Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и структурно-функциональный анализ гена тирозинаминотрансферазы человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и структурно-функциональный анализ гена тирозинаминотрансферазы человека"

российская академия наук сибирское отделение новосибирский институт биоорганической химии

о д

2Ц гит :

На правах рукописи УДК 577+57.012+57.012.5

Зеленин Сергей Михайлович

ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНА ТИРОЗИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1994 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор, член - корреспондент РАЕН Н.П.Мертвецов

Официальные оппоненты: доктор химических наук Г.А. Невинский, доктор биологических наук H.A. Колчанов

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Эн-гельгардта РАН

Защита состоится 1994 года в " " часов на

заседании Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Акт2§льность_темы.!_ -

Выяснение . механизмов регуляции функций клетки стероидными гормонами является актуальной проблемой современной биологии. Согласно существующим представлениям, после проникновения в клетку стероидные гормоны взаимодействуют с цитоплазматическими' белковыми факторами - рецепторами гормонов. Образовавшийся гормон -• рецеп-торный комплекс'(ГРК). проникает из цитоплазмы в клеточное ядро, где взаимодействует с акцепторными сайтами хромосомной ДНК: В результате изменяется скорость синтеза специфических молекул матричной РНК и вслед за.этим-синтез белков. .Особенности регуляции стероидами различных генов определяются, по - видимому, именно строением и' расположением акцепторных сайтов. Поэтому для детального изучения механизмов гормональной регуляции экспрессии генов прежде всего необходим анализ структур? генов. Причем особенно йажно определение полной структуры генов, включая не только районы экзо-нов, но,и прилежащих к гену регуляторных районов, а"также интро-нов;

Известно, что синтез тирозинаминотрансферазы в клетках печени млекопитающих имеет тканеспецифичный стероидрегулируемый характер (Raiha, Schwartz. 1973). Данная работа посвящена структурно -функциональному изучению гена тирозинаминотрансферазы (TAT) человека. Для. проведения такого рода экспериментов первоначально необходимо приготовить препараты ДНК гена TAT человека., В связи с этим на начальном этапе работы необходимо было отработать методы клонирования на примере гена тирозинаминотрансферазы-крысы и провести-клонирование гена тирозинаминотрансферазы человека. Для детального анализа структурной оргайизации генов необходимо знание их нуклео-тидной последовательности. Определение полной нуклеотидной последовательности гена TAT человека явилось'следующим этапом работы. Расположение регуляторных элементов в гене TAT человека, 'ответственных за регуляцию экспрессии гена глюкокортикоидами, неизвестно (Rettermieier, 1990). В связи с'этим, помимо изучения структурных особенностей организации гена TAT человека, на следующем этапе работы необходимо было провести анлиз полной нуклеотидной последовательности этого гена с целью выявить наиболее вероятные участки

связывания глшокортикоид - рецепторного комплекса. 0§2чная_ндвизна_и_пзактическая_цешо

При клонировшии гена тирозинаминотрансферазы крысы была разработана орипшальная схема отбора клонов из геног.ных библиотек с использованием зондов на основе одноцепочечной формы бактерподпга MI3. Успешно выполнен отбор гена тирозинаминотране&разы крысы ;i проведен первичный анализ отобранных клонов.

В процессе работы сконструирован набор молекулярных зон;\оь для генов тирозинаминотрансферазы. проопиомел&локо; тина и прол-а.--тина, позволивший проводить научно-исследовательскпг pan /ги, по священные изучению механизмов регуляции этих генэв.

По разработанной схеме отбора клонов из геисю; Л -'тол>лтеки человека был выделен ген тирозинаминотрансферазы чс.-ивек^. Создан набор рекомбинантных ДНК со вставками, полностью п«р«к;.лi-шкий геи TAT человека. Впервые определена полная куклоотнднчя ^ -следова тельность гена TAT человека.

При анализе нуклеотидной последовательности г«Я:& гироьинами-нотрансферасы человека обнаружены вероятные учаспг;: -иязыранил гормон - рецепторного комплекса. Дополнительно к ^.нарунен-

ным (Retteiimeier, 1990), найдены еще три Aiu - поьтоса, • ти иной степени совпадающие с консенсусом для Alu - повторов. Кроме того, в пнтроне № 6 геиь TAT человека обнаружен дпмер длиной &ä нуклеотидных остатка. Установлено, что и каждом па мономеров этого димера на 3' - конце находится прямой 16 - членный повтор.

Результаты исследований были доложены ¡iu v съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Вавилова ¡Москва, 1987); на III Всесоюзном съезде эндокринологов (Ta;:,.>:tKr, i939): на конферен ции "Геном человека - 90" ;Лореславль - Залосский, Г990), на конференции "Геном человека --Э1" (Переслаъль - Залесский, 1991), на конференции "Геном человека - 93" (Черноголовка, 1993); на 7 Международном конгрессе по изоферментам (Новосибирск, 1992); на втором рабочем совещании "Регуляция экспрессии генов млекопитающих" (Новосибирск, 1991). По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура_и_объем_работы. диссертация изложена на 192 страницах, она включает 27 рисунков, список цитированной литературы содержит

150 наименований. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждений, выводов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. I. Конструирование молекулярных зондов и отбор генов тирозинамино-трансферазы из геномных библиотек.

1.1. Конструирование молекулярных зондов, содержащих фрагменты кДНК и гена тирозинаминотрансферазы из печени крысы.

Содержание специфической мРНК тирозинаминотрансферазы в поли-сомной поли - А РНК из печени даже при индукции гидрокортизоном составляет не более 0,02 - 0,058. Поэтому при клонировании кДНК TAT крысы мы применили способ клонирования кДНК с использованием в качестве затравки не олиго - дТ, а специфического олигонуклеотида, выбранного по известной структуре мРНК TAT крысы. Этот способ позволил быстро и эффективно отобрать клоны, содержащие в составе гибридных плаз:<!ид нуклеотидные последовательности мРНК TAT. В результате отбора был получен клон № 5, обозначенный рТАТ - 5 -VGZK. Клонированный фрагмент имел размер 353 п.н. и соответствовал району от 1896 до 2249 нуклеотида, согласно опубликованной первичной структуре мРНК TAT крысы (Grange et al., 1985).

При конструировании зондов для отбора гена TAT из библиотеки генов крысы проводили субклонирование фрагментов кДНК и гена тирозинаминотрэнсферазы из печени крысы в составе бактериофага MI3. Для провещи правильности отбора клонов, содержащих фрагмент к1Ш либо гена TAT крысы, проводили секвенирование оцДНК клонов методом Сэнгера от универсального праймера. Полученные зонды были использованы в дальнейшем для отбора генов TAT крысы и человека.

1.2. Разработка схемы отбора клонов из геномной библиотеки генов на основе бактериофага,х.

Как правило, в индивидуальной бляшке фага х содержится очень мало фаговых частиц, поэтому для отбора клонов из библиотеки генов с использованием радиоактивных молекулярных зондов выбирают высо-комеченные зонда. Среди известных типов молекулярных зондов достичь наибольшей удельной радиоактивности позволяют зонды на основе оцДНК бактериофага MI3. Мы предположили, что в силу высокой чувствительности в гибридизации использование таких зондов может быть весьма полезным при отборе клонов из библиотеки генов в составе

векторов на основе фага X. Для решения методичебких проблем, возникших при использовании такого типа зондов, нами была разработана оригинальная схема отбора клонов (Рис. # 1-).

