Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Устойчивость вируса ящура к воздействию физико-химических факторов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость вируса ящура к воздействию физико-химических факторов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК г: ■ ВСЕРОССИЙСКИЙ ШЧНО-ИССЛЩОаАГНЛЬСКйЗ ИНСШУТ

айШинАРйой ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

/'''*?' ^ - ' ■

На правах р/кописи УДК 576.858.43:577.3: 578.086.

ПОНОМАРЕВ. Алексей 1Ырович

УСТОЙЧИВОСТЬ ВИРУСА ЯЩУРА К ВОЗДЕЙСТВИЮ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

03.00*05;"Вирусология"

АВТОРВФВРАГ

диссертации на соискание ученой.степени *

докторе биологических наук

Покров - 1993 р.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ;

-КУЗНЕЦОВА Светлана Владимировна,доктор биологических наук;

-КОРОЛЕВ Михаил Борисович,доктор биологических наук;,

^-РЫБАКОЗ Сергея Сергеевич,доктор биологических наук. .

ВЕДУЩЕЕ. УЧРЕИЕНЛЕ:Институт эпидемиологии и микробиологии им.акад.Н.$.Гамалеи

• .

Защита диссертации состоится 17 марта 1994 гбда в 10 часов на заседании специализированного совете Д 120.61.ОХ. . по защите диссертация на соискание ученей степени доктора, наук при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (601120,г.Покров,ВладикирскоЯ области,ВНШЗВиМ),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " (9с2. 199ц г.

Ученая секретарь специализированного-совета,кандидат ветеринарных наук - Г.П.Федоров ., •

I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.Актуальность проблемы.Ящур относится к числу особо опасных вирусных заболеваний.продолжавший наносить серьёзный ущерб ,'кивогноЕОДству многих стран.Вакцинопрофилактика болезни ведется с применением препаратов,приготовленных.на основе инактивированного вируса.Перспектива получения высококачественных вакцин нового поколения неразрывном образом связана с- решением проблемы сохранения устойчивости вируса а также изыскания оптимальных я щадящих методов очистки, концентрирования и хранения вируссодержащего сырья.Условия переживания вируса ящура во внешней среде определяются различными по природе количественными' и качественными фактора-пи. У ровням количественных факторов соответствует числовая шкала и порядок уровней имеет определенная смысл.Количественные факторы имеют физико-химическую природу и представляют собой различные энергетические воздействия на агент: тепловое,электромагнитное,оптическое,ионизирующее и др.К качественным факторам следует отнести различные вещество и технологические процессы (Адлер О.П. и др.,1976).

Рассматривая совокупность условий существования виру-зов ин виво и ни витро,можно заключить,что пзрвостепеннув роло среди э*их факгаров играют температура и рН среды ^Макаров Б.В..Бакулов И.В.,197*0.Данные Бахраха (1957) по гер.чоинактивации вируса ящура,представленные в виде двух 1рямых. различного наклона,в различной интерпретации объясняются двумя механизмами реакции без раскрытия их сущности, 1 также рассматриваются как следствие гетерогенности вирус-т юй популяции.Литературные сведения по различному поведении »ируса ящура в кислой и щелочной зонах рН чаце всего ограждены константацией фактического материала без теорстичос-:осо объяснения фенойена разрушения вирусных структур.

В настоящее время научных, данных о расшифровке неханкэ-1ав инактивации вируса яцура при различных физкко-химиче-

ских воздействиях недостаточно.Отсуствие убедительного объяснения механизмов инактивации не позволяет определить пути сохранения устойчивости вирусных антигенов в соста-- ве противоящурных вакцин,а также на этапе культивирования вируса,технологических процессах очистки,концентрирования инактивации,высушивания и др.Одной из причин,объясняющих отсуствие убедительных данных о механизме сохранения структуры и свойств вируса при различных воздействиях являет' ся то,что известные модели строения вируса ящура (Узюмов В.Л. ,1972;—^ /.о/,/: ,1975) преимуществен-

но характеризуют архитектурное построение вирионов как изотропных структур,тогда как белковая оболочка вирусных частиц образована структурными'полипептидали с различными функциональными свойствами.

Перечисленные выше нерешенные вопросы указывают' на актуальность намеченных исследований,направленных на изучение механизмов^инактивации и стабилизации вируса ящура что является важной задачей при разработке и получении высококачественных вакцин и диагностических препаратов. 1.2.Цель работы.Основной целью настоящей работы является получение данных по морфологии вируса ящура с последующей разработкой.структурно-функциональной модели вируса ящура и на её основе рассмотрение механизмов инактивации вирусных структур при различных внешних воздействиях.

1.3.0с'йовные задачи исследования.В соответствии с поставленной цельо решались следующие задачи:

-отработка оптимальных условии получения препаративных количеств препаратов,содержащих преимущественно •частицы вируса ящура,и изучение молекулярно-биологинес-ких особенностей строения вирусных частиц различных типов вируса;

-изучение симметрии вирусных частиц и ^определение признаков асимметрии в их строении;

-построение структурно-функциональной модели вирио-нов.позволяшцей обосновать механизм инактивации вируса ' под влиянием внешних факторов;

-изучение некоторых механизмов инактивации вируса ящура под воздействием внешних фак»оров в процессе культивирования вируса в суспензии клеток ВШ-21 ,при образовании пе.ны в суспензии,при замораживании вируссодержашх суспензий,влиянии на вирус различных температур,высушивании вирусных препаратов,действии ферментов,специфических антител,химических веществ,электрического и магнитного полей. • л

1.*>.Научная новизна.Впервые разработан метод очистки и концентрированря вируса ящура с использованием ультрафильтрации с целы» получения концентратов вируса в обезвоженном состоянии с кратностью концентрирования от I ООО до Ю СОО крат (авторское свидетельство СССР !,'1102272), что позволило стандартизировать исходные условия опытов при проведении молекулярно-биологических,вирусологических и иммунобиологических исследований (авторские свидетельства СССР Н4И9177,»1565021 .и №161591?;.

Показана возможность получения различными способами поляризованных пленок-лодлодек для изучения строения вирусных частиц и их электрических свойств методом электронной микроскопии (авторские свидетельства. СССР..Ч45691, №469513.и 81639). •

Впервие показано наличие в структуре частиц вируса ящура признака асимметрии в виде дипольной структура, отражавшей, единство симметрии и 'асиммегрии.Существованиз дипольной электрической структуры обнаружено также у вируса .везикулярной болезни свиней и вируса Везикулярной -■экзантемы свиней,что может служить подтверадением'.обцей ~ закономерности строения РНК-содержйцих' вирусов- животных.. ^

Для каждого типа вируса ящура определены условия оптимального замораживания и хранения концентрированных суспензий с целью накопления полуфабрикатов вируса для изготовления противоящурных вакцин.Установлено,что оптимальные условия сохранения вируса ящура определяются выбором буферного раствора и рН суспензии,замораживаемой при температуре минус 10-й0°С.Показано,что метод ультрафильтрации в сочетании с криогенным измельчением мембраны с концентратом вируса может широко применяться при получении обезвоженных образцов с остаточной влажностью менее 1% при ¿охранении биологических свойств вируса.

. 1.5.Теоретическое значение-работы.На основании проведенных исследований установлено,что устойчивость вируса ящура зависит от сохранения природного базового свойства вирусных частиц - их электрического заряда.Определяющим фактором механизма инактивации вируса ящура является сообщение системе вириона дополнительной энергии,вызывающей изменение энергетического (электрического) состояния вируса,а следовательно и его функции.

Разработана и дана обоснование новой структурно-функциональной' модели- строения вируса ящура в виде электрофи-зиче<£кой блок-схемы.отражающей локализованное расположение структурных полипептидов б&лковой оболочки.

1.6.Практическая ценность работы.На основании проведенных исследований/разработан комплексный метод получения из суспензий кативного и; инактивированного вируса ящура концентрированных препаратов в обезвоженном порошкообразном состоянии,в составе которых вирус сохраняет свои биологические свойства в течение нескольких лет.

Б процессе работы по получению очищенных и концентрированных препа'ратов вируса разработаны и утверждены еле- , дующие методики,которые прошли комиссионные испытания и используются при молекулярно-биологических исследов'аниях

и получении биологических препаратов:

-"Методика получения очищенного и концентрированного антигена лапинизированного вируса ящура А^".Утверждена директором института ¿4.05.86 г.

-"Методика получения высокоочищенных суспензий вирусе ящура".Утверждена директором института.01.Об.83 г.

-"Методика получения высококонцентрированного вируса .ящура".Утверждена директором института 19*01.88.г.

-"Методика препаративного выделения 1463 частиц вируса ящура и их количественная оценка".Утверждена 'директором института 10.01.88 г.

По результатам исследования морфологического и молеку-лярно-биологического строения вируса ящура разработана следуокие методики:

-"Методика оценки количественного и качественного состояния вируса ящура с помощьо электронной-микроскопии". ■Утверждена директором института ¿5.12.87 г.

-"Методика изоэлектрического фокусирования балков вируса ящура*в полиакриламидном геле".Утверждена директором института 3i.0i.89 г.

Методики внедрены в лабораторную практику института и использовались также при получении концентрированных препаратов вируса яцура в промышленных условиях завода "ирьёвецветбкопрвпарат".Выполненные разработки вошли в технологические разделы ТУ на изготовление "Вакцины против ящура оиваленгной типа А,I) Сиз вируса,выращенного на кле тках БЩ-21)",утвержденных департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации С1992Л- • .

1.7.Основные положения диссертационной работы,выноси- , мые на защиту: _*..'.

, .' 1.7Л.Результаты .определения оптимальных условий очи* стки,концентрирования к выделения 1465 частиц вируса яаура с переводом последних в обезвоженное поровкообразнов.

состояние".

1.7.¿.Результаты электронно-микроскопических исследований строения вируса ящура по выявлению признака асимметрии в структуре вирусных частиц.

1.7.Результаты электронно-микроскопического изучения изменений электрофизического состояния вирусных частиц при различных внешних воздействиях.

1.7.4.Результаты исследований структурных особенностей вируса,ящура различных типов._

1.7.Ь.гезультаты проверки рН-зависимой устойчивости вируса ящура в составе очищенных суспензий,замороженных при температуре минус Ю+2°С.

1.7.6.Результаты обоснования структурно-функциональной модели отроения вируса ящура.

1.7.7.Результаты исследований механизмов инактизации виру-са ящура под воздействием внешних факторов в процессе культивирования-в суспензии шегок ВНК-21,при образовании пены в 'суспензии,влияния на вирус различных температур, высушивании вирусных препаратов,действии ферментов,специфических антител,химических веществ,электрического и магнитного полей.

1.8.Апробация рзботы.Оснбвные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета БНЯЯИ (1980-1990);на симпозиуме специалистов стран-членов СЭВ по проблеме-"Профилактика и эффективная борьба с ящуром,а также создание высокоэффективных противоящурйых вакцин"(1$81,г.Владимир);1У,У и У1 Всесоюзных ветеринар- ; ных вирусологических конференциях "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии" (1976,г.¿ладимир;г.Казань,1980Г г.Владимир,1990)¡Всесоюзной конференции "Разработка, апро-_ бация и государственный контроль ветеринарных препаратов

(1981, г. Москва); на восьми научных конференциях ВНИЯИ (1974-1966); на Всесоюзной научно-технической конференции "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине* (1990, г. Нижний Новгород); на международной научной конференции 'К новой стратегии борьбы с ящуром" (1991, г. Владимир).

