Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы стабилизации и инактивации вируса ящура при воздействии физико-химических факторов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы стабилизации и инактивации вируса ящура при воздействии физико-химических факторов"

РГ6 од

I I /1ГЛ Ь^О

На правах рукописи УДК 576.858.43:577.

3:578.086

ПОНОМАРЕВ Алексей Петрович

МЕХАНИЗМЫ СТАБИЛИЗАЦИИ И ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСА ЯЩУРА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

03.00.06 "Вирусология"

У?

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Владимир , 1996

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных ( ВНИИЗЖ) МСХиП Российской Федерации

Научный консультант: УЗЮМОВ Василий Лаврентьевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РСФСР

Официальные оппоненты: ХРИПУНОВ Егор Максимович, доктор ветеринарных наук, профессор ( ВНИИВВ и М, г. Покров) МАКАРОВ Владимир Владимирович, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации ( Университет Дружбы Народов, г. Москва)

ОРЛЯНКИН Борис Григорьевич, доктор биологических наук, профессор (ВИЭВ, г. Москва)

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (п. Щелково, Московской обл.)

$ " 1996 г. в //

Защита диссертации состоится " О " (1//ц'Ццх|1(/ 1996 г. в // часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных МСХиП по адресу: 600900, Г.Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ.

Автореферат разослан " _1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета - В.А.Мищенко

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Вакцинопрофилактика ящура ведется с применением препаратов, приготовленных на основе инактивированного вируса. Промышленное производство вакцин связано с наработкой больших объемов вирулентного вируса, сохранение структуры и свойств которого имеет первостепенное значение при получении высококачественных вакцин нового поколения.

Создание вакцин нового поколения базируется на получении инак-тивированных антигенов вируса яшура в концентрированном виде, что вызывает необходимость определения условий сохранения устойчивости вируса на различных технологических этапах, связанных с репродукцией вируса в суспензии клеток ВНК-21, с очисткой вируссодержащих суспензий от балластных белков и сопутствующих веществ, с концентрированием вируса, его инактивацией, хранением, высушиванием и др.

Несмотря на то, что проблема инактивации вируса ящура принципиально решена на уровне ее практического применения при изготовлении противоящурных вакцин, имеет место целый ряд вопросов, касающихся расшифровки механизмов инактивации вируса ящура в различных условиях. Рассматривая условия существования вирусов in vivo и vitro можно заключить, что среди факторов влияющих на сохраняемость вируса первоочередную роль играют температура и рН среды ( В.В.Макаров, И.А. Бакулов, 1974).

По данным Бахраха (1957) термоинактивация вируса объясняется двумя механизмами реакции без раскрытия их сущности. Кроме того, указанные подходы не оказались продуктивными в плане сохранения устойчивости вируса ящура в зоне температур 15-55°С. Это подтверждается тем, что гипотеза о существовании двух различных механизмов термоинактивации - "нуклеинового" и "протеинового" не позволяет объяснить сохранение устойчивости антигенов вируса ящура, получаемых, например, методами сублимационной и распылительной сушки (Кравченко В.М. и соавт.,1983).

Литературные^ сведения по инактивации вируса ящура в кислой и щелочной среде чаще всего ограничены констатацией фактического материала без теоретического объяснения феномена разрушения вирусных структур. Следует также отметить, что известные из литературы сведения о механизмах инактивации

вируса ящура при воздействии внешних факторов различной природы нельзя считать убедительными, так как отсутствует единая теория этого явления. По-видимому, задачу поддержания активной и специфичной структуры вируса, то есть сохранение его устойчивости на этапах наработки вирусного сырья, очистки, концентрирования, хранения, инактивации, а также в составе противоящурных вакцин нельзя решить без феноменологического описания взаимосвязи между физико-химическими свойствами вирусных частиц и микроокружением внешней среды. При этом следует учитывать важнейшую особенность строения вирусных частиц как функционирующих биосистем, в структуре которых целесообразно различать структурный и функциональный аспекты организации вирусных частиц (Энгельгардт В.А., 1981). Иными словами, проблема сводится к определению коррелирующей взаимосвязи структуры вирионов с их функциональностью, основой которой является принцип накопления, хранения, реализации и утраты энергии вирусными частицами, как биосистем обладающих свойством живого только в потенциале (Bandea, 1983).

Перечисленные выше нерешенные вопросы указывают на актуальность намеченных исследований, направленных на изучение механизмов стабилизации и инактивации вируса ящура, что является важной задачей при разработке и получении высококачественных вакцин и диагностических препаратов.

1.2. Цель работы. Основной целью работы являлось изучение механизмов стабилизации и инактивации вируса ящура на этапах культивирования, очистки и концентрирования, хранении при различных температурах, воздействии внешних факторов различной природы, высушивании, изготовлении вакцин, а также изучение признаков симметрии - асимметрии в структуре 146S частиц вируса ящура.

1.3. Основные задачи исследований. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие вопросы:

-отработать оптимальные условия получения высококонцентрированных препаратов вируса ящура и на их основе получить препаративные количества 146S частиц для изучения строения, физико-химических и биологических свойств вируса ящура различных типов;

-установить возможные причины повреждения вирусных структур в динамике их накопления при культивировании вируса ящура в суспезии клеток ВНК-21 и изучить влияние рН на репродукцию вируса ящура и некоторых других вирусов животных;

-изучить влияние на структуру и свойства вируса ящура рН среды суспендирования, солевых и буферных растворов, высушивания вирусных препаратов, действия ферментов, специфических антител, химических инактивантов, электрического и магнитного полей;

-определить электрофизическую характеристику структурных полипептидов и целых вирионов вируса ящура различных типов;

-изучить признаки симметрии и асимметрии в строении 1463 частиц вируса ящура, вируса везикулярной болезни свиней и вируса везикулярной экзантемы свинер;

-обосновать механизм стабилизации и инактивации вируса при воздействии физико-химических факторов.

1.4. Научная новизна. Впервые разработан метод очистки, концентрирования, стабилизации и выделения 146Э частиц вируса ящура с получением их в препаративных количествах в виде обезвоженных концентрат -порошков (авторское свидетельство СССР №1102272), что позволило стандартизировать исходные условия опытов при проведении молекулярно-биологических, вирусологических и иммунобиологических исследований (авторские свидетельства СССР № 1489177, № 15650221 и № 1615917).

Определены условия повышения чувствительности клеток ВНК-21 к вирусу ящура, вирусу диареи КРС и аденовирусу КРС, свидетельством чему является ускорение темпа поражения клеток вирусом, что позволяет уменьшить вероятность модификации указанных выше вирусов в процессе их репродукции в суспензии клеток ВНК-21.

Впервые установлен режим стабилизации структуры и свойств вируса ящура различных типов при замораживании очищенных и концентрированных суспензий. Показано, что оптимальные условия сохранения вируса определяются выбором буферного раствора и рН суспензии, замораживаемой при температуре минус 10-40°С.

Установлено, что регулирование процесса удаления влаги из концентрированных препаратов вируса, достигаемое совмещением процесса концентрирования и обезвоживания вируссодержащей суспензии методом ультрафильтрации с последующим активным вентилированием мембраны с концентратом вируса и вакуумированием концентрат-порошка, позволяет получать препараты с остаточной влажностью менее 1% при сохранении биологических свойств вируса ящура.

Показана возможность использования метода электронной микроскопии для количественной экспресс-оценки нативных и инактивиро ванных антигенов вируса ящура, предназначенных для изготовления противоящурных вакцин. Разработаны различные способы получения поляризованных пленок-подложек для изучения строения вирусных частиц и их электрофизических свойств (авторские свидетельства СССР №445961, №469913 и №481639).

1.5. Теоретическое значение работы. На основании электронно-микроскопических исследований морфологии вируса ящура с использованием поляризованных пленок-подложек показано, что под воздействием электрического потенциала поверхности пленки-подложки в структуре белкового капсида вирионов происходят конформационные изменения. В зависимости от величины положительного электрического потенциала пленок-подложек (авторское свидетельство СССР №469913) конформационная перестройка может вызывать смещение изоэлектрической точки с р1 5,7 в объеме в сторону больших значений (ориентировочно р1 7,0-7,4) в монослое на поверхности пленок-подложек. Контрастирование вирусных частиц в их изоэлектрической точке, характеризующейся равенством противоионов раствора ФВК в адсорбционном слое заряженным группам на поверхности вирионов, позволило выявить признаки смешанного контраста в виде негативно и позитивно окрашенных участков белкового капсида. Наличие положительно и отрицательно заряженных участков поверхности 1465 частиц отражает асимметричность их строения. При более высоких электрических потенциалах как положительной, так и отрицательной полярности пленок-подложек конформационная перестройка белкового капсида сопровождается разрушением структуры вирионов на отдельные структурные компоненты.

В опытах по изоэлектрическому фокусированию белков вируса ящура установлено, что структурный полипептид УР1 заряжен положительно, а полипептиды УР2 и УРЗ - отрицательно, ассоциация которых в структуру протомера приводит к образованию асимметричного диполя. С учетом электрофизических параметров структурных полипептидов показано, что целые вирионы вируса ящура обладают суммарным электроотрицательным зарядом, величина которого существенно различается у отдельных типов вируса и обуславливает их различную устойчивость в идентичных условиях внешней среды.

Результаты исследований показали, что устойчивость вируса ящура зависит от сохранения природного базового свойства вирусных частиц - их

электрического заряда. Определяющим фактором механизма инактивации вируса ящура является сообщение системе вириона дополнительной энергии, вызывающей изменение энергетического состояния вируса, а следовательно и его функции. В частности это следует из того, что от состояния ионизации карбоксильных групп белковой оболочки вирионов или величины их электроотрицательного заряда, определяемого величиной рН среды, зависит устойчивость вируса при замораживании очищенных и концентрированных суспензий.

1.6. Практическое значение работы. На основании проведенных исследований разработан комплексный метод получения из суспензий нативного и инактивированного вируса ящура концентрированных препаратов в обезвоженном порошкообразном состоянии, в составе которых вирус сохраняет свои биологические свойства в течение нескольких лет.

Выполненные разработки вошли в технологические разделы нормативно-технической документации: "Временная инструкция по изготовлению и контролю универсальной и поливалентной вакцины против ящура типов А, О, С и Азия-1", утвержденная ГУВ 19 июня 1991 года; ТУ "Вакцина против ящура бивалентная типа А,О (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21) инактивированная", утвержденные директором института и согласованные с департаментом ветеринарии МСХиП Российской Федерации в 1995 году.

Показана возможность сокращения в среднем в два раза времени репродукции вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21, что имеет важное практическое значение в плане снижения производственных и энергетических затрат при наработке вируссодержащего материала для изготовления биопрепаратов. Кроме того, ускорение темпа поражения клеток вирусом значительно уменьшает опасность развития контаминации, причиной которой могут быть материалы и условия культивирования.

В процессе работы по получению очищенных и концентрированных препаратов вируса разработаны и утверждены следующие методики, которые прошли комиссионные испытания и используются при молекулярно-биологических исследованиях и получении биопрепаратов:

-"Методика получения высокоочищенных суспензий вируса ящура". Утверждена директором института 01. 06. 83 года;

-"Методика получения очищенного и концентрированного антигена лапинизированного вируса ящура А22". Утверждена директором института 24. 05. 86 года.

-"Методика получения высококонцентрированного вируса ящура". Утверждена директором института 19. 01. 88 года;

-"Методика препаративного выделения 1465 частиц вируса ящура и их количественная оценка. Утверждена директором института 19. 01. 88 года;

-"Методика подготовки посевного очищенного и концентрированного вируса ящура для культивирования в суспензии". Утверждена директором института 28. 12. 93 года.

По результатам исследований морфологического и молекулярно-биологического строения вируса ящура разработаны следующие методики:

-"Методика оценки количественного и качественного состояния вируса ящура с помощью электронной микроскопии". Утверждена директором института 25. 12. 87 года;

-"Методика изоэлектрического фокусирования белков вируса ящура в полиакриламидном геле". Утверждена директором института 31. 01. 89 года. Методики внедрены в лабораторную практику института и используются также при исследовании других вирусов животных.

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1.7.1. Результаты определения оптимальных условий очистки, концентрирования, стабилизации и выделения 146Б частиц вируса ящура с переводом последних в обезвоженное порошкообразное состояние.

1.7.2. Исследования по репродукции вируса ящура и некоторых других вирусов животных в зависимости от рН суспензии клеток ВНК-21, а также результаты проверки рН-зависимой устойчивости вируса ящура в составе очищенных суспензий, замороженных при температуре минус 10+2°С.

1.7.3. Результаты исследований механизмов инактивации вируса ящура под воздействием внешних факторов в процессе культивирования в суспензии клеток ВНК-21, влиянии на вирус различных температур, солевых и буферных растворов, при образовании пены в суспензии, при высушивании вирусных препаратов, воздействии ферментов, специфических антител, химических инактивантов, электрического и магнитного полей.