Ктшактвкамв itmmrn АЩ *

Matènuà ¡еипЁр-Хвре*4Л . Ц5Хкикмм1>

[па-кат пт

Ррогнет lacZ — Нтмв kiM-jmtm

К/ыяер** тЬ*

* 1 Mpukiytmm t jnfewt

ни-ктт ♦

или

на-к m um _ „

2.Цкр афЛ-уй^гигд

Шшы '

(UWU

I

XmU Kißmv&MJi

шт^ишяЛмш

белый

I

Рис. I. Схема отбора генов из геномных бйблйотек', сконструированных в бактериофаге

Одним из ключевых-моментов этой,схемы является„использование как минимум двух зондов для разный генов при отборе клонев 'из' библиотеки. Один из зондов является альтернативным для выявления ложно - положительных сигналов, появляпцихся в связи с загрязнением рекомбинантных клонов клонами с исходной формой вектора (в случае использования вектора на основе бактериофага х серии Харон 4А). 1.3. Отбор гена TAT из библиотеки генов крысы. i

При первичном.отборе.клонов из библиотеки генов было-проанализировано I5Ö000 независимых клонов. Из них по. гибридизации с зондами на основе оцДНК фага MI3, содержащей фрагменты кДНК -TAT .было отобрано 239 клонов.В качестве альтернативного зонда для выявления ложно - положительных сигналов использовали оцДНК бактериофага MI3, содержащего фрагмент кДНК проопиомеланокортина (ПОМК) быка длиной 360 ,п.н. Пос.пе всех процедур очистки и повторного ана-

лиза отобранных клонов окончательно бнло отобрано четыре клона, давших положительные сигналы при гибридизации с зондами на ген TAT крысы.

Для анализа вставок в отобранных клонах проводили гибридизацию препаратов ДНК индивидуальных клонов с олигонуклеотидными зондами. выбранными равномерно по структуре полноразмерной мРНК TAT печени крысы от 5' - конца до 3' - коша. Оказалось, что ДНК одного из гибридных клонов (ДНК хТАТ № I) гибридизуется со всеми использованными олигонуклеотидами, соответствующими экзонам А, D, I, L гена TAT крысы, и не гибридипуется с олигонуклеотидным зондом, соответствующим экзону И I гена ПОМК крысы. В качестве положительного контроля гибридизации была использована ДНК xrTAT № I, в которой отсутствуют ЕсоЕ I - фрагменты № I - 3 гена TAT, переданного из лаборатории Г.Шутца (Германия). На рисунке № 2 приведены результаты гибридизации ДНК клона хТАТ Jl I, отобранного нами из библиотеки генов крысы, и ДНК клона XRTAT W I.

I 2 3

Fue. 2. Радиоавтограф нитроцеллюлозных фильтров после гибридизации ДНК отобранного клона, содержащего ген TAT (хТАТ KI) с олигонуклеотидными зондами, соответствушими определенным экзонам гена TAT крысы: I - экзону L; 2 - экзону J; 3 - экзону D; 4 - экзону А. Фильтр под JK5 гибридизовали с олигонуклеотидом, соответствующим экзону .¥1 гена проопиомеланокортина крысы.

Совокупность данных по рестрикции, дот- и блот- гибридизации ДНК клона хТАТ № I позволила нам предположить, что данный гибридный клон содержит полноразмерный ген TAT, несколько отличающийся по своей структурной организации от ранее описанного (Рис. № 3). Окончательное заключение о структуре этого клона было решено сделать после определения нуклеотидноП последовательности клонированного нами фрагмента геномной ДНК крысы в клоне ХТАТ .¥1.0 этэй целт полученный материал к."?нч ХПТ № I был использован для по-

следующего субклонирования фрагмента геномной ДНК.

А в

1

I

Рис. 3. Радиоавтограф нитроцеллюлозного фильтра после блот-гибридизации ДНК клона х ТАТМ с зондами, приготовленными на основе бактериофага MI3: MI3 ТАТЕР Ж39 (а) и MI3 ТАТЕ3.2 J£2 (б). При разделении ДНК в агарозном геле на дорожки наносили: 1,4 - кДНК TAT крысы в составе фага MI3 в качестве положительного контроля для блот-гибридизаши; 2,5 - исходную ДНК хТАТ №1; 3,3 - EcoE I -фрагменты ДНК хТАТ Ш.

1.4. Отбор гена тирозинаминотрансферазы из библиотеки генов -человека.

Отбор клона с геном TAT человека проводили из библиотеки ге1 нов, сконструированной в векторе на основе бактериофага я серии ЕМВЬ 4. При клонировании гена TAT человека мы использовали зонды и схему отбора клонов, использованные при отборе гена TAT крысы. Было проанализировано около 70000 независимых клонов из библиотеки генов человека. Все процедуры первичного отбора клонов, рассевания клонов до индивидуальных бляшек, вторичный отбор и приготовление небольших количеств рекомбинантных ДНК бактериофага х проводили аналогично процедурам, опробованным нами при отборе гена TAT крысы. В результате проведенных экспериментов было отобрано 28 клонов для олигонуклеотидного картирования клонированных фрагментов_гена TAT человека. Согласно результатам олигонуклеотидной гибридизации, приведенным на рисунке 'А, клон TAT № 17 - I содержит вставку, представляющую собой ген TAT человека, либо его часть.

«Э-Л

/SV*

«eZ>

Рис. 4. Радиоавтограф нит-poцeлJЮлoзныx фильтров после гибридизации ДНК отобранного клона ХТАТ #17 - I с олигонук-леотидными зондами, соответствующими определегшым экзопам гена TAT крысы: экзону Ь, J, D, В И А.

2. Структурно - функциональный анализ гена TAT человека. 2.1. Приготовление препаратов ДНК фргментов гена TAT человека.

В связи с тем, что были установлены только нуклеотидная последовательность кДНК TAT человека и экзон - интронная структура гена (Kettenmeier, 1990), мы поставили задачу определить полную нуклеотидную последовательность этого гена. При этом была изменена стратегия исследования: для приготовления препаратов ДНК гена TAT человека был использован метод полимеразной цепной реакции. Структура олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации, и расположение их относительно гена ТАГ приведены на рисунке 7. Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили по методу Сэнгера с предварительным клонированием или по методу Максама -Гилберта. В последнем случае для введения концевой метки во фрагмент, подготавливаемый для секвенирования, в один из праймеров вводили концевую метку, .а затем использовали при повторной амплификации фрагмента гена TAT человека.

Выбранный нами способ определения нуклеотидной последовательности гена TAT человека обладает рядом преимуществ по сравнению с подходом, использованным при секвенировании гена TAT крысы. В частности, исключается стадия конструирования геномных библиотек.

отбор и идентификация клонов, миигсстадцйше субклонирование и приготовление препаратов ДНК. Kpo;.ie toix, появляется возможность изучать особо вариабелыше районы геномной Uli'" при секвенировании фрагментов хромосомной ДНК не минимальны.1-: 'бразцов ткани.

Для приготовления препарата ДНК человека использовали ткань плаценты. Качество выделенной ДНК было проверено при электрофорезе в 0,4% агарозе. Основная часть ДНК имела высокомолекулярный состав. При электрофорезе препаратов ДНК, гидролизованных рестрикта-зой, были хорошо видны дискретные полосы, соответствующие повторам в геномной ДНК, что также подтверждало хорошее качество приготовленных препаратов ДНК., В процессе работы были подобраны условия для амплификации фрагментов гена TAT человека. Анализ полученных продуктов амплификации проводили с помощью электрофореза в агароз-ном геле (Рис. № 5).