1.9. Публикации результатов нссладаваннй. По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ. Получено 7 авторских свидетельств.

1.10. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 361 странице машинописного текста, включает введение (6 стр.), обзор литературы (48 стр.), материалы и методы (6 стр.), результаты исследований (194 стр.), обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения (37 стр.). Список использованной литературы вклю-чеет 233 источника на русском языке и 163 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 37 таблицами и 87 рисунками. В приложении (32 стр.) представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Вирусы. При проведении исследований использовали штаммы вируса ящура из коллекции ВНИЯИ, репродуцированные е организме крольчат и в культуре клеток ВНК-21:

- вирус ящура А£2 -550 - выделен от крупного рогатого

скота в 1964 году в колхозе им. Шаумяна, Азербайджанской ССР, Сальянского производственного управления;

- вирус ящура Азия-1 № 48 - штамм из музея института;

-8- вирус ящура С № 564/72 - "Закарпатский", выделен от крупного рогатого скота 08.10.72 г. в колхозе мм. Кирова, Закарпатской области, с. Чека, Виноградского района УССР; • вирус ящура 0} -№194 - 'Волгоградский", выделен в

1967 г.;

- вирус ящура Сат-1 № 96 - штамм из музея института;

- вирус ящура Сат-2 Кения (183/74} выделен в Кении в 1974 году, поступил из Пирбрайта 17.05.84 г.;

- вирус ящура Сат-3/3 Вес№а1еп<1 1/65 - выделен- в Африке в 1965 г., поступил из Пирбрайта в 1967 г.;

Другие вирусы, вызывающие заболевания с везикулярным синдромом:

вирус везикулярной болезни свиней штамм Т-75, адаптированный к монослойной культуре клеток 1В-Я8-2;

вирус везикулярной экзантемы свиней штамм А-4В, адаптированный к монослойной культуре клеток 1В-П8-2;

вирус везикулярного стоматита штамм Нью-Джерси и штамм Индиана.

2.1.2. Очистка вируссодержаших суспензий Очистку суспензий культурального и лапинизироеанного вируса ящура проводили в различных вариантах с использованием хлороформа, катионного флокулянта - анионита ВА-2, полиэтилен-имина и активированной кремневой кислоты. Применение последнего флокулянта изложено в описании авторского свидетельстве СССР № 1102272.

2.1.3. Концентрирование вируса ящура. Концентрирование вируса ящура и других вирусов, вызывающих заболевания с везикулярным синдромом, проводили в соответствии с методиками указанными выше.

2.1.4. Опцедепсииа содержания вирусспеииФическрго белка и компонентного составу вцрура Для определения содержания

вирусспецифического белка в суспензиях вируса ящура была использована методика количественной ИЖ,разработанная А.Ф.Бондаренко (1980).Сущность метода заключается в определении комплементсвязывающей активности вируссодержащего материала.в реакции.связывания комплемента,который в сочетании с методом зонального центрифугирования позволяет контролировать компонентный состав вируса. •

2.1.5.Титрование вируса ящура.Для определения инфекционной активности вирус ящура титровали на мышатах-сосунах ^-6-и дневного возраста и титр вируса выражали в ДД^д^ Образцы культурального вируса ящура титровали на монослой-ной культуре клеток свиной почки и титр вируса выражали в

$ ТЦ%0/мл-

2.1.6»0птический контроль содержания 146$ частиц в ' суспензиях вируса ящура.Оценку количественного содержания 146$ частицЬируса ящура проводили методом спектрофотомот-рии путем определения плотности градиента сахарозы после . фракционирования в нем вирусного материала.По кривой регистрации оптической "плотности определяли площадь соответствующую пику частиц.Концентрации частиц вычисляли сравнением со стандартной кривой (смесь дрожжевой 'РНК. 31? и белка -69%).На основа нетодики оптического контроля

разработанной С.¿.Рыбаковой и С.С.Рыбаковым (Т980) нами , выполнены некоторые усовершенствования данной методики, позволяющие не только осуществлять контроль вирусных препаратов,но. и получать препаративные количества препаратов содержащих преимущественно 1463 частицы вируса ящура.

2,1.7.Электронная микроскопия.При подготовке препаратов для электронно-микроскопических исследований использовали пленки-подложки,приготовленные о применением устройства защищенного авторским свидэтелвотвом СССР №69913. При исследовании количественного и качественного,а также

электрофизического состояния вируса ящура при различных воздействиях внешней среды препараты вируса наносили с использованием пленок-подложек поляризованных во внешне« электрическом поле или на поверхности кислого (щелочного) водного раствора.Кроме того,адсорбцию вирусных частиц на поверхность пленок-подложек проводили во внешнем электрическом поле, согласно описаниям изобретений №.445961 и В81639. .

Злектронно-микроскрпические исследования вируса ящура и других вирусов проводили на электронных микроскопах 1ЕМ-7 и 1ЕМ-100В при ускорявшем напряжении 80 кБ и 30000 -30000-кратном увеличении.Для фотографирования использовали фотопластинки для ядерных исследований типа МК и МР, а также штриховые репродукционные наивысшей контрастности,

2.1.8.Иетод вертикального гэль-электрофореза.Для опре. деления молекулярной массы структурных полипептидов вируса ящура концентрированные препараты,содержащие преимущественно 1465 частицы (0,5-0,8 мг/мл).регидратировали в диссоциирующем буфере и разделяли в полиакриламидном геле в присуствии додецилсульфата натрия на аппарате АВГЭ-1. Денсктометрирование полученных электрофореграмм осуществляли ^а регистрирующем приборе "Хромоск&н" (Великобритания)."

2Л.9.Метод изоэлекгрического фокусирования.Для иссле дования цзоэлектрических характеристик структурных полипе птидов вируса ящура концентрированные препараты.содержащие 1463 частицы (0,5-0,8 мг/мл),регидратировали в диссоциирующем буфере и разделяли в % ПМР в присуствии 8М мочевины,амфолинов рН 3-10 и рН 6-8.ТЭМЭД и персульфата ' аммония.Денситометрирование гелевых столбиков осуществляли на регистрирующем приборе "Хромоскан".

,2.1.1%.Определение белка в суспензиях вируса ящура' спектрофотометрическим методом.Для определения содержания

балластных белков в суспензиях использовали метод основанный на поглощении белков в ультрафиолетовой области (280 нм),который относится к простым и быстрым приемам контроля количества белка з неокрашенных суспензиях (Ю.А.Холин, ■и др.,1931).Измерения проводили в кварцевых кюветах толщиной 1,см на двухлучевом записывающем спектрофотометре модели ¿/У-260 ("Шимадзу",Япония).

2ЛЛ1.Определение остаточной влажности 'в сухих препаратах. Сущность -метода заклинается в определении уменьшения массы навески препарата после высушивания при*темпера-туре 105 С з течение I часа.Остаточную влажность концент-рат-порошков.содержатих вирус ящура,определяли в соответствии с ГОСТ 24061-89.

2.1.12.Быделениэ и оценка РНК вируса ящура.Бируснуи РНК выделяли детергенгно-фенольным методом о добавлением хлороформа по методике разработанной Н.А.Перевэзчиковой и др. (1986).Концентрацию РНК и степень освобождения от белков определяли измерением оптической плотности при 230,260 и 280 нм на двухлучевом записывающем спектрофотометре.Целостность РНК проверяли с помочью метода электрофореза в 1% агарозе (пластинчатый гель).

^-2.1.13.Статистическая обработка результатов опытов. При определении размеров вирусных' частиц проводили статистическую. обработку не менее 100 замеров.Размеры частиц определяли непосредственно с злектроннограмм с помоиьэ катетометра КМ-б (погрепность измерения +0,02 ни).В целях наглядности характера распределения размеров частиц строили гистограммы относительных частот.Границы доверительного интервала устанавливали с помощью коэффициента Стйен- ' та-прз заданной надежности Р=0,95.

• При определении статистической ошибки сродней арифметической величины титра вируса,а также при определении

уровня достоверности мезду сопоставляемыми опытными данными использовали методику,описанную Н.В.Садовским (1975).. 2.2.Результаты исследований 2.2.1.Получение препаратов,содержащих 146.5 частицы вируса ящура Изначальным условием проведения* молекулярно-биологичес-ких исследований по расшифровке механизма устойчивости вируса в различных условиях внешней среды является наличие гомогенных высококонценгрированных очищенных препаратов, содержащих 1463 частицы вируса ящура.Методологически процесс очистки,концентрирования и выделения 1465 частиц с учетом принципов системного подхода предусматривает выбор методов с определением их оптимального сочетания и взаимосвязи между собой.

При отработке метода в качестве вирусного сырья использовали тушки крольчат,инфицированные вирусом ящура.Ви-руссодержащие суспензии получали гомогенизацией целых или разделанных тушек крольчат на коллоидной мельнице в буфер- . ном растворе.'Очистку- вируссодержащих суспензий проводили с использованием хлороформа в соответствии.с общепринятыми методами.Для повииения степени очистки суспензий от белков и уменьаешя'потерь вируса за счет диссоциации комплексов "белок-вирусные частицы" перед.обработкой хлороформом к суспензии добавляли при интенсивном перемешивании 6-1%-кыЯ раствор активированной кремневой кислоты до конечной концентрации 0,12-и,14%.Результаты сравнительных опытов показали,что з суспензиях,очищенных с добавлением кремневой, кислоте .концентрация вирионов в 2-4 раза выше концентрации частиц в суспензии,очищенной только одним хлороформом.

Для выделения частиц вирус ящура концентрировали

в два этапа;ка первом или предварительном этапе вирус осаждали с помощь» ПЭГ,сущность данного метода заключается в

о

^ . -13-

том,что при раствЪрении в суспензии ПЭГ (7-10$) изменяются гидродинамические свойства|5елков .Изменение свойств белковых макромолекул сопровождается их флокуляцией.с "образованием' белковых комплексов,в состав которых включаются ■и вирусные частицы.При отстаивании или центрифугировании вирусные частицы соосаждавтся вместе с белком.Полученный белковый осадок ресуспендировали в буферном растворе в 1/10 от исходного объёма суспензии,так как при проверке кратности концентрирования было установлено,что потери вирусной массы при очистке концентрированной суспензии минимальны при объёмной кратности концентрирования 5-10 раз.Увеличение кратности концентрирования сопровождается существенными потерями вируса в пределах 30-7С#,что,по-видимому, обусловлено прочными связями вирусных частиц с белковыми комплексами,удаляемых в процессе очистки с помощью хлороформа.

На втором этапе концентрирования проводили сравнительное осаждение вируса из очищенных Ю-кратных концентратов методом ультрацентру.фугирования и методом ультрафильтрами.Концентрирование вируса методом ультрафильтращш осуществляли на установке типа ФМ-02—1000 с использова- * нием0полупроницаемой мембраны УМ-ЭОО о диаметром пор 254 А.Результаты опытов показали,что по эффективности, концентрирования вируса лщура оба метода равнозначны.Однако, для целей получение препаративных количеств, концентрированного вируса большего внимания заслуживает метод ультрафильтрации или мембранная технология,которая имеет существенные преимущества перед-другими мэгодвми по простоте исполнения и возможности осаждения вируса из боль-икх объёмов суспензии. ,• .