1.7.4. Исследования морфологических и молекулярно - биологических особенностей строения вируса ящура различных типов с выявлением признака

асимметрии в структуре вирусных частиц. Результаты исследований изменений в морфологии вприоно» при различных внешних воздействиях.

1.8. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета института в виде ежегодных отчетов по темам государственных заданий 8.1.-3.81. 7.2.2.-84. 12. 08 и 02.04.М (1980-1995); на симпозиумах специалистов стран-членов СЭВ (1981, г. Владимир; 1988, г. София); IV. V и VI Всесоюзных ветеринарных вирусологических конференциях (1976, г. Владимир; 1980, г. Казань; 1990, г.Владимир); на Всесоюзной конференции (1981, г. Москва): на восьми научных конференциях ВНИЯИ (1974-1988): на Всесоюзной научно-технической конференции (1990, г. Нижний Новгород); на республиканской конференции (¡990, г. Харьков); на республиканской научно-практической конференции (1993. г. Харьков); на международной конференции "К новой стратегии борьбы с ящуром"(1991, г. Владимир); на Всероссийской научно-практической конференции (1995, г. Владимир).

1.9. Публикации результатов исследовании. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ. Получено 7 авторских свидетельств.

1.10. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 429 страницах машинописного текста, включает введение (6 стр.), обзор литературы (49 стр.), материалы и методы (7 стр.), результаты исследований, выводы и практические предложения (271стр.). Список использованной литературы включает 253 работы на русском языке и 182 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 38 таблицами и 82 рисунками. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную н практическую ценность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы н методы

2.1.1. Вирусы. При проведении исследований использовали штаммы вируса ящура из коллекции института, репродуцированные в организме крольчат, культурах клеток ВНК-21.1В-Я5-2. ПСГК:

-вирус ящура А;:-550 - выделен от крупного рогатого скота в 1964 году в колхозе им. Шаумяна. Азербайджанской ССР. Сальянского производственного управления;

-вирус ящура Азия-1 №48 - штамм из музея института; -вирус ящура С I -564/72 - "Закарпатский", выделен от крупного рогатого скота 08.10.72 г. в колхозе им.Кирова, Закарпатской области, с.Чека, Виноградского района УССР;

-вирус ящура 0| -194 - "Волгоградский", выделен в 1967 году; -вирус ящура БАТ-! №96 - штамм из музея института;

-вирус ящура ЗАТ-2 Кения (183/74) выделен в Кении в 1974 году, поступил из Пирбрайта 17.05.84 года;

-вирус ящура БАТ-З Бечуаналенд 1/65 - выделен в Африке в 1965 году, поступил из Пирбрайта в 1967 году. Другие вирусы животных:

-вирус везикулярной болезни свиней штамм Т-75, адаптированный к монослойной культуре клеток 1В-113-2;

-вирус везикулярной экзантемы свиней штамм А-48, адаптированный к монослойной культуре клеток 1В-К8-2 и ПСГК;

-вирус везикулярного стоматита штамм Нью-Джерси и штамм Индиана; -вирус диареи крупного рогатого скота штамм Орегон; -аденовирус крупного рогатого скота первого серотипа.

2.1.2. Очистка вируссодержащих суспензий. Очистку вируссодержащих суспензий культурального и латинизированного вируса ящура проводили в различных вариантах с использованием хлороформа, катионного флокулянта -анионита ВА-2, полиэтиленимина и активированной кремневой кислоты. Применение последнего флокулянта изложено в описании авторского свидетельства СССР №1102272.

2.1.3. Концентрирование вируса ящура. Концентрирование вируса ящура и других вирусов, вызывающих заболевания с везикулярным синдромом, проводили в соответствии с методиками указанными выш<р.

2.1.4. Определение содержания вирусспецифического белка и компонентного состава вируса. Для определения содержания вирусспецифического белка в суспензиях вируса ящура была использована методика количественной РСК, разработанная А.Ф.Бондаренко (1980). Сущность метода заключается в определении комплементсвязывающей активности вируссодержащего материала в реакции связывания комплемента, который в сочетании с методом зонального центрифугирования позволяет контролировать компонентный состав вируса.

2.1.5. Титрование вируса ящура. Для определения инфекционной активности вирус ящура титровали на мышатах-сосунах 4-6-дневного возраста и титр вируса выражали в ^ ЛДя/«л. Образцы культур аль но го вируса ящура титровали на монослойной культуре клеток свиной почки и титр вируса выражали в ^ ТЦЦ

50/.«л.

2.1.6., Оптический контроль содержания 1463 частиц в суспензиях вируса ящура. Оценку количественного содержания 1468 частиц вируса ящура проводили методом спектр о фото метр ии путем определения оптической плотности градиеьгга сахарозы после фракционирования в нем вирусного материала. По кривой регистрации оптической плотности определяли площадь соответствующую пику 1463 частиц. Концентрацию 1465 частиц вычисляли сравнением со стандартной кривой (смесь дрожжевой РНК - 31% и белка - 69%). На основе методики оптического контроля, разработанной С.А.Рыбаковой и С.С.Рыбаковым (1980), нами выполнены некоторые усовершенствования данной методики, позволяющие не только осуществлять контроль вирусных препаратов, но и получать препаративные количества образцов, содержащих преимущественно 1465 частицы вируса ящура.

2.1.7. Электронная микроскопия. При подготовке препаратов для электронно-микроскопических исследований использовали пленки-подложки, приготовленные с применением устройства защищенного авторским свидетельством СССР №469913. При исследовании количественного и качественного, а также электрофизического состояния вируса ящура при различных воздействиях препараты вируса наносили с использованием пленок-подложек поляризованных во внешнем электрическом поле или на поверхности кислого (щелочного) водного раствора. Кроме того, адсорбцию вирусных частиц на поверхность пленок-подложек проводили во внешнем электрическом поле, согласно описаниям изобретений №445961 и №481639. Для контрастирования вирусных препаратов использовали преимущественно 3-4% растворы фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) рН 6,?.

2.1.8. Метод вертикального гель-электрофореза. Для определен^ молекулярной массы структурных полипептидов вируса ящура концентрированные препараты, содержащие 1465 частицы (0,5-0.8 мкг/мл), регидратировали в диссоциирующем буфере и разделяли в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия на аппарате АВГЭ-1.

Денсигометрирование полученных электрофореграмм осуществляли на регистрирующем приборе "Хромоскан" (Великобритания).

2.1.9. Метод изоэлектрического фокусирован™. Для исследования изоэлектрических характеристик полипептидов вируса ящура использовали препараты в виде обезвоженных концентрат-порошков, содержащих 146S частицы (0,5-0,8 мкг/мл), которые регидратировали в диссоциирующем буфере и разделяли в 5% ПААГ в присутствии 8М мочевины, амфолинов рН 3-10 и рН 6-8, ТЕМЭД и персульфата аммония. Денситометрирование гелевых столбиков осуществляли на регистрирующем приборе "Хромоскан".

2.1.10. Определение белка в суспензиях вируса ящура спектрофотометрическим методом. Для определения содержания балластных белков в суспензиях использовали метод основанный на поглощении белков в ультрафиолетовой области (280 нм), который относится к простым и быстрым приемам контроля белка в неокрашенных суспензиях (Ю.А.Холин и др., 1981). Измерения проводили в кварцевых кюветах (10 мм) на двухлучевом записывающем спектрофотометре модели UV-260 (Шимадзу, Япония).

2.1.11. Определение остаточной влажности в сухих препаратах. Сущность метода заключается в определении уменьшения массы препарата после высушивания при температуре 105°С в течение часа. Остаточную влажность концентрат-порошков, содержащих вирус ящура, определяли в соответствии с ГОСТ-24061-89.

2.1.12 .Выделение и оценка РНК вируса ящура. Вирусную РНК выделяли детергентно-фенольным методом с добавлением хлороформа по методике разработанной Н.А.Перевозчиковой и др., (1986). Концентрацию РНК и степень освобождения от белков определяли измерением оптической плотности при 230, 260 и 280 нм на двухлучевом записывающем спектрофотометре. Целостность РНК проверяли с помощью электрофореза в 1% агарозе (пластинчатый гель).

2.1.13. Статистическая обработка результатов опытов. При определении размеров вирусных частиц проводили статистическую обработку не менее 100 замеров. Размеры частиц определяли непосредственно с электроннограмм с помощью катетометра КМ-6 (погрешность измерения ±0.02 нм). В целях наглядности характера распределения размеров частиц строили гистограммы относительных частот. Границы доверительного интервала устанавливали с помощью коэффициента Стьюдента при заданной надежности Р=0,95.

При определении статистической ошибки средней арифметической величины титра вируса, а также при определении уровня достоверности между сопоставляемыми опытными данными использовали методику, описанную Н.В.Садовским (1975).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Получение пьггс:соке.чцентрировянных препаратов вируса ящура

Для исследований устойчивости вируса в различных условиях внешней среды необходимо наличие очищенных высококонцентрированных препаратов, содержащих преимущественно 1468 частицы вируса ящура. Процесс очистки, концентрирования и выделения 1465 частиц предусматривает выбор методов с определением их оптимального сочетания и взаимосвязи между собой.

При отработке метода в качестве вирусного сырья использовали тушки крольчат, инфицированные вирусом ящура. Вируссодержащие суспензии получали гомогенизацией целых или разделанных тушек крольчат на коллоидной мельнице в буферном растворе. Для очистки вируссодержащих суспензий применяли хлороформ (5-10% от объема суспензии). С целью повышения степени очистки суспензий от белков и уменьшения потерь вируса за счет диссоциации комплексов "белок - вирусные частицы" перед обработкой хлороформом к суспензии добавляли при интенсивном перемешивании 6-7%-ный раствор активированной кремневой кислоты до конечной концентрации 0,12-0,14%. Результаты сравнительных опытов показали, что в суспензиях, очищенных с добавлением кремневой кислоты, концентрация вирионов в 2-4 раза выше концентрации частиц в суспензии, очищенной только одним хлороформом.

Вирус ящура концентрировали в два этапа: на первом или предварительном этапе вирус осаждали с помощью ПЭГ (7-10%). Сущность данного метода заключается в том, что при растворении в суспензии ПЭГ изменяются гидродинамические свойства белков. Изменение свойств белковых макромолекул сопровождается их флокуляцией с образованием белковых комплексов, в состав которых включаются и вирусные частицы. При отстаивании или центрифугировании вирусные частицы осаждаются вместе с белковыми комплексами. Полученный осадок ресуспендировали в буферном растворе в 1/10

от исходного объема суспензии. Суспензию вируса после концентрирования дважды очищали с помощью хлороформа, используя для целей эмульгирования смеси или размельчитель тканей, или ультразвуковой дезинтегратор, или коллоидную мельницу.

На втором этапе концентрирования проводили сравнительное осаждение вируса • из очищенных 10-и кратных концентратом методом ультрацентрифугирования и методом ультрафильтрации. На ультрацентрифуге "Суперспид-65" (Великобритания) вирусные частицы осаждали при 100 000д на дно центрифужных пробирок в бакет-роторе 3x20 мл. Концентрирование вируса методом ультрафильтрации осуществляли на установке типа ФМ-02-1 ООО с использованием полупроницаемой мембраны УАМ-300 с диаметром пор 254А.

Результаты опытов показали, что по эффективности концентрирования вируса ящура оба метода равнозначны. Однако для целей получения препаративных количеств концентрированного вируса большего внимания заслуживает метод ультрафильтрации или мембранная технология, которая имеет существенные преимущества перед другими методами по простоте исполнения и возможности осаждения вируса из больших объемов суспензии.

Основным недостатком данного метода является требование высокой предварительной очистки суспензий от балластных белков, что, по-видимому, послужило одной из причин задержавших разработку и внедрение данного метода при работе с вирусом ящура. Кроме того, в опытах с лабильными штаммами вируса отмечалась его инактивация при концентировании методом проточной ультрафильтрации.

Факт разрушения неинфекционных 146Б частиц вируса ящура А22-550 и 0| -194- был установлен в опытах по концентрированию вируса из высокоочищенных суспензий методом проточной ультрафильтрация. В концентрированном препарате титр вируса и содержание балластного белка соответствовали кратности концентрирования, тогда как количество вирионов, определяемое с помощью электронного микроскопа, оставалась на уровне исходного образца. Очевидно, в процессе концентрирования происходит разрушение вирионов за счет сил трения при интенсивном движении частиц над поверхностью мембраны.

Полученные данные согласуются с данными литературы, что позволяет заключить об ограниченных возможностях данного метода при концентрировании вируса из высокоочищенных суспензий. В связи с этим основное внимание в нашей работе было уделено методу концентрирования

вируса ящура и других вирусов животных с использованием статической ультрафильтрации, исключающей активное перемешивание жидкости над мембраной.