12 3 4;5 6 7 8 9 10 II

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагментов гена TAT человека. Белыми точками обозначены целевые продукты амплификации. Номера ин-тронов гена TAT человека, соответствующие препаратам ДНК, приведены сверху. На первой дорожке нанесен маркер длины: продукты гидролиза бактериофага х по Есо91 I - сайтам. Размеры фрагментов приведены слева.

2.2. Определение полной нуклеотидной последовательности гена TAT человека.

Выбор олигонуклеотидов для амплификации интронов гена TAT человека был сделан таким образом, чтобы концы каждого из амплифи-

■p\.'."i>'.. . <■/■ - TU'-pirrnit ГГ.'"- Т/ Т ''

'' ' ' т ', ~~~ Ï 1'Г г COOT""' ' V--r*/.." г .у'*- г'?■ - ^ г п . ■ -л г

г'; .' ; т. •.т.,•-'";)!"' ■'." .'¡oc::?-! '"T'j.'^-tüc:" г.а;; ¡, .• тг'\ ' . n.j-.'i.'l.'-: ji;о".' .;> ¡"i 'ilt..""; ^i-r-j '"ocv:.1 гряя т."" •-•cvr-rf ~г. ^ '.vv.t't s '..-{•я 700 a.fi.. прод/ес'./зуг;;;,;'':: позкш*^ н-1 'гзчало

крипгш" -d"' Т.'.Т s.-.сг?полнуг.; ну-лготиЕг-о последователь -КОСТЬ ЕСС.< î'w.'jîîor, от А .50 I I! БСЭУ, иятрочо?. от г ЛО к- ii, ÎV. pifîSim'! стрлтсгял ci-ск-и атклеогияг:?'* пге^оде.'-агс.'и-.--

No 0бОЛ1!'1Мг,Ч1'

? t 95

Л388

6582

8775

10969

1 шгат^'-Д

2 iNTi'iГ!. :

п Tf.JT ' !" ' 1 1

4 TNVIiniW,.-!-illjlll.. "!.'..'; . int. !.: ' . luv 'u ' ■.:.. ¡. I ÏJ'i . . '

;m .

'NT. -;.""■!. :. INI. -V "-f.:.. IUT ' ' 'OU/:.. ' 1? INT1 18î!:.i. :■'■.. 14 HÏATE.'.til ,.ÎK,.

t

10 1 i 1С

—>

—>

F.ic. •'■. ( i( ~,u '.•;:!^лулеккй rovne? нуклести;:»:^

юллсч in i bnu .iij .'ш-^юшготраисфгуаяь человека.

? слалсяa-

ш-сти гена 1AT человек:». Ere полная нуклеотипная последовательность ь^'ДстаБлена яа рисунке 7. Сборка полной структуры гена TAT человека проводилась с использованием пакета программ DNASIS и . ригинальной программы И.Б. Морозова для сборки нуклеотидной по-'."(••йонаюльности из о-до-лшых фрагментов.

:..о. П иск участков юна TAT человека, потенциально участвующих в :.'"г.\'л.:!;:,!И транскрипции.

анализе Фрагмента нуклеотидной последовательности гена 'V ч- л», века н власти f50-.'> относительно начала транскрипции гена

>

функциональных-консенсусов для глюкокортикоидных рецепторов обнаружено не было. В связи с этим было высказано предположение, что, в отличие от гена TAT крысы, в гене TAT человека область -2500 не участвует в регуляции транскрипции гена глюкокортикоидами (Eetten-maier, 1990). По - видимому, регуляторные элементы, участвующие в стероидной регуляции транскрипции гена TAT человека, наблюдаемой в экспериментах, располагаются в другйх раДонах генр. Ранее было-обнаружено, что сайты связывания для рецепторов глюкокортикоидов могут находиться не только в 5' - прилежащей области гена, но также во внутренних районах гена и в 3' - прилежащей области. Учить.'-« вая все перечисленные факты, была сделана попытка найти в структуре гена сайты связывания гормон - рецепторного комплекса. Для поиска таких участков была использована программа поиска сайтов связывания гормон - рецепторного комплекса с использованием метода перцептрон, созданная Селедцовым И.А. (Сектор компьютерного анализа биополимеров, Институт цитологии и генетики СО РАН) (Plisov et El., 1991). В результате компьютерного анализа полученной нук-леотидной последовательности гена TAT человека было обнаружено три наиболее вероятных участка связывания .гормон - рецепторного комплекса (Рис.Ж 7). Для выяснения степени их участия в регуляции экспрессии гена TAT человека необходимо провести дополнительные эксперименты с выявленными участками гена.■ 2.4. Особенности структурной организации гена TAT человека.

Помимо поиска участков ДНК,- соотвествующих по структуре сайтам связывания глюкокортикоид - рецепторного комплекса, был проведен компьютерный анализ особенностей структурной организации гена TAT человека.

При анализе нуклеотидной последовательности гена TAT человека были обнаружены совершенные палиндромы, имеющие размеры полностью комплементарного стебля не менее 5 нуклеотидных остатков.- Кроме того, в структуре гена был обнаружен ряд прямых и обратных повторов длиной не менее 11 пар оснований. Среди всех обнаруженных повторов особо выделяются повторы в интронах К 3, 6 и ю.

В интроне № б гена TAT человека был обнаружен фрагмент длиной 84 нуклеотидных пары, представляющий собой димер, состоящий из двух высокогомологичных мономеров. На 3'-конце каждого из мономеров обнаружена полностью повторяющаяся последовательность из

нуклеотидных остатков. Остальные части мономеров гомологичны на 84i. При анализе базы данных нуклеотидных последовательностей JMBL банка было обнаружено более сотни нуклеотидных последовательностей, содержащих участки, гомологичные нуклеотидной последовательности 16 - членного прямого повтора из интрона 6. Среди найденых выделяется ген Xenopus Xaevis XTG 5-1, кодирующий белки с большим количеством цинковых пальцев. В этом гене 1б - членный элемент повторяется 91 раз.

Особый интерес представляют Alu - повторы, обнаруненные ранее в экзоне L и в регуляторной области гена тирозинаминотрансферазы человека. Встраивание этих элементов в регуляторную область гена человека вызвало изменение структуры регуляторннх элементов, ответственных за регуляцию транскрипции стероидами в случае гена тирозинаминотрансферазы крысы (Rettenmeier, 1990}. При анализе полной структуры гена TAT человека было обнаружено дополнительно еще три участка, имеющих разную степень гомологии с опубликованной ранее последовательностью консенсуса для Alu - повторов (Kariya et al.. 1987).

Поптор из интрона № 10 на 80 Ж гомологичен консенсусной последовательности Alu - повтора и имеет подобную Alu - повторам организацию.

На з'- конце интрона N 3 гена TAT человека обнаружен Alu -повтор, имеющий структурную организацию, отличную от обычной для Alu - повторов. Внутренний А,Т - богатый район этого повтора имеет необычно большие размеры. При сравнении с консенсусом для Alu -повторов внутренний А,Т - богатый участок оказывается на 50 пар оснований больше, чем в консенсусе. Без этого дополнительного района нуклеотидная последовательность данного Alu - повтора совпадает с консенсусом на 76 %. Однако прямые концевые повторы, как правило, присутстующие на конца;; Alu - повторов, в этом случае отсутствуют.