Основным недостатком данного метода является требование высокой степени очистки сусппнзий от баллсстных белков,что,по-видимому, послужило одной из причин задзржав-пих . . • •

разработку и внедрение данного метода при работе с вирусом яцура.Кроме того,в опытах с лабильными штаммами вируса отмечалась его инактивация при концентрировании методом проточной ультрафильтрации.

Факт инактивации,связанная с разрушением неинфекцион-иых 1463 частиц вируса ящура ¿22-550,был установлен щ-ми в опытах по концентрировании вируса из высокоочищен-аых суспензий методом проточной ультрафильтрации.В процессе концентрирования титр вируса и содержание балластного о елке. соответствовали кратности концентрирования, тогда как концентрация вирионов,определяемая с помощь» электронного микроскопа,оставалась на уровне исходной. Причиной явного несоответствия количества частиц до и поело концентрирования является разрушение вирионов за счет трения при движении частиц над поверхностью мембраны.

Полученные данные согласуются с данными литературы по инактивирувщему воздействип проточной ультрафильтрации на лабильные биоструктуры,что позволяет закличить об ограничении* воз можно стя;: данного метода при концентрировании вируса из высокоочщенных суспензий.В. связи с этим основное внимание в нашей работе было уделено методу концентрирования препаратов вируса ящура и других вирусов методом статической ультрафильтрации,исключающей активное перемешивание жидкости над мембраной.^ "

Для получения 10-и кратных концентратов вируса ящура предварительно очищенные суспензии обрабатывали 11УГ и затем после очистки их с помощь» хлороформа использовали для ультрафильтрации.Лроцесс статической ультрафильтрациии. веля при избыточном давления 0,2-0,4 Мпа-до полного перехода жидкости в ультрафильтрат с. образованием концентра- . , та вируса на.поверхности мембраны в виде гелеобразной пленки.Уатеи вирус элкшровала с мембраны в буферный раствор и получали ¿00-300-кратные концентраты,при суммарной

-15- '

потере вирусной массы не более 303». ■

. Основным недостатком данного метода является го, что полученный из большого объёма суспензии концентрат вируса практически невозможно сохранить длительное время в жидком состоянии.Использование, для .консервации и хранения сверхнизкой температуры жидкого азота не всегда доступно и экономически невыгодно,а замораживание очищенных концентратов при температуре -20г40°С сопровождается разрушением вируса,что исключает данный вариант хранения.

Простота и доступность основных технологических приемов* получения высококонцентрировакных препаратов вируса в форме гелеобразной пленки на поверхности мембраны и во зможность злпции вируса придают этому методу особую привлекательность. Эти факты послужиди основанном для определения условий сохранения вируса при замораживании мембраны с целью консервации и сохранения концентрата продолжительное время. *

-Для предотвращения разруаония вируса при замораживании использовали 20-30$ раствор сахарозы.Сущность метода проста и заключается в том,что по окончании процесса уль трафильтрации через мембрану с концентратом вируса пропускали раствор сахарозы.После этого мембрану извлекали из установки,помещали в фарфоровую ^ашку,приливали 50-70 мл жидкого азота и с помощью пестика растирали мембрану до поропкообразного состояния в течение 2-3 мин.Затем порошок переносили в стеклянный флакон и хранили при температуре, минус 10*-30°С. ' ■ ;

Полученные' впервые методом ультрафильтрации и криогенным измельчением порошки,содержание вирус ящура э концентрированном виДе.'былй названа нами для краткости как концентрат-порошки.Для. контроля вируса в составе концентрат-порошков последние;.регидратировали в буферном растворе рН 7,5-7,6,осветляли микрофильграцией через.стерилизующие • ...

мембраны типа ИМ №1 или №2 (Владипор) и-контролировали титр вируса,содержание общего виру специфического белка (ОВБ) и компонентный состав,

Проведенные опыты показали,что комплексная очистка с использованием ПЭГ и хлороформа позволяет получать суспензии культурального и лапинизированного вируса ящура с содержанием остаточного белка 10-50 мг/ь и пригодных для статической ультрафильтрации.Процесс ультрафильтрации проходит на молекулярном уровне с эффективным задержанием как целых вирионов.так и их структурных компонентов на поверхности мембран типа УАМ-ЗОО.^бО ио5С0 с диаметром пор соответственно равными 254,350 и 500 ¿..Насыщение мембраны-с концентратом вируса раствором сахароза предохраняет 'структуру вируса от разрунення при охлаждении мембран:.; в жидком азоте и последующим измельчении до порошкообразного состояния.Данный способ проверен также при концентрировании вирусов,вызывающих заболевания с везикулярным синдромом (ВБС.ВЭС и вирус везикулярного стоматита) .

Получение порошкообразных концентратов инактивирован-них антигенов вируса ящура имеет большую практическую значимость в плане создания резерва антигена для приготовления противоящурных вакцинЛами проведены опыты по получению конценграт-поропков,содержащих «¡¡активированный вирус ящура ¿22-^0 я с последующей проверкой ви-

руснах антигенов в составе вакцин.Концентрат-порошки с-антигеном вируса ящура ¿22-550 хранили до проверки в те'-ченио 2-х месяцев при температуре -196° и +б-8°С.Перед приготовлением вакцин обратное разведение в буферном, рао-творе составляло 5 700 раз.Вакцины готовили согласно инструкции и проверяли иммуногенну» активность на взрослых белых мыаах весом 19-22 г.Установлено,.что хранение

концентратов не влияет на компонентный состав инактивиро-санного » • г

вкруса,поскольку вакцины обладали равной иммуногенной активностью СИмД^ду^ равна 0,06+0,01 мл).Кроне того,к положительным сторонам данного метода относится следующее:

-в процессе ультрафильтрации вместе с ультрафильтратом уходят остаточные количества ииактивирувщего вещества,что позволяет получать антигены очищенные ве только от белков, но и посторонних примесей; .

-при регидратацни концентрат-порошков с 'заведомо известным содержанием вирусспецифического белка возможно получать антигены с эаренеэ заданном количеством Мб и частиц, как ¿оновных структурных компонентов,определяющих ихму-ногеннуи активность вакцин.

Основная задача настоящего раздела работы - это получение препаратов.содержания 1465 частицы вируса ящура была решена с использованием концентратов после регидратацни концентрат-порошков и их фракционированием в градиенте сахарозы с выделением фракций,содержащих 1465 частицы.Концентрацию 1465 частиц в фракциях определяли по площади пика соответствующей седшентограммы.Раствора сахарозы,содер,где,яь 1465- частицы,использовали для получения обезвоженных препаратов 1465 частиц методом статической ультрофильтриции.

Результаты контроля регидратированных концентрат-поро-иков 1465 частиц методом электронной микроскопии показали однороднув массу вириенов без признаков нарушения их морфология.Гомогенность препаратов была подтверждена так,те при контроле компонентного состава метолом количественной РСК. Проверка полипептидного состава вируса методой электрофореза в ПААГ показала,что на электрофореграштх фиксируотся основные структурные полипелтиды с молекулярной массой УР1 -"2б.5»-27.0.УР2 - 2б,0Ц6,5,и<Л>3 - 24,0*25,0 кД.Принес-ей б'елков не обнаружено,что характеризует достаточно высакил уровень очистки препаратов.

Относительно биологических показателей в опытах с лапинизированным вирусом ящура Азия-1 были получены кон- . центрат-порошки с титром вируса 13 ф -¡%о/мл титРе вируса в исходной суспензии 8,0^- Д%о/МЛ'Из данных концентрат-порошков после их регидратации были выделены 1463 частицы вируса с титром 10,5 ^ ДД^д^,которые после обезвоживания и перевода в порошкообразное состояние хранили при температуре минус Ю-30°С.

При концентрировании вируса ящура из вируссодержащих суспензий объёмом ,100 ли более отделение осадка после ПЭГ- проводили на проточном сепараторе "Альфа-Лаваль".Накопление осадка в шламовом пространстве сепаратора' и его сброс в приемную емкость позвол'яет получать концентрат вируса,который после соответствующей очистки использовали для подготовка большой серии концентрат-порошков указанными выше методами.

Полученные таким образом концентрированные препараты были использованы для"исследований строения и свойств вируса ящура-при различных физико-химических воздействиях с целью расшифровки механизма его инактивации.

^ 2.2.2.Электронно-микроскопические исследования, структуры вируса ящура-

Исследования структура вируса ящура в условиях негативного контрастирования (рН вирусной, суспензии 7,3-8,0 "и ■ рН раствора ФВК '6,8) позволяют наблюдать однородно окрашенные светлые вирионы на темном фоке контрастирующего вещества.Структурные компоненты вируса ящура в форме 75 и 125 частиц по морфологическим параметрам соответствуй? ■ их размерам и форме.в составе цедого вириона.Изменение конформации данных компонентов возможно наблюдать при... изменении солевого состава суспензии,например,при добвв- ^ лении хлористого цезия к суспензии содержащей 75, и 125

частицы.При этом толщина стенок шзсиды увеличивается в размерах,в 125 часгицы прибретают форму напоминавщуп шар. Морфологическую неоднородность целых вирионов возможно наблюдать после прогревания концентрированных суспензий при 3?°С в течение 43 часов я проявляющуюся различиями в размерах-частиц и заполнением полости белковой оболочки вирионной РНК:ядроРНК занимает вс» внутреннюю полость оболочки,часть - с видимыми фрагментами РНК и полное её -отсуствиз с.образованием "пустых" халсид.Данное наблюдение показывает,что полноценность вирионов определяется не только сохранением их внешних признаков целостности, но и количеством РНК в составе вирусных частиц.

При электронно-микроскопических исследованиях вируса ящура из концентрированных суспензий с рН 8,0-8;6 и контрастировании вирусных препаратов раствором ВФВК рНб,8 нами впервые была выявлена морфологическая закономерность в-строении вирусных,частиц,проявляющаяся наличием у вирионов "смешанного" контраста.Смешанный контраст характеризуется образованием у вирионов в данных условиях контрастирования одновременно позитивно и негативно окрашенных участков белковой оболочки,что соответствует положительно и отрицательно заряженным участкам поверхности частиц. Неравновссность распределения электрических'зарядов на поверхности вирусных частиц отражает асимметричность их строения.Позитивно окрашенный участок занимает 30-35£ поверхности вириона.

К.особенностям проявления смешанного контраста относится т?,что среди основной массы частиц с умеренно окрашенным позитивным участком просматриваются отдельные ви-р.ионы с интенсивно окрашенным позитивна» участком,По-ви-•димому,разделение вирионов по интенсивности контраста или по степени асимметричности определяется их структурно-функциональным состоянием,кодируемым структурными

. -20- ,. . • >/ полипептидами УР1,У?2 и У?3,экспонированными на поверхности частиц.В данном случае вириона проявляют, различную функциональную активность по отношению к контрастирующим анионам §ВК,которые взаимодействуя с белковой оболочкой обозначают участки поверхности вирионов,отличающиеся по . плотности электроположительного -заряда.Как следует из данных литература в структуре белковой оболочки положи- _ тельным знаком заряда обладает структурный пблипептид У?1 {раскисР-? ,19,32). ' ,

По результатам морфологических исследований вируса ящура и его структурных компонентов была построена объёмная модель строения вирионов,выполненная в форме;сфероида и образованного 60-ыо структурными субъединицами,расположенными в соответствии с икосаэдрической симметрией ка поверхности шара по диаметру соответствующему прбпор-ционально увеличенному диаметру вирионной РНК.На модели функциональные участки белковой оболочки окрашены идентично электронно-микроскопическому изображению вирионов. • Отличительной особенностью данной модели от известных является то,что она отражает признаки симметрии и асимметрии в строении.вируса ящура.