Для получения 10-и кратных концентратов вируса ящура предварительно очищенные суспензии обрабатывали ПЭГ и затем, после их очистки с помощью хлороформа, заполняли установку для ультрафильтрации. Процесс статической ультрафильтрации вели при избыточном давлении 0,2-0,4 МПа до полного перехода жидкости в ультрафильтрат с образованием концентрата вируса на поверхности мембраны в виде гелеобразной пленки. Затем вирус элюировали с мембраны в буферный раствор и получали 200-300-кратные концентраты при суммарной потере вирусной массы не более 30%.

Однако, полученный таким образом концентрат практически невозможно сохранить длительное время в жидком состоянии без потерь биологической активности вируса. Использование для консервации и хранения сверхнизкой температуры жидкого азота не всегда доступно и экономически невыгодно, а замораживание очищенных концентратов при температуре минус 20-40°С сопровождается разрушением вируса, что исключает данный вариант хранения.

Простота и доступность основных технологических приемов получения высококонцентрированных препаратов в форме гелеобразной пленки на поверхности мембраны и возможность элюции вируса придают этому способу особую привлекательность. Эти доводы послужили основанием для определения условий сохранения вируса при замораживании мембраны с целью консервации и сохранения концентрата продолжительное время.

Для предотвращения разрушения вируса при замораживании использовали 20-30% раствор сахарозы. Сущность метода проста и заключается в том, что по окончании процесса ультрафильтрации й осаждении частиц на поверхность мембраны в установку заливали раствор сахарозы из расчета полного покрытия всей поверхности (20-30 мл). Затем в установке создавали избыточное давление и пропускали раствор сахарозы через мембрану с концентратом вируса. После этого мембрану извлекали из установки, помещали в фарфоровую чашку, приливали 70100 мл жидкого азота и с помощью пестика растирали мембрану до порошкообразного состояния в течении 2-3 мин. Затем порошок переносили в стеклянный флакон и хранили при температуре .минус 10-30°С.

Полученные впервые методом ультрафильтрации и измельчением в жидком азоте порошки, содержащие вирус ящура в концентрированном виде, были

названы нами для краткости как концентрат-порошки. Для контроля вируса в составе концентрат-порошков последние регидратировали в буферном растворе рН 7,5- 7,6 осветляли микрофильтрацией через стерилизующие мембраны типа МФА № 2 ( Владипор). В полученной суспензии определяли титр вируса, содержание общего вирусспецифнческого ( ОБВ) и компонентный состав вируса.

Результаты опытов показали, что комплексная очистка с использованием ПЭГ и хлороформа позволяет получать суспензии культурального и лапинизированного вируса ящура с содержанием остаточного белка 10-50 мг %, пригодных для статической ультрафильтрации. В процессе ультрафильтрации на поверхности мембран типа УАМ-300, 460 и 500 с диаметром пор соответственно равными 254, 350 и 500 А эффективно задерживаются как целые вирионы, так и их структурные компоненты - 75 и 125 частицы. Насыщение мембраны с концентратом вируса раствором сахарозы предохраняет структуру вируса от разрушения при охлаждении мембраны в жидком азоте и последующим измельчении до порошкообразного состояния. Данный способ проверен также при концентрировании вирусов, вызывающих заболевания с везикулярным синдромом (ВВС, ВЭС и вирус везикулярного стоматита).

При концентрировании вируса ящура из вируссодержащих суспензий объемом 100 литров и более отделение осадка после ПЭГ проводили на проточном сепараторе "Альфа-Лаваль". Накопление осадка в шламовом пространстве сепаратора и его сброс в приемную емкость позволяет получать концентрат вируса, который после соответствующей очистки использовали для подготовки большой серии концентрат-порошков указанными выше методами.

Нами проведены также опыты по получению концентрат-порошков, содержащих инактивированный вирус ящура Агг-550 и 0| -194 с последующей проверкой вирусных антигенов в составе вакцин. Концентрат-порошки с антигеном вируса ящура Агг-550 хранили до проверки в течение 2-х месяцев при температуре минус 196°С и плюс б-8°С. Перед приготовлением вакцин концентрат-порошки регидратировали в буферном растворе в соотношении 1/3700. Вакцины готовили согласно инструкции и проверяли иммуногенную активность на взрослых белых мышах массой 19-22 г. Установлено, что хранение концентратов при различных температурах не влияет на компонентный состав инактивированного вируса и вакцины, приготовленные из данных преппаратов, обладали равной иммуногенной активностью (ИмД 50/мл равна 0,06+0,01 мл). Кроме того, к положительным сторонам данного процесса относится следующее:

-в процессе ультрафильтрации через мембрану уходят низкомолекулярные белки и остаточные количества пнактивирующего вещества, что позволяет получать антигены с более высокой степенью очистки;

-при репщратации концентрат-порошков с заведомо известным содержанием вирусслецифического белка возможно готовить антигены с заранее заданным количеством 146 и 75S частиц, как основных структурных компонентов, определяющих иммуногенную активность противоящурных вакцин.

2.2.2. Получение препаратов, содержащих 146S частицы вируса ящура

Высококонцентрированные препараты вируса ящура, получаемые при регидратации концентрат-порошков, содержат все основные структурные компоненты вируса: 146, 75 и 12S частицы. В связи с этим перед нами стояла задача получения препаративных количеств высокоочищенного вируса, содержащего преимущественно 146S частицы. Это объясняется не только тем, что препараты высокой чистоты имеют непреходящее самостоятельное значение в сугубо научном плане, но и в целях более четкого установления механизмов инактивации вируса, а также выявления новых свойств агента (Г.Г.Девятых, Ю.Е.Еллиев, 1981).

В опытах с лапинизированным вирусом ящура Азия-1 №48 были получены концентрат-порошки, после регидратации которых з буферном растворе и осветления суспензии через стерилизующий микрофильтр титр вируса был равен 11 !g ЛД 5о/мл. На ультрацентрифуге ОТД-65 в градиенте сахарозы 5-20% данный концентрат вируса фракционировали в течение 1,5 часа при 27 ООО об/мин. Затем градиент сахарозы сканировали через проточный спектрофотометр с выделением и сбором фракций, содержащих 146S частицы, концентрацию которых определяли по площади пика соответствующей седиментограммы. Раствор сахарозы, содержащий 146S частицы с титром вируса 9,5 lg ЛДзо/ил использовали для получения обезвоженных препаратов 146S частиц методом статической ультрафильтрации.

Результаты контроля регидратированных концентрат-порошков 146S частиц методом электронной микроскопии показали однородную массу вирионов без признаков нарушения их морфологии. Гомогенность препаратов была подтверждена также при контроле компонентного состава вируса методом

количественной РСК. Проверка полипептидного состава вируса методом электрофореза в ПААГ показала, что на электрофореграммах фиксируются основные структурные полипептиды с молекулярной массой VP1 - 26,5-27,0, VP2 -26,0-26,5 и VP3 - 24,0-25,0 кД. Примесей белков не обнаружено, что характеризует достаточно высокий уровень очистки препаратов. Полученные таким образом концентрированные препараты были использованы для исследований влияния различных физико-химических факторов на структуру и свойства вируса ящура с целью изучения механизмов его инактивации.

2.2.3. Изучение механизмов инактивации вируса ящура при физико-химических воздействиях

2.2.3.1. Репродукция вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21

В задачу настоящего раздела исследований входило изучение возможных причин повреждения вирусных структур в динамике их накопления в суспензии клеток ВНК-21 при инфицировании последних вирусом ящура Ац-550 и Oi -194. Опыты по культивированию вируса ящура совмещали с серийным изготовлением полуфабрикатов вируса для получения противоящурных вакцин в условиях завода "Юрьевецветбиопрепарат".

В результате проведенных исследований установлено, что репродукция вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21 характеризуется взаимозависимым процессом образования 146 и 75S частиц. Взаимозависимый характер наработки клетками ВНК-21 структурных компонетов в форме 146 и 75S частиц выражается зеркальной симметрией кривых накопления данных компонентов в суспензии, что свидетельствует об онтогенетической природе происхождения 75S частиц, как промежуточного продукта при формировании полных вирионов. В качестве практической рекомендации при получении вируссодержащих суспензий для предотвращения частичной инактивации вируса, связанной с влиянием клеточных ферментов, следует процесс культивирования останавливать при лизисе 80-85% клеток.

2.2.3.2. Влияние рН на репродукцию вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21

Влияние рН на чувствительность первичных культур клеток почек поросят и почек телят к вирусу ящура было ранее показано в работах Г.А.Кудрявцевой и соавт., (1979) и Patty (1971). В наших опытах для репродукции вируса ящура использовали перевичаемую культуру клеток ВНК-21, выращенную в суспензии по общепринятой методике в стеклянных и металлических ферментерах объемом 5, 25, 50 и 250 литров. Выращивание клеток проводили на культуральной среде РС-ЗМ, приготовленной на растворе Эрла с включением в состав среды сухого гидролизата белков крови в концентрации 0,15% (А.С.Оковытый и соавт., 1986) и 5-7% сыворотки КРС, очищенной с помощью ПЭГ по методике разработанной М.В.Котовой и соавт. (1991).

При культивировании клеток в ферментерах увеличивающегося объема в последовательных пассажах концентрация клеток колебалась в пределах 1,5-3,0 млн/мл после 48-72 часов их размножения при рН 6,8-7,4. Для определения влияния рН на репродукцию вируса ящура по окончанию культивирования клеток в суспензии изменяли рН с 6,7-6,8 до 7,6-7,7 добавлением гликоколового буфера. Затем отключали термостат и магнитную мещалку. Подачей охлажденной воды в ферментере поддерживали температуру 13-15°С и клетки отстаивали в течение 1820 часов. После этого из ферментера удаляли до 90% ростовой среды, рН которой уменьшалась до 7,1-7.3. Концентрат клеток разводили поддерживающей средой с рН 7,4-7,5 до плотности клеток 2,5-3,0 млн/мл. При этом количество живых клеток в суспензии сохранялось на уровне 95% и более.

Перед заражением клеток вирусом в ферментере поднимали температуру до постоянного значения 37°С и вносили вирус в дозе 0,01-0,2 ТЦЦ so на клетку. Культивирование вируса вели без подачи воздуха при поддержании рН суспензии в пределах 7,2-7,5 периодическим добавлением гликоколового буфера.

Результаты исследований показали, что продолжительность репродукции подтипов вируса ящура А22, Aj , Oi и SAT-1 составляла от 8 до 13 часов. Для одного подтипа вируса время репродукции определялось дозой заражения: при дозе 0,16 ТЦДзо на клетку вирус SAT-1 поражал 90% клеток за 9 часов, а при дозе 0,1 ТЩЬо на клетку за 10 часов.

В данных условиях опытов подтип вирус ящура SAT-2 отличался наиболее коротким временем репродукции - 6-S часов, а при дозе заражения 0,5 ТЦД so на

клетку через 5 часов культивирования в суспензии оставалось менее 10% живых клеток. Выход ОВБ для указанных выше подтипов вируса был равен в среднем 1 мкг/мл из расчета на 1 млн/мл клеток при содержании от 60 до 85% 146 и 75Э частиц от общей массы вирусспецифического белка при титре вируса 7,5-8.5 1й

ТЦД 50/мл*

В опытах с подтипом вируса ящура БАТ-З время репродукции составляло от 9 до 13 часов и выход ОВБ в среднем был равен 1,5-1,6 мкг/мл на концентрацию клеток 1 млн/мл. Например, при концентрации клеток в суспензии 2,4 млн/мл накопление ОВБ было равно 4 мкг/мл при наличии 46% - 1465 частиц, 20% - 755 частиц и 34% приходилось на 12Б частицы. При этом титр вируса был равен 7,5 ^ ТЦД 50/мл-

В контрольных опытах отстаивание клеток проводили при рН соответствующей конечному этапу культивирования клеток, значение которой чаще всего находилось в слабо кислой области и в процессе отстаивания клеток смещалось до 6,4-6,5. После смены среды в суспензии сохранялось в среднем около 80% живых клеток. При заражении клеток вирусом в дозе 0,5 ТЦД на клетку время репродукции вируса колебалось в пределах от 18 до 24 часов. Содержание ОВБ в суспензиях составляло 0,5-1,0 мкг/мл при титре вируса 7,0-8,0 ^ ТЦД 5о/*л.

Таким образом, экспозиция клеток ВНК-21 в суспензии с исходным значением рН 7,6-7,7 и конечной 7,1-7,3 с ресуспендированием клеток в среде с рН 7,4-7,5 позволяет сохранить количество жизнеспособных клеток на уровне 95% и повышает чувствительность клеток к различным подтипам вируса, о чем свидетельствует эффективное заражение клеток вирусом в дозе 0,01-0,2 ТЦД зо на клетку при сокращении в среднем в два раза времени его репродукции.

