Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт органического субстрата и синтез запасных веществ углеводной природы в связи с кинетикой роста RHODOCOCCUS MINIMUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Транспорт органического субстрата и синтез запасных веществ углеводной природы в связи с кинетикой роста RHODOCOCCUS MINIMUS"

на правах рукописи

ТРАНСПОРТ ОРГАНИЧЕСКОГО СУБСТРАТА И СИНТЕЗ ЗАПАСНЫХ ВЕЩЕСТВ УГЛЕВОДНОЙ ПРИРОДЫ В СВЯЗИ С КИНЕТИКОЙ РОСТА ШОПОСОССиЬ МШ№5

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 4

Пущино - 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории экологической физиологии микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Е. Л. Головлев; кандидат биологических наук Л.М.Барышникова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор И.Н.Позмогова; кандидат биологических наук Э.Г.Дедюхина

Ведущая организация: кафедра биологии почв ф-та Почво-

ведения Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится 21 июня 1996 г. в 1430 ч. на заседании специализированного совета Д 002.69.01 в Институте биохимии и физиоло-

142292^ г.Пущино Московской обл.., ; институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН ;

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Автореферат разослан ^ мая 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

В.М.Вагабов

Актуальность проблемы. Медленнорастущие микроорганизмы, в частности бактерии актиномицетной линии эволюции рода Rhodococcus, у которых выявлены способности разлагать ксенобиотики (например, хлорфено-пы). а также утилизировать нефть и нефтепродукты, в последнее время зсе больше привлекают внимание микробиологов. Эти организмы постоянно находятся в состоянии крайне медленного роста, фактически не реагируют ускорением размножения на повышение содержания питательных веществ в :реде. Поэтому "вспышек" роста родококков в природных биоценозах ' не происходит (Головлев, 1983). -■,. . •

На примере быстрорастущих микроорганизмов известно, что отбор по . :корости роста имеет первоочередное значение для их эволюции. Это поз-золяет более эффективно использовать субстрат и, следовательно, поддерживать жизнеспособность в экологически нестабильной постоянно меняющейся среде. В рамках этих представлений детально исследовались закономерности регуляции метаболического потока на уровне отдельных ферментов и ферментных систем (Иерусалимский, 1966); на уровне крупных метаболических блоков, контроль активности которых может осуществляться одновременным действием нескольких регуляторных механизмов (Сель-гав, 1978); а также на уровне регуляции метаболических блоков и метаболизма в целом, например, поливалентными регуляторами {цАМФ, адени-патный заряд, гуанозинтетрофосфат и т.д.) Обычно подразумевается, что выявленные на этих микроорганизмах механизмы регуляции роста и метаболизма универсально применимы для всего микробного мира (Печуркин, 1978). Однако, многие из установленных для этих культур закономерностей роста неприложимы к представителям других экологических и таксономических групп (Головлев. 1983; Аминов. 1986; Паников, 1986). Так, для медленнорастущих микроорганизмов, в частности родококков, до сих пор неизвестно, какие механизмы поддерживают стабильную численность их популяции в природных условиях.

Поэтому, управление культурами родококков. а также понимание их кизнеспособности в природных условиях требуют изучения физиологических эсобенностей и ответственных за них метаболических механизмов)

Состояние вопроса, цель и задачи исследования. Транспорт субстрата является первым звеном взаимодействия субстрата с клеткой в длинной депи метаболических реакций. Поэтому логически обоснованно предположить, что именно процесс поглощения субстрата регулирует поток вещества в клетку, и, соответственно, скорость роста культуры. Попытки связать скорость поглощения субстрата со скоростью роста предпринимались для быстрорастущих организмов (Klebsiella aerogenes. Escherichia coli) эще с 60-х годов. Аналогичные работы для медленнорастущих организмов.

в частности родококков, отсутствуют.

В то же время, отток субстрата на биосинтез углеродсодержащих резервных компонентов клетки является еще одним возможным механизмом, регулирующим скорость роста микроорганизмов (Паников, 1989). Высокая активность метаболического потока, связанная с накоплением углеводов (стабильный уровень полисахаридов в клетках родококков составляет 20-2555; от сухой биомассы даже в ненасыщенной среде) может быть причиной 'замедленного роста бактерий.