Морфологические изменения в структуре вирионов,свя- • заннае с состоянием смешанного контраста,выявляются при , воздействии на вирус различных внешних фактороа.При продолжительном хранении концентрированных суспензий вируса при температуре +4-6° и +26°С изменения в структуре вирионов вкраяаются появлением на фоне интенсивно окрашенло-го позитивного участка негативного локуса,который может занимать от I до 12% поверхности вириона.Б препаратах'. " после хранения при температуре +26°С негативные локусы просматриваются также и в структуре частиц с умеренно окрашенным позитивным участком.Изменения в структуре-по-* зитивно окрашенного участка мокко также наблюдать при

суспендировании и хранении вируса в растворе хлористого цезия с плотностью 1,8-1,9 г/см3,при продолжительном воздействии на вирус ПЗГ.Нарушение морфологического состояния вирусных частиц определенным образом связано с изменениями поверхностного электрического заряда,что возможно-связано с проявлением инфекционной активности вируса, значения которой при указанных выше воздействиях снижается на 1-3 порядка.

2.2.2.Г.Электронно-микросхопические исследования . ' электрофизических свойств вируса ящура«

Образование при контрастировании вирусных препаратов позитивно и негативно окрашенных участков поверхности ви~ рионов позволяет выделить в структуре вируса ящура явно выраженные полюса - участки различавииеся по характеру заряда.Характерной особгнносгьг поведения вирусных частиц в условиях Смешанного контрастирования является то, что частицы на подложке занимают преимущественно "боковое", положение по отноиенио к поверхности пленки-подложки.Боковую ориентации вирионов возможно объяснить фактом электростатического взаимодействия поверхностного заряда вирусных частиц с отрицательно заряженным слоем подсыхающего на подложке раствора ФВК. ;

При подготовке вирусных препаратов во внешнем электрическом поле установленогчто при действии униполярного электрического поля вйрусние частицы,расположенные на изолированной от электрода подложке,испытывают в жидкое-, ти вращающий момент.При испарении с подложки остаточных количеств §ВК вирусные частицы фиксируется слоем красителя, что позволяет при положительном потенциале наблюдать вирионы' с преимущественной ориентацией позитивным участ-'ком вверх.Результаты данных опытов подтверждавт дипольный характер распределения электрических зарядов на поверхности вирусных частиц.Бсди заряд поверхности возможно

..•■'• -22-оцакить визуально,то действие заряда РНК экранируется белковой оболочкой вириона.

При контрастировании концентрированных препаратов ви~ .руса ящура раствором калия кремневольфрамовокислсго были' получены электронные микрофотографии кристаллов соли, образующиеся на подложке при испарении жидкости.Кристаллизация солей на подложке сопровождается включением в состав кристаллов вирусных частиц в силу высокой концентрации вирионов на подложке.Внутри кристаллов отдельно ле-, , жащие вирионы сохраняют сферическую форму,а близксраспоч ложенные аступавт во взаимодействие с образованием агрегатов из 2-3-х и более частиц.Образование агрегатов происходит благодаря слияние оболочек вирионов.В структуре . некоторых агрегатов отмечается слияние внутренних ядер-РНК, которые на электронных микрофотографиях выглядят более светлыми по сравнению с оболочками.Механизм образования агрегатов из вирусных частиц обусловлен процессами происходящими при кристаллизации соли,в результате ^его' включенные в состав кристалла вирионы лишаются'своей защитной сольватной оболочки,что обнажает их полярные участки и создает условия для оффективного электростатического вфииодействия.Эффект слияния по своэму характеру•напоминает электрический пробой между заряженными частицами с образованйам связующих перемычек как между белковыми оболочками,так и между ядрами РНК,что воз'можно только при условии наличия противоположных знаков заряда данных структур. - . " "

Дальнейшее изучение, электрофизических свойств вирус- : ных частиц методом электронной микроскопии проводили с . ' использованием поляризованных пленок-подложек,которые получади как путем поляризации .пластиковой пленки на повер-» хности кислого (щелочного) водного раствора,так и поляризацией готовых плскок-поддожек во внешнем электрическом

поле.Электронно-микроскопическим путем установлено,что при адсорбции вирионов на "щелочной" подложке (положительно заряженной).полученной с поверхности водного раствора с' рН 9,0,в структуре полных вирионов отмечается деформация связей,сопровождающаяся увеличением размеров частиц до их предельного значения - 33+35 нм.В отдельных ви-рионах наблюдается отделение белковой оболочки от РНК и выход РНК через разрыв в оболочке.Более высокий электрический заряд поверхности пленки-подложки (рН водного раствора 11,0-12,0) вызывает разруиенив части вирионЬв на два структурных компонента:ядро РНК и фрагменты белковой оболочки.

Поляризация пленок-подложек на поверхности заселенного водного растворе придает ям лучшую адсорбционнуи способность по сравнении С подложками,полученными при нейтральном рН водного раствора.При высоком электрическом потенциале поверхности подложки часть вирионов разрушает ся до структурных компонентов в форме "скобок".Механизм электрофизического разруиения вируса ввязан с.возникновением' в структуре вирионов механических напряжений,что выбывает нарушение связей между структурными компонентами вирионов и их распад.

Распад вирионов от перезарядки вирионов в чистом виде можно наблюдать при контрастировании вирусных препаратов раствором 4*ВВ рН 3,0.-Одномоментное воздействие красителя с'разрушающим эффектом позволяет наблюдать распад белковой оболочки на составляющие её фрагменты при сохранении формы сферы.Среди продуктов раеттада отсуствует РНК в том виде,как.она фиксируется на электронных микрофотографиях 'при действии щелочной среды.

Разруиенив вируса под действием кислого рН среды общеизвестно и наиболее часто используется в целях его инактивации при дезинфекции.Однако разрушение структуры

вирионов возможно предотвратить предварительной поляризацией вирионов во внешнем электрическом поле.Электрообработка вирионов в составе вирусной суспензии сопровождается электроположительной поляризацией их поверхности,в результате чего при контрастировании препаратов раствором ФВК рН 3,0 поверхность вирионов полностью окрашивается . позитивно при сохранении их целостности.

При электронно-микроскопических исследованиях высококонцентрированных вируссодержащих суспензий возможно наблюдать паракристаллические скопления вирионов,которые в простейшем варианте,трактуются как следствие высокой концентрации вирусных частиц в препаратах.Использование для адсорбции зирионов поляризованных пленок-подложек переводит этот феномен из разряда случайных в закономерно воспроизводимые.Наблюдаемая упорядоченность при формировании паракристаллических скоплений гомогенных вирусных частиц, образующихся при определенных условиях (степень очистки, концентрация частиц,заряд поверхности пленки-подложки) позволяет заключить,что данные скопления следует рассматривать не как механические группировки частиц,а как системы, состоящие из отдельных подсистем (вирионов),связанных друг £ другом потенциальными силами.Адсорбция вирионов на ' поверхности пленки-подложки.поляризованной положительным "потенциалом,вызывает не хаотичное,в упорядоченное формирование паракристаллов .'Периодической вынуждающей силой в данном случае является электрическое поле жесткого дипольно го момента вирионов,проявляющееся во взаимодействии с заряженной поверхностью пленки-подложки.При многослойном скоплении первый слой упорядочение расположенных частиц является подложкой для зторого.который в свою очередь фо- : рмирует третий слой и т.д.,то есть на уровне второго и третьего слоев упорядоченность уже определяется межвирйон-ными взаимодействиями,что также подтверждает наличие

дипольного момента у вирусных частиц. • .

2.2.2.2.Электронная микроскопия других вирусов,вызывающих заболевания с везикулярным' синдромом

Исследование морфологии вируса везикулярной болезни свиней (8БС) осуществляли после очистки,концентрирования.! и разделения вирусных чаотиц в градиенте'плотности хлористого цезия.Фракции градиента о плотность» 1,338 г/см3,характеризующиеся максимальным титром инфекционном« содержали полные вирионы или 1505 частицы.Из фракций градиента с плотность» 1,324 г/см3 были выделены "пустые" капсиды,В идентичны« с вирусом ящура условиях нанесения и контрастирования вирусных препаратов в структура полных вирионов вируса ВБС Т-75 было выявлено наличие смешанного контраста, отражающего дипольний характер электрической структуры 1505 „частиц данного вируса.В структуре пустых хапсид .смеасшшй контраст не выявлен,что характерно и для пустах капсид вируса ящура.

Исследование морфологии вируса везикулярной экзантемы свиней (БЭС)'проводили после его очистки й концентрирования при контрастировании вирусных препаратов 4% раствором Й8К рН б,8.Частицы вируса ВХ имеют шарообразную форму с шиловидными структурами на поверхности.На плотном фоне контрастирующего вещества вирионы приобретают звездчатую форму с наличием позитивно и негативно окрашенных участков поверхности.При диаметре частиц вируса ВЭС 40 нм.позитивно окрашенный участок занимазт 15-20?'от всей поверхности вириона.Кроме того, среди вирионов о негативным контрастом встречаются единичные вирионы,в структуре которых просматривается интенсивно окрашенный позитивный участок.

Проведенные электронно-микроскопические исследования

показали,что обнаруженный нами феномен дипольной электрической

' ■ -26- -

структуры вируса ящура является также характерным признак ком структуры у представителя рода энтеровирусов - вируса ььи и у представителя рода калицивирусов - вируса ВЭО.что может служить подтверждением общей закономерности строения данных вирусов.,

'¿. Строение вируса ящура различных серотипов При изучении строения белковой оболочки вируса ящура использовали концентрат-порошки с содержанием 0,5-0,8 мг виру специфического белка в форме .1.465 частиц, которые после разрувеиия до структурных полипептидов исследовали методами электрофореза и электрофокусирования в ПАаГ.Результат и опытов показали незначительные различия в величинах молекулярной.массы структурных полипептидов между различными серогипами вируса ящура.

В процессе, изорлектрического разделения структурных полипептидов установлено,что основной структурный ПП УР1 для вируса ящура типов А^-Эзи, 1)^-194,Азия-1,С и Сат-2 Фокусируется в щелочной зоне рН.то есть является положительно заряженным.Структурные полипептиды уР2 и 7Р^ фокусируются в кислой зоне' рй и соответственно имеют отрицательный .знак заряда.Полученные ками данные согласуются с данными других авторов (П.лрушке и др.,1981;д.А.Шалско и др. Однако, на основании полученных >

данных провести сравнительную оценку вируса ящура различных серотипов затруднительно.Уто становится возможным при рассмотрении структуры вируса ящура в форме системы,состоящей, из отдельных блоков - заряженных структурных Ш1.