Наиболее совпадает со структурой консенсуса Alu - повторов нуклеотидная последовательность, обнаруженная внутри интрона з. На концах этой последовательности находятся 14 - членные np;.w:e повтора, степень гомологии этой последовательности с консенгуссм для Alu - поморов дос5игш»т 87 %. Особенно прччзчат*льно, что j-a 3'- юнце -того Alu - повтора обнаруггеаэтся не л.Т - богао:-

• . -. Г> ,:.li-----1; =1DÍ I - л l : Г/.'il/.ir ¡W.j-imííJ '.'И!!'.":;.".' .4

с поя jji ли;;! ¡. pacnpoc ip:.;rt,ii¡¡-í Alu. - повтор от в г;:нсме

(lUiríy ■ et „i., i'jíO. Согласно сала ип nsoc, пр;: созревааки 73i. r:U осоаз^етса t.-FHIí. uu которой, посте копчронания зукорютическиЛ "/Зггл'нол тршскршт&сой и дупликаакл, образуется прсзчествегави: ¡■jií, /.in - повтора приматов. Есзкс&тсо, в ысзм случае ш кмгем иа-P-KüiT .Ни - повтора, еи.е но польгргкегэсч ро к о? л 51 ií ' ".ии с i:: шперестройкам. Сравнение иуклеотшшх последовательностей . генов TAT нлзкопигохких в этой области гена, возможно, прояснит механизм лоя&ления и функционирования Ala - повторов з геноме человека.

Дп&шз структуры гена tat человека проводился с использованием компьютерной системы длл автоматического модекулярно - генетического анализа "AutoGene" и программ, созданных сотрудниками Лаборатории теоретической и молекулярной г?нетики (Институт цитологии и генетики СО РАН), а также пакета программ dmasis.

Рис.-7. Нуклеотидная последовательность гена TAT человека.

Под нуклеотидной последовательностью гена тпрозинаминотранс-ферази человека приведет известные участки нуклеотидной последовательности гена TAT крысы. Нуклеотидные последовательности вырав-нены с достижением максимальной идентичности. Совпадающие участки нуклеотидннх госледовательностей обозначены пунктирной линией, делении в гене TAT крысы-приведены в виде пропусков, а отличающие-' ся нуклеотидные остатки и вставки обозначены буквами, соотвествую-цими структуре гена TAT крысы.

Нуклеотидная позиция -и соответствует началу транскрипции мРНК TAT. TATA -, CAAT - последовательности, два сайта полиадени-лирования заключены в рамки. Последовательности интронов приведены маленькими буквами, экзонов - большими. Выведенная аминокислотная последовательность TAT человека приведена над нуклеотидной последовательностью, Тег - -стоп кодон..

Гексануклеотидц, соответствующие высококонсервативной области консенсусной последовательности, связывающей ГРК, обозначены как GRE и выделены сплошной линией над структурой гена. Участки гена.

наиболее вероятно связывающие ГРК, выделены сплошной линией под структурой гена и обозначены как - "Ядро" сайта связывания ГРК * I, * 2 и * 3.

Alu - элементы в экзоне L, в интронах з и 10 заключены в рамку. Концевые прямые повторы, ограничивающие эти последовательности, обозначены стрелками сверху. В интроне * 6 под нуклеотидной последовательностью гена сплошной линией выделены 16 - членные прямые повторы, а пунктирной - высокогомологичные участки в структуре димера.

Нуклеотидные последовательности праймеров, выбранных "для амплификации фрагментов гена TAT человека, их обозначение, ориентация и положение относительно гена обозначены стрелками над структуру гена.

М138

■I. ----------------------->

aactgcacaggtttcagctgccttggacaccctgtgcttttcagctattt -g-----g—a-c-tg--------------------ctt-a-tga-

51.

ttt

CEE I

gttgaatggaacttaagtgcccaatttgttctgattggagcaaaactttg

tc

ta-t---ttgtt-g—с------g--------a-c-----j-------c-

101.

tggac^gacaaggat^.-'.gcgtccaagatgtaggaagttaaaaaaaaaatg

---tg—с----a-aa—aaatt---gca----gcaaag---1—t---

151.

ttgccaaacaaggtgtagagcacgatcctatctgtgttttgaaatctatg ( 247 п.н.

201.

aaattatgtatctatgcacctatatgtaatgtatctatctctgaatggag

)-

251.

ggaaagagcctgaccattaccaccctctacccctgggagtgagaatgaag — t-tt-a—aa—tc---1—ttgct—tat-ca---------c-ag—

с

tgtacagggagcaggtgcaaggaagaatgctcacttcttactttatatat

—с—:—a—áag—gtacca----g-cc---gt—aa ' —g-

351.

ttctgtactgttaaaattttaactggctgttttgtaaaaaaaatttaata -c-taac- ------gaoc---

Sac GRE II

401 ,

aaagctatcaactgtaaccagaagtactttctgacagtagatgttctcaa

----t---------с---с с—c-g-cc—cac— -t-------

a"

451.

accatctcaccaagtgcccagaaagagttaacacaggagaattccagatg

501Г" "GKË шач-; 7 a

11 tgaagtgagaacaaat tcc tgo t1 tgagggtgggaggtgggc 11aggg

с----1—a—g------с—a-a—g—a-----cccag— -t---

551.

atgagaggcaatgacgggggagaggaggaaagaagctgaggggagagctg

g-----aa—gcagt-----gtg—gtatgg-ggtag-tcc—g gga

ag

601.

gctgctgagt tgtcat tcc

laccaatgg

catgaaagtttcaagcccaacg

-gga—t----с---с——j--------a---с---g-c---gg-

t

651.

cccat t tgtggagac tat t tes

' . +1 ggagttaggatttgeatсtgagttсATT

------g-ct—a---------a-g—с----с----с-----с----с

701ЭКЗОН А

GCCCCTGTAACCTGTCAAAGAAGAGCTAAGGGAGCTTTCGGGGTTGGCTT

at-aga- g— t—gtgg -g-a------ata—t------g

M139

751----------------------> . интрон 1.

CTTGGAGGCTGCTTTCTCCTTTACTTGGAAGgtaaaaa111 taagt t táa —g------------g---gg-------------tccc

gttgatcaggyagtggtgactgattgagytgttaatttttt■tctttt.'t•gg ' 851. . . . . . ,

tgtattgatttctttttccagctagggctgtaacatgcttatgggataag 901.

gttttacttt"бactaacaatgatatttacatggaacttctaacaagatgg 951. . . . .

agtggttcttcctggtcctctgcagatgacaagaagcattaggtagattt 1001. .

tcttggataggctcgcatggaaaggaaggagaacctatgctttgactgat 1051. ....

gaacaattttcatcttattccttcttggtttcacatagagcatggttaag •1101.

ccttgacaggaattgcaga,:gcgtgtagcaaatcctacttaagtagaatg 1151 .

ggttcttgctttattttccatctcagtaaaaactcttaaaactcccccat 1201. . •

tcatagíaaagctactttacaacagaaagtagaaaaaaaaataaagagag 1251. .

agtttggaaagacaott'ttagtgaagtcacocaatgtttaggtccaaatg

"Ядро" сайта

1301.

tagctcctctgtcccccagcgctatgttatcaacatcacagggaacttct

связывания ГРК № 1 .

М141

ЭКЗОН В Ме1АзрРгоТугМе1;11еС1пМегЗегЗ ttcccctcgcagGCTTCGCTAGTGATGGACCCATACATGATTCAGATGAGCA

— tt— ---------ag—gc------t-c---g---------c-gatg

' М140

1401-------- ....