Данный феномен, по-видимому, обусловлен тем, что изменение рН суспензии клеток до постоянного значения 7,6-7,7 и инкубация клеток при физиологическом значении рН не только стандартизирует исходные условия подготовки клеток к инфицированию вирусом, но и позволяет сохранить полярность трансмембранного потенциала клеток, что положительно сказывается на размножении вируса. Культивирование вируса с переводом клеток из слабо кислой среды в слабо щелочную непосредственно перед инфицированием их вирусом вызывает изменение полярности трансмембранного потенциала клеток, что, очевидно, является основной причиной снижения чувствительности клеток к

заражению вирусом и, соответственно, более продолжительному времени его культивирования.

В соответствии с описанной выше технологией нами были проведены опыты по культивированию в суспензии клеток ВНК-21 вируса диареи КРС и аденовируса КРС. При заражении клеток вирусом диареи через 11-12 часов после инфицирования концентрация живых клеток уменьшалась и составляла 10-15% от исходного количества, что указывало на окончание процесса культивирования вируса. По результатам контроля было установлено, что вирус диареи КРС накапливался в суспензии с титром 7,5-7,75 lg ТЦД зол« и активностью в РСК 1:16. В контрольных опытах данный вирус культивировался в течение 22-24 часов.

При культивировании аденовируса КРС для заражения использовали посевной вирус, который вносили в суспензию так же как и вирус диареи из расчета 0,3-0,5 ТЦД so на клетку. Через 12-13 часов после заражения в суспензии было поражено вирусом 85-90% клеток. Результаты контроля показали, что при титре вируса 6,0-6,5 Ig ТЦД тш антигенная активность в РДП была равна 1:321:64. В контрольных опытах при инкубации клеток в слабо кислой среде при прежней дозе заражения время репродукции аденовируса составляло от 24 до 28 часов. При титре вируса 6,0 lg ТЦД soли антигенная активность в РДП 1:4-1:16.

Проведенные исследования показали, что процесс наработки вирусов животных существенно активировался при инкубации клеток ВНК-21 в слабо щелочной среде и последующем культивировании вируса в среде с рН 7,2-7,5. Говорить о точном механизме такой активации пока затруднительно, так как данный феномен малоизвестен в отечественной и зарубежной литературе. Относительно механизма усиления репродукции альфавирусов в слабо щелочной среде О.П.Жирновым (1986) выдвинуто несколько гипотез, по одной из которых основной механизм связан с активацией внутриклеточных этапов репликации вирусных макромолекул.

Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что при размножении вирусов в суспензии клеток ВНК-21 одним из важных факторов является рН, определяющая оптимизацию условий выращивания вирусов с целью повышения качества противовирусных вакцин и диагностических препаратов. Это обусловлено тем, что-повышение чувствительности клеток позволяет уменьшить вероятность модификации вируса, так как в клетках с низкой чувствительностью только небольшая часть вирусной популяции способна репродуцироваться при условиях отличающихся от оптимальных (Patty, 1971). Кроме того, ускорение

темпа поражения клеток вирусом не только снижает производственные и энергетические затраты, но и значительно снижает опасность развития контаминации, причиной которой могут быть материалы и условия культивирования, что позволяет свести к минимому потери при наработке вируссодержащего материала.

2.2.3.3. Устойчивость вируса ящура при различном значении рН среды

Для проведения исследований были подготовлены концентрат-порошки культурального вируса ящура 0|-194. В целях уточнения влияния различных значений рН среды суспендирования на интактный вирус аликвотные навески концентрат-порошков регидратировали в ФБР с рН 7,6, 8,0 и 8,6. Результаты контроля показали, что при рН 8,6 титр вируса не снижается , а в отдельных опытах отмечалась тенденция к его повышению относительно образцов с рН 7,6.

В опытах по определению рН-зависимой устойчивости регидратированные и осветленные микрофильтрацией суспензии вируса ящура замораживали при температуре минус 10+2°С. Выбор данной температуры обусловлен эффективным разрушением вируса при замораживании очищенных вируссодержащих суспензий.

Результаты опытов с вирусом ящура О) -194 показали, что при сочетании двух факторов: рН 7,6 вирусной суспензии и ее замораживание вызывает разрушение более 90% 146Б частиц и снижение титра вируса на три порядка, в то время как в диапазоне рН 8,3-8,6 титр вируса и содержание 1463 частиц сохраняется на уровне контрольного незамороженного образца.

Феномен рН-зависимой устойчивости был проверен в опытах с другими подтипами вируса ящура, что позволило определить оптимальные значения рН при суспендировании вируса в 1/15 М ФБР и его последующем замораживании. Для вируса ящура Агг-550 оптимум рН в пределах 8,5-8,7, Азия-1 №48 - 8,4-8,6, БАТ-1 - 8,2-8,4, ЗАТ-2 - 8,5-8,7 и БАТ-3 - 8,2-8,5.

Сохранение и разрушение вируса ящура при замораживании очищенных и концентрированных суспензий при различном значении рН позволяет предположить, что механизм устойчивости обусловлен соответствием структуры среды структуре объекта - вирусным частицам. Различия в структуре среды при различном значении рН относительно суспендированных в ней вирусных частиц

определяется величиной электрического потенциала, который при рН 7,6 равен минус 36 мВ, а при рН 8,6 равен минус 96 мВ. По-видимому, разрушение вируса при замораживании является следствием взаимодействия различных по величине электрических потенциалов вирионов и градиента электрического поля на границе лед-вода (Л.Г.Качурин и соавт., 1967). Сохранение вируса определяется совпадением по знаку и величине заряда вирионов и внешнего поля на границе лед-вода, что возможно при наличии у вирионов отрицательного электрического заряда. Эффект устойчивости вируса наиболее выражен при суснендирОБапии вируса в буфере БТЕ или фосфатном буферном растворе содержащем I% сахарозы при указанном выше оптимуме рН.

2.23А. Влияние среды суспендирования на состояние 1465 частиц вируса ящура

В процессе экспериментальных и технологических работ одним из факторов воздействия на вирус ящура является среда суспендирования, куда вирус переводится в результате тех или иных операций. В опытах по определению влияния среды суспендирования использовали аликвотные навески концентрат-порошков 146Б частиц вируса ящура Азия-1 №48, которые регидратировали в ацетатном буфере, 0,02 и 1/15 М ФБР, буфере 5ТЕ, растворе Хенкса и среде Игла при общем значении рН 7,5-7,6.

Результаты опытов показали, что состав исходной вирусной популяции изменяется в зависимости от среды суспендирования. Это в свою очередь оказывает влияние на инфекционную активность вируса. В суспензии на ацетатном буфере отмечается снижение на 50% содержания 1465 частиц при одновременном повышении титра вируса'на 0,5 ^ ЛД ¡оып против титра вируса в суспензиях на растворе Хенкса и среде Игла и на 1,0 ^ ЛД ¡ош против титра вируса в суспензиях на фосфатных буферных растворах.

Сопоставление данных по титру инфекционности и содержанию в образцах структурных компонентов вируса свидетельствует о том, что показатель титра вируса связан с качественным составом вирусной популяции, определяемой соотношением инфекционных и неинфекционных 1465 частиц. Для данной серии опытов максимальная инфекционная активность вируса отмечается в образцах на ацетатном буфере при минимальном относительном процентном содержании 1465 частиц. Возможно предположить, что процесс регидратации концентрат-

порошков сопровождается воздействием на вириокы их сольватного комплекса, вызывающего в суспензии на ацетатном буфере разрушение неинфекционных 146 Б частиц, как наиболее лабильных, которые своим присуствием влияют на проявление инфекционной активности вируса.

Наиболее благоприятные условия для сохранения структуры 1465 частиц формируются при регидратации концентрат-порошков в буфере БТЕ, растворе Хенкса и среде Игла. Стабилизирующий эффект данных растворов, очевидно, обусловлен защитной сольвагной оболочкой вокруг вирионов, солевой состав которой способствует более полной нейтрализации полярных групп вирусных частиц и сохранению их устойчивости.

2.2.3.5. Термоинактивация вируса ящура

При изучении устойчивости вируса ящура к воздействиям различной температуры были проведены исследования влияния на состояние 1465 частиц вируса различных типов в суспензии и в составе концентрат-порошков.

Опыты по термоинактивации лапинизированного вируса ящура Аи-550 и Азия-1 №48 показали зависимость качественного состава вирусной популяции от температуры прогревания, определяемого количественным содержанием в суспензии инфекционных и неинфекционных 146Б частиц. При увеличении температуры прогревания до 45°С уменьшается относительное процентное содержание 1463 частиц при сохранении титра вируса на уровне контрольного образца, что свидетельствует о разрушении неинфекционных 146Б частиц. Температура 55-60°С вызывает спонтанный распад полных вирионов и резкое снижение титра вируса.

По-видимому, кроме энергии теплового возбуждения на устойчивость вируса определенным образом влияют структурные перестройки воды в температурных интервалах, определяющих не монотонную зависимость функциональных свойств биологических систем от температуры, а характеризующуюся резкими скачками при определенных значениях. Эти температуры группируются в следующие интервалы: 13-16, 28-32, 44-46 и 60-63°С (А.И.Халоимов и соавт., 1976), Возможно именно эти факторы и определяют отсуствие монотонного изменения основных показателей вируса: титра инфекционности и содержания 1465 частиц в суспензиях вируса ящура Агг-550 и Азия-1 №48, прогретых в течение часа при температуре 15, 30, 45 и 60°С .

Особенность кинетики термоинактивации вируса ящура выражается тем, что при температуре 15, 30 и 45°С в суспензии разрушаются неинфекционные 146Б. Сопоставление данных по термоинактивации вируса ящура в суспензиях и обезвоженых концентрат-порошках позволяет заключить о влиянии активности воды на термоустойчивость вирусных структур. Преимущественное разрушение вируса в суспензии обусловлено тем, что регидратация концентрат-порошков в буферном растворе сопровождается образованием вокруг вирионов сольватной оболочки. Увеличение теплового движения 2 жидкости вызывает нарушение стабильности сольватной оболочки и, как следствие, разрушение структуры вирионов.

2.2.3.6. Влияние высушивания на вирус ящура

Традиционно задача получения обезвоженных препаратов вируса решается с помощью метода лиофильного высушивания. В нашей работе проведены сравнительные опыты по получению обезвоженных препаратов методом ультрафильтрации и методом лиофильного высушивания.

Проведенные опыты подтвердили известные из литературы сведения о повреждающем воздействии на вирус процесса лиофильного высушивания замороженных образцов без защитных добавок. Добавление к суспензии лапинизированного вируса ящура С|-5б4 компонентов защитной среды не обеспечивает сохранение инфекционной активности на исходном уровне. Кроме того, данный метод отличается большой продолжительностью процесса обезвоживания и высокой энергоемкостью аппаратуры.

Обезвоживание вирусных суспензий методом ультрафильтрации при существенном сокращении времени позволяет сохранить титр вируса при минимальных потерях вирусной массы. Основной недостаток получаемых концентрат-порошков, связанный с относительно высокой остаточной влажностью порядка 50-60%, устраняется путем поэтапного удаления влаги методом активного вентилирования мембран с концентратом вируса, с последующим досушиванием измельченного порошка в вакуумной установке. Биологические тесты показали, что оптимальное время подсушивания мембран с концентратом вируса остается в пределах одного часа при достижении остаточной влажности 8-10%. Дополнительное обезвоживание концентрат-порошков в вакуумной установке в течение часа позволяет получать сухие препараты с

остаточной влажностью менее одного процента при сохранении структуры и свойств вируса ящура.

Относительно механизма инактивации вируса при высушивании следует отметить, что разрушение вируса определяется условиями опыта: содержанием влаги в исходном препарате и скоростью ее испарения. В условиях вакуума как в случае лиофилъного высушивания, так и в случае обезвоживания концентрат-порошков в образце возникает интенсивный поток молекул воды, которые при своем движении могут захватывать заряженные ионы, в результате чего возникает электрический ток. Соответственно плотность потока заряженных молекул воды определяется содержанием влаги в исходном образце. При отсуствии эффективного разряда в образце возникают электрические потенциалы, которые воздействуя на вирусные частицы вызывают в их структуре конформационные изменения , что и является причиной разрушения вируса при регидратации концентрат- порошков в буферном растворе. Уменьшение скорости испарения воды при лиофильном высушивании, а следовательно и уменьшение повреждения вируса достигается внесением перед замораживанием в вирусную суспензию защитных добавок, обладающих способностью удерживать воду при ее испарении из замороженных образцов. При обезвоживании препаратов, полученных методом ультрафильтрации, уменьшение скорости испарения воды достигается путем поэтапного ее удаления. Прямое удаление влаги из концентрат-порошков с остаточной влажностью 50-60% с использованием вакуумной установки приводит к разрушению более 90% вируса.

