.

5. Нуклеотидная последовательность области фаговой ДНК, соответствующей поздним генам 25,26,51 и -анализ работы позднего промотора Р/> Ч .

Для более детального изучения поздней транскрипции области из -29 было проведено выборочное определение нуклеотидной последовательности фрагмента, соответствующего поздним генам 25, 26,51 /см.рис.1 и рис.6/.

Машинный поиск открытых рамок считывания и поздних промоторов Т4 в определенной наш последовательности дал неожиданный результат: почти всю исследованную область /примерно I т.н.п./ покрывают две открытые рамки считывания, направление которых соответствует ранним генам, транскрибируемым с ^ -нити. Перед этими рамками считывания /названными нами и о яр-2 / на-

ходятся ¿Ъ -последовательности, а перед ов-£-1 — канонический ¿икс-ёох /промотор { /, то есть, /все необходимое для экспрессии этих рамок считывания на поздней стадии инфекции/рис.6/.

Кроме этих рамок, в исследованной.нами области имеются еще два потенциальных поздних гена, направленных уже в обычную сторону. Один из них содержится внутри фрагмента/см.рис. I/, имеет открытую рамку считывания / ¿¿^ i /длиной в 64 кодона и перед ней последовательность ТАТСААТА, совпадающую с поздним промотором Т4 в 7 нуклеотидах из 8/промотор Р/-.2 /. Неясно, работает ли данная последовательность в качестве реального позднего гена, поскольку эту область покрывает и вышеупомянутая О&^-г вчитывающаяся в противоположную сторону.

Положение второго потенциального гена показано на рис.6. Перед открытой рамкой считывания / 0Д-Р2. / также находится кано-нический„/'"¿«-(¿»/промотор 3 /, что позволяет предполагать, что эта последовательность транскрибируется на поздней стадии ин-

Рио.7. Л -анализ работы промотора Рр ^ .

I - РНК, выделенная на 5 мин. заражения Т4 при 30°С. 2,6 - РНК, выделенная на 15 мин. заражения при 30 С.

3,5 - частичное расщепление фрагмента использованного

для ¿4 -анализа, по гуанпнагл. 4 - то же, что и 3, расщепление по пушнам

7 - то же, что и 2, заражение фагом 39143"

8 - то же, что а 7, с добавленным за 30° до заражения 100 мкг/мл

новобиодином

9 - РНК из незараженных клеток, содержащих шгазмиду

10 - ШК из клеток с плазмидой р&н, выделенная на 15 мин. после

заражения фагом Т4 33~55~

II - то же, что и 10, с добавленным за 30 мин. до заражения

100 мкг/мл новобиодином

12 - РНК из клеток с плазмидой ь»сн , выделенная на 15 мин.

заражения фагом 39~43

13 - то же, что и 12, с добавленным новобиодином как в II

Г7

фекции. Интересно отметить, что этот ген также перекрывается со "встречным" геном, но лишь в промоторной-области, которая имеет поэтому палиндромный - вид ТАТТТАТАААТА.

Вопрос о том, каким генам соответствуют обнаруженные последовательности, остается открытым. Известно лишь, исходя из опытов по спасения маркера, что и оер ' и ог,: -2 могли бы соответствовать гену 25.

Промотор /°/>1 - не единственный поздний промотор исследуемой области, расположенный в необычной ранней ориентации. Вце один был найден неподалеку от исследованной области

при анализе наш последовательности, известной из литературы. Его положение показано на рис.6/РрЧ /. Оно оказалось удобным для // -картирования, и мы обнаружили, что этот промотор, действительно, включается на поздней стации инфекции/рис,7-2/.

' ' Таким образом, в области -29 хромосомы фага имеются поздние промоторы, ориентированные в необычной, ранней ориентации. Этот факт может объяснить необычное поведение ранней нити исследуемого фрагмента в составе фаговой хромосомы на поздней стации инфекции: возрастание ее транскрипции вдвое и зависимость такого возрастания от репликации фаговой ДНК/см.разделI/.