Электрический заряд целого вириона как параметр экстенсивности определяется суммированием электрических зарядов структурных ПП,формирующих белковую оболочку вирусных частиц.Суммирование электрических потенциалов соотве-* тсгвующих значениям р! для ПП УР1ДР2 и УРЗ с учетом их

полярности позволяет определить электрический потенциал целого вириона.Результаты расчетов показали,что вирус ящура обладает суммарным отрицательным зарядом различной величины и зависит от типа вируса.

Если величине pl структурных ПП соответствуют различные значения э.д.с.,то по величине электрического потенциала целого вириона можно решить обратную задачу - определить изоэлектрическую точку целого вируса.Для вируса ящура к,^ 550,обладающего суммарным электрическим потенциалом -48,7 мЬ,внешний электронейтрализующий потенциал соответствующий изоэлектрической точке должен быть равен +48,7 мВ.что соответствует pH 6,2,то есть для данного типа вируса р!=6,2 Среднее значение pl для указанных выше типов вируса ящура совпадает со значением pl (-5,7) .приведенным в монографии Х.Ререра (.1971),что подтверждает правильность проведенных расчетов.

Принимая во внимание поверхностное расположение заряженных групп белка в структуре вириона и,исходя из принципа суперпозиции,позволяющего оценивать действие системы фиксированных зарядов путем непосредственного сложения эффектов однотипных зарядов,возможно определить относительную величину поверхности вириона,приходящийся на соответствующий ПП.При расчетах результирующее поле целого вириона находили путем векторного сложения (без учета полярности) электрических потенциалов каждого ПП- и их сумму принимали за.100?.По вкладу каздого ПП определяли процент-' ные соотношения,приходящиеся на ПП УР1,УР2 и УУЗ.Йз полученных данных следует,что в зависимости от типа вируса ПП JPI занимает от Зи ^о Чй% поверхности вчриона.Эти данные совпадают с размерами позитивно окрашенного или положительно заряженного участка вириона при смешанном контрастировании и согласуотся ■ с данными литературы {ßexnu.icl,&-tc' icCaac/e ,iSi5) по определению относительных количеств

-28- ; • ... калсидньгх белков,полученных из анализа кривых распределе-- кия. радиоактивности СУР1=35,Ш. " .

На основании полученных данных можно., предположить,что в^рион как система,обладающая ограниченным и невоспол^няё-мым запасом электрической энергии,при изменении внешнего поля в результате фмико-химического воздействия часть энергии.теряет и эти потери,связанные с величиной его электрического заряда,определяет устойчивость вируса ящура.. Справедливость этого предположения подтверждается на прй^ мере'различной устойчивости в идентичных условиях внешней среды вируса ящура ^¿-551) и 0^-494,обладающих электрическим потенциалом соответственно равным -48,7 и г 89,3 мВ.то есть чем выше потенциал тем ниже устойчивость.Кроме того, известно,что в вирусной суспензии с рН 7,4-8,и внешний электронейтрализующий потенциал для вирусных частиц имеет значения от -24 до -76 мВ.Соответствие потенциала внешней среды по величине электрическому потенциалу вируса ящура А22~Ь50 способствует сохранении баланса электростатических связей в структуре вирионов и,как следствие,вирус 'обладает более высокой устойчивость!). • .

Фактически из этого положения следует,что для сохранения устойчивости вируса ящура необходимо полностью нейтрализовать положительный потенциал структурного Ш1 УР1 равным по величине внешним электрическим потенциалом»что возможно при переводе вирусных частиц в среду со щелочным значением рН.

2.2.ЭЛ.Устойчивость вируса ящура при различном .значении рН среды . .

В .соответствии с выдвинутой нами гипотезой устойчивое состояние вируса ящура 0-194 должно соответствовать рН

среды 6,2-8,З.Для проверки рН-зависимой устойчивости очи-ценные суспензии вируса яаурз 0Т-194 замораживали при

температуре минус Ю+2°С.Выбор метода замор-'..кивания обусловлен эффективным разрушением вируса при данной температуре в составе очищенных суспензий.

Результаты опытов показали,что при сочетании двух факторов: рН 7,6 очищенной вирусной суспензии и её замораживание вызывает разрушение более 90$ 1465 частиц и снижение титра вируса на три порядка,тогда как в диапазоне рН 8,3-8,6 титр вируса и содержание 1465 частиц сохраняется на уровне контрольного образца.Замораживание суспензий, содержащих инактивированный вирус ящура 0|-194 сопровождается разрушением основных структурных компонентов до 125 частиц при рН 7,5 ч сохранением 1465 частиц при рН8,3 -8,4.

йз результатов.данных исследований помимо подтверждения теоретических расчетов следуот и практические выводы, связанные с принципом стабилизации нативного и инактнвиро-ванного вируса ящура для целей длительного хранения,так как разрушение вируса в состава очищенных и концентрированных суспензий происходит на этапе замораживания.Феномен устойчивости вируса ящура 0^-194 был проверен с другими типами вируса,что позволило определить оптимальные значения рН при суспендировании вируса в 1/15 М ФБР.Для вируса ящура А22~550 оптимум рН в пределах 8,5-8,7,Азия-I - 8,4-8,б,Сат-1 - 8,2-8,4,Сат-2 - 6,5-8,7 и Сат-0 -8,28,5. . ' . ' ; •

Хранение препаратов вируса япура Азия-1-при температуре минус 40°С в течение года сопровождается разрушением 14б^и 75? частиц при рН 7,5,7,8 и 8,0.В образцах с рН8,4 содержание 1463 частиц сохраняется на уровне исходного незамороженного образца.Соответственно с разрушением частиц титр инфзкционкости вируса снижается.на 4 порядка,тогда как при рН В,4 титр вируса снижается с 8,5 до 8,0^-ТЩЦ0у

, -30-

Сохранение структуры и свойств вируса ящура при замораживании ^очищенных вируссодержащих суопензий при щелочном значении рН подтверждает электрофизическую природу разрушения вирусных структур как следствие.взаимодействия элек л . трического поля вирионов с градиентом внешнего электриче-. ского поля,возникающего на границе лед-вода (Л.Г.Качурин и др.,1967).Эффект устойчивости наиболее выражен при сус-пендировании вируса в буфере 5ТЕ или в фосфатном буфере , содержащем 0,5-1$ .сахарозы. _ '

2.2.Э.¿.Моделирование строения вируса ящура На основании выполненных исследований и данных литературы возможно заключить,что структура вируса ящура представляет собой сложную систему,состоящую из двух подсистем: РНК и белковой оболочки,последняя из которых состоит из отдельных блоков - полипептидов,различающихся по молекулярной массе,величине и полярности их электрического заряда. Существование структур в форме, целых вирионов и "пустых" капсид свидетельствует о том,что энергетические связи РНК -белок и белок-белок компенсируют эти различия с образованием функционально активного вируса.

Учитывая общую закономерность организации живых систем складывающейся из двух компонентов:организации структурной и организации функционнальной (В.А.Знгельгардт,1981) возможно представить структурно-функциональную схему организации вируса как системы.На рисунке изображена блок-схема организации вируса ящура как биосистемы.Из данной схемы следует,что от состояния структурной и функциональной организации вирусных частиц зависят основные свойства, ви-. руса ящура - его инфекционная и иммуногенная активность.- . Проявление инфекционной и лммуногенной активности вируса возможно при сохранении его устойчивости во внешней .среде. то.есть основные свойства вируса ииейг структурно-функциональную основу. _ "

Структурно-функциональная'блок-схеса организации • ' вируса ящура,как биосистемы.

•Взаимосвязь устойчивости вируса явдра с его структурной организацией -определяется влиянием внешних факторов на морфологическую структуру вирионов.В целях "сохранения * '. структурной .устойчивости целесообразно перевести варус-• ные частицы из жидкой среды в твердое порошкообразное

состояние и вирусные концентраты хранить при низкой тем- . пературе (-Ют-30°С),что позволяет существенно уменьшить величину энтропии,как меру внутренней неупорядоченности.

, При установлении взаимосвязи устойчивости вируса ящу-^ . ра с его функциональной организацией необходимо'акценти-» ровать внимание на энергетической компоненте в структуре вирусных частиц.устойчивость которых зависит от интенси- ■ вности обмена электрической энергией с микроокружением внешней среды.По-видимому,изменение электрического состо--~ ; * яния частиц вируса ящура под влиянием внешних факторов сопровождается частичной или полной потерей их функциональной активности.В частности это подтверждается сохранением структуры и свойств вируса ящура при замораживании очищенных вирусеодержащих суспензий при рН 8,2-8.7.

Вопросам детализации механизмов инактивации вируса при различных физико-химических воздействиях внешней среды псвеящйны отдельные разделы данной работы. ;

2.2.Изучение механизмов инактивации вируса

ящура при физико-химических воздействиях 2.2.4.1.Влияние среды суспендирования'на состояние 146* частиц вируса ящура

В процессе экспериментальных» $ технологических работ одним из факторов воздействия на вирус ящура является среда суспендирования.куда вирус переводится в результате тех или иных операций.В опытах Ао проверке влияния . среды суспёндирования использовала концентрат-порошки, содержащие 1465 частицы вируса ящура Азия-1,которые ре-гидратировеиш з ацетатном буфере,0,02 и 1/15 М ФБР,буфере ¿ТЕ',растворе Хенкса и среде Игла при общем значении" рН 7,5-7,6.

Результаты опытов показали,что .состав'исходной вирусной .

популяции изменяется в зависимости от среды суспендировав ния.Зто в свою очередь оказывает влияние на инфекционную активность вируса.В суспзнзии на ацетатном буфере отмеча ется снижение на 50$ абсолютного содержания 1465 частиц при одновременное превышении на 0,5 ^ .'ЦЦд^дТитрв вируса в аликвотных образцах регидратированных в среде Игла и А на растворе Хенкса ц т ^»^ ^ ^зо/мл в сУспенэиях яа сфатных буферных растворах.Превышение титра вируса в суспензии на ацетатном буфере свидетельствует о том,что в - процессе регидратации разрушаются неинфекционные 146>' частицы,как наиболее лабильные-и которые своим присуствием влияют на проявление инфекционной активности вируса.

В опытах п'о регидратации концентрат-порошков и после дующем прогревании суспензий при температуре 30°С установлено,что в сравнительном аспекте наибольшую стабильность проявляет вирус в суспензии на буфере '5ТЕ,растворе Хенкса и среде Игла.Стабилизирующий эффект данных растворов очевидно обусловлен образованием защитной сольватной оболочки вокруг вирионов,солевой состав которых способствует более полной нейтрализации полярных групп .вирусных частиц • по сравнению с ацетатным и фосфатными буферами. .

2.2,4.2.Влияние эемораживания-оттаивания на морфологию вируса ящура Известно,что вирус ящура- в определенных условиях обла-,дает устойчивостью к многократному воздействию .низких тем--ператур.При этом устойчивость значительно возрастает при • внесениичв вирусную сурпензию компонентов защитной среды. В патах по проверке^влияния замораживания на морфологию вирусных частиц использовали высЬкоочищенньгэ суспензии вируса ящура А22~550 с рН-7,5-7,7,образцы которых подверга-' ■ ли 5-и кратному замораживанию-оттаиванию при температуре.

