Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиология роста бактерий Rhodococcus Minimus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиология роста бактерий Rhodococcus Minimus"

РГЗ сл

О з ФЕВ «37

На правах рукописи

ТИХОНОВА ЕЛЕНА БРОНИСЛАВОВНА

ФИЗИОЛОГИЯ РОСТА БАКТЕРИЙ ЛНОООСОССиЯ МШМЮЗ

(03.00.07 - микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биояпгнчрских нчук

Пущине - 1997

Работа выполнена а лаборатории экологической физиологии микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов

доктор биологических наук, профессор Е.Л. Головлев; кандидат биологических наук И.Т. Ермакова

доктор биологических наук, профессор Д.И. Никитин; кандидат физико - математических наук И.Г. Минкевич

кафедра биологии почв ф-та Почвоведения Московского ГосударственногоУниверситета им. М.В. Ломоносова

1997 г. в 1430ч. на заседании Совета по защите диссертаций Д 002.69.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН по адресу: 142292, г. Пущино Московской области., Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан 1997 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита состоится

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций

доктор биологических наук

В.М. Вагабов

Актуальность проблемы. Изучение биологии медленнорастущих микроорганизмов рода Rhodococciis проводится в настоящее время по разным направлениям: подвергается пересмотру их таксономическое положение, исследуются экофизиологические и биохимические особенности, изучаются патогенные свойства некоторых видов, родококки становятся объектами исследования генетиков и молекулярных биологов. Интерес к родококкам оправдан их уникальной способностью к утилизации или трансформации разнообразных веществ (хлорароматические соединения, углеводороды и т.д.). Кроме того, родококки относятся к микроорганизмам, реализующих низкие скорости роста. Они отличаются высокой метаболической активностью и медленной реакцией на меняющиеся условия среды, что дает им возможность легко приспосабливаться и выживать. Перечисленные свойства родококков позволяют использовать их в экобиотехнологических процессах. В связи с этим, несомненный интерес представляют работы, посвященные изучению кинетических особенностей роста роста родококков в лабораторных и промышленных условиях культивирования, физиологической реакции микробной культуры на изменение условий выращивания и связи особенностей физиологии и кинетики роста родококков с их экологическими характеристиками и поведением в естественных условиях обитания.

Состояние вопроса, цель и задачи исследования. Уравнение Моно, лежащее в основе множества моделей роста и воспринимаемое как зависимость скорости роста от текущей концентрации субстрата, вполне удовлетворительно описывало кинетику роста быстрорастущих микроорганизмов, для которых характерна я реакция клеток на изменение концентрации лимитирующего компонента. Однако, эти кинетические модели оказались неприменимы для описания кинетики роста этих микроорганизмов в условиях лимита по консервативным компонентам среды: N, Р и т.д. (Kuenzler et al., 1962, Cunningham et al., 1978), а также микроорганизмов актиномицетной линии (Schaefer, 1948) и олиготрофов (Gaudy et al., 1967, 1971, 1973). Ранее в лаборатории экологической физиологии микроорганизмов проводилась работа по изучению кинетики и регуляции скорости роста родококков в условиях периодического и непрерывного культивирования, и были отмечены некоторые особенности, отличающие родококков от других микроорганизмов. В частности, было показано, что культура растет экспоненциально в широком диапазоне концентраций субстрата, а также выдвигалось предположение о метаболическом лимитировании скорости роста родококков (Барышникова и др. 1980, Аминов, 1986).

В связи с выше изложенным, целью настоящей работы было изучение зависимости скорости роста от концентрации источника углерода и возможных метаболических механизмов регуляции роста родококков.

Для решения поставленных задач было проведено:

-21) изучение зависимости скорости роста от начальной и текущей концентрации субстрата,

2) изучение реакции культуры на обогащение среды источником углерода и резкое снижение его концентрации

3) изучение макромолекулярного состава (РНК, ДНК, белка) в динамике периодического роста быстро- и медленнорастущего штаммов исследуемой культуры и при изменении условий культивирования,

4) изучение энергетического обмена указанных штаммов, взаимосвязи его со скоростью роста,

5) выявление различий в метаболических путях в клетках быстро- и медленнорастущего штаммов на уровне активностей ключевых ферментов метаболизма глюкозы.

Научная новизна. I. Впервые показана своеобразная кинетика роста родококков на ряде углеводов (глюкоза, галактоза, манноза). Характерными особенностями роста на этих субстратах являются: а) низкие скорости роста, б) две константы насыщения субстратом для диапазона низких и высоких его концентраций, в) необычайно высокие значения К, (на порядок и более выше величин, известных для быстрорастущих микроорганизмов, г) рост культуры с постоянной скоростью, заданной исходными условиями, независимо от изменения текущей концентрации субстрата, что является свидетельством аутогенной регуляции скорости роста как механизма ее стабилизации на уровне, детерминируемом начальными условиями. 2. Показано своеобразие механизма регуляции скорости роста медленнорастущих микроорганизмов: ни уровень РНК в клетке (гипотеза "РНК-лимитирования"), ни уровень энергетического обмена не являются факторами, детерминирующими рост этих организмов. 3. Впервые предлагается возможность описания быстро- и медленнорастущих штаммов R.minimus В293 по совокупности фенотипических признаков как фазовых вариантов исследуемой культуры.