• В лаборатории экологической физиологии микроорганизмов многолетние исследования по экологии, физиологии и биохимии медленнорастущих организмов проводились с Rhodococcus minimus В293. Выделение быстрорастущего клона (rtsax = 0.36ч"1) S. minimus В293 предоставило дополнительные возможности в изучении регуляции скорости роста медленнорастущих организмов на примере Л.minimus В 293.

С учетом вышеизложенного цель работы заключалась в изучении роли транспорта органического субстрата (глюкозы) в клетки и синтеза запасных углеводсодержащих веществ в регуляции скорости роста Rhodococcus minimus В293. Для реализации указанной цели решались следующие задачи:

1) изучение поглощения глюкозы клетками медленнорастущего и быстрорастущего штаммов R. minimus В293 в зависимости от условий культивирования;

2) исследование свойств и транспортных систем глюкозы у медленнорастущего и быстрорастущего штаммов R. minimus В293;

3) изучение регуляции скорости транспорта глюкозы в клетки R.minimis В293:

4) изучение динамики запасных углеводсодержащих компонентов биомассы у медленно- и быстрорастущего штаммов R. minimus В293 в зависимости от условий культивирования.

Научная новизна работы. 1. Впервые изучена система транспорта глюкозы у представителя медленнорастущих микроорганизмов R. minimus В293. Показано, что транспорт глюкозы энергозависим и осуществляется в основном за счет разности электрохимического потенциала ионов водорода; медленнорастущий штамм имеет 2 системы транспорта глюкозы в растущей культуре, причем одна из них S1 является индуцибельной галактозной системой, способной транспортировать глюкозу, а вторая S2 - конститутивной глюкозной системой. Быстрорастущий штамм имеет одну транспортную систему глюкозы S3 (конститутивная, галактозная система, способная переносить глюкозу) как в растущей культуре, так и в условиях голодания; обнаружен механизм катаболитной репрессии-инактивации ("глю-

эзный эффект") транспорта глюкозы у R.minims В293;

2. Впервые изучена динамика запасных углеводсодержащих компонен-эв биомассы R.mtnlmus В293 (гликогена и трегалозы) в условиях перио-лческой культуры, голодания по источнику углерода и на средах с раздай источниками углерода. Показано, что скорость синтеза углеводной асти биомассы значительно опережает скорость синтеза белка.

Практическая ценность работы. Изучение транспорта глюкозы как озможного звена, регулирующего скорость роста культуры, а также расп-еделения метаболических потоков (накопление запасных углеводных ком-онентов биомассы) у R.minimus В293 позволило глубже понять механизмы, етерминирующие скорость роста у медленнорастущих бактерий. Полученные езультаты представляют теоретическую базу для разработки адекватных атематических моделей, прогнозирующих динамику популяций медленнорас-ущих микроорганизмов в природных условиях, а также для разработки оп-имальных алгоритмов управления ростом и физиологической активностью анной группы микроорганизмов в лаборатории и промышленности.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на :онференции молодых ученых ИБФМ РАН (Пущино. 1988 г-.), на конференции Биоконверсия-88" (Рига, 1988 г.), на конференции "Регуляция микробно-'о метаболизма" (Пущино, 1989 г.). на сессиях научных работ ИБФМ РАН ;пущино, 1992, 1993 г. г.).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 6 статьях и 3 тезисах.

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на страницах «ашинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описа-■шя методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуж-цения, заключения, выводов, приложения. Работа включает 24 таблицы, 19 эисунков. Список литературы содержит 258 источников (из них 192 зару-Зежные).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Объекты исследований. Объектом исследований при изучении роли транспорта органического субстрата и синтеза запасных веществ углеводной природы в связи с кинетикой роста служил Hiodococcus minimus в 893, выделенный из почвы, пропитанной нефтью, при поиске микроорганизмов, трансформирующих органические соединения. В нашей работе использовались два штамма культуры R. minimus В293: медленнорастущий штамм (/ijnax на среде с глюкозой составляла 0.05 ч'1) и быстрорастущий штамм

