Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура ключевых генов прокапсида Т-четных бактериофагов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура ключевых генов прокапсида Т-четных бактериофагов"

российская академия мвдшнеких наук научно .'- 'исследовательский институт вирусологии им. д. И. ивановского

На правах рукописи УДК 57.083:577.1

ШРУСНЧ ЗДЗНА ИВАНОВНА

- СТРУКТУРА КЖ5ЧЕЗУХ ГЕКОВ ПРОЙЛЙСИДА Т-ЧКТНЮС БАИТЕРйе^АГОЗ

03.00.03. - молекулярная биология

I

Автореферат диссертации на союканкэ учоной степени кандидата биологических каук

Москва - 1993

Работа выполнена в лаборатории " Молекулярной генетики " ЮШ вирусологии ни. Д.И. Ивановского РАМН. '

/

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Месяяягаиав

'Официальные оппоненты: доктор биологических наук

E.H. Добрав

доктор биологическик наук 0. Я. йирноз

Ведущая организация: Институт ыолэкуаярной: генетики РАИ

Защита состоится "_^ г Л'•/_" 1993 г.

в "_¿У час. на заседании Специализированного

Совета Д. 001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 16 )

Автореферат разослан ;9 с-Г ^ 1993 г.

С диссертацией мокко ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии ш. Д.И. Ивановского РАМН..

Ученый секретарь . Специализированного Совета кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник -A.M.• Жуковский

характеристика f а б о т у

Актуальность проблемы

Бактериальные еирусы явились основными модельными .объектами, которые определили успешное развитое многих направлений молекулярной биологии. Исключительно важную роль бактериофаги сыграли при изучении структурно - функциональной организации биомакромолекул и механизмов сборки надмолекулярных биологических комплексов и вирусов. Интерес к бактериофагам в последнее время объясняется перспективами репения с их помощью не только фундаментальных, но и прикладные проблей. В частности, механизм упаковки ДНК Т-четных бактериофагов и вирусов семейства Herpssvirldае весьма схожи (Kai iiiski, Black, 1S06; Вооу, et.al. 1992). Кроме того, как у бактериофагов Т-четной серии, так и у представителей Herpesvirus? процесс формирования капсида основан на сборке промежуточного белкового ядра, которое подвергается полному прогеолитичеекому расщеплению на поздних стадиях формирования вирионов (Welch, et.al., 1991). Недавно обнаружено, что протеиназа, кодируемая геном 21 бактериофага ТА, и протеин аза tierpssviridae шею? значительную гомологию. Процессы упаковки ДНК л высокоспецифического протео-лиза белкового ядра могут яеиться весьма удобныая мишенями для создания ис2ж вашстералевтическга ергдсм. К моменту начала этой работа нуклеотидяая последовательность геян 20, кодирующего белок, ответственным за инкциацш образования кора к упаковку ДНК вируса, а та'же последовательность гена 22, кодирующего главный компонент ядра сборки прокатила, не были известны. йх клонирование, определение полной нуклеотидной последо-Е2тельнос'х-и, экспрессия в клетках Е. coli, а та;же сравнительное изучение региона генов', форквдгюцщ: ядро и ьротеиназу, кодируемую геном 21 у фагов, родственных Т4, и явилось основой данной диеегргациенкой работы. Мы рассматриваем наши данные в свете последующих исследований Т-четных бактериофагов и Horpesviridae с целью получения шсокоспецифичтс: лигандов для химиотерапии вирусных инфекций ДНК-садервадих ¿ярусов да стадии упаковки Шч в прокапай и ингкбироваякя яротеиназ.

Научная новизна

В кастояшей работе впервые были прокиозирогакы и определены полные нуклеотидные последовательности ДНК генов 20 и 22, кодирующих белки ядра сборки прокалсида бактериофага Т4, кото-

_ о _

рая составляет, соответственно, 1572 и 807 куклеотилных пар.

Впе«ЕЫ? проведено физическое картирование геноЕ, кодирующих прокарсздные белки бактериофага 72 и получека кдонотека генома этй-о фага. Ероклонирована и определена полная куклео-тидная последовательность генов 67, 68 и 21, а также проклони-рована и частично определена последовательность генов £0 я 22, кодирующих белки сборки прокапсида фага Т2.

Создан вектор экспрессии гена 22 бактериофага Т4, позволяющий нарабатывать этот белок в препаративных количествах.

Методом полимеразной цепной реакции впервые получен для 32-х бактериофагов, родственных Т4, фрагмент гена 21, кодирующий вирусную протеин азу.

Направленность и ценность работы

При выполнении диссертационной работа ш в основном преследовали цели фундаментального характера „- получение новых сведений о последовательности генов бактериофага Т4, играющих ключевую роль в формировании прокапсида. Несомненно, результаты определения нуклеотидной последовательности генов 20 и 22 бактериофага Т4 и большинства генов, кодирующих белки ядра прокапсида бактериофага дикого типа 12, родственного фагу 74, являются базовыми для дальнейших генетических и биохимических исследований, а также для изучения структуры белков, кодируемых этими генами.

Важно отметить, что объектом исследования явились структурные белки кора проголовки фагов, родственных фагу Т4. Поскольку, как известно, размер и форма капеида этих слояных вирусов определяются лроголовкой, то результаты диссертации важны для понимания формообразования сложных надмолекулярных биологических структур и ДНК - содержащих вирусов.