Практическая ценность работы. Особенности физиологии родококков, преставленные в настоящей работе, позволяют предсказать поведение этой группы микроорганизмов в различных условиях культивирования. Прогнозирование и моделирование поведения, управление ростом являются конечной целью экофизиологического исследования родококков. Кроме того, исследование возможных лимитирующих звеньев, контролирующих скорость роста, на разных уровнях метаболизма позволяют ближе подойти к пониманию феномена медленного роста родококков.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых ИБФМ РАН (Пущино, 1989 г), на международной конференции "Enzymatic and genetic aspects of environmental biotechnology" (Пущино, 1995), на сессиях научных работ ИБФМ РАН (Пущино, 1989, 1990, 1992).

Публикацни. Основное содержание работы изложено в 3 статьях и 2 тезисах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на /30 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания методов исследования, изложения полученных результатов (4 главы), их обсуждения, выводов. Работа включает 3 таблицы, 31 рисунок. Список литературы содержит^источников литературы (из них/W зарубежные).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования была культура Rhodococcus minimus В293, ранее выделенная из почвы, пропитанной нефтью. Особенностью культуры является ее физиологическая гетерогенность, проявляющаяся в наличии вариантов культуры, отличающихся по максимальной удельной скорости роста на среде с глюкозой. В настоящей работе были использованы два штамма культуры: медленнорастущий вариант (штамм, содержащий не более 5 % клеток быстрорастущего варианта, с максимальной удельной скоростью роста на глюкозе 0.06 1/час) и быстрорастущий вариант (штамм, обогащенный клетками быстрорастущего варианта, с максимальной удельной скоростью на глюкозе 0.15 1/час).

Бактерии культивировали в колбах с объемом среды 75 мл на качалке при 180 об/мин и t=28°C в минеральной среде (рН 7.0) следующего состава (г/л): NH4H2PO4 - 5.5, К2НРО4 *ЗНгО - 10.0, MgS04 *7Н20 - 0.7, FeSO* *7Н20 - 0.003. Среду готовили с добавлением смеси микроэлементов. В качестве источников углерода использовали глюкозу, галактозу, маннозу, фруктозу и ацетат. Определение их концентрации проводили согласно ранее описанным методам (Jemalli, Rodriguez-Kabana, 1970; Дише, 1967).

Интенсивность дыхания измеряли полярографическим методом. Дыхание in situ измеряли в суспензии клеток в культуральной жидкости. Эндогенное дыхание измеряли на отмытых клетках.

Определение АТФ проводили по известной методике (Kimich et al. 1975) с экстратом люциферин-люциферазы из высушенных светлячков (Bakkar, Mangerich, 1983).

Уровень восстановленных пиридиннуклеотидов измеряли на целых клетках в среде культивирования или на отмытых от среды и суспендированных в буфере (рН 7.5) по интенсивности флюоресценции в области 440 нм. Длина возбуждения 366 нм.

Активность ферментов определяли в бесклеточном экстракте, полученном при разрушении на прессе ИБФМ. Содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry et а!., 1951). Активность полифосфатзависимой гексокиназы определяли по методу Шимоны (Szymona, 1962) с полифосфатами п=155. По известным из литературы методикам определяли активность АТФ-зависимой гексокиназы

(Estabrook et a!., 1960), пзоцитратлиазы (Dixon, Kornberg, 1959), пируватдегидрогеназы и кетоглутаратдегидрогеназы (Weitzman, 1972), аминобутираттрансаминазы (Scott, Jakoby, 1958).

За основу метода определения содержания ДНК и РНК брали схему, разработанную Спириным (Спирин, 1958) и Белозерским и описанную Ванюшиным с некоторыми дополнениями (Ванюшин, 1964). Белок определяли по сумме аминокислот (Шкидченко, 1977) и по метод}' Лоури.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Кинетика роста Rhodococcus minimus В293 на средах с разными источникам»

углерода и энергии

Первая часть работы посвящена изучению зависимости скорости роста от начальной концентрации субстрата. Эксперименты проводили по методике Моно. В качестве объекта исследования были два штамма культуры - медленно и быстрорастущий, представляющие из себя разные клоны исходной культуры и различающиеся по скорости роста на глюкозе. В качестве источников углерода и энергии в работе использовали глюкозу, галактозу, маннозу, фруктозу и ацетат.

На рисунке 1 представлена зависимость скорости роста медленнорастущего штамма от начальной концентрации глюкозы в среде. Зависимость имеет двухфазный характер с двумя значениями Ks для диапазона низких (до 2.5 г/л) и высоких (5 г/л и выше) концентраций субстрата. Величины констант насыщения для роста необычайно высоки (на порядок и более выше значений K¡ , известных для быстрорастущих штаммов). Кроме того, кривая зависимости скорости роста от начальной концентрации субстрата не выходит на насыщающий уровень даже при больших концентрациях глюкозы. Кинетика роста быстрорастущего родококка отличается более высоким сродством к субстрату, однако, в целом характер зависимости скорости роста от концентрации субстрата такой же, как и для медленнорастущего варианта.