жидкого азота.Контроль состояния вирусных частиц осуществ~ ляли

-34- ■ •

под электронным.микроскопом. '

Исследования показали,что после -замораживания/-вирусные суспензий на электроннограммах помимо двух основных типов частиц с интенсивно и умеренно Окраиенным позитивным учась тком появляются еще два типа частиц:частицы с негативно . окрашенной точкой на фоне .позитивного участка и частицы, измененное состояние которых выражено сменой контраста; белковой оболочки с позитивного на негативный.Изменения в структуре вирионов в данном случае выяцляю?ся по различной функциональной активности участков белковой оболочки по отношение к анионам $ВК,что отражается на характере, контраста позитивного участка.Нарушение электрофизической структуры отдельных вирионов не оказывает существенного влияния на их морфологические параметры:размеры и форму вирионов.При раздельном измерении с электроннограмм установлено .что размеры всех видов частиц находились в пределах 25,7+28,3 нм.

Контрольные опыты по замораживанию-оттаиванию концентрированных суспензий при температуре минус 10+2°С'показали наличие морфологических изменений в структуре сохранившихся вирионов,связанные с нарушением характера смешанного контраста:изменены размеры позитивно окрашенного участ ка и его форма.Часть вирионов разрушена до 12$ частиц.:

2.2.4.3.Термоинактивация вируса ящура При изучении устойчивости вируса ящура под воздействием природных факторов особая роль отводится температуре Это обусловлено тем,что температурный фактор является определяющим при- репродухции вируса,его хранении и аднак-тивации.Для исследования механизма Термоинактивации были проведены опыты по елиянию температуры на состояние 146$. частиц в суспензии и в составе концентрат-порошков'.'

. Опыты-по термоинактивации лапинизированного вируса ящура. ¿22-550 и Азия-1 показали изменения в качественном составе вирусной популяции в зависимости от температуры прогревания и определяемой соотношением в суспензии инфекционных и неинфекционных 1465 частиц.При увеличении прогревания до 45°С уменьшается относительное процентное содержание 146,3 частиц при сохранении титра вируса на уровне контрольного образца,что свидетельствует о разрушении неинфекционных 1463 частиц.Температура 55-60°С зазывает спонтанный распад полных вирионов и резкое снижение тит'ра вируса.

Снижение устойчивости вируса при повышении температуры суспензии от 4° до 45°С,по-видимому.связано с увеличением активности воды,влияющей на- состояние сольватноЯ оболочки вирионов,при нарушении которой наиболее лабильные частицы разрушаются.Првышение устойчивости 1465 частиц вируса ящура,прогребаемых з составе концентрат-поро-. вков.подтзерздавт причастность активности воды к 'разруае-- кии вирионов при нагревании суспензии до 45°С.

Прогревание концентрат-порошков при температуре 55- . 60°С помимо разрушения вирионной РНК вызывает расцепление основных структурных полипептидов белковой оболочки на более мелкие структуры.Появление-новых структурных белков с измененными йзоэлектрическими точками отражает • связь электрической компоненты вирусных'частиц с потерей их устойчивости,связанной с разрушением электретной структуры вирионов.На-причастность'электрегных свойств' биоструктур-»'изменению энергетических-параметров в зависимости от температур^-указывает в--13.С.Андреев и др.(Г987; • 1990).

.''• 2.2.4.4.Влияние высушивания на вирус ящура

Традиционно - задача получения обезвоженных препаратов

вируса решается о помощью метода лиофильного высушивания Б- нашей, работе проведены сравнительные опыты по получению обзвоженных препаратов методом ультрафильтрации и методом лиафильного высушивания. . *

Проведенные■опыты подтвердили известные сведения из литературы о повреждающем воздействии не вирус процесса лиофильного. высушивания замороженных образцов без защитной среди.Установлено,что добавление к суспензии коипонентов ••аиитной среды не обеспечивает сохранение инфекционной активности вируса ящура типа С на исходном уровне.Кроме " voro,данный метод отличается высокой энергоёмкостью.и большой продолжительностью обезвоживания образцов.

Обезвоживание вирусных суспензий методом ультрафильтрации позволяет сохранить титр вируса при минимальных потерях вирусной массы и при существенном сокращении времени получения концентрат-порошков.содержащих вирус ящура. . Основной недостаток получаемых концентрат-порошков,связанный с относительно высокой остаточной влажностью порядка ' 50-60$устраняется путем поэтапного удаления влаги методом активного вентилирования мембран с концентратом вируса, с последующим-досушиванием измельченного порошка мембраны в вакуумной установке.Биологические -гисты похазали, что оптимальное время подсушивания 'мембран с концентратом вируса остается в пределах одного часа при достижении остачочной влажности 0-10£.Дополнительное обезвоживание концентрат-порошков в вакуумно;! установке в течение часа позволяет получать сухие препарат« с остаточной-влажное-. Л'ью менее при сохранении биологических свойств вируса.

Относительно механизма инактивации вируса при высушивании следует отмстить,что разрушение вируса определяется условиями опыта:содержанием влаги в исходно;* препарате и • скорость» её испароиия.Б'условиях вакуума как в случав .пиофклького высушивания,так и в случае обезвоживания

концентрат-порошков при комнатной температуре в объекте испарения возникает интенсивный поток заряженных молекул воды,что вызывает появление локальных микротоков и соответствующих им электрических полей.Электрические процессы развиваются на диэлектрической основе при отсуствии эффективного разряда возникающих в -образце электрических потенциалов,что приводит их возрастанию до существенных значений и в конечном итоге вирус разрушается при взаимодействии заряженных вирусных частиц с внешним электрическим полем.Уменьшение скорости испарения воды при лиофи-льном высушивании,а следовательно и уменьшение повреждения вируса достигается внесением перед замораживанием з вирусную суспензии защитных добавок,обладавших способностью удерживать воду при испарении её .из замороженных образцов.Б случае обезвоживания препаратов.полученных методом ультрафильтрацни,уменьшение скорости испарения воды достигается путем поэтапного её удаления.Прямое испарение влаги из концентрат-порошков о остаточной влажностью 50-50$ о использованием вакуумной установки приводит к разрушению вируса.

2.'¿.4.5.Воздействие ферментов на вирус ятура Среди известных ферментов как фактор воздействия на структуру вируса ящура широко используется трипсин,вызывающий избирательное расаеплониз структурного полипзптк-да1 У?1.Нами проведены опыты по .изучении влияния- трипсина на структуру и свойства вируса.ящура типа С.

Б результате опытов установлено,что при воздействии . трип'сина в концентрации 2-3 мг/мл вирус.ящура торязт до 99% своай инфекционной активности при разрушении част . вирионов.В структуре сохранившихся вирионов наблюдай-■ ся морфологические изменения,связанные с их Э'лс:стрсфлз;!-ческим состоянием:нв положительно заряженном участка

-38- . . .. • •

белковой- оболочки появляется отрицательно заряженные лот*. ' кусы,лроявляещиеся как следствие действия трипсина на структуру полипрптида УР1.. .

Нами проведены также опыты'по определению кинетики * ■ инактивации вируса ящура типа С при активации ассоцииро- . ванной с вирусом эндонуклеазы.Для инактивации готовили активирующий буфер согласно данным $ссс/е£& ъ (1982),в ко- ' тором регидратировали концентрат-порошки,содержащие вирус' кщур;а, и затем вирусные суспензии выдерживали различное'" время при температуре 37°С с периодическим контролем рН, значение которого должно быть не менее 8,5.

'Из результатов опытов следует,что полная инактивация инфекционной активности вируса наступает через 18-20 часов экспозиции, при заданных параметрах.За это время в суспензии на 15-20$ уменьшается количество 146$ частиц. •Зыделение из образцов препаратов РНК и их коьтроль методом электрофореза показало,что в инактивированкыж препаратах РНК фрагментир'ована и находится в области клеточной РНК с константой седиментации На основании про-зеденных опытов можно заключить,что инактивация ассоциированной с вирионами эндануклеазамь не зависит от системы культивирования и является надежным методом получения авирулентных препаратов,так как деструкции подверга- . ется. только РНК при сохранении целостности полипептидов .белковой.оболочки.

2.2,'4.¿»Влияние специфических антител на вирус . • • • - ящура '..'.-.-

3 задачу настоящего, раздела работы входило изучение методом электронной .микроскопии характера взаимодействия. структурных ^компонентов вируса ящура с антителами класса о^р1,выделенными, методом аффинной, хроматографии".По результатам проведенных'исследований-по изучению механизма

г

нейтрализации вируса ящура специфическими антителами бы ли выявлены следующие особенности:

-взаимодействие вируса ящура'с гомологичными антителами сопровождается образованием агрегатов из вирусных частиц,что приводит к уменьшению титра вируса на 3-4 порядка против исходного значения без видимых деструктивных изменений в структуре вирусных частиц;

-произвольная ориентация вирионов в комплексах свидетельствует о взаимодействии антитед со всей поверхкос тыо вириона.что отражает характерный признак антител класса ^¿-(р'-гсл/? 1910)

-диссоциация комплексов антиген-антитело после прогревания препаратов при 37°С сопровождается функционал^ ными изменениями в структуре вирионов,выражаемых появлением негативных локусов на поверхности позитивно окрасы ного участка белковой оболочки вирионов.-По-видимому,распад комплексов и потеря инфекционной активности обусловлены измен&низм глектричоского заряда положительно заряженного участка поверхности вириона,являющегося сл-здст-• вием действия на вирус специфических антител.

2.2.4.7.Инактивация вируса ящура с помощью формальдегида Б наших опытах была принята классическая схема' инактивации, вируса ящура при различной концентрации-фориаль дегида от 0.025 до. 1%.Наибольший интерес з плане изучения механизма инактивации представляют, опыты, по влиянию но вирус.повышенной «концентрации формальдегида.Ниактира ция вируса ящура ¿¡>2-550 в суспензии с формальдегида . .вызывает-разрушение вирионов с образованием пустмх кап-'сид сизменбнными параметрами:при размахе варьирование в пределах 23-32 нм средний' диаметр'капсид составлял 27,5 нм при 2-х кратном увеличении толщины их стенок.

ч

Электронно-микроскопические исследования .формалинизирова-«кь:х капсид после года хранения при- тенпературе+44-б°С показали,что при сохранении' концентрации морфолЕЬия час-' тиц'отличается от первоначальной:исчезли признаки дефор- ч мадии стенок,диаметр капсид уменьшился до 24,5 нм при восстановлении размаха варьирования в пределах 2U-29hm.

Инактивация вируса ящура .0^-194 в суспензии с формальдегида вызывает разрупение 90-95J? вирусных частиц. Резрупение вируса возможно предотвратить воздействием на--вирусную суспензию в процессе инактивации постоянного электрического потенциала +4 000-5 ООО В.Действие внешнего потенциала позволяет задерживать распад вирионов во время инактивации и на короткий послеинактивационный период.При этом воздействие формальдегида на структуру Екруса проявляется увеличением среднего диаметра вирио-ков до 31 нм при размахе варьирования в пределах 26-36 н.ч.

По результатам проведенных исследований возможно заключать,что восстановление структуры капсид вируса ящуре Ii^-550 . и сохранение в экстремальных условиях инактивации целостности вирионов вируса ящура 0^-154 с приложением внешнего электрического потенциала является следствием участия электрических бил в сохранении устойчивости вирусных частиц.