Изучение вирусспецифической прртеиназной активности может ¡меть практическое значение в медицинской практике при создании ингибиторов вирусного созревания (Жирнов, 1989). Поскольку протеиназа бактериофага 74 - Т4 РРаза имеет родство и гомологию с протеивазой вирусов семейства //егрегИгМаа; то дальнейшее изучение этого белка приобретает особо актуальное значение.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Клонирование.и определение нуклеотидной последовательности гена 20, контролирующего инициацию формирования ядра сборки прокапсида бактериофага Т4 и упаковку ДНК вируса.

2. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена 22. ответственного за синтез главного компонента

ядра прскзпсида.

3. Модель регуляции полимеризации продукта гена 22 при формировании ядра сборки лрокалсида.

Апробация работы

Результаты исследований были доложены на заседании Специ- ■ ализировакного апрооационного совета " Общая к молекулярная вирусология " при НЮ! вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 2.7. 01. 1993 года.

Публикации

Материзлк диссертант изложены в 4. научных статьях. Нук-деотидные последовательности ДНК генов 20 и 22 бактериофага Т4 депонированы в ЕШЬ GENBANK.

Объем и структура работы

Диссертация построена по классическому агалу л состоит, из введения, обзора научной литературы по теме диссертационной работы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заканчивается выводил; результатов исследовательской работы и списком цитируемой литературы. Объем диссертационной работы составляет 126 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 5 таблицами и 22 рисунками. Список цитируемой литературы включает 155 наименовании.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Материй» и методы ;:сслодозеаиия

В работе были использованы еггашы S. coli, полученные иг коллекции лаборатории " Молекулярной генетики " НИИ вирусологии гад. Д. И. Ивановского: J M 109, В"Л, CR-63, DL21 (DES), CKM-603, TG-1, NM-522, DH5L, a также бактерт$агя: T4, T2 и шюкествешшй амбериутант бактериофага Т«а1с7.

32 Бактериофага, родственных Т4, полученные из коллекции Л. Голда (департамент молекулярной, клеточной я прикладной биологии (University of Colorado at Bouldor, USA).

Использовали жидкие питательные среды: LB - бульон, 2xTY - бульон, среды 50С и Ш. '

В качестве гйердьк питательных аред использовали: LB и М9 жидкие среды с добавкой 0,7 7, агаре, джи верхнего елок и 1,5% агара для нижнего слоя (Difco ,СТА). ТУЕ-агар, содержащий в 1 литре: бактоагзр - 15 г, бактотриптон - 10 г, дрожжевой экстракг - 5 г, хворав натрия -8 г.-

Ислользовади векторы лля клонироваикз и экспрессии производства фирмы " Stratagene " (USA): Bluescript KS Mi3T и Blue-

script SK Ш2Г, фир1и "Prowsffa" (USA): pGEM- 32 и pGE?.i-7Zf (+), полученный. А.Г. ПрклнпоЕыя к М.М. Шнеадером, сотрудниками лаборатории "Молекулярной генетики": pGEM-iiAZf (+).

Ялагмкйг с Фрагментами ЛИК бактериофага Т4 из коллекции плагмэд лаборатории " Молекулярной генетики полученные ранее К.В. Неплюевым, В.П. Ефимовым и А.Г. Прилиповьш: рТЗ-10, рТТ-4, рб91.

Пдаанядц с фрагментами ДИК бактериофагов 74 и Т2, получении е автором в ходе исследований: рб, p22-SacI, p22-HindIII, pS-89, р2(2), pS2(£)-HindIlI, pS-4.1, pl-SspI. p2-SspI, pl-Hcol, pc-Hco!, plMe-i, pAha-III, pSac-I.

Введение 32P метки во фрагменты ДНК

Радиоактивную штку во фрагменты ДНК, используеше в качестве зондов для гибридизации, веодили с помощь» реакции nick translation в соответствии с протоколом фирмы Araershan (США).

Точечная гибридизация ДНК

В реакцж гибридизации использовали низкие концентрации проб ДНК - 10 нг/мл. Иммобилизованную ДНК ( попользовали нейлоновый фильтр фирмы Hybond, Amershan) денатурировали, затем инкубировали в нейтрализующем растворе, сушили мембрану на воздухе и Евдеркали сод УФ (трансэлюминатор, фирма Sigma) 5 минут для фиксирования ДНК на фильтре. Проводили предгибриди-зацию при 65° С 3 часа и гибридизовали пробы ДНК с меченным 32Р зондом с активностью >103 импульсов в минуту в концентрации 50-100 нг зовда на 1 ь<д гиОридизационного буфера 18 часов при 65° С.

Сиквекирование ДЕК

Определение нуклеотидной последовательности проводила по методу Сэнгера (.Sanger, 1977). Для работы использовали набор Т7 Sequencing Kit производства Pharmacia LKB ( Швеция) согласно методике фирмы-производителя. Электрсфоратическоа разделение получаемых в лоляиеразнсй реакции цеп эй ДКК проводили на приборе " Macrophor " фирмы- Pharmacia (Швеция). Электрофорез . проводили при напряжении 1300 В и температуре 55° С до выхода из геля красителя брдафенолового синего. Гель фиксировали, сушили в жаровом шкафу на стекле и использовали для радиоавтог-ргфии.

Полимеразнзя цепная реакция

Фрагменты ДНК амшшфшшровалк методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием автоматического устройства фирмы Techne с автоматическим нагревательным блоком типа Programmable Ori-Black РНС-1. Проводили 20-40 цикл амплификации

по следующей ехек<е: цикл денатурации цикл отжига цикл полимеризации цикл полимеризации Затем амплифицированнуп ДНК анализировали электрофорезом в агарозном геле, окрашенном брок-гистым этидием.