Аналогичный характер зависимости скорости роста от начальных концентраций субстрата получены и при росте на галактозе и маннозе как для медленно, так и для быстрорастущего штаммов. На фруктозе и ацетате культура растет с более высокими скоростями, и в изученном диапазоне концентраций кинетика роста совпадает с моделью Моно и характеризуется более низкими значениями констант для роста.

Данные, полученные при культивировании на глюкозе, галактозе, маннозе, дают основание полагать, что на кривой периодического роста нашей культуры не должно быть участка с постоянной скоростью роста.

В связи с этим было проведено подробное изучение динамики роста культуры (на примере медленнорастущего варианта) на среде с глюкозой (рис.2). Из рисунка видно, что, напротив, культура растет практически без лаг-фазы с постоянной ско

Рис. 1. Зависимость удельной скорости роста Rhodococcus minimus В293 (медленнорастущий штамм) от начальной концентрации глюкозы в среде: 1 - в обычных координатах, 2 - в координатах Лайнуивера - Берка.

Рис. 2. Динамика роста медленнорастущего штамма Rhodococcus minimus В293 на среде с глюкозой. 1 и 2 - кривые роста, построенные в единицах оптической плотности и веса сухой биомассы соответственно, 3 - динамика потребления глюкозы в процессе периодического культивирования.

ростью, определенной как по изменению оптической плотности, так и по весу сухой биомасы, с момента засева клеток и до полного исчерпания субстрата в среде независимо от изменения концентрации глюкозы в среде, что опровергает выдвинутое выше предположение.

Постоянство скорости роста культуры на фоне изменения концентрации глюкозы в среде показано при всех используемых в опытах концентрациях субстрата. Проанализировав эти данные, мы построили график (рис.3), на котором наглядно показано постоянство скорости роста на фоне изменения концентрации глюкозы в среде для каждого конкретного опыта. Параллельность полученных линий и отражает постоянство скорости роста во всех проведенных экспериментах. Из этого рисунка можно видеть, что одной и той же концентрации глюкозы могут соответствовать разные значения скоростей роста культуры.

Следовательно, удельная скорость роста культуры не зависит от текущей концентрации глюкозы в среде. Таким образом, мы получили два противоречащих друг другу факта:

с одной стороны скорость роста зависит от начальной концентрации глюкозы,

с другой - скорость роста не зависит от изменения концентрации глюкозы в среде в процессе периодического роста.

Несоответствие зависимости ц от Shü4 и постоянства скорости роста в условиях периодического культивирования особенно наглядно можно показать, если построить следующий график для конкретного опыта, (рис. 4). Как видно из рисунка, различие между реальной скоростью роста (кривая 1) и скоростью, рассчитанной согласно зависимости ц от SB34 (кривая 2), увеличивается в процессе роста культуры, то есть возрастает способность культуры поддерживать более высокие скорости роста. Следовательно, реальное поведение культуры не соответствует зависимости скорости роста от начальной концентрации. Культура растет так, как будто бы эта зависимость характеризуется низкими К5.

Способность культуры в процессе периодического роста поддерживать более высокую скорость роста, чем та, которая следует из зависимости ц от Бнач , объясняется отчасти характером зависимости скорости роста от концентрации субстрата, определенной в хемостате для стационарных состояний (Аминов, 1986) (рис.3). В этом случае, зависимость имеет двухфазный характер с более низкими значениями констант для роста. Таким образом, 1) полученная зависимость скорости роста от начальной концентрации субстрата, отличающаяся высокими Ks , не подчиняется кинетике, описываемой уравнением Моно, 2) реальное поведение культуры не соответствует этой зависимости.

Для выяснения вопроса о том, за счет чего поддерживается постоянная скорость роста и какие факторы могут изменить ее в процессе роста, было проведено два вида экспериментов:

Рис. 3. Зависимость скорости роста культуры Кгаттих В293 от концентрации глюкозы в среде: 1 - зависимость скорости роста от начальной концентрации глюкозы в периодических условиях культивирования; 2 - зависимость скорости роста от стационарной концентрации глюкозы в условиях непрерывного культивирования; 3 - зависимость скорости роста периодической культуры от текущуй концентрации глюкозы в среде в опытах, с разными начальными концентрациями глюкозы (а - 5 г/л, б - 2,5 г/л, в - I г/л, г - 0,5 г/л).

время культивирования t часы

Рис. 4. Изменение скорости роста Rhodococctis minimus В293 (медленнорастущий штамм) в процессе периодического культивирования. 1 - изменение реальной скорости роста культуры в зависимости от остаточной концентрации глюкозы в среде, 2 - изменение расчетной скорости роста культуры в зависимости от остаточной концентрации глюкозы в среде, 3 - динамика потребления глюкозы.

-81) опыты с добавками глюкозы в разные фазы периодического роста -* эксперименты типа shift-up, в которых изучалась реакция культуры на

обогащение среды по источнику углерода, 2) опыты с перенесением клеток в среду с пониженным содержанием субстрата эксперименты типа shift-down, в которых изучалась реакция культуры на резкое снижение концентрации глюкозы в среде.