2.2.3.7. Инактивация вируса ящура химическими веществами

Данный раздел работы выполнен с целью определения влияния на структуру вируса ящура инактивирующих веществ, наиболее часто используемых для инактивации вируса при изготовлении противоящурных вакцин. В процессе инактивации вирус может оставаться настолько невредимым, что 146Б частицы сохраняют основную характеристику антигенности и, как следствие, их концентрация является одним из наиболее точных параметров, на котором базируется качество вакцин. В этой связи на примере лапинизированного вируса яшура 0| -194 нами выполнены опыты по установлению коррелятивной зависимости между концентрацией вирусных частиц, определяемых с помощью

электронного микроскопа, в ннактивированных образцах и иммуногеной активностью вакцин, изготовленных на их основе.

Опытным путем установлена прямо пропорциональная зависимость между величиной ИмД зо/«л и концентрацией частиц в пределах 0,5-10 х 1010 частиц/мл инактивированного полуфабриката. Данная концентрация 1465 частиц характерна для очищенных 10%-ных суспензий и 10-и кратных концентратов вируса 0| -194.

Для сравнительной проверки различных инактивантов вирус ящура 0| -194 инактивировали в суспензии: формальдегидом, гидроксиламином,

ацетиотиленимином, этиленимином, М-карбэтоксиэтиленимином и метилглиоксалем. Результаты проверки исходных ннактивированных образцов с помощью электронного микроскопа показали, что при инактивации различными химическими веществами в оптимальных дозировках количество вирионов во всех образцах одинаково и, соответственно, отсуствуют различия по величине иммуногенной активности вакцин, определяемой по величине ИмД зо/мл на взрослых белых мьпцах.

Поскольку в опытах по инактивации вируса ящура О1 -194 различными химическими веществами между ними не было выявлено существенных различий в дальнейших опытах при изучении механизма инактивации нами был использован формальдегид. Наибольший интерес в плане изучения механизма инактивации представляют опыты по влиянию на вирус повышенной концентрации формальдегида. В наших опытах была принята классическая схема инактивации вируса ящура при различной концентрации формальдегида от 0,025 до 1%.

Инактивация вируса ящура А22-550 в суспензии с 1% формальдегида вызывает разрушение вирионов с образованием пустых капсид с измененными параметрами: при размахе варьирования размеров в пределах от 23 до 32 нм средний диаметр капсид составлял 27,5 нм при 2-х кратном увеличении толщины их стенок. Электронно-микроскопические исследования формалинизированных капсид после года хранения при температуре 4-6°С показали, что при сохранении концентрации морфология частиц отличается от первоначальной: исчезли признаки деформации стенок, диаметр капсид уменьшился до 24,5 нм при восстановлении размаха варьирования размеров капсид в пределах 20-29 нм.

Инактивация вируса ящура 0| -194 в суспензии с 1% формальдегида вызывает разрушение 90-95% вирусных частиц. Разрушение структуры вирусных частиц возможно предотвратить воздействием на вирусную суспензию в процессе

инактивации постоянного электрического потенциала +4 000-5 ООО В. Воздействие внешнего потенциала позволяет задерживать распад вирионов во время инактивации и на короткий послеинактивационный период. При этом влияние формальдегида на структуру вирионов проявляется увеличением их среднего диаметра до 31 нм при размахе варьирования размеров частиц в пределах 26-36 нм.

По результатам проведенных исследований возможно заключить, что восстановление в инактивированных образцах параметров пустых капсид вируса ящура А22-550 и сохранение в экстремальных условиях инактивации, с приложением к вируссодержащей суспензии постоянного электрического потенциала, целостности частиц вируса ящура Oi -194 является следствием причастности электрической компоненты вирусных частиц к сохранению их устойчивости.

2.2.3.8. Влияние пенообразования на вирус ящура

Различные технологические процессы при работе с вируссодержащими суспензиями сопровождаются пенообразованием, для предотвращения которого используют яекогасители. Целью данного раздела работы было определение состояния вируса в условиях интенсивного пенообразования суспензий содержащих вирус ящура.

В опытах использовали очищенные и концентрированные суспензии вируса ящура Азия-1 №48, образцы которого подвергали воздушному барботированию в аппарате типа ПВ-20, исключающем вероятность попадания вируса во внешнюю среду при барботировании. В условиях наших опытов процесс пенообразования сопровождался инактивацией части вирионов: разрушению подвергались преимущественно 75S частицы и небольшое количество 146S частиц, при уменьшении содержания которых отмечалось некоторое увеличение титра вируса.

При рассмотрении механизма повреждения вирусных структур в условиях интенсивного пенообразования, как фактора внешнего воздействия при механическом встряхивании, вибрации, перемешивании, воздушном барботировании вируссодержащих суспензий следует отметить, что жидкая среда создает между твердыми частицами своеобразную подвижную пространственную решетку. Пенообразование как процесс непрерывного возобновления поверхности раздела вода-воздух ломает установившуюся структурную решетку и, как

следствие, оказывает воздействие на сольватую оболочку вирионов, что в свою очередь вызывает нарушение энергетического баланса в их структуре и вызывает распад частиц с недостаточно высоким уровнем собственной энергии.

2.2.3.9. Моделирование влияния на вирус ящура

переменного магннтного поля

В условиях внешней среды вирус ящура может подвергаться воздействию переменных магнитных полей как искусственной, так и естественной природы. Для проверки возможного воздействия переменного магнитного поля выполнены опыты по моделированию искусственной магнитной бури в флаконе с сухим концентрат-порошком, содержащим вирус ящура Азия-1 №48. В флаконы с концентрат-порошком помещали кусочки феррита, обладающих большим значением остаточной намагниченности. При включении магнитной мешалки постоянные магнитики совершают в флаконе интенсивное хаотичное движение, сопровождаемое витанием частиц порошка в замкнутом объеме флакона. Магнитную обработку образцов проводили в течение 18 часов при комнатной температуре.

Результаты опытов показали, что интенсивное турбулентное движение частиц порошка с вирусом ящура внутри флакона оказывает инактивирующее влияние на вирус ящура: титр вируса снижается на порядок, уменьшается содержание на 50% ОВБ и существенно изменяется качественный состав структурных компонетов вируса.

Относительно механизма инактивации вируса ящура под воздействием искусственной магнитной бури возможно предположить, что процесс движения частиц порошка с вирусом в магнитном поле сопровождается их дополнительной поляризацией. Появление электрических потенциалов на порошке, как носителе частиц вируса, ослабляет их структуру, увеличивая тем самым вероятность разрушения части вирионов при регидратации порошков в буферном растворе.

2.2.3.10. Влияние электрических полей на вирус ящура

Для проверки влияния внешних электрических полей на вирус ящура нами были проведены опыты по обработке униполярными электрическими

потенциалами сухих концентрат-порошков с остаточной влажностью менее 1%, содержащих культуральный вирус ящура SAT-1.

Результаты опытов показали, что прямое воздействие электрических полей изменяет качественный состав вирусной популяции. Положительный потенциал стабилизирует структуру вирионов, о чем свидетельствуют данные по контролю регидратированных образцов вируса до и после воздействия. Отрицательный электрический потенциал вызывает снижение содержания 146S частиц в суспензии с 64 до 25% при сохранении титра вируса на исходном уровне, что позволяет заключить о разрушении неинфекционных 146S частиц, отличающихся более лабильной структурой.

Полученные экспериментальные данные по прямому воздействию электрических полей на вирус ящура в составе сухих концентрат-порошков указывает на взаимосвязь между полярностью внешнего поля и суммарным электрическим зарядом вирионов. Внешний положительный потенциал вызывает противоположную или отрицательную поляризацию частиц порошка и адсорбированных на них вирусных частиц, что не вызывает нарушений в структуре вируса. Из данного положения следует, что частицы вируса ящура должны обладать суммарным отрицательным знаком заряда. Внешний отрицательный электрический потенциал вызывает соответственно электроположительную поляризацию твердых частиц порошка и вирусных частиц, что является причиной ослабления структуры вирионов вследствие их перезарядки. Это приводит к ослаблению межмолекулярных электростатических взаимодействий в структуре вирионов и их разрушению до I2S частиц при регидратации концентрат-порошков в буферном растворе.

2.2.3.11. Воздействие ферментов на вирус ящура

Среди известных протеолитических ферментов трипсин широко используется как фактор воздействия на структуру вируса ящура, а точнее как фактор избирательного расщепления структурного полипептида VP1. Нами проведены опыты по изучению влияния трипсина на структуру и свойства вируса ящура подтипа Ci -564. 1

В результате опытов установлено, что инкубация вируса с трипсином в концентрации 2-3 мг/мл сопровождается потерей 99% инфекционной активности при разрушении части вирионов. Электронно-микроскопические исследования

функциональных изменений в структуре вирионов указывают на нарушение их электрической структуры, связанной с уменьшением поверхности положительно заряженной части белковой оболочки вирусных частиц. Полученные данные согласуются с литературными данными, свидетельствующими об увеличении отрицательного заряда вирусных частиц, обработанных трипсином (Сауапа§Ь ег.аК, 1977).

При рассмотрении механизма воздействия трипсина на вирус ящура следует иметь в виду важную физическую и биологическую особенность данного фермента, обусловленную его электретным состоянием (Маскаренас, 1983). Возможно предположить, что морфологические изменения в структуре вирионов и распад части вирионов является следствием влияния пространственного заряда белка-фермента на межмолекулярные связи в структуре вирионов.

Нами проведены также опыты по определению кинетики инактивации лапинизированного вируса ящура подтипа Сл-564 при активации ассоциированной с вирусом эндонуклеазы. Для инактивации готовили активирующий буфер согласно данным Бсос1е11ег (1982), в котором регидратировали концентрат-порошки, содержащие вирус ящура. Затем образцы суспензии выдерживали различное время при температуре 37°С с периодическим контролем рН, значение которой должно быть не менее 8,5 на протяжении всего периода инактивации.

Из результатов опытов следует, что полная инактивация инфекционной активности вируса наступает через 18-20 часов экспозиции при заданных параметрах. За это время в суспензии на 15-20% уменьшается количество 1465 частиц. Выделение из образцов препаратов РНК и их контроль методом электрофореза показал, что в инактивированных препаратах РНК фрагментирована и находится в области клеточной РНК с константой седиментации 45. На основании опытов можно заключить, что инактивация ассоциированной с вирионами эндонуклеазами не зависит от системы культивирования вируса и является надежным методом получения авирулентных препаратов, так как деструкции подвергается только РНК при сохранении целостности полипептидов белковой оболочки.

Таким образом, из результатов опытов по воздействию некоторых физико-химических факторов на вирус ящура следует вывод об определенной общности механизмов сохранения устойчивости вирусных структур, связанных с их электрофизическими свойствами. Изложенные выше факты и гипотезы, по-

видимому, имеют более глубокие физические основания, обусловленные строением 146Б частиц вируса ящура. В связи с этим в следующих разделах нашей работы представлены данные по строению и физическим свойствам целых вирионов и их структурных компонентов.

2.2.4. Электронно-микроскопические исследования строения вируса ящура

Сложившиеся к настоящему времени представления о структуре вируса ящура, основаные на данных электронной микроскопии, преимущественно отражают архитектурное построение целых вирионов и их структуных компонентов. Выявление и описание другой части понятия "структуры" вируса ящура - функциональной организации вирионов или асимметрии в их строении в литературе не отмечается.

Исследования структуры вируса ящура в условиях негативного контрастирования при использовании 3-4% растворов ФВК рН 6,8 позволяют наблюдать однородно окрашенные светлые вирионы на темном фоне контрастирующего вещества. Структурные компоненты вируса ящура в форме 75 и 12Б частиц по морфологическим параметрам соответствуют их размерам и конформации в составе целого вириона. Морфологию вирусных, частиц, как биосистем, состоящих из двух подсистем: РНК и белковой оболочки возможно наблюдать под электронным микроскопом в неразрушенном состоянии. В отдельных случаях в структуре вирионов отчетливо просматривается ядро РНК, которое выделяется более выраженным негативным контрастом по сравнению с белковой оболочкой. При этом следует отметить морфологическую неоднородность вирионов, проявляющуюся различиями в их размерах и заполнением полости белковой оболочки вирионной РНК: РНК занимает всю внутреннюю полость, часть и полное отсутствие РНК с образованием пустых капсид. Данное наблюдение показывает, что полноценность вирионов определяется не только внешним видом целостности частиц, но и количеством РНК в составе вириона.

При изучении структуры вируса ящура с использованием метода электронной микроскопии нами впервые была выявлена морфологическая закономерность в строении вирусных частиц, проявляющаяся наличием в структуре белковой оболочки одновременно двух видов контраста: позитивного и

негативного. Данный вид контраста наблюдался на плотном фоне контрастирующего вещества при адсорбции вирусных частиц на поверхность поляризованных пленок-подложек и был назван нами как "смешанный".

Поляризованные положительным знаком заряда пленки-подложки получали в процессе термического испарения углерода на сеточки, покрытые пленкой из парлодиона. Перед напылением сеточки помещали на металлическую подставку, предварительно охлажденную в жидком азоте и установленную на чашку Петри с целью изоляции подставки с сеточками от основания распылителя.