П. Результата кссхедлзгиня :л ïsx а5суядс;!ме

ПЛ. Клонирование генов £0 и 22. кодирующих белки ядра сборки прокапсида бактериофага Т4, и определение из нуклеотидной последователь кости '*

Для суСюгояировгния гона 20 кает бога получена плазмида рб на основе рТЗ-10. При конструировав^ плгзш&ц рб 1'з исходной плазмиды рТВ-10 мы вырезали фрагмент Еоо RV-Xho I (1959 :ш) и клонировали зуо в век-гор Bluoscript S!'. М13+ по тем ке сайтам. CyôtciiOhbi для сигсвенирования гена 20 получали с использованием ыетода однонаправленных дэлеций. Для создании таких делеций применялся модифшшгаваквый нами протокол, первоначально разработанный фирмой Stratagene.

Для субкгонкрованяя гена 22 использовали ллаззду рТТ-4. После обработки ее рестриктазой Saс i, ввдолзля фрагмент размером 6QB кп и кяонировате в зестор Bluesertpt KS Ml3+ по Sac I. Плазииду p22-Sac I со вставкой Sac I- Sac- I, содержащей начало гека 22, использовали для субвлонирозанил и куккиг клоны •лспэльзовалк для сигазенирования'.

Креме того была создана плагмидз p22-Hindiii, содер.тадая вставку SacI-HindiI ! с З'-концерой частью нуклеотидной последовательности гена 22 и частью гена 23. Фрагмент S&с I- Kind III клонировали в вектор Bluascript KS по сайтам Sac I и Hind III. Блазмида p?2-Hind ПЗ была использована для енкьени-рованкк гена 22.

Ьуклеотидная последовательность ДНК генов 20 и 22 определялась в обеих цепях методом термиякрувдего шптбировакия цепи диде зокекяуклэок¿аки по Сзнгеру.

В ходе пашах ^селедовазкй впервые была определена куклео-т.чдная последовательность генсв 20 и 22 бактериофага Т4. Открытая рамка считывания гена 20. вчлвчагзэя 1572 вп, кодирует белок из 524 аминокислотных остатков ( Рис. i). Расчитанная по аминокислотному составу молекулярная масса пг 20 составляет 50800 дальтон, что находится в соответствии с молекулярной

! минута при 94" С 30 секунд прзг 56° С 1 минута при 72° О 1 минута при 72° С

массой 5ЗСЮО дачьтон. полученной эксиерямэнтачьно. йзоэлектри-чеекая точка белка - pi 5.1. ; ■

Рис. 1. Нуклеотидная последовательность гена 20 и предсказанная аминокислотная последовательность белка в однобуквекном коде 1 TAT AAA TAT MC TAT AAT TCC CAT TTS BAG AAT ACA ATG AAA 42

M К

. 43 TTT AAT STA TTA AGI TTG TTT GCT CCA 7GG GCT AAA ATS GAC 84 FNYLSLFAPWAKMD •85 GAA CGA AAT TTT AAA GAC CAA GAA AAA GAA GAT CTT SIT TCC 126

EP. NFKDQEKEDLVS 127 ATT АСА eCC CCA AAS CTT GAT GAT GGA ODA ASA GAA TTT GAA 168

i ТА Р KL D DG AR EFE 169 GTA AGC- TCG AAT SAA GCT GCT TCT CCT TAT AAT GCT GCA TTC 210

VSSNEAASPYNAÀF 211 CAA АСА ATT TTT GGT TCA TAT GAA-CCA K?A'ATG AAA ACT ACT 252

QTi FBSYEFGMKTT 253 CST SAG CTT ATT GAT АСА TAT CGT AAT CTC ATG AAT AAC TAT 294

REL I D T Y R .4 L M N N Y 295 GAA GTA GAT AAT GCA GTT TCA GAA АТС GTT TCA GAT GCT АТС 336

E VD.UAV S E 1 VS ü A I 327 GTC TAT GAA GAT GAT ACT GAA GTC GTA GCG TTA AAT TTG GAT 378

VYEDDTE VVALNLD 379 AAA TCT AAA TTT AGC CCA AAA ATT AAA AAT ATO ATG TTA GAT 420

К S К . F S P К I К N M M L D 421 GAA TTT AGT GAT STA TTA AAT CAT СТА TCG TTT CAA CGA AAA 462

EFSDVLNHLSFQRK 463 GGT TCT 6AT CAT TTT АЩА CGT TGG TAT GTT GAT TCA AGA ATT 504

G . S 0 H F R R W -V D S R I 505 TTC TTT CAT AAA АТС ATT GAT CCA AAA CGT CCA AAA GAA GGC 546

F F H K l 1 D P K R P.K'E G 547 ATA AAA SAA TTA CGT AGA TTA GAC CCT CGC CAA GTT CAG TAT 588

I К E L R R L D P R Q Y Q Y 589 GTT CGT GAA ATT ATA АСА GAA ACT GAA GCT GGC ÁCA AAA ATA 630

V R E I 1 T E- T E A. G T К I

631 GTT AAA GGT TAC AAA GAA TAT TTT ATA TAT GAT ACT GCC CAT 672

V KGY.KEYF I YDT A H

673 GAG TCA TAT GCA TCT GAT G3T "AGA ATG TAT GAA GCT GGC АСА 714

ESYACDGRMYEAGT'" 715 AAA ATA AAA ATT CCT AAA GCT GCC GTC GTT TAT GCC CAT TCT 756 К - I ■ К. I PK A A V V Y A H S

757 GGA ТТЛ GTC GAT G L V D 799 CAT CGT GCÎ GTT H R A V 34J GAT GCT GTA GTC

D A V V 383 CGT GTT TGG TAT R v w y 925 GCT GCT GAG CAC A A E H 967 CGT GTA GTA TAT R V 'V Y 1009 CAG CAT AAT ATG Q H N M 1051 CGT GAT GGT AAA R D G К 1093 GCT GAT AAT ACT A D N T 1135 CAA GCT CTT TAT Q A L Y 1177 CCG CAA GAC CAA P Q D Q 1219 AGC ATT ACA CGT S ï T R 1261 GAG TTA CAG CAC