егЬуз01уАзпЬеиРгоЗег11еЪеиАарУа1Н1зУаЪАзпУаЮ1уС1у ОСАААОаСААССТССССТСААТТСТССАССТССАТСТСААССТТССТССС .---g-------Ь-----------1а--------

Ь

ArgSerSerValProGlyLysMetLysGlyArgLysAlaArgTrpSerVa AGAAGCTCTGTGCCGGGAAAAATGAAAGGCAGAAAGGCCAGGTGGTCTGT

----à---g—a-aa—-g—a---------g--------a---gac—

1501. . . .. . .

lArgProSerAspMetAlaLysLysThrPheAsnProIleArgAlalLeV GAGGCCCTCAGACATGGCCAAGAAAACTTTCAACCCCATCCGAGCCATTG

1551. . . ...

alAspAsnMetLypVall/ysProAsriProAsnbysThrMetlleSerLeu TGGACAACATGAAGGTGAAACCAAATCCAÁACAAAACCATGATTTCCCTG ------------,----TC_g—a----_g_____g---g-------1—-

1601. . . • • SerlleG интрон 2

TCCATTGgtgagttggggacactactgaggggctgtcattgtcctcctct

1651. . . ' . '

actctcatgttcacaggotggttggagáagatggcagttgggggtgagtc 1T01. . • . ' .

tgagtactgaacatgggagaataacctcttggctccttttgtgttttcct

экзон c

Mi 43

1751. .---------------------->

lyAspProThrValPheGlyAsnleuProThrAspProG

cccataaaaagGGGACCCTACTGTGTTTGGAAACCTGCCTACAGACCCTG -------------------g-------------------

1801. . . . ■ . <-------

luValThrGInAlaîiîetLysAspAlabeuAspSerGlyLysTyrAsnGly AAGTTACCCAGGCAATGAAAGATGCCCTGGACTCGGGCAAATATAATGGC

----------а—с-----------------------g—g—с------

Ы142

1851----------------

TyrAlaProSerlleG интрон 3

TATGCCCCATCCATCGgtaagctcotcctgagactccataoctggtgact 1901.

gccaaatctttagtgctcttataacaggactaaatgtotagcaatcctct

1951. ....

tcactttcctgatgcacaattcctaaggagaggctaagattacatggtcc 2001.....

tttggatttgggaaccgggtctcgggatgcttaaatacaaggcatcaagg 2051. ....

tccaacttctttcctggctttctttgacatatgggcacttccctctaggc 2101. . . ...

tcccaaacatacttatttgtcaagtaaagctcctatcctatcattactaa 2151. . ...

11 с taac tgaaggcc t tgagt o tggcaggagc 11 tgtgt t tgc tgagcc t 2201. . ' . . .

ctaggtcctaaatggatttacttattgctctgtgtatatagctcctttgc 2251.....

tteatttctgcttctctatgtattgaaggccctatttteattatggtcçt 2301. . . . .

gagcacattgaaatgcaattgttaccgtttatgaetaacgggtttaaaca

2351. ' ' . GRE IY .

aacaaataaacaaacacccaagaacaacaaaaaatgggctgtcaaactga 2401. ....

aggatagaaggttgtttctgatagattgaaattactcctttttaggtttc• 2451. . ". . • .

tctccatctattaaaaatttctaccctgaatattttggtaaagtacatga 2501 - .

ttccttgactttcagtattgaatcattttttttccttatgtgtacataga 2551. . • .

aacacacttcttaatgcagaataaaaccccagtttcatgataaaateaaa 2601. ....

ttttaaaaacactttaaagagttatatcggggacttcgtggtttttcggt 2651 . . .. .

tgattac t taca111tataaagt t teaLacgacaaaaataaaagcaaaat 2701.....

caagaccaaaagttgttataaaaaaagtttctaatgactttaacatccag 2751 .

stat taggaaac tgat ttaacctgaaaaammnaaccaagtctc tat ttg 2801 .....

ac-iair.gttcaaaggt tctg4avst ttteatttcaaaggagatacaggtg

2851. . ' СКЕ

t;taatatatgtctaaaaaagtgttct tcctcattagtaattaaggaagtg 2901'.

otgatttgtataactttgaдacacccatctatacctattaaattagtaaa 2951. . . . . .

cattatgaaatagtgcctctagccttgctaagttgt<?tttttgaac ч1;аа 3001. . ^ .

attttgcaaaatattatgatgggcatgaaactgctgatacttcaagc tg 3051. . . .

taagccaacatttggaaatattgtacaaaaataatttgaaataaaaattt

"Ядро" сайта связывания ГРК N 2 3101. . ... .

gtacaaaaatactgataagaa_tattacataacataaaaaacttaaaatgg 3151. . .-*-.-

accacatgaat tgaatgcaotgat1асаас t Ьс111

tttttttttttttt

3201. ....

Ф Ъ11; 1; Ъ1; tgagacgaag t Ь11 cgc t с t tg t tgcccaggcggagtgcag tg 3251.

gcatgatcttggctcaccgcaacctccgcctcccgggttcaagtgattct 3301.

cctgtctcagcctcctgagtagctcggattacaggcacgcnccacaatgc 335.1. . . .

ccagctaatttttgtatttttagtagagatgagatttctccatgttggtc 3401. . . ' . •. -

agactggtctcaatctcccgacctcaggtgatccacccaccttnncctcc 3451. .

caaagtnctgggattacaggcataacaccgcgcptggg5attacзacttc

3501 —^ ....

t taaaaaatacagt ccc'taaaaaagat 1 tgggaataa tagaaatcc I tgt 3551. . ' ...

attacacagaataaaatataancacagaaatcaagatggtgeagagtatt 3601 .....

tggggagctcttccttgttatcatttatacattcgtgcttatactaaaat 3651.

tgtaaaacataaaagtgtaagtgaatctcctttatccacaatggctgaga

3701. ....

gctgaactaaatagaatgccctctgagcaggggcagaggcagcctgacca-3751. . . . .

gatgctgggcctccagggcatagctgtcagttgagggatgaaaacttcat 3801 .

cttct

_t tgccaggcacagtggctcaccectgtaatcccagcactttcagga

3851. . . . ■ ' ■ .

ggctgaggtgggaggagcccctgagacccaggagtgtgaaatcagcctgg 3901. . . . . .

gcaacagagggagattctgtctctaca!aaaaaaacaaacaaaaâcaaaac 3951 .

aaaacaaacaaacaaaaaacaaaacaaaaaaatteaaaaattagctgaat 4001 .....

gtgggggagcacw.ctatagtcccagctactcaggaggctaaggtgggag 4051. . . .

gatcccttgagcccaggaatttgaggccgcagtgagctatggctgtgtca 4101. . . .

ctgcactccaagtccgggtgacagagtgagacacagtctctaaaaaccaa

4151 .

aaaagc

M145 '

.ЭК30Н D . lyPheLeuSerSerArgGl JtccactttccactcttttctttcagGCTTCCTATCCAGTCGGGA

---a---------------

M144

4201--------> <----------------------

uGluIleAlaSerTyrTyrHisCysProGluAlaProLeuGluAlaLys GGAGATTGCTTCTIATTACCACTGTCCTGAGGCACCCCIAGAAGCTAAGg

4251ИНТР0Н 4 . . ■ .

tgggccttatacaagacaccagctctgaagcaatttagggcaaactatco

4301.