Опыты shift - up. Импульсное внесение глюкозы проводили в разные фазы роста культуры. Начальные условия культивирования были выбраны не случайным образом, а исходя из того установленного факта, что зависимость скорости роста от начальной концентрации характеризуется двумя Ks : для диапазона низких (до 2.5 г/л) и высоких (от 5 г/л) концентраций глюкозы. Сравнивали влияние условий предварительного выращивания на характер реакции культуры. Показано, что при дополнительном внесении источника углерода ее скорость роста увеличивается, но только при культивировании в среде с низкими начальными концентрациями субстрата (до 2.5 г/л) (рис.5), причем после добавки глюкозы культура начинает расти с постоянной скоростью и без лаг-фазы.При высоких исходных концентрациях глкусозы реакции культуры на обогащение среды не наблюдалось, в этом случае можно говорить о ограничении скорости роста "сверху". Подобный тип ответа получен для обоих штаммов при росте на глюкозе, галактозе и маннозе.

Рис. 5. Динамика роста (1) и дыхательной активности (2) медленнорастущего штамма Rhodococcus minimus В293 при импульсных добавках 5 г/л глюкозы в среду с начальной концентрацией глюкозы 0.66 г/л. Светлые символы - контроль, темные символы - после импульса глюкозы. Столбики - концентрация глюкозы в среде в момент дополнительного внесения субстрата. Добавка сделана: а - в начале экспоненциальной фазы, б - в конце экспоненциальной фазы, в - в стационарной фазе.

Данные по изменению скорости роста при импульсном внесении глюкозы суммированы на рисунке 6. Как видно из рисунка,' скорость роста, с которой культура растет после добавки, значительно выше скорости, которую можно было бы ожидать исходя из зависимости ц от Бшч.

Рис. 6. Влияние импульсных добавок глюкозы на скорость роста культуры Rhodococcus minimus В293 (медленнорастущий штамм) при разных начальных концентрациях субстрата. 1 - зависимость удельной скорости роста ц от начальной концентрации глюкозы S„a4, 2 - зависимость удельной скорости роста ц", которую культура реализует после добавки субстрата, от концентрации субстрата S", равной сумме текущей концентрации субстрата в среде в момент добавки Stc* и количества добавленной глюкозы Sam при начальнойконцентрации глюкозы в среде 1 г/л. 3 - зависимость удельной скорости роста ц"от S" при начальной концентрации глюкозы в среде 5г/л.

Опыты shift-down. Клетки, взятые из среды с высоким содержанием субстрата (5 г/л) в разные фазы роста, отмывали и стерильно переносили в новую среду с низкой концентрацией субстрата (1 г/л), (рис.7). Культура реагировала на новые условия выращивания уменьшением скорости роста в тех случаях:

1) когда использовали клетки из ранней экспоненциальной фазы (1.5 -2.0 часа),

2) когда использовали клетки, взятые в конце экспоненциальной фазы (когда остаточная концентрация глюкозы в среде снижалась до 2.5 г/л и ниже).

При этом результирующая скорость в новой среде соответствовала зависимости ц от SM, . При переносе клеток из фазы активного роста, когда текущая концентрация глюкозы в среде была еще высока, культура практически не реагировала на изменение условий культивирования. Т.о. механизм поддержания скорости роста исследуемой культуры может работать на повышение скорости роста и на ее понижение.

Рис. 7. Изменение скорости роста культуры Rhodococcus minimus В293 (медленнорастущий штамм) при переносе клеток из среды с начальной концентрацией5 г/л в среду с начальной концентрацией 1 г/л в разные периоды роста. 1 - кривая роста, контроль, 1а, 16, 1в - кривые роста, опыт, 2 - динамика потребления глюкозы в контрольном опыте.

Исходя из полученных данных, свидетельствующих о мультистабильности роста культуры в широком диапазоне концентраций субстрата, предполагается наличие автогенной регуляции скорости роста культуры, то есть механизма стабилизации скорости роста на уровне, определенном начальными условиями. Однако, говорить об автономности поведения культуры можно лишь в определенном смысле. При низких концентрациях субстрата автогенная регуляция скорости роста предполагает тем не менее способность культуры реагировать на резкое увеличение или снижение концентрации субстрата изменением скорости роста. Тот факт, что поведение культуры в процессе периодического роста, а также реакция культуры на изменение концентрации субстрата не укладываются в полученную нами зависимость скорости роста от начальной концентрации субстрата, позволяет предположить, что скорость роста не контролируется внешним субстратом. Контролирующим элементом в механизме автогенной регуляции скорости роста является, скорее всего, внутриклеточный метаболит-регулятор, причем, предположительно, зависимость скорости роста от концентрации этого метаболита характеризуется более высоким сродством к субстрату. В связи с этим, в дальнейшем поиск скоростьлимитирующей стадии проводили на внутриклеточном уровне.

2. Изменение состава компонентов активной части биомассы при разных скоростях роста культуры R.minimus В293.