В дальнейшем с помощью ¿1 -анализа промотора РрЧ мы подтвердили вывода, изложенные в разделе 4. Как видно на рис.7/9/ этот промотор не функционирует в незараженной клетке в составе рекомбинантной плазмиды. Однако, если заразить клетку фагом Т4, то сигнал, соответствующий этому промотору, появляется/рис.7-12/. Так как в этом опыте использовали двойной мутант по генам 43 и 39, у которого собственный промотор Р/>Ч не работает /рис.7-7,8/, то наблюдаемую транскрипцию следует отнести за счет промотора

Рр </ .находящегося на плазмиде. Заражение клеток с плазмидой фагом Т4, мутантным по генам 33 и 55, показывает, что такая транскрипция зависит от функционирования этих генов /рис.7-10,II/ и следовательно, связана с модификацией РКК-полимеразы.

С помощью /1 -картирования промотора Рр Ч мы проверили также роль сверхспирализации нлазмидной ДНК в работе поздних промоторов. Для подавления функции ДНК-гиразы использовали ново-биоцин. На рис.7/13/ видно, что интенсивность сигнала, соответ-

ствующего промотору -РрУ , при инактивации ДНК-гиразы падает, то есть, при понижении степени сверхспирализации ДЕК работа этого промотора подавляется.

Таким образом, данные по Л -анализу работы промотора подтверждают результаты, полученные в разделе 4 с помощью РНК-ДНК гибридизации. Для активной транскрипции поздних генов в составе рекомбинантной длазмиды необходимо взаимодействие с РНК-полимеразой регуляторннх фагоспецифических полипептидов. Остается неясным, в каких участках /- -нити инициируется слабая транскрипция, идущая на шгазмиде в отсутствие фагоспецифи-ческих белков. Приведенные данные позволяют думать, однако, что она не связана с работой поздних промоторов Т4. Кроме того, для транскрипции поздних генов на рекомбинантной плазмиде трвбуется сверхспирализация ДНК. Маяно думать, что этот факт имеет отношение к проблеме "компетентной" матрицы, возникающей в процессе репликации фаговой ДЩ при нормальном развитии фага и разрешающей позднюю транскрипцию.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что поздние гены фага Т4 в составе реномбинантннх шгазмид в целых клетках активно' транскрибируются РНК-полимеразой, модифицированной в результате инфекции. Для этой транскрипции необходима сверхспирализация плазмидной ДНК и наличие в составе РНК-полимеразн регуляторных фагоспецифических полипап-тидов.

2. Показано, что работа средних промоторов фага Т4 практически не зависит от сверхспирализации ДНК.

3. Фагоспецифические белковые факторы не требуются для экспрессии средних генов на цитозинсодержащей ДНК» но они необходимы

в случае модифицированной ДНК фага Т4.

4. Определена нуклеотидная последовательность области фаговой ДНК, соответствующей поздним генам 25,26,51. Охарактеризованы потенциальные промоторы и открытые рамки считывания, находящиеся в этой области. Промоторы поздних генов фага Т4 могут находиться в необычной "ранней" ориентации и инициировать транскрипцию с ранней нити ДНК Т4,

В

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях: ".

1. Зограф Ю.Н., Огрызько В.В., Басс И.А. Область генов -29 фага Т4: экспрессия /"""-»и *-;/<■ <з - 16-я конференция ФЕБО, тезисы докладов,Москва, 1984, с.408.

2. Зограф Ю.Н., Огрызько В.В., Басс И.А., Черный Д.И. Область генов ^ -29 фага Т4: клонирование и экспрессия. - Мол.биол., 1985, т.19, №3, с.818-832. .

3. Зограф Ю.Н.,- 0.1рызько В.В., Шмерлинг К.Г., Синякова Р.Н., Маркин С.М. Сверхсшрализация ДНК и транскрипция клонированных генов фага Т4. - 6-й двусторонний симпозиум СССР-ФРГ "Структура и функция генома", тезисы докладов, Ленинград, 1985, с.19

4. Огрызько В.В., Маркин С.М., Шмерлинг Е.Г., Синякова Р.Г.,

< • Зограф Ю.Н. Влияние сверхспирализации на транскрипцию клонированных генов фага Т4. - Мол.биол.,1986, т.20, Ю, с.745-747