При уточнении механизма образования у вирионов смешанного контраста возможно предположить, что вирионы в процессе контрастирования окружены монослоем ФВК и, при совпадении размеров частиц с толщиной монослоя, их изображение формируется всей поверхностью. Из данных литературы (Л.В.Часовникоза и соавт., ¡980; Л.А.Остерман, 1983) известно, что в монослое для белков наблюдается значительное смещение изоэлектрической области в сторону больших значений, например, для иммуноглобулина в растворе с р1 5,8 до р1 7,5 в мономолекулярной пленке. Общепринято, что такое смещение изоэлектрической области белка в монослое зависит от величины электрического потенциала и, возникающего на границе раздела фаз, и описывается уравнением Больцмана

рНв = рНу + е • и / 2,3 • к • Т,

где рНз- эффективное рН в поверхностной фазе; рНу - эффективное рН в объеме; е - элементарный заряд; к - постоянная Больцмана; Т - температура.

Последовательность приготовления препаратов вируса для электронной микроскопии включает этапы нанесения вируссодержащей суспензии на поверхность пленки-подложки, экспозицию в течение 5 минут, удаление избытка жидкости с пленки-подложки фильтровальной бумаги с таким расчетом, чтобы на поверхности оставалась едва заметная пленка жидкости. По-видимому, на данном этапе электрический потенциал пленки-подложки вызывает конформационные изменения в структуре белкового капсида, связанные с диссоциацией аминогрупп под воздействием положительного потенциала, что приводит к смещению изоэлектрической точки вирионов с р1 5,7 в растворе в сторону больших значений. Возможно предположить, что диссоциация

аминогрупп происходит в белках с преобладающим содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков.

Известно, что соли тяжелых металлов могут специфически реагировать с биологическими веществами. Соединяясь с определенными веществами, атомы и молекулы накапливаются в определенных местах биологического объекта, повышая тем самым контрастность соответствующих структур (В.И.Брусков. 1968; Г.Гайер, 1974). Учитывая вероятность конформационной перестройки белкового капсида в монослое на поверхности положительно заряженной пленки-подложки возможно предположить, что контрастирование вирусных частиц раствором ФВК происходит в их изозлектрической области (ориентировочно р1 7,0-7,4) с формированием смешанного контраста. В данном случае смешанный контраст характеризует картину распределения анионов ФВК на поверхности вирионов при условии их полного окружения электронно-плотным веществом.

Наличие в структуре вирионов позитивно и негативно окрашенных ( положительно и отрицательно заряженных) участков белковой оболочки отражает асимметричность их строения, выявляемой по различной функциональной активности данных участков по отношению к контрастирующим анионам ФВК, которые взаимодействуя с аминогруппами белковой оболочки обозначают участки поверхности вирионов, отличающиеся по плотности электроположительного заряда. К особенностям проявления . смешанного контраста относится то, что среди основной массы частиц с умеренно окрашенным позитивным участком просматриваются отдельные вирионы с интенсивно окрашенным позитивным участком. Как следует из данных литературы в структуре белковой оболочки положительным знаком заряда обладает структурный полипептид УР1 (ВапеПг^, 1982).

Морфологические изменения в структуре вирионов, связанные с состоянием смешанного контраста, выявляются при воздействии на вирус ящура различных внешних факторов. При продолжительном хранении концентрированных суспензий вируса при температуре 4-6°С и 26°С изменения в структуре вирионов выражаются появлением на фоне интенсивно окрашенного позитивного участка

I

негативного локуса, который может занимать от 1 до 12% поверхности вириона (позитивно окрашенный участок занимает от 30 до 40% всей поверхности вириона). ;

Изменения в структуре позитивно окрашенного участка можно наблюдать при суспенднровании и хранении вируса в растворе хлористого цезия с

плотностью ¡,8-1,9 г/см3 , при продолжительном воздействии на вирус раствора ПЭГ. Нарушение морфологического состояния вирусных частиц определенным образом связано с изменениями их поверхностного заряда, что возможно влияет на проявление инфекционной активности вируса, титры которого при указанных выше воздействиях снижаются на ! -3 порядка.

2.2.4.1. Исследования электрофизических свойств вируса ящура

Образование при контрастировании вирусных препаратов позитивно и негативно окрашенных участков поверхности вирионов позволяет выделить в структуре вируса явно выраженные полюса - участки различающиеся по характеру заряда при постоянном значении рШ. Характерной особенностью поведения вирусных частиц в условиях смешанного контрастирования является то, что частицы на подложке занимают преимущественно "боковое" положение по отношению к поверхности пленки-подложки. Боковую ориентацию вирионов возможно объяснить фактом электростатического взаимодействия дипольно заряженных вирусных частиц с отрицательно заряженным слоем подсыхающего на подложке раствора ФВК.

При нанесении вирусных частиц на пленки-подложки во внешнем электрическом поле установлено, что при действии униполярного электрического поля вирусные частицы, расположенные на изолированной от электрода подложке, испытывают в жидкости вращающий момент. После испарения с подложки остаточных количеств раствора ФВК вирусные частицы фиксируются слоем красителя, что позволяет наблюдать вирионы в положении с преимущественной ориентацией позитивным участком вверх. Результаты данных опытов подтверждают дипольный характер распределения электрических зарядов на поверхности вирусных частиц. Если заряд поверхности вириона возможно оценить визуально, то действие заряда РНК экранируется его белковой оболочкой.

При контрастировании концентрированных препаратов вируса ящура раствором калия кре.мневольфрамовокислого были получены электронные микрофотографии кристаллов соли, образующиеся на подложке при испарении жидкости. Кристаллизация солей на подложке сопровождается включением в состав кристаллов вирусных частиц в силу высокой их концентрации на подложке. Внутри кристаллов отдельно лежащие вирионы сохраняют

сферическую форму, а близко расположенные вступают во взаимодействие с образованием агрегатов из 2-3-х и более частиц. Образование агрегатов происходит благодаря слиянию оболочек вирионов. В структуре некоторых агрегатов отмечается слияние внутренних ядер - РНК, которые на электронных микрофотографиях выглядят более светлыми по сравнению с оболочками. Механизм образования агрегатов из вирусных частиц обусловлен процессами происходящими при кристаллизации соли, в результате чего включенные в состав кристалла вирионы лишаются своей защитной сольватной оболочки, что обнажает их полярные участки и создает условия для эффективного электростатического взаимодействия. Эффект слияния по своему характеру напоминает электрический пробой между заряженными частицами с образованием связующих перемычек как между белковыми оболочками, так и между РНК, что возможно только при наличии противоположных знаков заряда данных структур.

Дальнейшее изучение электрофизических свойств вирусных частиц методом электронной микроскопии проводили с использованием поляризованных пленок-подложек, которые получали поляризацией пластиковой пленки на поверхности кислого (щелочного) водного раствора или поляризацией готовых пленок-подложек во внешнем электрическом поле. Электронно-

микроскопическим путем установлено, что при адсорбции вирионов на положительно заряженной ("щелочной") подложке, полученной с поверхности водного раствора с рН 9,0, отмечается деформация связей в структуре вирионов, сопровождающаяся увеличением их размеров до предельного значения - 33-35 нм. В структуре отдельных вирионов наблюдается отделение белковой оболочки от РНК и выход РНК через разрыв в оболочке. Более высокий электрический потенциал поверхности пленки-подложки (рН водного раствора 11,0-12,0) вызывает разрушение большей части вирионов на два структурных компонента: РНК и фрагменты белковой оболочки.

Поляризация пленок-подложек на поверхности закисленного водного раствора придает им лучшую адсорбционную способность по сравнению с подложками, полученными при нейтральном рН водного раствора. При высоком электрическом потенциале подложки часть вирионов 'разрушается до структурных компонентов в форме "скобок". Механизм электрофизического разрушения вируса связан с конформационными перестройками и

возникновением в структуре вирионов механических напряжений, что вызывает нарушение связей между структурными компонетами вирионов и их распад.

Разрушение вируса при действии кислой среды общеизвестно и наиболее часто используется в целях его обезвреживания. Распад вирионов, как следствие смены полярности при переходе из слабо щелочной среды в кислую с рН ниже их изоэлектрической точки, возможно наблюдать при контрастировании вирусных препаратов раствором ФВК с рН 3,0. Одномоментное воздействие красителя с разрушающим эффектом позволяет наблюдать распад белковой оболочки на составляющие ее фрагменты при сохранении формы сферы. Среди продуктов распада отсуствует РНК в том виде, как она фиксируется на электронных микрофотографиях при действии щелочной среды.

Однако, разрушение вирусных частиц возможно предотвратить предварительной их поляризацией во внешнем электрическом поле. Электрообработка вирионов в составе вирусной суспензии на пленке-подложке сопровождается электроположительной поляризацией их поверхности, в результате чего при контрастировании препаратов раствором ФВК с рН 3,0 поверхность вирионов полностью окрашивается позитивно.

Характерные признаки нарушения функциональной организации вирионов или их асимметрии установлены также в опытах по влиянию специфических антител на вирус ящура. Первоначально взаимодействие вируса ящура с гомологичными антителами 1«С сопровождается образованием агрегатов из смешанно контрастированных вирусных частиц, что приводит к уменьшению титра вируса на 3-4 порядка против исходного значения при отсуствии видимых деструктивных изменений в структуре вирионов. Образование агрегатов ингибируется высокой ионной силой среды суспендирования. Снижение ионной силы исходной вирусной суспензии с помощью диализа восстанавливает способность вирионов к формированию комплексов антиген-антитело, что свидетельствует о причастности электростатических сил к их образованию.

Функциональные изменения в структуре вирионов наблюдаются после прогревания суспензий, содержащих комплексы антиген-антитело, при температуре 37°С, что вызывает распад последних на отдельные вирионы, в структуре которых ' выявляются негативные локусы на фоне позитивно окрашенного участка белковой оболочки. Инфекционная активность вируса при этом не выявляется при наличии в препаратах высокой концентрации вирионов. По-видимому, распад комплексов и потеря инфекционной активности

обусловлены конформационными изменениями связанными с нарушением структуры электроположительного участка поверхности вирионов, что является следствием действия на вирус специфических антител. В заключении

настоящего раздела работы следует отметить, что данные по асимметрии в структуре вируса ящура, полученные методом электронной микроскопии, являются -новыми и требуют подтверждения при исследовании других вирусов животных.

2.2.4,2. Электронная микроскопия других вирусов, вызывающих заболевания с везикулярным синдромом

Исследование морфологии вируса везикулярной болезни свиней (ВБС) осуществляли после очистки, концентрирования и разделения вирусных частиц в градиенте плотности хлористого цезия. Фракция градиента с плотностью 1,338 г/см3, характеризующаяся максимальным титром инфекционности, содержала полные вирионы или 1505 частицы. Из фракции градиента с плотностью 1,324 г/см3 были выделены "пустые" капсиды. В идентичных с вирусом ящура условиях нанесения и контрастирования вирусных препаратов в структуре полных вирионов вируса ВБС Т-75 было выявлено наличие смешанного контраста, отражающего признак асимметрии в структуре 1505 частиц данного вируса. В структуре пустых капсид смешанный контраст не выявлен, что, по-видимому, связано с отсусгтвием РНК и проникновением контрастирующего раствора ФВК внутрь капсиды.

Исследование морфологии вируса везикулярной экзантемы свиней (ВЭС) проводили после его очистки и концентрирования при контрастировании вирусных препаратов 4% раствором ФВК рН 6,8. Частицы вируса ВЭС имеют шарообразную форму с шиловидными структурами на поверхности. На плотном фоне контрастирующего вещества вирионы приобретают звездчатую форму с наличием позитивно и негативно окрашенных участков поверхности. При диаметре частиц вируса ВЭС 40 нм позитивно окрашенный участок занимает около 15% от всей поверхности вириона. Кроме того, среди вирионов с негативным контрастом встречаются единичные вирионы, в структуре которых просматривается интенсивно окрашенный позитивный участок.

Проведенные электронно-микроскопические исследования показали, что обнаруженный нами феномен асимметричного распределения электрически

заряженных групп белковой оболочки в структуре вируса ящура является также характерным признаком структуры представителя энтеровирусов - вируса ВБС и представителя калицивирусов - вируса ВЭС, что может служить подтверждением общей закономерности строения данных вирусов. Об отсуствии артефактов при смешанном контрастировании свидетельствует оптимальное для вируса ящура значение эффективной рШ в поверхностной фазе (7,0-7,4), а также сохранение размеров и формы вирионов при данном виде контрастирования. Однако, данные электронной микроскопии нельзя считать однозначным доказательством наличия в структуре вируса ящура положительно и отрицательно заряженных участков белковой оболочки. В целях более полной аргументации данного феномена нами были проведены опыты по изучению электрофизических свойств структурных белков вируса ящура.