4351.

ctttttacttgtttctgttccacaagaagtacgggtgtcagagggggaaa GEE YI '

age tgagaacaat t tccc 11tagcaattagaagact tc tcatatagttgg 4401. . . ...

ggtcactaatcagtgatfatagttaatgtcattacagtgtgataatgacc

4451 .....

gatcccatacaacttaatgtggtgtctgtctcaaggaggccgaaaggatc

4501.....25LE1

ccagagagcacctatatttgattgtctgtaaaagatcatttgagaacaac 4551. ....

tcataaacactaagaaattattttaaaaaattttaccaataggatctttc 4601.....

ttttttaaaaaaaattgtagcttttctcatttactgtaaggtcatttaga 4651.....

gagaaagatagaagtaccaggacatactgaat tgatgcagtgccaagt t1 4701. ....

aaatgatgtccttccetctatagtctactgtgtggggtcagcatttteta 4751.....

acataatgtgtgtctgtcacctgtatgtcagcgaagagccaggcttcaaa 4801. . . ...

tctctggccaaaagtaaataaataaccaagcgaaaaaggtccaaggccag 4851. ....

catgctctctcatggaagtctgctgagtcacagccaacctatccttttta 4901. ....

aagtgatttaagtggccaacatttcaacaatagttatcaacatatataaa 4951. ....

tttcttttggttttggcttagtacatttcctactacttacaacttgttaa 5001. ....

aggaagttcacgattgctcccaactcacccacctgacaacttcttttctc 5051. ....

ctgttgctgttggaacccctaatgaaattaaccttttatttccttcacag 5101ЭКЗОН E

AspYallleLeuThrSerGlyCysSerGlnAlalleAspLeuCysbeuAl GACGTCATTCTGACAAGTGGCTGCAGCCAAGCTATÎGACCTTTGTTTAGC

5151. . GRE VIII

aYalLeuAlaAsnProGlyGlnAsnlleLeuValProArgProGlyPheS TGTGTTGGCCAACCCAGGGCAGAACATCCTGGTTCCAAGACCTGGTTTCT ------------1—t—a— a--------ca-------g—с—g—t-

■ "Л1 и L.-)í!l:¡'JI.íí.-.,OiyIlcGI-.;''rall,ysI.guT.yr

ОТ ТСГ ACA 'dt''TCT( 'GC'W/(!ГСТ *TsHATTGftOGTCAAACTCTAC

:пТ.еи:.е j »¡u pon 5 Л ATTTGTTGstaчаtgac ttttlaatettpgactcaaatgctcogttact

r.rjeetguaaaaaata batgaacattHottoagcagaisjaaggtctcaaag

tffütSSt t.^aagccagagacagacttta t tgc t taca t tggaccc t tgog 5401. . . ...

л taagtgaggattccocctaaatgtt teagaateatettagteteaccct , . i-cara F

Pi oGluLyfiSerTl'pGlalleAßpLeuLysGlnl.eu trie 11 tctctccagCCAGAGAAATCTTGGGAAATÏGACCTGAAACAACTG

GluTyrLeuIleAspGIuLysThrA]aCysLeuIleValAsnAsnProSe '1AATATCTAA TIGATGAAAAGACAGCTTGTCTCATTGTCAATAATCCATC

------c---g__c---------a-----g-----tg-------с— с-----

(.11 06

5551. -----------------------> <---------------

rAsnProCysGlySerValPheSerLysArgHisLeuGlnLysIleLeuA AAACCCCTGIGGGTCAGTGÏTCAGCAAACGTCATCTTCAGAAGATTCTGG

M1 Í Ö

5601—----------

laV нитрон 6

CAGgtacgtccagcagac.ttcacagaggacgaggtggggacagaatcctt

5651------....

' cagctgttgtgtgaaatgacaaaaaccagtcattccctaagt tccaagcc ■3701 .

tggggtggaggtggggagctccactgatgtctctcatcaatactgtgccr

5751. ....

taggagtggtaggcctggcctaaaagaggaaaaagaagaaatacttgtct

5801. ....

cttcatcactcccaggagaaaaagaartagtacttgcctcttcatcactc

-^---------------Г--------.-

16-членный повтор 5851.'

ccatcacgttgaagatagggtctgaaatatctagttacttaaatggtgaa

5901. ' .

ttcaggctctgcactctggaagagtatgttaagaatttacagttcttaaa 5951. ....

taggaagacaaaacacacaaacatgaaatgcaaatcacactttgcttgtg 6001. ....

ctttttgtctttct'ctttaagaattgtaacttcttaatattacgggatag 6051. ....

ggaaattacatgatattatgtgactattacatgataaagcaattcacatt

M108

6101. . . ЭК30Н G

alAlaAlaArgGlnCysVal aaaactgatt tcagcatgt 1t tat 11 tcagTGGCTGCACGGCAGTGTGTC

M107

ProIleLeuAlaAspGiuIleTyrGlyAspMet интрон 7

CCCATCTTAGCTGATGAGATCTATGGACACATGgtgagt с t tga t oagga --------------c-----------1------ --

"Ядро" сайта

6201. ....

tatatcactacagtaatctcaaattattttatgggaactttagaagtgga

связывания ГРК N 3 6251.....

ataatcagaaacaactcctaatcgtttcattacagcaaatcagcatccct

6301.

gcacttttttacaaatatatagacccacaactccttagccagttttctga 6351. ....

aacccaaagaac 11 tggaaatccaaagattcctggaat teat ttggt tac 6401. . . _ . -

aaaacctgatttgacctgatatttgtagatttttatttttcccacttgtg 6451. ....

atctatatatttgttaagagtgtggggaaaatggcagaaatgttaatatt 6501.' . . ...

cttgattaggggtactatcctagacagctctgggagtgttacataacgta 6551. . . . *

tggtaagtgtgctacatggcctttctgaagcccaaaccattttgcattat 6601. . . ...

gaaaatacctggccccaggaatttcagataagggattgtggacttatatt 6651 .....

ttaaatctgtagctcctatagacagtaatttcatagagccagcttcatgg 6701 .

agttgtaaatattactgggdtagggtcagtttcctcattttaggcttcct 6751 ...

t taatccagtccagacaccaaattaaatgtctttgtgtagtccccttcaa "6801t ....

agccicttgcaatcccagteatgcttcagggtagggatgatcccattaat

, ecaaggacccgtccetagtgatagaaggaaatgggtgggagccacgggat

оtgggat tgcagtgagaagtagacaagaaaacaaccataanaagtccctc

M109

сQ5!. 5KSCH H . <------------------------

ValPheSorAspCysLysTyrGluProLeuAlaThrLeuSerT t i.ct.-agOTOITTTCGGATTGCAAATATGAACCACTGGCCACCCTCAGCA

hrAspValFrcTleLeiK?erCysGlyGlyLeuAlaLysArgTrpLeuVal

ooo,atgtocccatoctgtoctgtggagggctggccaagcgctggctggtt

- ■ a-----t------------------------1--------------------------

Kl 10

ProGlyTrp/.r¿;L{!'-!Ji:;V; ¡-li^L^'jIlvüi:.-'ü-,;;.- '"¿Л: 3 : CCCGGCl GvJaGOÏTOCiûCXGOâ.TCCTCATTv'ATOaCCGAaGAG/ CATV tí

KT 19

7101-----------------

eGlyAsnGlu интрон

TGGCAATGAGgtga Laata tggtgaaagagtatgtgtaa 111.a ta

7151.

tatttatotcatgagcacagtggggacaagggaggcttt t11ot ' ttct t 7201.

tctccttgtcagtcaagcagcatgtgtgtggcagagctgggc ta..:gar.(-e 7251. . ...

cagagggtctgatctaagaatgcc.actagacaccatcac 111 .'..аадзИ

7301. . GRE IX .