Поиск внутриклеточного лимитирующего скорость роста звена проводится на самых разных уровнях клеточного метаболизма (транспорт органического субстрата, белоксинтезирующий аппарат, промежуточный метаболизм). Данный

раздел работы посвящен изучению возможности лимитирования скорости роста исследуемой культуры на уровне белоксинтезирующего аппарата, в частности, применимости концепции РНК - лимитирования к таким микроорганизмам, как родококки. Для реализации поставленной задачи изучали содержание РНК, ДНК, белка в клетках двух штаммов культуры Rhodococcus minimus на средах с разными начальными концентрациями глюкозы и при обогащениях среды путем импульсных добавок источника углерода в ходе роста культуры.

Установлено, что содержание белка и ДНК в клетках не изменялось не зависимо от условий культивирования и обьекта исследования. Различия отмечались лишь в содержании РНК, что коррелирует с различиями в скоростях роста у медленно- и быстрорастущего вариантов, что видно из рис. 8. Причем, общее содержание РНК у этих микроорганизмов ниже (до 5.5%), чем у быстрорастущих бактерий. Хотя рост исследуемых родококков начинается практически без лаг-фазы, в динамике РНК имеет место временная задержка в 1-2 часа. В дальнейшем по кривой роста количество РНК достигает максимального уровня через 4-6 часов и остается далее постоянным до стационарной фазы.

Рис. 8. Динамика содержания РНК в процессе периодического роста медленнорастущего (М) и быстрорастущего (Б) штаммов И.тгттш В293 при разных начальных концентрациях глюкозы в среде, а - 1 г/л, 6-5 г/л. Пунктиром показано начало стационарной фазы.

Опыты с импульсным внесением глюкозы показали, что при низких начальных концентрация* глюкозы в среде, когда культура реагировала на обогащение среды увеличением скорости роста, в клетках увеличивалось лишь содержание РНК. И в этом случае также имела место временная задержка в ответе РНК. При этом содержание белка и ДНК оставалось неизменным. При высоких исходных концентрациях глюкозы импульс субстрата не вызывал ни изменения скорости роста, ни содержания РНК.

Сопоставление динамики прироста биомассы, удельной скорости синтеза белка и содержания РНК (рис. 9) позволяет отметить, что

1 -0-1

1 2 3 4 5 24 48 72 Время культивирования, часы

а

- 121) удельная • скорость роста культуры достигает постоянного значения практически сразу после засева культуры, в то время как динамика содержания РНК запаздывает, 2) с еще большей задержкой во времени достигает своего постоянного значения удельная скорость синтеза белка.

РНК. % к сух. биом.

1п (ОП: белок, мг/мл)

5 10 15

время культивирования, часы

Рис. 9. Динамика содержания РНК (1) и кривые роста по оптической плотности (2) и белку (3) в процессе периодического роста медленнорастущего варианта культуры Ят/тти.? В293.

Эта динамика отличается от классической кинетики РНК-лимитирования, указывая скорее на то, что синтез РНК и ее уровень "подстраивается" под установившуюся скорость роста культуры и не является фактором, определяющим рост культуры в новой среде. Родококки имеют, скорее всего, достаточный уровень белоксинтезирующего аппарата, что позволяет им адаптироваться к новым условиям культивирования и расти в широком диапазоне скоростей роста. Наблюдаемое отсутствие лаг-фазы для роста исследуемой культуры и экспериментально показанное отставание динамики РНК может быть связано с интенсивным потоком на запасание в первые часы роста. Преимущественный синтез пассивной части биомассы и отставание синтеза активной части является характерной реакцией культуры на улучшение питательных свойств среды. Следовательно, вопрос контроля скорости роста родококков решается клеткой на другом внутриклеточном уровне.

3. Взаимосвязь энергетического обмена и скорости роста культуры Я.тЫтш В293.

Проведенные ранее исследования с близкими к изучаемым в настоящей работе микроорганизмами показали, что имеется ряд особенностей, характеризующих своеобразие их энергетического обмена, а именно:

I) избыток восстановительных эквивалентов, возможно, ингибирующих дегидрогеназы (Ерошина и др., 1977),

- 132) низкая скорость поглощения кислорода клетками, коррелирующая со

скоростью роста (Аминов, 1986), 3) различия в составе дыхательной цепи и ее эффективности, коррелирующие

со скоростью роста (Ермакова, 1990) Целью настоящего раздела работы было выяснение вопроса, является ли уровень энергетического обмена фактором, детерминирующим скорость роста исследуемой культуры. Для реализации поставленной цели проводили сравнительное изучение параметров энергетического обмена (дыхательной активности, пула АТФ, уровня восстановленных пиридиннуклеотидов) в клетках медленно- и быстрорастущего штаммов при росте на разных субстратах, разных начальных концентрациях источников углерода и в условиях переходных режимов.

Было установлено, что динамика дыхательной активности на всех перечисленных субстратах имеет одинаковый характер. На примере динамики интенсивности дыхания медленнорастущего родококка на глюкозе (рис. 10) показано, что потребление кислорода клетками достигает максимальной скорости через 1-2 часа после засева культуры, после чего начинается снижение дыхания до стационарной фазы. Динамика дыхания клеток быстрорастущего родококка имеет тот же характер. Однако, надо отметить, что дыхание медленнорастущего штамма резистентно к КСЫ и ниже в 1.3 раза уровня интенсивности дыхания быстрорастущего родококка, чувствительного к КСЫ.