2.2.5. Электрофизические свойства структурных белков вируса ящура

При изучении строения белковой оболочки вируса ящура различных типов использовали концентрат-порошки с содержанием 0,5-0,8 мг

вирусспецифического белка в форме 1465 частиц, которые после разрушения до структурных полипептидов исследовали методом электрофореза и электрофокусирования в ПААГ. Результаты опытов показали незначительные различия в величинах молекулярной массы структурных полипептидов между различными серотипами вируса ящура.

В процессе изоэлектрического фокусирования установлено, что основной структурный полипептид УР1 подтипов вируса ящура А22, Азия-1, Оь С1 и ЗАТ-2 фокусируется в щелочной зоне градиента рН, то есть является положительно заряженным. Структурные полипептиды УР2 и УРЗ фокусируются в кислой зоне градиента рН и соответственно имеют отрицательный знак заряда. При ассоциации трех неидентичных по заряду полипептидов УР1, 2 и 3 в процессе морфогенеза образуется асимметричный белковый диполь - протомер. Полученные нами данные согласуются с данными других авторов ( П.Крушке и соавт., 1981; Р.Рюкерт, 1989; Л.А.Быкова и сотр., 1990; Ж.А.Шажко и соавт., 1991). Однако, на основании полученных данных провести сравнительную оценку вируса ящура различных серотипов затруднительно. Это становится возможным

при рассмотрении структуры вируса ящура в форме системы, состоящей из отдельных блоков - заряженных структурных полипептидов.

Электрический заряд целого вириона как параметр экстенсивности определяется суммированием электрических зарядов структурных полипептидов, формирующих белковую оболочку вирионов. Суммирование электрических потенциалов соответствующих значениям изоэлектрических точек (р1) для полипептидов УР1, УР2 и УРЗ с учетом их полярности позволяет определить электрический потенциал целого вириона. Результаты расчетов показали, что вирус ящура обладает суммарным отрицательным зарядом различной величины и зависит от типа вируса.

Если величине р1 структурных полипептидов соответствуют различные значения э.д.с., то по величине электрического потенциала целого вируса можно решить обратную задачу - определить изоэлектрическую точку целого вируса. Для вируса ящура А22-550, обладающего суммарным электроотрицательным потенциалом 48,7 мВ, внешний электронейтрализующий потенциал, соответствующий изоэлектрической точке, должен быть равен +48,7 мВ, что соответствует рН 6,2, то есть для данного подтипа вируса р! 6,2. Среднее значение р1 для указанных выше подтипов вируса совпадает со значением р1 5,7, приведенным в монографии Х.Ререра (1971), что подтверждает правильность проведенных расчетов.

На основании выполненных исследований и данных литературы возможно заключить, что структура вируса ящура представляет собой сложную систему, характеризующейся структурной и функциональной организациями вирионов. Если структурная организация вируса определяется размером и формой вирионов, размерами и количеством структурных субьединиц в составе белковой оболочки и их расположением в соответствии с симметрией икосаэдра, то функциональная организация вируса характеризуется разделением в составе белковой оболочки структурных полипетидов с противоположным знаком заряда.

По-видимому, основной причиной разделения электрических зарядов на поверхности белкового капсида является асимметричность строения вирионной РНК (Бепоуа С.Э. ей а1., 1978; Нозэтапп М. О. е1. а1., 1985). В процессе морфогенеза из асимметричных белковых диполей - протомеров в ориентирующем поле клеточной мембраны формируются пентамеры и, вероятно, структуры с форме прокапсид с параллельным расположением идентичных субъединиц. Неравенство положительно и отрицательно заряженных групп на

поверхности протомеров обуславливает искривление поверхности белковых структур при потере последними контакта с мембраной, что сопровождается образованием полусфер с положительно заряженными группами белка внутри. В ассоциатах из белковых диполей их результирующий дипольный момент многократно возрастает (Е.Т.Кулин, 1980), что создает энергетические предпосылки для взаимодействия данных структур с РНК, суммарный заряд которой, также как и для-целого вируса, характеризуется электроотрицательной величиной. Инкапсулирование РНК в состав прокапсида сопровождается нейтрализацией ее отрицательно заряженных групп, а положительно заряженные группы РНК при этом остаются свободными, что является причиной возникновения асимметрии в структуре РНК , а затем и целого вириона.

На завершающей стадии сборки белкового капсида РНК взаимодействует с пентамерами, которые укладываются антипараллеяьно в структуру вирионов и . тем самым нейтрализуют положительно заряженные группы на поверхности РНК. Таким образом формируется функционально активная структура вируса с признаками симметрии-асимметрии, что соответствует общей закономерности строения биосистем, функционирование которых основано на принципе устойчивого неравновесия (И.Г.Емельянов, 1994).

Взаимосвязь устойчивости вируса с его структурной организацией определяется влиянием внешних факторов на .морфологическую структуру вирионов. В целях сохранения структурной устойчивости целесообразно перевести вирусные частицы из жидкой среды в твердое порошкообразное состояние и вирусные концентраты хранить при отрицательной температуре, что позволяет существенно уменьшить величину энтропии, как меру внутренней неупорядоченности.

При определении взаимосвязи устойчивости вируса ящура с его функциональной организацией необходимо акцентировать внимание на энергетической компоненте вирусных частиц, обусловленной асимметричным расположением структурных субъединиц - протомеров в составе белковой оболочки. При обосновании механизма инактивации вируса ящура следует иметь в виду, что вирионы , как биосистемы, обладающие ограниченным и невосполняемым запасом электрической энергии, при воздействии физико-химических факторов частично или полностью утрачивают запасенную энергию, вследствие чего происходит ослабление структуры вирионов и их разрушение. Признаки нарушения функциональной структуры вирионов были выявлены при

электронно-микроскопических исследованиях последствий воздействия на вирус ящура замораживания-оттаивания, хранения концентрированных суспензий вируса при положительных температурах, влиянии вируснейтрализующих антител, воздействии растворов хлористого цезия , ПЭГ и др.

На основании данных представлений механизм стабилизации вируса ящура основан ' на принципе соответствия электрофизических свойств среды, определяемых величиной рН, солевым составом, температурой, состоянием трансмембранного потенцила клеток и другими факторами, электрофизическим параметрам вирусных частиц. Данное положение подтверждается на примере оценки сравнительной устойчивости вируса ящура А22-550 и 0|-194 в идентичных условиях внешней среды. В вирусной суспензии с рН 7,5-7,8 внешний электронейтрализующий потенциал имеет значения от -36 до -48 мВ. Для указанных выще типов вируса электрические потенциалы соответственно равны -48 и -89 мВ. Соответствие потенциала внешней среды по знаку и величине электрическому потенциалу вируса ящура Аг2-550 способствует сохранению баланса электростатических связей РНК-белок и, как следствие, вирус обладает более высокой устойчивостью. Кроме того, данное положение экспериментально подтверждено в опытах по определению рН-зависимой устойчивости вируса в процессе замораживания очищенных вируссодержащих суспензий, воздействии постоянных электрических полей различной полярности и в других опытах.

3. ВЫВОДЫ

3.1. Разработан комплексный метод очистки, концентрирования и стабилизации вируса ящура, позволяющий с помощью ультрафильтрации концентрировать вирус до состояния гелеобразной пленки на поверхности мембраны и получать обезвоженные концентрат-порошки вируса охлаждением мембраны в жидком азоте и ее измельчением до порошкообразного состояния. На основе высококонцентрированных препаратов вируса ящура отработан метод получения препаративных количеств 146Б частиц в виде обезвоженных концентрат-порошков.

3.2. Установлен взаимозависимый характер образования в клетках ВНК-21 структурных компонентов вируса в форме ¡46 и 75Б частиц, что свидетельствует об онтогенетической природе происхождения 75Б частиц, как промежуточного продукта при формировании полных вирионов.

3.3. Установлено, что сохранение полярности трансмембранного потенциала клеток ВНК-21 при осаждении последних путем отстоя в слабо щелочной среде с последующей сменой ростовой среды на поддерживающую с рН 7,4-7,5 и культивированием вируса в слабо щелочной среде сопровождается повышением чувствительности клеток к вирусу ящура, вирусу диареи КРС и аденовирусу КРС, на что указывает сокращение в среднем в два раза времени репродукции вируса ящура при множественности заражения 0,01-0,02 ТЦЦ50 на клетку, вируса диареи КРС и аденовируса КРС при множественности заражения 0,3-0,5 ТЦЦ50 на клетку.

3.4. Механизм инактивации вируса ящура при замораживании вируссодержащих суспензий взаимосвязан с электрофизическими свойствами вирусных частиц. Показано, что при замораживании очищенных и концентрированных вируссодержащих суспензий с рН 8,2-8,7 структура и свойства вируса ящура сохраняются, а в суспензиях с рН 7,5-8,0 разрушение вируса составляет более 99%.

3.5. Устойчивость вируса ящура при переводе вирусных частиц из твердого порошкообразного состояния в жидкую среду характеризуется влиянием на структуру вирионов их сольватного комплекса, ионный состав которого зависит от среды суспендирования и определяет состояние электрокинетического потенциала вирусных частиц.

3.6. Термоинактивация вируса ящура в очищенных суспензиях и в сухих концентрат-порошках связана с влиянием активности воды на состояние сольватного комплекса вирионов. В суспензии в интервале температур 15-45°С тепловое воздействие вызывает разрушение неинфекционной части вирусной популяции. Повышение температуры суспензии от 45 до 60°С сопровождается увеличением активности воды, что вызывает полную инактивацию вируса вследствие нарушения стабильности сольватной оболочки вирионов.

3.7. Инактивация вируса ящура при высушивании обусловлена электрофизическими процессами, возникающими при испарении водной фазы из вируссодержащих препаратов. При интенсивном испарении водной фазы отмечается разрушение вируса. Регулирование процесса удаления влаги из препаратов вируса позволяет сохранить структуру и свойства вируса в препаратах с остаточной влажностью менее 1%.

3.8. Методом изоэлектрического фокусирования определены электрические заряды структурных полипептидов вируса ящура: УР1 - заряжен положительно, а

УР2 и УРЗ - отрицательно. Из трех данных полипептидов в процессе морфогенеза формируются ассиметричные белковые диполи - протомеры. Суммарный электрический заряд целых вирионов характеризуется отрицательной величиной, которая имеет существенные различия для отдельных типов вируса. Более высокой устойчивостью обладают вирусные частицы с меньшим значением электрического заряда.

3.9. Установлено наличие смешанного контраста в структуре 146Б частиц вируса ящура в виде позитивно и негативно окрашенных участков белкового капсида, что отражает признак асимметрии в изометрической структуре вирионов. Наличие признака асимметрии обнаружено также у вируса везикулярной болезни свиней и у вируса везикулярной экзантемы свиней.

ЗЛО. Устойчивость вируса ящура при воздействии физико-химических факторов зависит от степени конформационных изменений в структуре вирусных частиц, вызывающих в свою очередь нарушение энергетического баланса в их структуре, что наиболее показательно в опытах по инактивации вируса в кислой среде.

3.11. Первопричиной инактивации вируса ящура является нарушение его функциональной организации, связанной с асимметричным строением вирусных частиц. Признаки нарушения асимметрии в структуре вирионов установлены при замораживании - оттаивании, термоинактивации, действии трипсина и вируснейтрализующих антител, при продолжительном хранении концентрированных препаратов вируса и воздействии других факторов.

4. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО РЕАЛИЗАЦИИ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Предложения для научных целей. На основании проведенных исследований разработаны "Методика получения высококонцентрированного вируса ящура" и "Методика препаративного выделения 1465 частиц вируса , ящура и их количественная оценка", использование которых позволяет стандартизировать исходные условия опытов и получать воспроизводимые результаты при изучении механизмов инактивации и стабилизации вируса ящура. Кроме того, данные методики в сочетании с "Методикой изоэлектрического фокусирования белков вируса ящура в полиакриламидном геле" и "Методикой оценки количественного и качественного состояния вируса ящура с помощью электронной микроскопии" позволяют проводить молекулярно-биологические исследования структурных

особенностей строения вируса ящура различных типов, регистрировать и анализировать морфологическое состояние вирионов при воздействии различных физико-химических факторов, проводить экспресс-оценку нативных и инактивированных антигенов вируса ящура, предназначенных для приготовления противоящурных вакцин.

По результатам исследований отработан также методический подход по определению условий сохранения устойчивости вируса ящура при замораживании очищенных и концентрированных суспензий, который мо;::гг успешно использоваться при работе с другими вирусами животных.

При проведении электронно-микроскопических исследований отработан метод приготовления мелкозернистых пленок-подложек, существенно улучшающих качество электронных микрофотографий вируса ящура. Кроме того, для улучшения адсорбции вирионов при нанесении вирусных препаратов, а также для изучения электрофизических свойств вирусных частиц разработаны различные способы получения поляризованных пленок-подложек для электронной микроскопии.