E L Q H 1303 AAA АСА AAT CTT К T N L 1345 TGG AAT GAT GAA W N D E 1387 GAT AGC TAC TTT D S Y F 1429 CGA AGA ATT AAT R R I N 1471 AAA TAT ATT TCT , KYIS, 1513 ATG ACT GAT GA/t

M T D E 1555 GAA GAG TCT AAA E E S К

TGT TGC GGT AAA AAT АТС-С С G К N I AAA CCT GCT ААС CAA ПА К P А N Q L ATT TAT CGC ATT ACT CGT 1 Y R ] T R GTA GAC ACA GGT AAT ATG V D T G N M ATG CAA CAT GTT ATG ААС M Q H V M N GAT GCA TCA АСА GGT AAA D A S T G . К TCT ATG АСС GAA GAC TAT S M T E D Y GCT GTG АСА GAA GTT GAT A V T E V D GGC AAT ATG GAA GAT ATT G N M E D I ATG GCA TTA CGT GTT CCT M A L R V P CAA GGC GGT GTG ATG TTT Q G G V M F GAT GAA TTA ACG TTT GCT D E L T F A AAS TTT GAA GAA GTT TTC К F E E Y F TTG CTT AAA-GGT ATA АТС L L К G I 1 ATA AAT AAT ATT AAG ATA

I N M I К I GCT GAG CTC AAA GAA-GCA A E L К E A ATG СТА ACC ATG GCA GAA M L T M A E CAC AGA ACT GCT ATS AAA H R T A M К GAA ATA GAA CAA GAA GCC E ] E Q E A GAG GCT CGT TTC CAA GAC E A R F Q D

АТС G3S TAT TTG 798

I 5 Y L AAA TTA TTA 5АЛ 840 К L L E GCT CCT GAC CGT 882 A P D R CCT GCT CGT AAA 924 P A R К ACG ATG AAA ААС 966 T U К N ATA AAA AAT CAA 1008

I К N Q •TGG TTG CAG CGC 1050 ' W L Q R ACT СП CCT GGT '1092 T L P G CGT TGG TTT AGA 1134 R W F R CTT TCA CGC ATT 1176 L S R 1 GAT TCT GGA ACT 1218

D S G T AAA m ATT CGT 1260 К F I R СТА GAT CCG CTT 1302 L D P L АСА GAA GAT GAG 1344 T E D E GAA TTT CAT CGG 1386 E F H R GAA ATT TTG GAA 1428

EILE CCA ПТ ATT GGT 1470 P F I G GAC ATT TTG CAG 1512 D I L Q AAG САЛ ATT GAA 1554 К Q I E CCC f»C CAA GAA 1596 P D Q E

УЕВ

1597 САА САЗ ОАТ ТТТ ТАЛ Т&З ААС ЗТТ Т ; 1621

а й- о р г

'Открытая рамка считывания гена 22, включающая 807 нп, колирует белок из 269 аминокислотных остатков ( Рис. 2). Рассчитанная по аминокислотному составу молекулярная масса пг 22 составляет 29900 дальток. Изоэлектрическая точка, белка - р! 4.34.

Рис. 2. Нукдаотидная последовательность гена 22 и предсказанная аминокислотная последовательность белка в однобуквенном коде В таблице стрелками обозначены сайты возможного протеоли-тического расцепления на С - конце пг 22 на ранних этапах сборки проголовки. Подчеркнуты повторяющиеся групш отрицательно заряженных аминокислотных остатков (Е- шш 0).