На рис. 11 представлены данные, характеризующие максимальный уровень интенсивности дыхания родококков на разных субстратах. Как видно из рисунка, низкие скорости роста медленнорастущего штаммг. на глюкозе, галактозе, маннозе (0.01-0.06 1/час), Л. егуЛгороНя на глюкозе коррелирует с пониженной интенсивностью дыхания (120-150 натом 0/мг*мин) и резистентностью дыхания к КС>1. У быстрорастущего штамма характер подобной корреляции между интенсивностью дыхания и скоростью роста на среде с глюкозой и маннозой сохраняется. При росте обоих штаммов на фруктозе и ацетате скорость роста и интенсивность дыхания значительно выше (скоростей роста - 0.08-0.12 1/час, дыхание клеток - 200 220 натом 0/мг*мин, чувствительность к I мМ KCN - 60-80 %). Однако, результаты измерения дыхания при росте обоих штаммов в среде с разными начальными концентрациями субстратов показали, что связи между дыхательной активностью и изменением скорости роста в результате изменения начальнойконцентрации внешнего субстрата нет. Кроме того, максимальная скорость роста медленнорастущего штамма на глюкозе и минимальная скорость роста быстрорастущего родококка на глюкозе примерно равны, однако по интенсивности дыхания и состоянию дыхательной цепи штаммы различаются в значительной степени. Следовательно, начальная концентрация субстрата в среде определяет скорость роста культуры (как в случае быстро-, так и медленнорасту щего штаммов), но не затрагивает систему регуляции энергетического обмена.

■g Л

I I

•о

4i 2k 36„ 48 CO время культивирования , часы

Рис. 10. Динамика дыхательной активности медленнорастущего штамма R.. minimus В293 при росте на среде с глюкозой. 1 - кривая роста. 2 - концентрация глюкозы в среде, 3 - интенсивность дыхания клеток in situ , За - то же. но с внесением в полярографическую ячейку 27 мМ глюкозы. Заштрихованные столбики -эндогенное дыхание, светлые - то же, но с внесением в полярографическую ячейку 27 мМ глюкозы. Цифры на кривой роста - степень ингибирования (-) или стимулирования (+) дыхания I мМ KCN.

¿00

too

ао/ -

Rftodococcus minimus

о яедленнорастуиии штамп

■ 5ыстрорзатущии штамп

№Н-ноъа

ГШИ010 ацетат

И

af

0(Х

i ¡0 <10 as 25 S 20 1 S 1 5 г/а

концентрация субстрата

Рис. 11. Влияние начальной концентрации субстрата (г/л) на удельную скорость роста и дыхательную активность при культивировании К/юЛососсш пит-пиа В293 на разных источниках углерода.

Реакцию дыхательной активности на изменение концентрации субстрата изучали также в опытах с добавками глюкозы при ее низких и высоких начальных концентрациях субстрата. Установлено, что дыхание клеток медленно- и быстрорастущего штаммов, как и скорость роста, реагирует на добавку лишь в условиях низких начальных концентрациях субстрата (рис. 5). 8 опытах с начальной концентрацией глюкозы 5 г/л культура не реагировала на добавку субстрата ни изменением скорости роста, ни дыхательной активности. Аналогичные закономерности получены и для быстрорастущего штамма.

Одной из особенностей энергетического обмена исследуемых штаммов является высокое (относительно дыхания in situ) эндогенное дыхание. Оно составляет 50% от дыхания in situ по всей кривой роста как у быстро-, так и у медленнорастущего родококков. В начальный период роста эндогенное дыхание практически не реагирует на экзогенную глюкозу (рис. 10), что свидетельствует о наличии внутриклеточных субстратов для окисления и их значительном вкладе в общую дыхательную активность. В отличие дыхания in situ, зависимость эндогенного дыхания клеток медленно- и быстрорастущего штаммов при росте на глюкозе от концентрации субстрата имеет двухфазный характер с разными значениями Км в области низких (0.002 - 0.02 г/л) и высоких (1 - 40 г/л) концентраций глюкозы (рис. 12). Значения Kmi и Кмг различаются на два порядка

Рис. 12. Зависимость скорости потребления кислорода ¡отмытыми клетками медленнорастущего штамма культуры Rhodococcus minimus В293 от концентрации глюкозы: 1 - в обычных координатах, 2 - в координатах Лайнуивера - Берка.

между собой. Значения этих констант для быстрорастущего родококка в 2 раза ниже, чем для медленнорастущего. Приведенные данные коррелируют с результатами кинетики транспорта, полученными для этих штаммов (Соколова, Барышникова, 1990).

Для исследования возможной связи между скоростью роста культуры и уровнем энергетического обмена проводили измерение пула АТФ при росте культуры на разных субстратах и при разных концентрациях источников углерода.

%

Ь i -IPO ZOO ЗОО 1 i>

—i-4jj—i—i—i—i-

0.25 ai i ю 20зою ионцентраиия гакжозы , 5 у/л

пиридиннуклеотидов (3)и пула АТФ (4) в условиях периодического культивирования медленнорастущего штамма культуры Rhodococcus minimus В293 па среде с глюкозой.