Предложения для использовании в производстве биопрепаратов. Выполненные разработки вошли в технологические разделы нормативно-технической документации "Временна я инструкция по изготовлению и контролю универсальной и поливалентной вакцины против ящура типов А, О, С и Азия-1", утвержденная ГУВ; ТУ "Вакцина против ящура бивалентная типа А, О (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21) инактивированная", утвержденные директором института и согласованные с департаментом ветеринарии МСХиП Российской Федерации.

Разработанные методики: "Методика получения очищенного и концентрированного антигена лапинизпрованного вируса ящура А22" и "Методика получения высокоочищенных суспензий вируса ящура" позволяют получать очищенные и концентрированные антигены вируса ящура на существующем технологическом оборудовании биопредприятий с использованием проточного сепаратора.

На основании "Методики подготовки очищенного и концентрированного вируса ящура для культивирования в суспензии" возможно проводить наработку серийных образцов посевного вируса в удобном для применения виде без промежуточного освежения, а также вести накопление концентрированных

полуфабрикатов вируса для приготовления противоящурных вакцин и диагностических препаратов.

5. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Улупов H.A., Морев Ю.Б., Пономарев А.П., Молчанова А.И. -Электронная микроскопия препаратов вируса ящура после ; инактивации формальдегидом и его нейтрализации II Ящур. Тем. сб. науч. работ. Т.Я.Владимир, 1975. - С. 316-317.

2. Устройство для получения угольно-коллодиевых пленок-подложек: А.с.469913 СССР, М. кл. G 01 1/ 28 С 12 К 1/00, С 23 , С 15/00 /А.П.Пономарев, А.И.Молчанова, В.А.Ларионов, Н.Н.Лебедева . -3 с.

3. Устройство для приготовления препаратов для электронно-микроскопических исследований: А. с. 481639 СССР, М кл. С 12 к, 1/00 / А.П.Пономарев, А.И.Молчанова. -4 с.

4. . Способ приготовления вирусных препаратов для электронной микроскопии: А. с. 445961 СССР, М. Кл. 12К 1/00/А.П.Пономарев. -2 с.

5. Котова М.В., Татаренко Г.К., Мамков Н.С., Холин Ю.А., Пономарев

A.П. - Физические и биологические свойства вируса ящура и его компонентов// Акт. вопр. вет. вирусол. Т. 2. - Владимир, 1976. - С. 23-24.

6. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Узюмов В.Л. - Структура белковой оболочки вируса ящура II Ветеринария. - 1977. №9. -С. 39-42.

7. Пономарев А.П., Зубов И.В. - Применение ультразвука при изготовлении эмульгированных противоящурных вакцин // Акт. пробл. вет. вирусол. -Владимир, 1978. - С. 62-63.

8. Котова М.В., Холин Ю.А., Пономарев А.П., Татаренко Г.К., Узюмов

B.Л. - Влияние хранения лапинизированного вируса ящура на стабильность I40S частиц при инактивации формальдегидом //Акт. пробл. вет. вирусол. - Владимир, 1978. -С. 21-23.

9. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Коренная Н.С. -Изучение структуры вируса ящура типов А и О //Акт. пробл. вет. вирусол. -Владимир, 1978. -С. 23-24.

10. Пономарев А.П., Молчанова А.И.. Узюмов B.J1. -Использование ультразвука при очистке афтозного вируса ящура // Ветеринария. -1978. №9. -С.38-40.

11. Молчанова А.И., Пономарев А.П., Ануфриева Т.А. -Применение ультразвуковых волн при выделении РНК вируса ящура // Акт. пробл. вет. вирусол. - Владимир, 1977. - С. 65-67.

¡2. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Узюмов ВЛ. - Влияние условий контрастирования растворами фосфорновольфрамовой кислоты на электронно-микроскопическое изображение вируса ящура // Вопр. вирусологии. - 1979. №5. -С. 470-476.

13. Молчанова А.И., Пономарев А.П., Титов И,Н., Дьячкова Т.П. -Влияние солей хлористого цезия на структуру вируса ящура II Акт. пробл. вет. вирусол: Тез. докл. - Владимир, 1980. - С. 48-49.

14. Пономарев А.П..Молчанова А.И.,Коренная Н.С. - Морфологическое сравнение вируса ящура типов А и О // Акт. пробл. вет. вирусол. : Тез. докл.. -Владимир, 19S0. - С. 42-43.

15. Пономарев А.П. - Электронномикроскопическое изучение морфологических особенностей структурных компонентов вируса ящура типов А и О: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Владимир, 1980. -18 с.

16. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Коренная Н.С., Дьячкова Т.П. - О механизме действия кислого значения pH среды на структуру вируса ящура // Акт.пробл.вет.вирусол.: Тез. докл. - Владимир, 1980. - С. 46-48.

17. Пономарев А.П., Ефимов Н.И., Оковытый A.C. Электронномикроскопическая оценка вируса ящура // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. -Владимир, 1980. -С. 32-34.

18. Молчанова А.И., Пономарев А.П., Узюмов B.JI. - Сравнительное изучение лапинизированного вируса ящура типов А и О И Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. - Казань, 1980. - С. 127.

19. Пономарев А.П., Гладилин Г.В., Оковытый A.C., Ефимов Н.И. -Корреляция между иммуногенностью и массой вируса ящура, определяемой методом электронной микроскопии // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Разработка , апробация и гос. контроль вет препаратов" 31 марта - 2 апреля 1981 г. - С. 68-69.

20. Котова М.В., Татаренко Г.К., Пономарев А.П., Холин Ю.А., Мамков Н.С., Удалых М.Г.. Узюмов B.JI. - Свойства белковых компонентов лапинизированного вируса ящура//Ветеринария. -1981. ,N"«2. - С. 34-37.

21. Котова М.В., Пономарев А.П., Узюмов В.Л.,Татаренко Г.К., Холин Ю.А. - Влияние формальдегида на структуру 140S частиц лапинизированного вируса ящура А22 // СЭВ. Матер, симп. по пробл. Профилактика и эффективная борьба с ящуром ...- Владимир, 1981. - С. 57-62.

22. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Узюмов В.Л. - Изучение механизма повреждающего действия замораживания на вирус ящура // СЭВ. Матер, симп. по пробл. Профилактика и эффективная борьба с ящуром ...-Владимир, 1981. - С. 6368.

23. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Узюмов В.Л. - Определение концентрации частиц вируса ящура в суспензии // Ветеринария. -1983. №1. - С. 2224.

24. Арупонян Л.П., Пономарев А.П. - Влияние различных методов концентрирования вируса ящура на его структуру и компонентный состав // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ. - Владимир, 1983. - С. 43-45.

25. ХудяковГ.А., Пономарев А.П. - Выявление вирусоподобных структур в культуральной среде методом электронной микроскопии // Акт. пробл. вгг. вирусол. Тез. докл. науч.конф. ВНИЯИ. - Владимир. - С. 22-23.

26. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Бодина H.A., Кравченко A.A., Дьячкова Т.П. - Очистка суспензий вируса ящура с применением полиэтиленгликоля для электронной микроскопии // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ. - Владимир, 1983. - С. 35-37.

27. Способ очистки вируссодержащей суспензии: А. с. 1102272 С12 7/02 / Ю.Б.Морев, А.И.Дудников, В.Н.Коропов, А.П.Пономарев (СССР) - 8 с.

28. Пономарев А.П., Молчанова А.И., Узюмов В.Л. - Электрические свойства вируса ящура II Биологические науки. -1984. №6. - С. 18 -23.

29. Пономарев А.П. Признаки симметрии и асимметрии в структуре вируса ящура // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ. -Владимир, 1986. - С. 4-6.

30. Жарова H.H., Пономарев А.П., Оковытый A.C., Калугина Т.Е. -Испытание некоторых методов инактивации микоплазм-контаминантов в сыворотке КРС П Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф .ВНИЯИ. -Владимир, 1986. -С.32-32.

31. Рыбакова С.А., Шоршнев В.И., Михайлина Н.М., Рыбаков С.С., Пономарев А.П., Цветкова С.А. - Сравнительное изучение некоторых методов

определения уровня противояшурных антител // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ. -Владимир, 1986. - С. 93-95.

32. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, используемый для получения моноклональных антител к вирусу ящура А22: А. с. 1489177 СССР, AI, С12 5/00, А61 К 39/42 / Т.Э.Неуман, Л.А.Глобенко, НЛ.Давыдова, А.П.Пономарев, В.И.Шоршнев, А.Н.Бурдов, Г.А.Худяков, М.Ю.Саарма.-3 с.

33. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus -продуцент моноклональных антител к вирусу ящура 0-1618: А. с. 1565021 СССР, AI, С 12 5/00, 5/02 / Л.А.Глобенко, Н.Л.Давыдова, Т.Э.Неуман, М.Ю.Саарма, А.Н.Бурдов, А.П.Пономарев, Л.У.Маматкулова, Г.А.Худяков.-З с.

34. Андреева О.Г., Пономарев А.П. Использование полиэтиленгликоля для определения содержания 12S компонента в суспензиях вируса ящура // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ. -Владимир, 1987. -Т.1. - С. 60-61.

35. Чепуркин A.B., Лядский М.М., Дрягалин H.H., Котова М.В., Пономарев А.П. О некоторых факторах, влияющих на иммуногенность ящурного антигена // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ. - Владимир, 1987.-Т. 2.-С. 12-14.

36. Оковытый A.C., Жарова H.H., Калугина Т.Е., Пономарев А.П. -Усовершенствование метода бактериологического контроля микоплазм-контаминантов культур клеток и сыворотки крови // Матер. 11-го симпоз.специалистов стран членов СЭВ по пробл. "Профилактика и эффективная борьба с ящуром, а также создание высокоэффективных противоящурных вакцин". - София, 1988. - С. 51-61.

37. Дудников А.И., Майков Н.С., Савельев В.Ю., Мищенко В.А., Шажко Ж.А., Пономарев А .П., Кременчугская С.Р., Базаров М.А. и др. - Адъювант: A.c. 1615917 СССР, А 61 К 39/135 , 35/06. -12 с.

38. Шоршнев В.И., Рыбакова С.А., Михайлина Н.М., Пономарев А.П. -Получение антиидиотипатических сывороток, специфичных к противоящурным антителам // Тез. докл. Всесоюз. науч. тех. конф. "Совр. пробл. иммунол.. биотехнол. и клеточной инженерии в вет. медицине" - Нижний Новгород, 1990. -С. 136-137.

39. Пронин И.А., Пономарев А.П., Шоршнев В.И., Боброва Т.В., Андреева О.Г., Пучкова Н.Г., Некрасов A.B. - Стимуляция специфического иммунитета

антигеном вируса ящура, конъюгированного полиоксидонием // К новой стратегии борьбы с ящуром: Междунар. кокф. - Владимир, 1991. - С. 76-77.

40. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Соболева Л.П., Андреева О.Г., Бодина H.A., Чугрова Л.К. - Электрофизические свойства структурных полипептидов вируса ящура и модель строения вирионов // К новой стратегии борьбы с ящуром: Междунар. конф. - Владимир, 1991. - С. 139-141.

41. Пономарев А.П., Смирнов В.И., Андреева О.Г., Бодина H.A., Чугрова Л.К. - Культивирование вируса ящура А22 и 0-194 в промышленных условиях // К новой стратегии борьбы с ящуром: Междунар. конф. - Владимир, 1991. - С. 100102.

42. Пономарев А.П.,Соболева Л.П., Андреева О.Г., Бодина H.A., Узюмов

B.Л. - Электрофизические свойства структурных полипептидов вируса ящура II Биологические науки. -1992. №7. -С. 66-73.

43. Белоконь B.C., Бабкин В.Ф., Прохорягова О.В., Мищенко В.А., Новожилова Е.В., Пономарев А.П. и др. - Использование метода флуоресцентных зондов для отбора и оценки систем репродукции вирусов // Биотехн. вет. препар.: Матер, науч. - практ. конф. - Харьков, 1993. - С. 18.

44. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Баранов С.Г. - Совершенствование процесса репродукции вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21 // Вирусн. болезни е. - х. ж-ных: Тез. докл. всарос. научно - практ. конф. - Владимир, 1995. -

C. 137.

45. Пономарев А.П., Баранов С.Г. - Регенерация ПЭГ для повторного использования при концентрировании вируса ящура // Вирусн. болезни с. - х. ж-ных: Тез. докл. всерос. научно - практ. конф. -Владимир, 1995. - С. 139.

46. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Узюмов В.Л. - Сохранение структуры и свойств вируса ящура при замораживании очищенных и концентрированных суспензий//Ветеринария. -1995. №4. - С. 28-31.

47. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Михалишин В.В. - Получение обезвоженных концентрированных препаратов вируса ящура ультрафильтрацией // Ветеринария . -1995. №6. - С. 37-41.

Отпечатано на полиграфической базе отдела патентных исследований и научной информации ВНИИЗЖ. Тираж 100 экз. июня 1996 г.