2.2.4.6.Влияние образования пены в суспензии ■ ' на вирус ящура

Различные технологические .процессы при работе с в.иру-ссодерлсащики сусп1лт/гми сопровождаются ценообразованием для предотвращения которого-используют п'еногасители. ' Цольи'данного раздела работы било определение состояния вируса в условиях интенсивного -пекообразования суспензии-содс^^и^сп ij^ipyc яиур^.. ....

В опытах использовали очищенные и концентрированные ;

, -41-

суспенаии вируса ящура А.зия-1,образцы кстор.л подвергали воздушному барбогированию в аппарате типа ПБ-20.В условиях наших опытов процесс пенообразования сопровождался инактивацией части вирионов:разрушению подвергались преимущественно 755 частицы и небольшое количество 146Ь частиц,при уменьшении содержания, которых отмечалось некоторое увеличение ти!ра вируса.

При рассмотрении механизма повреждения вирусных структур в условиях интенсивц ого ценообразования,как гзкгора внешнего воздействия при механическом встряхивании,вибрации,перемешивании,воздухом барботировании вируссодер^са-щих суспензия следует отметить,что жидкая среда создазт между твердыми частицами своеобразную подвижную пространственную решетку.Ценообразование как процесс непрерывного возобновления поверзности раздела вода-воздух ломает установившуюся структурную решетку и соответственно воздействует на сольватную оболочку вирионов,что з своя очередь оказывает влияние на олектретнос состояние вирусных частиц. По-видимому, нарушение энергетического равновесия вызывает распад вирионов с недостаточно высоким уровнем собственной энергии.

2.2.4.9.Моделирование влияния на вирус ящура магнитной бури

В условиях внешней среды вирус ящура' может подвергаться воздействию переменных магнитных полей кач: искусственной, так и естественной природы.Для проверки возможного воздействия переменного' магнитного поля выполнены опыта по моделированию искусственной магнитной- бури в Флаконе с сухим концентрат-порошком,содержащим культуральный вирус ■ящура Ащия-1.Б флаконы с .концентрат-порошком помещали кусочки'феррита, которые при включении магнитной'мезал:« со-'зершали интенсивное хаотическое движение,сопровождаемо

не только перемешиванием порошка,но и витанием частйа в . замкнутом объёме флакона.

■Из результатов опытов следует,Что при воздействии искусственной магнитной бури в течение 18-часов при комнатной температуре титр вируса по сравнению с контрольны!« образцами уменьшался на один порядок с разрушением 50% 1466 частиц. ' 1

Относительно механизма .инактивации вируса ящура под_ Бездействием искусственной магнитной бури возможно предположить,что процесс движения частиц порошка с вирусом в магнитном поле сопровождался их дополнительной поляриза- . цией.Появление электрических потенциалов на порошке,как носителе вируса,оказывает влияние на заряженные вирусные частицы и;кек следствие,ослабляет их структуру,увеличивая тем .самым вероятность разрушения части вирионов при \ эгидрагации порошков в буферном растворе.

2.2.4.10.3лияние электрических полей на вирус ящура

Для проверки влияния внешних электрических лолей и подтверждения биоэнергетической концепции механизма инактивации вируса нами были проведены опыты по обработке сухих концентрат-порошков,содержащий культуральный вирус ящура СатЯ,униполярными электрическими потенциалами.

В результате прямого воздействия электрических полей изменяется качественный состав вирусной популяции.Положительный потенциал стабилизирует структуру вирионов,о чем ■ свидетельствует компонентный состав вируса до и после воздействия -Отрицательный электрический-потенциал, вызывает Сггижение содержание 1465 честиц ,в" суспензии с 64 до 25 £ пру. сохранении тигра .вируса на .уровне исходного, значения-, что позволяет заключить' о разрушении нзкНфекциоьных 1^63' частицах-отличаяииеся более лабильной структурой.

Данные опытов по прямому воздействию электрических

полей на вирус ящура в составе сухих концентрат-порошков сопоставимы с результатами опытов по электронно-микроскопическому исследовании вируса ящура 'г.ри нанесении вирусные препаратов на поляризованные пленки-подлокки и подтвержу-, дают биоэнергетическую концепцию механизма инактивации вируса ящура,обусловленную воздействием внешних физико-химических факторов на электрическую структуру вирионов.

2.2.4ЛХ.Влияние система культивирования на вирус ящура

В задачу настоящего раздела исследований входило изучение возможных причин повреждения вирусных структур в динамике их накопления в суспензии клеток ВНК-21,при инфицировании .последних вирусом ящура и вирусом типа 0^-194.Опыты по культивировании вируса ящура совмещали с серийным изготовлением полуфабрикатов вируса для лриготор ления лротивоящурных вакцин в условиях завода "Урьевецве!' биопрепарат".

В результате проведенных опытов установлено,что процесс репродукции вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21 . характеризуется взаимозависимым цикличным накоплением • 146 и 755 частиц.Взаимозависимый характер наработки клетками ВНК-21 структурных компонентов в форме 146 и 75$ частиц выражается зеркальной симметрией кривых накопления данных компонентов в суспензии и свидетельствует об онтогенетической природе происхлждения 755 частиц,как промежуточного продукта при формировании полных вирионов.В качестве практической рекомендации при получении вируссодер жащи* суспензий-для предотвращения.частичной инактивации вируса,связанной 'с влиянием клеточных ферментов,следует процесс культивирования останавливать при лизисе 60-о?^ •клеток. ч, '

-¡Й- • . '

Обобщая результаты исследований следует отметить,что . при выполнении работы были решены вопросы как прикладного, так и теоретического характера.Исследования структуры и . свойств вируса ящура,а также механизмов его-инактивации 4 были проведены-с использованием концентрат-порошков,что • позволило стандартизировать условия постановки опытов и получать воспроизводимые результаты.Согласование независимых- друг от друга фактов,подученных методами электронной -микроскопии и изофокусированием,отражающие наличие положи-" гельно' и.отрицательно заряженных компонентов в структуре - белковой оболочки»вирионов,соответствует общебиологической закономерности строения объектов живой природы,для которых характерна неравновесная электрическая поляризация (Блюме-нфельд,19б1;Кулин Е.Т.,1980;Протасов ¿.Р.,Сердюк O.A., 1982;Маскаремас С,1983).

Выявление в структуре вируса ящура признака асимметрии в виде неравновесного распределения электрических зарядов ' устраняет одностороннее представление о строении вируса как абсолютно сийметрично построенных вирусных частицах и характеризует нераздельное единство признаков симметрии-асимметрии в структуре I46S частиц вируса ящура.Моделирование строения вируса ящура на основе электрофизических параметров структурных компонентов вирусных частиц позволило экспериментальными данными подтвердить теоретические предпосылки сохранения устойчивости вируса при замораживании очищенных и концентрированных суспензий.Интерпретация данных, полученных при изучении механизмов инактивации вируса, укладывается в рамки электрофизической подели,основанной на природном базовом свойстве вирусных частиц - их электри- . ческом заряде.В соответствии с этим задача сохранения структуры и свойств вируса.сводится в основном к созданию уело* вий снижающих интенсивность обмена электрической энергией4 вирионов о михроокружением внешней среди.

-Л5-. ' 3.ВЫВОДИ

'3.1.Разработан комплексный метод очистки.концентрирован ния и выделения 1465 частиц вируса ящура в препаративных количествах,позволяющий с помощью ультрафильтрации и криогенного измельчения получать препараты нативного и инакти-вированного вируса ящура в обезвоженном порошкообразном состоянии с кратностью концентрирования от 1000 до I0C00 крат

3.2.Методом электронной микроскопии выявлена дипольная структура частиц вируса ящура,характеризующаяся наличием у вирионов смешанного контраста и проявляющаяся в процессе ориентации гирионов во внешнем электрическом поле,при формировании упорядоченных паракристаллических скоплений на поверхности поляризованных пленок-подложек из полных вирионов и пустых капсид,а также при образовании ассоциатов из вирусных частиц.

3.3.Признак асимметрии в виде неравновесного распределения положительно и отрицательно заряженных группировок а структуре белковой оболочки вируса ящура характеризует единство симметрии-асимметрии или единство структуры и функции в конкретных биоструктурах - 1465 частицах.Существование дипол^ной структуры обнаружено также у вирусов везикулярной болезни свиней и везикулярной экзантемы свиней,что может служить подтверждением общей закономерности строения данных вирусов.

3.4.Структурный полипепгид УР1 обладает!положительным,а полипептиды 7Р2 и УРЗ - отрицательным знаком' заряда.Суммарный электрический заряд целых вирионов характеризуется отри-цательной-'ве'личиной,которая имеет существенные различия у разных типов вируса 'ящура.

3.5.'Обоснованы два вида моделей,характеризующих структурную и функциональную организацию вирусных частиц.Струк.тур-

* ной организации соответствует модель из 60-и структурных'

-46- ;

субьединиц,расположенных в соответствии с симметрией икоса®, дра вокруг ядра РНК,а функциональной - электрофизическая мо дель в виде графической схемы,отражающей взаимное расположе ние. заряженных полипептидов в структуре белковой оболочки..*' -

3.б.Нейтрализация положительного заряда полипептида УР1 в зоне. рН 6,2-8,7 обеспечивает сохранение структуры и свойств вируса ящура при замораживании очищенных и концентрированных •вируссодержащих.суспензий. Изменения электрического заряда вирионов при воздействии различных физико-химических фа-' кторов "сопровождается разрушением вируса и снижением его биологической активности,что свидетельствует о взаимосвязи устойчивости вируса с его электрической структурой. .

3.7.7стойчивость вируса ящура при переводе вирусных частиц из твердого порошкообразного состояния в жидкую среду зависит от среды суслендирования и определяется составом со-льватной оболочки вокруг вирионов,которая взаимодействуя с полярными группами белковой ооолочки сгаомлмзируе* структуру вирионов.

3.8.Механизм термоинактивации вируса ящура в зоне температур от 4° до 45°С связан с влиянием активности воды.на состояние сольватной оболочки вирионов.Повышение температуры от 45° до 60°С сопровождается расщеплением структурных полипептидов белковой оболочки и изменением их изоэлектричес-кой точки. ' ' . ' ■

3.9.Отмечено,что на заключительном этапе культивирования вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21 происходит части чная инактивация,обусловленная влиянием ферментов клетки.Кинетика накопления структурных компонентов вируса в процерсе его репродукции свидетельствует об онтогенетической природе происхождения 755 частиц.

-474. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО РЕАЛИЗАЦИИ НАУЧБиХ ЕЫ8СДОВ "Предложения для научных целей.Для стандартизации исходных условий проведения опытов по изучению механизмов инактивации вируса ящура и получения воспроизводимых результатов нами разработана "Методика препаративного выделения 1465 частиц вируса ящура и их количественная оценка",которая в сочетании с "Методикой изоэлектрического фокусирования белков вируса в полиакриламидном геле" и-"Методикой оценки количественного и качественного состояния вируса с помощью электронной микроскопии" позволяет проводить моле-кулярно-биологическйе исследования вируса ящура при воздействий различных физико-химических факторов.