Как видно из рис. 13 в первые часы роста культуры происходит снижение содержания пула АТФ с последующим увеличением его до исходного уровня, что соответствует пику дыхательной активности в тот же период роста. Уровень АТФ в клетках быстро- и медленнорастущего штаммов одинаков, несмотря на различия в скоростях роста, интенсивности дыхания и эффективности функционирования путей переноса электронов. Содержание АТФ не зависит ни от концентрации, ни от природы ростового Субстрата. Так, при культивировании на средах с фруктозой и ацетатом никаких принципиальных различий в динамике и содержании АТФ не обнаружено.

Опыты с добавками субстрата по фону низких и высоких начальных концентраций показали, что содержание АТФ не изменялось ни в тех условиях, когда культура реагировала изменением скорости роста и дыхательной активности, ни в тех, когда реакции клеток не было отмечено.

Таким образом, различий в пуле АТФ в штаммах, реализующих разные скорости роста и отличающихся разной эффективностью генерации энергии, не обнаружено.

Динамика восстановленных пиридиннуклетидов в процессе роста медленнорастущего штамма аналогична динамике АТФ (рис. 13). Уровень восстановленных пиридиннуклеотидов в клетках быстрорастущего штамма,

дыхание которого чувствительно к КСМ, на 20-30% ниже, чем в клетках медленнорастущего родококка, резистентного к КСМ. При изменении скорости роста в результате изменения начальной концентрации уровень восстановленных пиридиннуклеотидог. не изменялся.

Таким образом,полученные данные позволяют сделать вывод о том, что уровень энергетического метаболизма достаточен и не лимитирует рост каждого из штаммов, различающихся по эффективности генерации энергии (основной путь переноса электронов у быстрорастущего варианта и цианидрезистентный - у медленнорастущего).

4. Сравшпсльное изучение особенностей промежуточного метаболизма медленнорастущего и быстрорастущего штаммов культуры ¡¡.тштю В293

Известно, что родококки имеют сложную систему промежуточного обмена, с наличием многочисленных параллельных путей и шунтов и низким общим уровнем активности. Особенностями их метаболизма являются низкие активности ферментов ЦТК, его раюмкнутость на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы, отсутствие пируватдетдрогеназы, аминобутиратного шунта, высокая активность глиоксилатного шунта (Головлёв и др., 1983), процесс фосфорилирования глюкозы в клетках коринеподобных бактерий и некоторых родококков осуществляется не за счет энергии АТФ при участии АТФ-гексокиназы, а при участии ПФ-гексокиназы (Ерошина и др., 1980). В связи с этим, было предпринято исследование выявления различий в функционировании метаболических путей в клетках двух вариантов исследуемой культуры. Были определены активности ряда ферментов гликолиза (АТФ- и полифосфатзависимой гексокиназы, пируватдегидрогеназы), ЦТК (а-кетоглутаратдегидрогеназы), ключевых ферментов глиоксилатного (изоцитратлиазы) и аминобутиратного (у-аминобутираттрансаминазы) шунтов.

На рис.14 представлена активность гексокиназных ферментов в динамике роста быстро- и медленнорастущего вариантов на среде с глюкозой. Активность ПФ-гексокиназы несколько выше в клетках быстрорастущего варианта, чем у медленнорастущего. Активность АТФ-гексокиназы у обоих вариантов ниже, чем полифосфатгексокиназы. При росте культуры на фруктозе клетки также были способны использовать полифосфаты в реакции фосфорилирования, при этом активность полифосфатзависимой гексокиназы в клетках обоих вариантов была практически одинакова и также преобладала над активностью АТФ-гексокиназы. Из полученных результатов можно заключить, что 1) ПФ-гексокиназа является конститутивным ферментом в клетках обоих штаммов. Свойство использовать полифосфаты для фосфорилирования углеводов, характерное для родококков, не определяется условиями внешней среды и не зависит от скорости роста культуры. 2) Более высокая активность ПФ-гексокиназы в первые часы роста культуры коррелирует с высоким уровнем дыхания в этот период и, возможно, оправдана

повышенной потребностью клетки в продукте гексокиназной реакции - гл-6-фосфате, необходимом как для промежуточного обмена, так и для процессов синтеза резервных веществ.

время культивирования .часы

Рис. 14. Динамика активностей АТФ- и полифосфатзависимой гексокиназ в клетках быстро- (Б) и медленнорастущего (М) штаммов Rhodococcus minimus В293 при культивировании на среде с глюкозой. 1 - полифосфатгексокиназа, 2 -АТФ - гексокиназа.

Установлено, что при росте на глюкозе в клетках как медленно-, так и быстрорастущего штаммов не обнаружены активности а-кетоглутарат-дегидрогеназы, пируватдегидрогеназы, у-аминобутираттрансаминазы. Активность изоцитратлназы, ключевого фермента глиоксилатного шунта, в клетках обоих вариантов была равна.