1 ТТА ТАА АТА ТТА ТТА ТСТ ААА САА САБ еде ТАС ААА АТв СТТ 42

43 ААА ОАА САА СТБ АТТ осс (ЗАА <306 СА6 ААА АТТ 6АТ м ост и ТСС 84

К Е а Ь I А Е А а К I 0 А Б

35 БТТ 6СТ стт БАТ ЛБТ АТГ ТТС (ЗАА ТСА (ЗТТ ААТ АТТ ТСТ ССО 126

V Л 1 Б Б I г Е Б V N 1 5 Р

127 ОАА (ЗСА ААА вАА АСТ ТТС езс АСТ 6ТА ТТС ОАА ОСТ АСС (ЗТС 168

Е А К Е Т ? в Г V г Е А . Т V

169 ААВ ОАЭ САС всс втт ААА ТТА (ЗСТ вАА ТСТ САТ АТС ест ААА 210

К. Н А V К ь А Е Б Н 1 А К

211 АТГ ест 6АА ААА вСА вАА ¡ЗАА вАА (ЗТА (ЗАА ААА ААТ ААА ОАА 252

I Л Е К А Е Е Е V Е К N К Е

253 (ЗАА БОС 6АА вАА ААА (ЗСТ (ЗА6 ААв ААА АТС (ЗСТ 6А6 САА (ЗСТ 294

Е А Е Ё К А Е К К 1 А Е а А

295 ТОТ ААА ПС АТТ 6АС САТ СТТ (ЗСА ААА ОАА тез СТС ОСТ 6АА 336

з К Г I 0 Н 1 А К Е V 1. А Е

337 ААТ ААА ТТА ОСА стт БАТ ААА азе АТС ААА <зсс 6АА СТв ТТТ 378

N К 1 А V Б К в I К А Е Ь Р

379 (ЗАА ТСС ате стт (ЗСТ КЗА ТТА ААА ЕАв стс ТТТ СТТ БАА САС 420

Е. 5 м 1 6 в 1 К Е 1- р V Е Н

421 ААС стт стт 6ТТ ССА (ЗАА (ЗАА ТСА 6ТТ (ЗАТ 6тт вта (ЗСТ (ЗАА 462

И V V v ' Р Е Е 5 V 0 V V А Е

463 дте г* д * ЬАн (ЗАА САБ СТО САА ОАА САТ ААА 6АА вАА ТОО ССТ СвТ 504

и Е г Е Ь 0 Е Н К Е Е 3 Р К

- О -

505 CTG TTC GAA GAA CTG ЛАТ AT G CGC SAC GCA TAT АТС AAT TAT 546

L F E_E L N M R D A Y I N Y

54? GTG CAG CST GAA GTG GCA TTG AGO GAA AGT ACT AAA GAT CTG 588

YQP. EVALSESTKDL 589 ACT GAG T CT CA A AAA GAA AAA GTC TCT GCT CTG GTC GAA GST 630

TESQKEKVSALVEG 631 A TG GAT TAT TCA GAT GCA TTC TCA AGT AAA TTG AGT GCA АТС 672

MDYSBAFSSKLSA 1 573 GTA GAA ATG GTG AAG AAA TCT AAT AAA GAT GAA AGC ACT ATT 714

V E M V К К S И К D_E S T I

*промотор гека 23 715 ACT GAG AGT ATA AAT ACT CCT GAT ACT GAA GCA GCC GGA CTG 756

TES I NTPDTE-AAGL 757 AAT TTC GTC ACT GAA GCT GTA GAA SAT AAA OCT GCA CAG GGT 798

M F V T E A V E_D К A t A t Q G '

799 GCA GAA GAT ATT GTA AGT GTA TAT GCG AAA БТС GCA TCT CGT 840

A Í E_JD I V S V V A К V A S R

341 "ТС TAA TTT TAA ABS TTA ACA. CAA ЛТВ -867 FZFZRLTQ Met гена 23

Анализ генов 20 и 22 фага Tí показывает,, что частоты использования в триплетах кугаеотидоЕ G и С существенно снижены по сравнение с А- и Т, что язхяется типичным для бактериофагов T-nevxañ серии.

1.1.2. Ресгрикп.иоиное картирование генов 20 , 67 , 68, 21, £3, 24, кодиружцих белки пзокалсида бактериофага 72 и их .•^локирование

Стратегия рестрикционяого картирования генов белков про-кзпсвда фага Т2 была определена невозможностью рестрикционного анализа геномоз бактериофагов дикого хила, в евязм с тем, что аодифкцярозанкую днк фага дикого типа гидролизуе* ограниченное количество рэстрикционных ферментов. Нави исследования показали, что эгдонукпяазы KcoRV, Taql, Ndel, DraJ, Sspl и asuI гкд-рс-лизуят ДкК генома фага 72.

3 реетрикцкозном кзртирозания генома фага T2L мы леяоль-говгли рэстриктззу' Eco P.V, даюгзуи прк полном гидролизе геномной ДИК около 20 фрагментов, размером о? iOCO до 23000 нуклео-твдое Интересующие нас гены 20 , 67 , 68, 21» 22 и 23 были картированы методом гибридизации по Саузерну ( Southern, 1975) 20 фрагменте размером 19QC0 нуклеотицов генома фага 72.

Ьо избежании трудностей клонирования фрагментов ДНК боль-

шого размера, фрагмент 1SOOO нп частично гидролизовзли рест-риктаэой ":Aha III и получили ряд Фрагментов размерами от 3000 до 11000 на, которые затем без выделения лигирозали с вектором Bluescript FS Ы13+ по сайту Eco RV и трансформировали в клетки Е. coll СКЫ-603. Анализ ДНК суперскрученных плазмид показал, что 50% выросших клонов имеют вставки. Селекцию отобранных клонов проводили методом точечной гибридизации ДНК клонов с зондами, меченными изотопом 32Р, которые ранее мы-использовали при картировании генов белков прокапсида в геноме фага Т2.

По результатам гибридизации нами был отобран клон р2(2), который затеи использовали для дальнейшего субклонирования генов. В первом случае отбирали плазыиду pS2(2)-Hind III и использовали для субюганирования генов 20 , 67, 68 и 23 С Рис. 3). Во втором случае отбирали плазмиду pS-4.1 и использовали для сиквенирования гена 22 до сайта Bgl II.

II.3. Сиквенкрование генов 20, 67, 68, 21 и 22 фага Т2

Нуклеотидная последовательность ДНК генов 20, 67, 68, 21 и 22 бактериофага Т2 определялась в обеих цепях методом терминирующего кнгибирования цепи дидезоксинуклеотидами по Сэнгеру.

i

Hindi ' Sspi

NM I Ndtf

Xhol

Ncol fol

i, i

Sipl Sacl

Hindlll

AJial Aha >

il

Ncol

g20

g67

g68

921

g22

да

. pS2(2|-HindUI

428 bp рАМИ о ■ -

230bp 959 bp ,

pt-Ncol p2-Ncol

с ■ ■ о ^

585 to pSicl

ты» pi-si*

Ю40Ьр

p2-Sspl

'/ ' „■' 3. Рестрикционное картирование генов 20, 67, 68, 21 и 22

• в составе плазмиды pS2(2)-Hind,III

^.OSBBHä'KBu сайги эндонуклеаз рестрикции и плазмиДы, использо-- аанаке в работе. Цифрами обозначен размер фрагментов, содер-

жаших гены фага Т2.