- 4 -

(Цпах на среде с глюкозой составляла 0.15 ч"1)-

2. Культивирование R. minimus В293 проводили на среде Канеда (модифицированной) следующего состава, г/л : NaCl - 0.5 ; ifgSÛ4-7tf20 -0.1 ; KHzPOi - 2.0 ; (NHi)zSOi - 2.0 : источник углерода в требуемой концентрации ; рН 7.0 (Kaneda & Roxburg, 1959). Условия опытов в периодическом режиме : колба Эрленмейера на 750 ш с объемом среды 100 мл, качалка 180 об/шн ; температура 28° С. Кроме колб культивирование проводили также в ферментере АНКУМ-2М. рабочий объем Зл, в периодическом и проточном режиме хемостата с лимитом по источнику углерода, азота или фосфора.

Опыты по голоданию проводили с клетками, взятыми из стационарной фазы роста и отмытыми раствором следующего состава, г/л : NaCl -0.5 и MgSOi■ 7Нг0 -0.1 при рН 7; культуру инкубировали в колбах на качалке при 28"С в ростовой среде Канеда без источника углерода.

3. Определение концентрации глюкозы осуществляли глюкозооксидаз-ным методом (Jemnall & Rodrlges-Kabana, 1970), используя глюкозоокси-дазу с активностью 250 ед/мг (Serva). Эффективность определения соста-ляла 7-10 мг/л.

4. Определение поглощения глюкозы проводили по модифицированному методу Germaine G. (Germaine & Tellefson, 1981) следующим образом : посевной материал выращивали в жидкой синтетической среде с глюкозой или другими углеводами. Биомассу дважды отмывали холодным раствором (0.5 г/л NaCl + 0.8 г/л AfgS04-7H20 при рН 7). Поглощение оценивали по включению равномерно меченной глюкозы, фруктозы или галактозы при 28° С. Реакционную смесь готовили на 10 M HEPES - TPMC буфере, рН 7,0, она содержала равномерно меченную 14С-глюкозу в необходимой концентрации, исходя из условий опыта : 7-71 жМ для S1 и 0.5-20 тМ для S2. и 0,56-0,6 мг клеток/мл. Пробы отбирали через 30 с и 1 шн в течение 2,5 и 5 шн. Впрыскивали в пробирки с 10 ш холодного 10 тМ раствора глюкозы. фильтровали через фильтр GF/F ("WHATMAN"), высушивали, помещали во флаконы со сцинтиллядаонным раствором, содержащим 4 г/л 1,4-бис-2-(5-фенилоксазо-лил)-бензола и 50 мг/л 2,5-дифенилоксазола, и просчитывали на спектрометре "SL-30 Intertecfintque" с эффективностью регистрации 80%. Скорость поглощения выражали в нмоль включенного субстрата мин'1 иг белка'1.

Оптимальные условия поглощения глюкозы (рН, t°, буфер, содержание белка в пробе) были ранее подобраны в лаборатории (Барышникова, Ероши-на и др., 1985).

5. Определение гликогеноподобных полисахаридов и трегалозы. Коли-

чественное содержание гликогена и полисахаридов клеточной стенки проводили по модифицированному методу Цевенхьюзена (геуейиЧгеп, 1966).

К навеске лиофильно-высушенной биомассы добавляли 7,51$ ИаОН (5 мл)- и проводили гидролиз при 105°С 4 часа. К гидролизату приливали двойной обьем 96% этанола (осаждение клеточных сеток и гликогена) и центрифугировали в течение 30 мин при 15 тыс. об. /тн. К осадку добавляли 5%-ную ТХУ так, чтобы конечная концентрация была 2,5-3.0%. Центрифугировали 30 мин при 15 тыс. об/ шн (гликоген - в растворе, клеточные стенки - в осадке). Гликоген осаждали из супернатанта двойным объемом спирта и центрифугировали 20 мин при 5 тыс. об. /мин. К осадкам гликогена и клеточных стенок добавляли 5 мл ЗИ Я2504 и проводили 6ч гидролиз при температуре 100°С. Пробы после нейтрализации промеряли на редуцирующие вещества с антроновым реагентом, а также методом Нельсона. Качественный и количественный состав моносахаров определяли на анализаторе углеводов фирмы Вго%гоп1с (ФРГ). Содержание гликогена и полисахаридов клеточной стенки выражали в процентах к весу сухой биомассы.