Следовательно, для родококков, различающихся по скорости роста, характерно наличие одних и тех же блоков на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы, отсутствие аминобутиратного шунта и одинаковая активность глиоксилатного шунта. Таким образом, рассмотренные метаболические реакции не являются "узким местом", определяющим различия в регуляции скорости роста в клетках исследуемых вариантов культуры.

Особенности физиологии родококков (физиологическая гетерогенность популяции, конститутивный синтез большинства ферментов, достаточность уровня энергетического обмена и белоксинтезирующего аппарата и др.) определяют поведение объекта в естественных условиях обитания. Родокки относятся к медленнорастущим микроорганизмам, но потенциально способны поддерживать и высокие скорости размножения. Причиной тому является, скорее всего, то, что в основе поведенческой программы родококков лежит, в первую очередь, готовность к сохранению жизнеспособной популяции в неблагоприятных условиях. Аутогенное ограничение скорости роста, позволяющее культуре некоторую автономность поведения независимо от условий окружающей среды, также может указывать на запрограммированность родококков на выживание в нестабильной и непредсказуемо меняющейся среде.

- 19-

выводы

1. Особенностью кинетики роста Rhodococcus minimus В293 (как медленно-, так и быстрорастущего штаммов) на средах с глюкозой, галактозой и маннозой является зависимость удельной скорости роста от начальной концентрации субстрата, характеризующаяся наличием двух разных К5 в диапазонах низких и высоких начальных концентраций и необычно высокими значениями этих К,. Уравнение Моно не применимо для описания и предсказания поведения-родококков в условиях периодического культивирования на данных источниках углерода, тогда как рост исследуемой культуры на фруктозе и ацетате подчиняется кинетике Моно (экспоненциальный рост с низкими константами насыщения субстратом).

2. Реакция культуры (изменение скорости роста при изменении текущей концентрации субстрата (глюкозы)) не соответствует полученной кинетической зависимости скорости роста от начальной концентрации внешнего субстрата. Скорость роста R.minimus при периодическом культивировании не зависит от текущей концентрации источника углерода. Предполагается аутогенная регуляция скорости роста как механизм стабилизации скорости роста на уровне, определенном начальными условиями культивирования.

3. Уровень РНК "подстраивается" под установившуюся скорость роста культуры и не является фактором, лимитирующим рост культуры в новой среде. Преимущественный синтез пассивной части биомассы родококков (запасные вещества) и отставание активной части (биосинтез макромолекул) является характерной реакцией культуры на увеличение содержания субстрата (глюкозы) . в среде культивирования.

4. Уровень энергетического метаболизма достаточен и не лимитирует скорость роста каждого из исследуемых штаммов. Различия в уровнях энергетического обмена медленно- и быстрорастущего родококков являются следствием функционирования регуляторной системы и определяются, вероятно, включением разных путей сброса восстановительных эквивалентов с разной эффективностью генерации энергии (основная дыхательная цепь или цианидрезистентный путь переноса электронов).

5. Показано, что для родококков, различающихся по скорости роста, характерно наличие одних и тех же блоков на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы, пируватдегидрогеназы, отсутствие аминобутиратного шунта и одинаковая активность глиоксилатного шунта, преобладающая активность полифосфатзависимой гексокиназы по сравнению с АТФ-гексокиназой. Рассмотренные метаболические реакции не являются "узким местом", определяющим различия в регуляции скорости роста исследуемых вариантов культуры.

-206. Аутогенная регуляция скорости роста, физиологическая гетерогенность популяции родококков, а также другие, обсуждаемые в данной работе особенности физиологиии исследуемой культуры являются основой поведенческой программы родококков, направленной, прежде всего, на выживание, поддержание жизнеспособности популяции в неблагоприятной и непредсказуемо меняющейся среде.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ермакова И.Т., Барышникова Л.М., Чемерис Н.А., Тихонова Е.Б. 1989. Регуляция скорости роста Rhodococcus minimus. Всесоюзная конференция "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов". ОНТИ НЦБИ АН СССР. Пущино. С.32.

2. Ермакова И.Т., Тихонова Е.Б., Барышникова Л.М., Чемерис Н.А., Головлев Е.Л. 1991 Зависимость скорости роста родококков от концентрации источника углерода в среде. Микробиология. Т.60. Вып.2. С.305-313.

3. Тихонова Е.Б., Ермакова И.Т., Головлев Е.Л. 1992 Изменение пула АТФ в динамике периодического роста Rhodococcus minimus В293. Микробиология. Т.61. Вып.4. С.591-597.

4. L.M.Baryshnikova, I.T.Ermakova, E.B.Tikhonova, E.L.Golovlev. 1995. Intermediary metabolism of aromatic degrading rhodococci. EERO Workshop "Enzymatic and genetic aspects of environmental biotechnology". 21-25 June. Pushchino. P.2.

5. Тихонова Е.Б., Ермакова И.Т., Головлев Е.Л. 1996. Реакция культуры Rhodococcus minimus на изменение концентрации источника углерода: макромолскулярный состав и энергетический обмен. Микробиология. Т.65. Вып.4. С.451-456.

27 Л 1.96 г. Зак.73*25Р. Тир ЛОР экз. -Уел. печ. л. I, -?5.

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПШ РАН