Для получения качественных электронно-микроскопических снимков частиц различных вирусов разработан способ' приготовления мелкозернистых пленок-подложек.Кроме того, разработаны способы получения поляризаванных пленок-под--лоз»ек для электронно-микроскопических исследований строения различных вирусов. ■ •

Предложения для использования в производстве биопрепа-' ратов.Выполненные разработки'вошли'в технологические разделы ТУ на изготовление "Вакцины против ящура бивалентной 'типа А,0 (из вируса.выращенного в клетках ВНК-21)".утвержденных департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации •Разработаны методики:"Методика получения очищенного и концентрированного антигена лапиниэированного вируса ящура ^22"получения высокоочищенных суспензий вируса ящура" и "Методика получения высококонцентрированного вируса, ящура" .которые позволяют проводить очистку и концентрирование с помощью"проточного сепаратора.получать концентраты вируса в обезвоженном порошкообразном состоянии,при ; годные для длительного хранения при низкой температуре с последующим использованием их в качестве посевного материала.Кроме того,замораживание очищенных и концентрированных

-46-

суспензий при щелочном значении рН позволяет получать посевной $ирус в удобном для применения' виде,а также, вести накопление-концентрированных полуфабрикатов вируса для . приготовления противоящурных. вакцин.и других биопрепаратов

5.СПИСОК ОСНОВНиХ РАБОТ,ОПУБШШШКЫХ ПО Т243 Д»1СС-Л5-ТАЦ1И

1.Улупов Н.А.»Моров 10.Б..Пономарев А.П..Молчанова А.Л. -Электронная микроскопия препаратов вируса ящура после ина ктивации формальдегидом и его нейтрализации//Ящур.Тем.сб. нау ч .-работ. Т. 2. -Владимир. 1975. -¡-С. 316-317.

2.Устройство для получения угольно-коллодиевых пленок-подложек:А.8.469913 СССР,И.кл.С- 0171/26 С 12 К 1/00,С 23 С 15/00/А.П.Пономарев,А.И.Молчанова,Б.А.Ларионов,Ь.Н.Лебедева (СССР).-3с.

. З.Устройсгзо для приготовления препаратов для электронно-микроскопических исследованиЯ:А.с.481639 СССР,М.Кл.С12 к 1/СО/А.П.Пономарев,А.И.Молчанова (СССР).-4с.

4,Способ приготовления вирусных препаратов для электронной микроскопии: А.с.445691 СССР.МДл.С 12К 1/00/А. П. Пономарев (СССР).-2с.

3.Котова М.В..Татаренко Г.К.,Майков Н.С.Долин Ю.А.,Пономарев А.П.-Физические и биологические свойства вируса ящура и его компонентов//Акт.вопр.вет.вирусол.Т.I.-Владимир, 1976.С.23-24. - .

б.Пономарев А.П..Молчанова А.И.,Узюмов В.Л.-Структура белковой оболочки вируса ящура//Вегаринария.-1577.-;ё9. С.39-42.

7,.Когова М.В. Долин А. .Пономарев А.П.,Татаренко Т.К. Узюмов В.Л.-Влияние хранения лапинизированного вируса на стабильность 1405 частиц при инактивации формальдегидом //Акт .пробл.вет. вирусол. -Владймир, 1978.С.-21-23.

8.Пономарев А.П..Молчанова-А.И..Коренная Н.С.-Изучение- структуры вируйа ящура. т.ипов А и 0//Акт.пробл.зет.ви-русол.-■Владимир,1978.С. 23-24.

9.Пономарев А.П..Молчанова А.Я.,Узюмов В.Л.-Влияние условий контрастирования растворами фосфорновольфрамо- ■ вой кислоты на-электронномикроскопическое изображение

вируса ящура//Вопр.вирусологии.-1979.КЗ.С.470-476. ' : .

10 Молчанова-АЛ.,Пономарев А.П.',Титов И Л!. .Дьячкова Т. П.-Влияние солей хлористого цезия на структуру вируса ящура/ /Акт. пробл. вег. виру со л: Тез. д'окл. -Владимир, 1980.0.48-49: П.Пономарев А.П.,Молчанова А.И.,Коренная Н.С.-Морфологическое сравнение вирува. ящура'типов А и 0//Акт.пробл. вет.вирусол.:Тез.докл.-Владимир,1980.С.42-43. ■ 12.Пономарев А.П.Электронномикроскопическое изучение • морфологических особенностей структурных компонентов ви-~ руса'ящура типов А и 0:Автореф.дис.канд.биол.наук.-Вла- ' цимир, 1980.-18'с.

13.Пономарев А.П..Молчанова-А.И.,Коренная Н,С.,Дьячко-ва Т.П.-О механизме действия кислого значения рН среды на структуру вируса ящура//Акт.пробл.вет.вирусол:Тез..докл.-Владимир, 1980.0.46-48. -..."'

. 14.Пономарев А.П..Ефимов Н.И.,Оковытый А.С.-Электрон-номикроскопическая оценка вируса ящура//Акт.пробл.вирусол Тез.докл.-БладимирД980.С.32-34.

15.Молчанова А.И.,Пономарев А.П.Дзюмов В.Л.-Сравнительное изучение лапинизированного вируса ящура типов Ли О //Акт.пробл.вег.вирусол.:Тез.докл.-Казань,.1980.С.127.

16.Пономарев А.П.,Гладилин Г.В.,Оковытый А.С..Ефимов

Н.И.-Корреляция мевду икмуногенностыо и массой вируса ящура, определяемой методом электронной микроскопии//Тез.докя Всесоюз.конф.",Разработка,апробация и госконтроль вет.пре-паратов"31 марта-2 апреля 1981 г.-Москва.1981.С.68-69.

17.Котова М.Б..ТатаренкоГ.К.,Пономарев А.П.Долин'Ю.А. •„ Мамков Н.С..Удалых М.Г. Дзюмов В.Л.-Свойства' белковых компонентов лапинизированного вируса' ящура//Ветеринария._-1981..'¿2'.С.34-37.. '

*< Д8.Котова М.В..Пономарев А.П.'Дзюмов В.1.,Татаренко Г* - к. Додин В.А.'-Влияние- формальдегида'на структуру: 1405 /час гиц лап'инизированйого вируса-яшура А22//СЭВ.Матера сими.

по пробл.Профилактика и эффективная борьба с ящуром... -Владимир,1981.С.57-62.

19.Пономарев А.П. .Молчанова А.И.Дзшмов 3. J.,-Изучение механизма повреждающего действия замораживания на вирус ящура//СЗВ.Матер.симп.по пробл.Профилактика и эффективная борьба с ящуром...-Владимир,1981.С.бЗтб8.

20.Пономарев А.П.,Молчанова А.И.,Узвмов В.JI.-Определение концентрации частиц вируса ящура в суспензиях//Ветери-нария. -1963. И. С. 22-24. J

21.Арутюнян Л.П..Пономарев А.П.-Влияние различных методов концентрирования на структуру и компонентный состав// Акт. пробл. вет.вирусол:Тоз.на'уч.конф. ВПИЛИ. -Владимир, 1963. С.43-45.

22.Пономарев А.П..Молчанова А.И.,Бодина H.A..Кравченко A.A..Дьячкова Т.П.-Очистка суспензий вируса ящура с применением полиэтиленгликоля для электронной микроскопии//Акт. пробл.вет.вирусол;Тез.докл.науч.конф.ВНЙЯИ.-Зладимир, 1983.С.35-37.

23.Способ очистки вируссодзржащей суспензии:А.с.II02272 С 12. 7/02/ Й.Б.Морев,3;Н'.Коропов,А.И.Дудников,А.П.Пономарев (СССР).-8с.

. 24.Пономарев А.П..Молчанова А.И,,Узюмов З.Л.-Электрические свойства вируса ящура//Биологические науки.-1984. №6.0.16-23

25.Пономарев А.П.Признаки симметрии й - .'асимметрии в структуре вируса яшура//Акт.пробл.вет.вирусол:Тбз.науч. конф.ЖШ.-Владимир,1986.С.4-6.

26.Штамм гибридных культивируемых клеток животных muscuius .используемый для получения моноклональных антител к.вирусу ящура А22:А.c.i489I77 СССР,AI,С 12- э/СО,

A6I К 39/42/ Т.Э.Неуман,Л.А.Глобэнко,Н.Л.Давыдова,А.П.По-. ночарев;В.»1.1£орашев ,Л.Н.Бурдов,Г.А.Худяков,М.Ю.Саарма.-Зс.

27.£тамм гибридных культивируемых клеток кивотных//%/5. mus сии/$ _ продуцент монооональны'х антител г. вирусу ящура 0-1618: А. с. 1565021 СССР,AI,С 12 5/00,5/02/ Л.А.Глобенко, Н.-Л.Давыдова,Т.Э.Неуман.М.Ю.Саарма.А.Н.БурдовД.Л.Пономарев Л.У.Маматкулова,Г.А.Худяков.-3 с.

2S.Андреева 0.Г. .Пономарев А.П.-Использование п<5*лиэти-ленгликоля для определения содержания 125 компонента в суспензиях вируса ящура//Ахт.пробл.вет.вирусол:Тез.докл. ■ на/ч.конф.ВШИ.-Владимир,1987,Т Л.С.60-61.

29.Чепуркин ¿.В., Лядский М.Н. Дрягалин Н.Н.Дотова М.Б. Пономарев А.П.-О некоторых факторах,влияющих на иммуноген-кость ящурного антигена//Акт.пробл.вет.вирусол:Тез.докл. науч.конф.ВЮШ.-Владимир,1987.Т.2.С.12-14.

30.Дудников А.И.,Майков Н.С..Савельев В.В.,Мищенко В. А., Еажко >-.А. .Пономарев А.П. .Кременчугская С.Р. .Базаров М.А., Пузанкова 0.С..Фомина Т.А..Нихалишин В.З.,Шипилов Б.И.- ч Адъовант:А.с.I6I59I7 СССР,А 61 Я 39/135,35/06.-12с.

31.Проник И.А..Пономарев А.П..Шоршнев В.И.,Боброва Т.В. Андреева О.Г..Пучкова Н.Г..Некрасов А.В.-Стимуляция специфического иммунитета антигеном вируса ящура,конвоированного полиоксидонием//К новой стратегии борьбы с ящуром:

И ежду на р.к онф.-Владим ир,1991.С.76-77.

32.Пономарев А.П.,Уземов В.Л..Соболева Л.П..Андреева О.Г.,Бодина Н.А.,Чугрова Л.К.-Электрофизические свойства структурных полипептидов вируса ящура и модель строения вирионов//К новрй стратегии борьбы с ящуром;Междунар.конф. -Владимир,Ï99I.С.I39-I4I.

33.Пономарев А.П..Смирнов В.И..Андреева О.Г.,Бодина Н.А.,Чугрова Л.К.-Культивирование вируса ящура А22 и 0-194 в промышленных, условиях//К новой стратегии борьбы с ящуром Мевдунар.конф.-Владимкр,1991.С.-100-102. .

"' 34.Пономарев А.П..Соболева Л.П...Андреева О.Г..Бодина Н.А.,УзЬмов В.Л.-Электрофизические свойства структурных ПП вируса ящура//Биологические науки.-1992.-№7.С.66-73.

. ..... У