aaaaacc tgatagaaaggtcagaacaagaaa;- t с taagacagaga *.«:-'. t, t 7351. . . . . 3KL. i: -

aagaaaagctaaacaacatgtttc ttgtgggtgtct t í ta¿ATv'C ".A JAI

7401. . . . .<----------

GlyLeuValLysLeuSerGlnArglleLeuGlyProCysIbrlleValGl GGGCTGGTGAAGCTGAGTCAGCGCATTTTGGGACCCTGTACCATTGTCCA

M111 M112

7451--------------------------------------------------------><-- -

nGlyAlabeuLysSerlleLeuCysArgThrProGlyGluPheTyrlíisA GGGAGCTCTGAAAAGCATCCTATGTCGCACCCCGGGAGAGTTTTACCACA

---1--------g--------tcag—a-----tcag------c-~ t----g

M120

7501------------------------------------------. . '

snThrbeuSerPheLeuLys интрон 9

ACACTCTGAGCTTCCTCAAGg taagggcagc tcctgccc t ccac 11 tggg

7551. ....

agtttgggagtcagagaatgccgcccgtggaattaggaataattggttct 7601. ....

cctttetggagccatgttccaatattaggagacggcatcggtgtaagcat 7651. ....

ccacacacacgtttctcacttccggccattctctctgcccctggtgaaaa

7701. . . . _GRE X

gcttcaagtaatagagctttttctttttcactccttatgccagaacatca 7751. ....

cacctacgttcccactcttcaatgaggggdctatttttaatgacttggot 7801.....

tttcttttacttaaattttgatccttgatttctccttgcctcttcttgta

M113

7851.ЭК30Н J . <---------------------

SerAsnAlaAspbeuCyaTyrGlyAlaLeuAlaAlalleProGlyLeuA gTCCAATGCÎGATCTCTGTTATGGGGCGTÏGGCTGCCATCCCÏGGACTCC

--------g—с-----с--------ас---------------------

М114

7901 . -----------------------> .

rgProValArgProSerGlyAlaMetTyrLeuMet интрон 10 GGCCAGTCCGCCCTTCTGGGGCTATGTACCTCATGgtgagtatgtgggtg

a---g--------------a—с--------1---

7951 .....

gcaggcactaggtcaatgcatgttgtaaggcaaagggcagtcattcagca 8001 .....

gaattgccacaggcagtcacgcagggtacaaagacaaccagctggcctcc 8051.....

taagccaagcagtttaggagttgtcttattctgaattgtcccactgaggt 8101. . . . .-

aatttagcctctatcagttctcataaaactctttaaatgacttaatta ?g

8151. ....

cagggcatggtggctcacgcctgcaatgcagcactttgggaggccaaggt 8201.....

ggacggatcattagcgcaggagttagagaccagcctgggcaacatggtga

8251 .....

aactctattgtctctacaagaaataaaaaaaaatgagctgggcgtggtgg 8301. . . .

cacactcctgtagtcctagetccttgggaggctgagatggaagaatgact 8351. ....

tgagccttggaggttgaggctgtagtgagccataatcgtgccactgtact 8401. ....

cccg t с tgggagacagag tgagacc с cato cgaaaaagaaaaaaaaaaaa 8451 . > ! i ;

_aaagatttaatttttcagtacagagaatcattttatatatgtagatacag

8501. . ...

ggaagatttaaaacacaaataagaggcttttcataccattgtaattctca 8551. ....

actggagtgatactggttcctaagggtatctgggaatgtatgggaatttt 8601.....

gtttgt11 tcagaatgactaggggc tgccat 11 tgtgggtcagggatgt t 8651.....

aaatatcctgcaaggggtgggctagtctcatgccataaagagttgcctgg 8701.....

ccctaatgccagtagtgtctcttttgagacatactagcattctatttcca 8751. . . . . .

gcttttatttatcagcatcagggaaggaactctttaatatttattaataa 8801. . . . .

aaatatatcctgtcttccctgagaaaaattccataaatattagccctctt 8851.....

atttatcagtgateagtagcacagttccaagatatctt-ttaaagtagccc 8901. . . ■ .GRE XI

ctaccttaatttctggcacaggaaattggcctgttctccctccttctgat

M121

8951. . . экзон К

ValGlylleGluMetGluHis aagttggCCtctccctcctgttggtatagGTTGGAATTGAGATCGAACAT

J

—g---------------g---

М116

М115 >

9001 —> <------------------------

PheProGluPheGluAsnAspValGluPheThrGluArgLeuValAlaGl TTCCCAGAATTIGAGAACGATGTGGAGTTCACGGAGCGGTTAGTTGCTGA

-----g-----с--------с-----------а--------ga----g—

' 9051. .

uGlnSerValHisCysLeuProAlaThr интрон 11 CCAGTCTGTCCACTGCCTCCCAGCAACGgtgggtgcctgtgtccctcagg

9101. ....

acattctcaacagtttctagagccccagaagcaagttctgagctggtttt 9151 .

tagcctgatcttttctcctccaacaaaatgtcttctcatttgataagatt 9201 .....

caaactgatgtgtctcatggatcctatttaaaatttgcttctccccccca 9c51 . • . .

tcataatcccatocatactgggaagaaaagttgtaaacaaacgttctagg •9301 .....

tgagaggaaattgatcctgatcccacaagtcattttaagatgaatgaact 9351 .....

cagt tggc. tgac t tagcatcccagtcatgggagctgaatgaar tgatggc • 9401. . • .

cctgatgaaatggtaccacttcttgtggatcagggtcctgaccattttag 9451. ....

ggtggtccagtaccagactcaattgctctgaaagtaacagactcttcttt M112

------------------------->

9501. экзон L ...

CysFheGluTyrProAsnPheIleArgValYalI1eThrValPr ttgcagTGCTTTGAGTACCCGAATTTCATCCGAGTGGTCATCACAGTCCC

-----с-----.---a------1----------------------

M1 17

9551. <-.----------:------------'— . '. •

oGluValMetMetLeuGluAlaCysSerArglleGlnGluPheCysGluG CGAG'M'GATGATGCTGOAGGCGTGCAGCCGGATCCAGGAGTTCTGTGAGC

9601.....

InHisTyrHisCysAlaGluGlySerGlnGluGluCysAspLysTer AGCACTACCATTGTGCTGAAGGCAGCCAGGAGGAGTGTGATAAATAGGCC

----------с-----------------------------с-----a---

9651.....

TGCATCCATTCTCCTGAGGATGTGTCCCATCTAGGGAAGGCÏGGACTAGG

et—с—g-c-------a--ca-------cgc-a---с—t------g-a

9701.....

CCTTGCGCCTCCTCAGGGACTCAGGTGGCCCTACTGGGAGAGGGGCCTCA

—get- -----------gc—aa—t-t—ga---------aa----1

9751.....

AATGCACCATGTCAAGGGTTCAAGATTGTTCCTGCTTTTCCCCAAGTACA

—a-----gca-g---ac—g-----ca—t—с---ос--- ---tt

9801 .....

ACCACACCCACACTCAGATCCTCCTCATTCACATCGCAGATTACTCCCTT

------—g—cgc-t gga-a-c-----ccc------

9851 .....

GCTCÎGCGCTGCTAGAGTGACTCACTAAÎTCATTAATCTGCCTCCCTCTC

a---a-tt-----g---cc-tgag—с- -----с---a-c-

9901 .....

GTAAGAÎTTCCTTCTTTTTTTTCTTGAAAGTACCAGGTGAACAAAGTTTA

с —a---cc—a—с---gg---1--- —с—----

9951. ....