Кроме того, гликоген и трегалозу определяли методом 'Н-ЯМР. Методика подробно изложена в диссертационной работе (см. Материалы и методы. раздел 2.5.). Статистическую обработку данных проводили по программе "ДИАНА" (Комаров и др., 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ПОГЛОЩЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ КЛЕТКАМИ К.МШШБ В 293 В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Для исследования связи транспорта глюкозы со скоростью роста изучали поглощение глюкозы в условиях периодической культуры. Поглощение глюкозы смотрели при низких, менее 30 иг/л, концентрациях глюкозы, а также при высоких (0.05-5 г/л) концентрациях, отражающих потребление глюкозы в процессе роста культуры (рис.1А, В). При низкой концентрации глюкозы в ячейке скорость ее поглощения постепенно возрастала в 4-6 эаз в процессе роста (рис.1А). В опыте с высокими концентрациями глюкозы в ячейке на кривой ее поглощения выделяются три участка: на фоне экспоненциального роста активное возрастание скорости транспорта в червые 16-24 часа культивирования (1 этап); затем снижение активности тоглощения глюкозы к началу стационарной фазы (2 этап); после исчерпа-1ия глюкозы вновь отмечалось постепенное возрастание скорости поглоще-

- 6 -

In ОП, конц. глюкозы V0

время, ч

In ОП. конц. глюкозы V0

время, ч

Рис.1. Динамика поглощения глюкозы (А - 0,0071 тМ; В - изменяющаяся концентрация от 22 М до 0,5 гпМ) отмытыми клетками медленнорастущего штамма Khodococcus minimus В 293 по кривой периодического роста.: —- in ОП (оптич. плотность); —Q— - концентрация глюкозы в среде {г/л): —Д— - начальная скорость (V0) транспорта глюкозы ( нмоль шн"1 кг белка"1)

ния субстрата (3 этап).

Различный характер поглощения низких и высоких концентраций глюкозы позволил сделать следующие предположения: 1) при изменении концентрации глюкозы в среде происходит модификация транспортной системы глюкозы S1 и изменение ее сродства к субстрату; 2) кроме ранее описанной в лаборатории (Барышникова и др.. 1985) системы транспорта глюкозы S1 с высоким сродством к субстрату имеется вторая, низкоэффективная система поглощения S2. которая и делает основной вклад при - высоких концентрациях глюкозы.

Проведенный анализ кинетических параметров показал, что в диапазоне концентраций от 0.011 до 160 тМ зависимость V(S) двухфазная (табл.1). Это отражается двумя значениями константы насыщения (К^,) и двумя значениями максимальной скорости транспорта (Vmax). Поэтому в дальнейшем мы будем использовать обозначения "система S1", для диапазона концентраций глюкозы 0,011-0.5 тМ (низкие концентрации) и "система S2". для диапазона концентраций 0.5-160 тМ (высокие концентрации).

Таблица 1

Кинетические параметры транспорта глюкозы в клетки медленно- и быстрорастущего штаммов R. minimus В 293. в условиях периодической культуры

Медленнорастущий штамм Быстрорастущий штамм

•Кп,1 = 0.9-10'* М Кщ = 0.5-10-* М

"Vmax1 = нмольмин'^ мгбелка'^ Vmax = 320-340 нмолышн'^ мгбелксг* Кп,2 = 1, 5-2. г-10-г М Vmax2 = 1200 нмольмин'1мгбелка'1

Опыты с быстрорастущим штаммом проводили по той же схеме (рис.2). Было обнаружено, что скорости поглощения глюкозы при низких и высоких концентрациях глюкозы практически не различались, возрастали параллельно росту культуры и достигали максимума в начале стационарной фазы роста. Значения У0 были в 2-2.5 раза выше, чем у медленнорастущего. Близкие значения скоростей при концентрациях, различающихся более, чем в 100 раз означают, что данная система транспорта близка к насыщению. Анализ кинетических параметров поглощения данной транспортной системы ЭЗ, показал, что зависимость однофазная и описывается значениями константы насыщения и максимальной скорости транспорта, представленными в табл. 1.