Результаты еиквенированкя показала, что нуклеотидная последовательность генов, кодирующих белки головки бактериофага Т2, на 99% гомологична нуклеотидной последовательности этой области генома фага Т4. В последовательности сиквенированных нами генов фага Т2 нет Еставок или делений, отличающих ее от нуклеотидной последовательности этик геноЕ бактериофага Т4. В последовательности протяженностью 3353 нл нами было обнаружено всего 7 нуклеотидкых замен, являющихся несущественными для кодирования соответствующих аминокислотных остатков (Рис.4).

В гене 20 однобуквенкые замены в на С привели к незначащим заменам аминокислот Е42 и Е49 на Ода и 049 (Рис. 4А). В последовательности гена 22 обнаружено 5 нуклеотидных замен. (Рис. 4В). В 5ег154 найдена однобуквенная замена в на С, в

А.

в 6

. ОСА А(ЗА САА ТТТ вАА БТА А6С ТСХЗ ААТ САА ОСТ ОСТ

Л К Е42 ? Е V Б Э N Е49 А А

В.

G С G С G

AAA GAA GAA TCA GCT CCT GTG TTC GAA GAA CTC AAT К E E s154a P V F E E' LieiN t t Î P R L

Рис. 4. Участки нуклеотидной последовательности ДНК генов 20 (Рис. 4А) и 22 (Рис. 4В) бактериофага Т2, в которых были обнаружены нуклеотиднне замены Сверху указаны нуклеотиды, находящиеся в данном месте в последовательности бактериофага Т4. Под стрелкой указаны аминокислоты, находящиеся в данном месте в последовательности бактериофага Г4. Цифрами обозначено положение аминокислотных остатков в пг 20 и uh 22.

Leuiei - тоже замена G на С. Замена второго нуклеотида С на G в триплете ССТ привела к появлению Ai55 вместо Р155. Замена второго нуклеотида G на С в триплете CGT пригела к замене Ri56 ка Pise- Поскольку обнаруженные нами замены на участке со 154

ло 161 аминокислоту е последовательности ДНК гена 22 фага Г2 не являются существенными, скорее всего они не приведут к изменению а-спиральной конформашш, наиболее вероятной по нашему мнению для этого участка.

Представленные результаты говорят о высокой консервативности нукиеотвдной последовательности генов, кодирующих белки проголовки Т-четных бактериофагов, которая, по-видимому, важна для точной сборки этой вачшейией субитруктуры бактериофагов.

После завершения работы по сиквенированию генов 20 и 22 фага Т4 и оперона геноЕ фага Т2 нам стала ясна картина регуляции транскрипции генов 20, 6?, 68, 21, 22 и 23, кодирующие белки головки фага Т4 ( Рис.5 ). Транскрипция гена 20 начинается с собственного позднего промотора шидмиди, расположенного на 36 нуклеотидов выше инициирующего кодона АШ. Наиболее вероятный сайт БМпе-0а1еагао - последовательность ЮЗА. Тер-

старт

36 гена 20 Юс/д

илишил— иша------дан-----------аэза-----ИАА

промотор гена 20 диа------АСвА—

старт 123/0 гена б?

о-тарт

гекз 63 125/р

ди0_.----доза-----11аа 33

—НАД АНЗ------штыдил----------------

старт ггоомотор гева 22 геда 21

п5/0 гева 22 141 21 15 125/0

А(ЗЗА------АШ-------1/у4и4А4Ц«--//--«ААШООтй^ААСАСЛААТЗ

промотор гена 23 старт

Рис.5. Регуляция транскрипции оперона ге;;ов, кодкрукда белки головки бактериофага Т4

.Выделенным срифтом обозначены кодокы инициации и термк-яации транскрипции генов.

Цифрами обозначено положение последовательности Шайна-Яальггрно и позднего промотора от инициирующего кодона.

минирующий колон ген в 20 13АА перекрывается с инициирующим ко-

- IS -

доном AUG следующего га ним гена 67, который кодирует один иг несущественных в сборке маленьких белков кора прокапсвда. Такое же перекрывание инициирующего кодона последующего гека с терминирующим кодоном предыдущего генз было обнаружено нами между генами 67-68 и 68-21. Гену 22 предшествует собственный поздний промотор UAUAAAUAU, локализованный в конце предшествующего гена 21, и последовательность Shine-Dalgarno AGGA. Трансляция гена 22 терминируется двумя стоп-ксдонами UAA и UUA, разделенными друг от друга триплетом UW. Возможно, что ген 22 входит также в единицу транскрипции, Екиочашую гены 20 , 67 , 68 , 21, 22 и 23, начинающуюся с позднего промотора UAUAAAUAU, стоящего перед геном 20. Обнаруженная в конце гена

22 последовательность промотора UAUAAAUC, возможно, служит для транскрипции гена 23, следующего за геном'22. Между генами 21 и 22, а тагане генами 22 и 23 есть очень короткая нетраслируе-мая область ДНК, не содержащая терминаторов транскрипции. Эти данные означают, что ген 22 может транскрибироваться с двух промоторов. Одна мРНК начинается с гена 20 и включает гены 20,

. 57 , 68 , 21, 22 и 23, кодирующих белки головки фага Т4. Другая начинается с гена 22 и содержит гены 22 и 23. Кроме того, ген

23 имеет собственную мРНК, начинающуюся с промотора, локализованного внутри гена 22.

Таким образом, синтез белков, участвующих в сборке капси-да, регулируется на уровне транскрипции. Чем больше копий белка ( как в случае с пг 23 ) присутствует в капскде, тем большее количество мРНК должно синтезироваться.