CCAGAAAGCAGTTGAGACAAGAAAATAAGAGCTCAGGATGAGGGAAAAGA

--------a—a—g-c--------g-£---------------a---gcag

g

10001. ....

AAAAGATTGAGAGAATTTGTGCCCCCAACCATTTCCTCAGACTCTAAGAA —g-egga-ga -gcct-t----с----------gtg—g

10051GREXII ....

AGAACACGCTCTCTCCAGGCAGGTCTGAAGCTCAACTCTCTÎATTGCCTC

—ate----1---1------g---------ca----

10101. ....

ACTTCAGGTATACCTCACTTTACACAAT AGAATT a.TAACTGGAA aga a ;T

-g— gc-g--------c-gg--- -cj-fac--ca—g--------

cac tcctcgtggtacagc

?,o

10151. _ .- .

' tggggacacatgtatïtggtgattaca.ttttaaacacattaggaaaagtt

с-а----ttg-aat-ca-t-a---gt---с---------с------с—

g

10201. ....

gctatttgaactttttattgatttttggggggagtaaagaattattitgtg -a-g---a—cagaa-t—t-'----:-atttttt------g---------c-

ggatccctga

10251,

ATGCAlAATAAA g—

tatcctttaattgatcgacttgccaaatttagatttgtg

-c-.-c-a—с—---a----c-t'—i---,-----c-act

agctt

ctg aga-

10301.

tgcatcaggctttctï

ttttttctttttttagagaagttcaatataagct

10351. ....

tttcttitctttgtttctttctttcitiattttcagatggagtcttgctq 10401 •• ■ , . ' . .

-tgtcgcccargctggagtgcagtggcgcgatctcggctcactgcaacctc 10451. . . .

cacctcctgggttcaagcgattctcttgcctcaacctcccaagcagttgg 10501 . . - .

gactacaggcgtgagccaccatgcccggctaatttttgtàtttttagtag 10551. . • v

agacagggtttcacgatgttagccaggctggtctcaaactcctgacctca 10601. . . ' ' .'

ggcaaictgcccgcctgggtctcctaaagtacigggattacaggcgtgag 10651.

ccacctcgcccagcg

10701,

jcatcaggctttcttaaagtgagagcacgcctgta -t------1----с----arag-—g—a—т c-

ctagagcaagcaggaatcAgagaccttccagaaatActactgigtaa6gg

—e¡—a—a---g-c-g—g-'-jj— t— g-ctt-g------,-ca—

aag с

10751. ....

ССАСАААТАТСТТСАСГТСТСАТТСТТАТАТААТСЛТТАТТАСТТТТССТ

а--- с------с^-----g—g--------—-------

сс а gcc

10801. ....

СТААТСТТААТАИСАГТТАТТААТАТАТАТТАТСТТТТС ДТАСАТТТТС а-с----g--------------g--------а----------г------1

1^1;аа с

10851. . . .

ТААСАААСАТТТАТАТТСАТААСАТСТТТТАТТТТССААС^аСАТАААТТ

-8с-

t

10901.

АТТСТТТТТСТТТТТТТТТТТИ1

ААТАА^

ГТТСАССААСТАТОССТСТТС

---1--- ----а------ ga---------а-(а)п

t

М146

10951----

ТСТСАТетСТТТТТ1ТСТС

выводы.

I. Проведен отбор генов тирозинаминотрансферазы из библиотек генов человека и крысы.

а) Сконструирован набор молекулярных зондов для изучеш.я регуляции стероидными гормонами экспрессии генов тирозинаминотранс-феразы и проопиомеланокортина крысы и человека.

б) Разработана оригинальная схема отбора клонов из библиотеки генов, основанная на использовании в качестве молекулярных зондов оцЦНК бактериофага М13.

в) Проведен отбор гена тирозинаминотрансферазы крысы из геномной библиотеки. Сделай первичный анализ отобранных клонов.

г) Проведен о'1бор гена тирозинаминотрансферазы человека из

геномной библиотеки.

д) Сконструироигл набор рекомбинантных ДНК со вставками, полностью перекрывающими ген TAT человека.

2. Впервые определила ножная нуклеотидная последовательность гена ТАГ человека. Суммарная длина полученной нуклеотпдной последовательности составляет IC0C3 п.н.

3. В результате компьютер него анализа нуклоотлдной последовательности гена TAT чел-, чекп с или Обнаружены:

a'i Три Alu - 110чторс* в нитроне № 3 и в нитроне К 10. 6 1 Лимер длиной 32 \ .клээ талых остатка в гнтроне № 6, состо-.яший из дьух выс> когомс.-'Л-кчншс мономеров, з каждом из которых имегея полностью! •:;.в11ал:>5жчя пуклеотрлная последовательность из h: 1-.,клеотидннх ocihnt^a.

в» Гри участка, по струкч.'/ре сайгам связывания глюко-

кплпкиид - рецепт* : ■''.(.плекса.

MHOtüHe репу .'iL..- ■, . ло.. еът. иии опублнксБам в следуших ра-

T'i

I- ¡1'!

зшп'биюп"' , I - лоска С.Я., Зеленин С.М., Каргинов К А., Лчвиьа Д.О., :.к ■ !. В., Ьондарь Л. А., Мертвецов И. П. Син-T'.'s :: fi,v-нии-ъизше ! ~:/;:.т;?ч;;нтарноП .->• - концевому участку

;.'чг;»1ч>И/Я ! НК тиргоин« . -чн^"-,«*« печени крысы // Известия СО 'Г, сир. ¿им. наук. ". I-!".;:. С. Л 2 - 125.

•'. об ленин . Мо| :i ),з и. Б., Тевс H.F., Горн В.В., Каргинов . "иэртвешш Н.П. 0-< о хина гигогинам! :чо'рансферазы из геном-itJi'i ■ „.-.диотски крчсы с гжгшьо молекулярных зенаов, сконструиро-Б'-'iiiii ла основе <5aKTvpnwWa MI3 - > Еиом^лимерн и клетка. 1989. Г.ь. л-. с. ;>:з - юо.

3. Moro/.ov 1.4. , jashln Y.P., Zeler:in .Т.Ч., Popova V.S., Mci-tv-it'j<yv H.P. Nucleotide . equsnoe of rat li"er tyrosine amino-« t'am.i'rrase gene fi-agmen". /, -".DNA sequi;: с in.? and Mapping. 1990. v. 1. - ic>< .

4. Зеленин C.M., 11« ikp:-. B.C., Морозю- И.В.. Тишков В.И., Егоров ч'.м., Мертв'.-4'iD Н.П. -.лределение пер*..*'1но;! структуры ZcoR I -фрагмента !(1 гека тир--: лкамннотрансфераэн крн-ч на автоматическом cet:i-.ч'п.г.р'с "Aj . I it d Oiosys tems 37СЛ" /. Бг<• >рганическая химия.

I991. T. 17. *7. С. 994 - 996.

5. Зеленин С.M., Мертвецов H.П. Нуклеотидная последовательность гена тирозинаминотрансферазы человека // Биоорганическая ХИМИЯ. 1994. т. 20. * 2. с. 196 - 204.

6. Mertvetsov N.P., Zelenin S.M., Morozov I.V., Mishin V.P., Bondar A.A., Karginov V.A., Chesnokov V.N. The structure and regulation of manmalian tyrosine aminotransferase and proopiomelanocortin gene // ISOZYMES: Role in Evolution, Genetics, Gene Mapping and Physiology. - World Scientific, 1994. - P. 71 - 82.