In ОП. КОНЦ. ГЛЮКОЗЫ V0

время, ч

Рис.2. Динамика поглощения глюкозы отмытыми клетками быстрорастущего штамма Rhodococcus minims В 293 по кривой периодического роста: —•--in ОП (оптич. плотность); —о--концентрация глюкозы в среде (г/л); начальная скорость (V0) транспорта глюкозы при ее концентрации 0.071 тМ (—Д—-) и 8.071 тМ (_л_)

2. СВОЙСТВА ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ ГЛЮКОЗЫ У МЕДЛЕННО- И БЫСТРОРАСТУЩЕГО ШТАММОВ R. MINIMUS В 293.

Для того, чтобы детальнее разобраться в роли транспорта глюкозы у каждого из штаммов исследовали свойства транспортных систем SI, S2 и S3.

1. Ингибиторный анализ показал . что у медленнорастущего штамма системы транспорта глюкозы S1 и S2 энергозависимы и поглощение глюкозы осуществляется в основном за счет разности электрохимического потенциала ионов водорода ( данные подробно изложены в диссертационной работе см. раздел 4.1. Характеристика транспортных систем глюкозы медленнорастущего штамма R. minims В 293).

2. Основным существенным различием между системами поглощения глюкозы S1 и S2 является сильное ингибирующее действие галактозы на систему S1 при добавлении в ячейку (рис.3). И напротив, галактоза не

- 9 -

ингибировала систему транспорта глюкозы S2.

У0 поглощ. глюк, для У0 поглощ. глюк, для 52,

нмоль мин*1 мг белка"1 нмоль шн"1 из белка"1

-

- -

- --- -

- 111 S2 Iltil $2 S2 ■ S2 -

1

О 0.5 5.0 10.0

Рис. 3. Скорость поглощения глюкозы в присутствии галактозы ( в концентрации от 0 до 10 г/л ) у клеток Д. тШтпиз В 293. выращенных на глюкозе: 51- скорость поглощения глюкозы при ее концентрации в ячейке 0,0357 тМ; Б2 - скорость поглощения глюкозы при ее концентрации в ячейке 5, 0357 тМ

3. Из данных табл.2 видно, что клетки медленнорастущего штамма после инкубации с галактозой в течение 5 часов, увеличивали скорость поглощения глюкозы в 4 раза, а скорость поглощения галактозы в 14 раз. Хлорамфеникол полностью подавлял возрастание скорости поглощения глюкозы и галактозы.

Таким образом, на основании этих опытов нами сделан вывод, что транспортная система S1 является индуцибельной галактозной системой у R. minimus. Глюкоза переносится этой системой неспецифически и менее эффективно (V0 глюкозы3-?, О нмоль тн^мгбелка'1 и V0 галактозы =1056,5 нмоль шн_1жзбелка"1 у клеток, выращенных на глюкозе). При выращивании на галактозе сродство системы транспорта глюкозы S1 возрастает в 15 раз (Кт= 0.6-Ю'5 М), а максимальная скорость транспорта глюкозы в 9 раз (Vmax= 360 нмоль тн^мгбелкаг1).

При исследовании транспортной системы S2 отмечена незначительная

Таблица 2

Поглощение глюкозы и галактозы клетками R. minimus В293,

выращенными на среде с ацетатом

Варианта Время инкуба-опыта ции с галактозой. ч Поглощение субстрата. % к контролю

глюкозы галактозы

Медленнорастущий штамм (81)

Контроль 1 0 100 100

(отмытые клетки) 5 120 115

Контроль 2 О 100 100

(отмыт.клетки + 5 100 100

хлорамфеникол)

Клетки + галак- О 100 100

тоза (5 г/л) 5 440 1430

Клетки + галак-

тоза + хлорамфе- 0 100 100

никол (80мкг/т) 5 100 100

Быстрорастущий штамм (S3)

Контроль 1 0 100 100

(отмытые клетки) 5 117 117

Контроль 2 0 100 100

(отмыт.клетки + 5 100 100

хлорамфеникол)

Клетки + галак- 0 100 70

тоза (5 г/л) 5 70 70

Клетки + галак-

тоза + хлорамфе- О 100 70

никол (80 мкг/мл) 5 70 35

стимуляция ее активности при выращивании на средах с разными источниками углерода, что свидетельствует о конститутивном синтезе данной системы поглощения.