II.4. Консервативность нуклеотидной последовательности гена

■ 21 у бактериофагов, родственных Т4

В ходе исследований нам было интересно выяснить, присутствует ли ген 21, кодирующий вирусспецифическую протеиназу у фага Т4, у других бактериофагов, близкородственных Т4 ? Для этих целей мы использовали метод полимеразной цепной реакции, позволяющий получить нуклеотидные последовательности функционально активного домена этого гена для 32-х бактериофагов,

. предоставленных н$м Л. Голдом из коллекции департамента молекулярной, клеточной и прикладной биологии (University of Colorado at Boulder, USA).

Вауло отметить существенные различия источников и времени выделения этих бактериофагов. Так, если фаг Т2 был выделен в 1925 году, то группа L2 бактериофагов была выделена в 1989 году. Кроме того, разнообразна география распространения самих

источников выделения фагоЕ. Достаточно сравнить группу RB фагов. выделенных в Нью-Йорке с'фагами TulA и TulB, полученными Е Германии, и Ml фагом из Великобритании. Несмотря.на сильные различия расмотреиных факторов в оценке происхождения исследуемых бактериофагов, родственных Т4, для 32 иг них характерна высокая консервативность последовательности ДНК нескольких изученных регионов (персональное сообщ. Miller, 1992).

Консервативность нуклеотидной последовательности ДНК гена 21 у т-четных бактериофагов, близких по морфологии к Т4, до 'наЕей работы никем не изучалась. Праймеры из последовательности гена 21 фага Т4, выбранные нами для проведения ПНР, показали отсутствие гомологии с другими участками нуклеотидной последовательности генома бактериофага Т4. Анализ амплифивдрован-ных фрагментов последовательности гена 21 методом гель -электрофореза как в 1.2Z агарозе, так и в 52 ПААГ в денатурирующих условиях, подтвердил, что в одних и тех же условиях реакции амплификации у всех 32-х бактериофагов нарабатываются одинаковые по размеру фрагменты ДНК гена 21 без видимых деле-ций и вставок.

На основании наших данных можно заключить, что ген 21, кодирующий вирусспецифическую протеиназу у бактериофага Т4, присутствует также и у 32-х бактериофагов, родственных по морфологии Т4, и что он высококонсервативен, указывая на важность этого гена для точной сборки прокапсида.

II.5. Экспрессия клонированного гена 22 бактериофага Т4

Для создания вектора экспрессии гева 22 бактериофага Т4 нами была использована система на основе промотора и РНК-поли-меразы бактериофага Т7. В качестве исходного вектора, содержащего последовательность промотора фага Т7, мы использовали коммерческую плазмиду pGEM-3Z (Promega, США). Для экспрессии белка, кодируемого геном 22, находящегося под контролем промотора фага Т7, был выбран штамм BL 21 (DE3), содержащий в геноме ген РНК-полимеразы бактериофага Т7 под котролеы 1ас-промо-тора. Для экспрессии в клетках Е. coll гена 22 фага Т4 нами была получена плазмида pS-89,содержащая фрагмент Has lll-Pst I (1122 нп), который клонировался в Еектор pGEM-3Z по сайтам Sma 1-Pst I. .

В лизатах клеток Е. coli, -содержащих вектор экспрессии гена 22 фага Т4, мы наблюдали появление пг 22 с молекулярным весом полностью коррелирующим с вычисленным из нуклеотидной последовательности ДНК гена 22. При этом рекомбинантный белок

га 2 часа синтеза составлял более 25" всего клеточного белка.

В соответствии с нашими результатами мы считаем, что экс-яресеированный пг 22 имеет тенденцию к полимеризации ?. клетках. Однако, в случае белка 22 мы не обнаружили каких-либо "телец включений" которые обычно присутствуют при высоких уроЕКях экспрессии многих белков.

П.5. Особенности аминокислотных последовательностей белков, кодируемых генами 20 и 22

Белок 20 содержит в своем составе около SDZ заряженных аминокислотных остатков, где Glu, Asp и Lys присутствуют примерно- з равных количествах. В последовательности 3.47. Pro и 4.IX Gly, присутствуют также 3 остатка Cys:'

В связи с особой функцией этого белка в упаковке вирусной ДНК, которая происходит с затратой энергии АТР, нам было интересно проанализировать его аминокислотную последовательность на возможные сайты связывания с ЛТР. Однако, анализ последовательности с помогши программы " PC/GENE " не выявил функциональных сайтов связывания дг 20 с нукяеотидами.

Белок 22 богат заряжеяными аминокислотными остатками -глутаминовой кислотой (17.47%) и лизином (10.41Z), и содержит незначительное количество глицина (2.6Z) и пролина (1.497.) и совсем не содержит цистеина.

Из предсказанной нами аминокислотной последовательности пг 22 заканчивается Phe. Однако, данные А. Тцутиты указывают, что белок 22, выделенный из кора полиголовок, содержит 251 аминокислоту и имеет Ala на С-конце (Tsuglta, 1980). В рассчитанной наш последовательности гена 22 остаток 251 - также Ala. Анализируя собственные результаты и данные, полученные А. Тцугктой, m предполагаем, что пг 22 подвергается протеолити-ческоыу процессингу вблизи С-конца молекулы на ранних стадиях полимеризации при сборке проголовки.'

Белок 22 является не только главным структурным компонентом кора. Он также основной морфопозтнческий белок ядра сборки прокапсида. В отсутствии пг 22 в клетках образуются шгогослой-ные полиголовки (Vanasida, et. al., 1970). При точечных ts-му-тантах в гене 22 при промежуточных температурах получается фаговые частицы с изометрической голоекой, причем ширина головки варьирует (Keller, et.al., 1988). В 1980 году было показано, что белок 22 способен к самосборке in vitro в гибкие, фибриллярные структуры различной длины, диаметром около 3 нм и шириной Э.5 км (Black, et.al., 19925. Эти так называемые "ленты"

были изучены А. Энгел методом сканирующей трансмиссионной электронной микроскопии. Данные его исследований подтвердили, что молекула 22 имеет ассикетричную форму прута, с.размерами приблизительно 1.5 х 2.5 х С.5 им. Молекулы выстраиваются друг за другом, образуя ленту. Гидродинамическими измерениями мономера пг 22 такхе была подтверждена ассвкетричвость молекулы.

Принимая во внимание 'имеющиеся в литературе данные об особенностях пг 22, и учитывая наш результата определения последовательности гека 22 и рассчитанную аминокислотную последовательность пг 22, мы провели анализ вторичной структуры пг 22 п на основе предполагаемой пространственной организации данного белка предложили способ его полимеризации при форыиро-вании ядра сборки прокапсида.

11.6. Модель полимеризации пг 22 при формировании кора прокап-скда

Проведенный нами анализ вторичной структуры пг 22 с помощью программа "ALB" показал, что 80% упорядоченных отрезков полипептидной цепи имеют «с-спкральну» конформэцим и образуют с высокой вероятностью 7 специфических «-спиралей, которые мы обозначили как 1А, 1В, 2, 3, 4, 5А и 5В ( Рис.6).

Основызагсь на компьютерных расчетах, мы предложи возможный путь сворачиваний молекулы белка 22 (Рис. 6а). Наибольшая по размерам предсказанная сс-спираль - спираль 3, включающая аминокислотные остатки 80-140, скорее всего, образует основу молекулы пг 22. Две другие длинные «-спирали, обозначенные нами как 1 (1А и 1В) и 5 (5А и 5В) , упеуюзакы антипарал-лелыдам образом вдоль основной оси молекулу.. Дъе короткие а-спирали ( 2 и 4) локализованы, соответственно> в дистальной и проксимально!! частях мономера пг 22.

Исходя из собственных результатов ка/листерного анализа и данных Paulson и Lasirjnli, показавших, что кор гигантских полиголовок имеет иаг 35° и содержит 6 спиральных лент (Paulson, L.aemly( 1977), мы■предложили модель подлмэрнзедаи мономеров иг 22, реализуемую, вогмошо, при форшрованж; ядра сборки прокапсида (Рис. 6в). Во время сборки кора мономеры пг 22 связываются, друг с другом, образуя тройную coiled-coil&d структуру, используя спирали 1 и 2 из одного мономера к спирель 5 из дру-■ гого мономера. Такое последовательное связывание мономеров пг 22 может приводить к наклону тята полимеризации на 35°.

(в) пг 22 при формировании ядра сборки прокапсида ВЫВОДЫ

1. Впервые определена нуклеотидная последовательность ДНК генов 20 и 22 бактериофага Т4. Ген 20, контролирующий инициацию формирования ядра сборки прокапсида и упаковку ДНК вируса, кодирует 524 аминокислотных остатков с общей молекулярной массой 60900 дальтон. Ген 22, ответственный за синтез главного компонента ядра 'прокапсида, кодирует белок, содержащий 269 аминокислотных остатков с общей молекулярной массой 29900 дальтон.

2. Впервые определена нуклеотидная последовательность ге-_нов 20, 67, 63, 21 и 22 фага Т2. Гены данного региона бакте-'риофагов Т4 и Т2 высоко консервативны (992 гомологии).

3. О помосью реакции цепной полимеризации выяснено, что ген 21, кодирукщий .вирусспецифическую протеиназу, присутствует у 32 сактериофагов, морфологически близких к Фагу Т4, которые были изолированы в разные годы в различных страна:-:.

- is -

i. Предложен механизм регуляции Формирования капсида на уровне транскрипции. Анализ последовательности ДНК генов, кодирующих белки кора проголовки бактериофага Т£ иТ4 по;сазал наличие трех единицы транскрипции: в первую еходят гены 20, 67, 63, 21, 22 и 23, вторая единица транскрипции содержит гены 22 и 22, и ген 23, кроме того, транскрибируется с собственного промотора', расположенного в гене 22.

5. На основе компьютерного анализа аминокислотной- последовательности предложена модель полимеризации продукта гена 22 при формировании ядра сборки прокапэида, основанная на межмолекулярных взаимодействиях «-спиральных участков белка.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Marusich Е. I., Mesyanzhinov Y.Y.- Nucleotida and deduced -snino acid seqiences of bacteriophage T4 gene 20.// NAR. -

1989, -V.17. -N.18. -P.7514

2. Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V. Nucleitide .and deducod amino acid sequences of bacteriophage T4 gene 22. // NAR. -

1989. - Y.17. - N.21. - P.S855 ;

3. Mesyanzhinov Y.V., Sobolev B.N., Marusich E.1-., Prilipov A. | S., Eflmov V. P. A proposed structure cf bacteriophage Г4 Î gene product 22 - a majpr prohead scaffolding protein. // ■ Yournal of Biology- - 1990. - V. 104. - P. 24--31

4. Sellvanov K.A., Ptilipov A.G., Efimov V.P., Marusich Е.1., Mesyanzhinov V.V. Cascade of overlapping late genes in bacteriophage Ï4 // Biomedical Science. -1990. -V.l. -P. 55-62

5. Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V. Nucleotide and deduced amino acic sequences of bacteriophage Г4 gene 20. // EMBL acception no.XI6055 Submitted August 22, 1989

6. Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V. Nucleotide and deduced amino acid sequences of bacteriphage T4 gene 22. // EM3L acception no.X16492 September 28, 1989