В результате исследования свойств транспортной системы глюкозы &? быстрорастущего штамма было установлено:

1. Энергизация поглощения глюкозы осуществляется в основном за счет разности электрохимического потенциала ионов водорода.

2. Данная транспортная система также, как и система медленнорастущего штамма, специфична для галактозы, но способна переносить и глюкозу.

3. Существенное отличие транспортной системы &3 от системы заключается в том. что система £3 синтезируется конститутивно: инкубация с галактозой в течение 5 часов не оказывала никакого воздействия

ни на транспорт глюкозы, ни на транспорт галактозы у быстрорастущего штамма (табл.2).

Таким образом, анализ свойств транспортных систем глюкозы у медленно- и быстрорастущего штаммов R.minimus В 293 показал следующее:

1). Система S1 медленнорастущего штамма, функционирующая в области концентраций 0,011-0,5 тМ глюкозы в среде, является индуцибельной галактозной системой.

2). Система S2 медленнорастущего штамма, функционирующая в области концентраций 0.5-28 тМ глюкозы в среде, является конститутивной системой поглощения глюкозы.

3). Система S3 быстрорастущего штамма, функционирующая в области концентраций 0.011-28 тМ. является конститутивной галактозной системой. способной переносить глюкозу.

3. ШЖОЗНЫЙ ЭФФЕКТ В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСПОРТА ГЛЮКОЗЫ КЛЕТКАМИ R. MINIMUS В 293

В ходе дальнейшей работы с медленнорастущим штаммом было обнаружено следующее:

1. В условиях периодической культуры после исчерпания глюкозы в среде наблюдалась стимуляция ее поглощения (этап 3 на рис.1В).

2. В хемостате при лимитировании глюкозой ее остаточная концентрация более 30 мг/л приводила к снижению скорости поглощения глюкозы в 2.5 раза (см. диссертация, раздел 3.3.)

3. В процессе голодания культуры по источнику углерода (глюкозе) отмечено возрастание в течение 3-х суток скорости поглощения глюкозы У0 на порядок (с 5.5 до 50,0 нмоль мин'1 мгбелка'1).

Стимуляция поглощения глюкозы системой S1 в условиях лимитирования роста и голодания может быть обьяснена действием метаболических регуляторных механизмов, среди которых наиболее вероятны:

1) механизм неспецифической реакции культуры на голодание, в основе которого лежит активация транспортных белков(а). Процесс характеризуется синтезом белка de novo и описан для многих бактерий (Spector et al., 1988; Lange k Hengge-Aronis. 1991; Matin, 1991);

2) механизм собственно "глюкозного эффекта", который может проявляться как на уровне синтеза транспортного белка(ов). так и на уровне его активности.

При инкубации без источника углерода клеток, выращенных на глюкозе. ацетате и галактозе (табл.3), скорость поглощения глюкозы системой

возрастала в среднем на порядок у клеток, выращенных на глюкозе. У клеток, выращенных на галактозе и ацетате наблюдалась стимуляция поглощения лишь на 15-20% и только в первые часы голодания.

Таблица 3

Скорость транспорта глюкозы при голодани клеток К. тШтиэ В 293, выращенных на разных субстратах* >

Субстраты Скорость транспорта глюкозы, толь шн"1 жзбелка"1

Время голодания, час

0 5.5 24 48 72

Глюкоза 5,0 20,5 30.0 35, 0 50,5

Ацетат 25,0 30.0 30.0 30,5 30,0

Галактоза 120.5 150,5 120.5 75. 0 -

- концентрация субстратов - 5 г/л (0,5%)

поглощение глюкозы. % 120

100

80

60

40

20

О

О часов 4 часа

Рис. 4. Действие внешней концентрации глюкозы ( от 0,05 до 5 г/л ) на поглощение глюкозы голодающими в течение 5 суток клетками R. minims В 293

На рис.4 представлены результаты опыта, в котором клетки, голодавшие по источнику углерода в течение 5 суток, инкубировались 4 часа с разными концентрациями глюкозы. Ингибирущий эффект глюкозы проявлялся очень быстро (через 10-15 мин взаимодействия).

таким образом, из этих опытов следует, что в стимуляции поглощения глюкозы при исчерпании источника углерода в среде участвуют как механизм неспецифической реакции на голодание (на 15-20%), описанный для многих оперонов, участвующих в углеродном и фосфорном обмене (Matin. 1991), а также собственно "глюкозный эффект" (на 80%).

Отрицательный "глюкозный эффект" может действовать как на уровне синтеза ферментов (катаболитная репрессия), так и на уровне активности (катаболитная инактивация). У нашего организма выявлены оба механизма. На рисунке 5 представлен опыт, где ингибитор синтеза белка вносили через 24 часа после начала голодания. Возрастание активности поглощения

V0 поглощения глюкозы. нмоль мин'1 кг белка'1

время, ч

Рис.5. Зависимость скорости поглощения глюкозы системой от времени голодания по глюкозе: 1 - без добавления хлорамфеникола;

2-е добавлением хлорамфеникола Ц) через 24 часа после начала голодания

глюкозы продолжалось еще в течение суток после внесения хлорамфенико-ла. Это указывает на активацию транспортных белков системы S1 без синтеза белка de novo, т.е. регуляцию на уровне активности ферментов.

С другой стороны, в табл.4 представлены данные, где в одних опытах было обнаружено полное подавление синтеза транспортного белка антибиотиком, а в других случаях такого эффекта не наблюдалось. Поскольку этот феномен обнаружен в результате многократно повторенных опытов, следует принимать эти вариации за экспериментальный факт, указывающий на изменчивость фенотипа "активируемый голоданием по глюкозе синтез белка транспортной системы S1".

' Таблица 4

Скорость транспорта глюкозы при голодании у клеток R. minimus В 293. выращенных на глюкозе

Скорость транспорта глюкозы при голодании, школь шн"1 мг белка'1

Варианты Разные Время голодания. ч

опыта опыты 0 5 24

Контроль 1 2, 0 20.0 20,0

(клетки из ста- 2 7, 0 20.5 30,0

ционарной фазы 3 6,5 10. 0 35,0

роста) 4 2, 0 - 20,5

Клетки + 1 4, 0 15.5 20,0

хлорамфеникол. 2 7, 0 25.0 20,5

80 тг/мл 3 5,5 5.5 5,5

4 2, 0 - 5,0

Клетки + 1 3. 5 10.0 25,0

актиномицин Д. 2 4, 0 30.0 25,0

5 жг/мл 3 4,5 5,0 2,5

4 2. 0 — 2,0

Таким образом, нами показано, что на уровне активности фермента отрицательный "глюкозный эффект" стабильно функционирует у данного организма, который не подвержен какой-либо изменчивости по этому признаку. На уровне синтеза белка (репрессия-дерелрессия) он реализуется лишь у некоторых вариантов (клонов) исследуемой культуры, у которых голодание по глюкозе индуцирует синтез белка транспортной системы S1. Наряду с ними имеются клоны, где синтез белка de novo не происходит.

Итак, транспорт глюкозы у R.minimus подвержен сложной разносторонней регуляции: индукция галактозой, ингибирование глюкозой, проявляющееся как на уровне синтеза транспортного белка, так и на уровне

его активности. Кроме того, проявляется неспецифическая активация транспортной системы Si во время голодания. Следовательно, R. minimus демонстрирует несколько механизмов, позволяющих адекватно реагировать на изменение условий питания по источнику углерода, даже на уровне одного метаболического процесса - транспорта глюкозы в клетки.

4. ЗАПАСНЫЕ ВЕЩЕСТВА И ИХ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ СКОРОСТИ РОСТА R. MINIMUS В 293

Отток субстрата- на биосинтез углеродсодержащих резервных компонентов клетки является еще одним возможным механизмом, регулирующим скорость роста микроорганизмов. У родококков обнаружена высокая активность метаболического потока, связанная с накоплением внутриклеточных углеводов (Монахова, 1984). Таким образом, постоянное присутствие в клетках полисахаридов (до 20-25% от сухого веса биомассы) может являться причиной замедленного роста бактерий.

При выращивании культуры К-тШтиэ В 293 на разных источниках уг-

М. ч-

0.8

0.4

углеводная фракция, % с. в.

-30

20

0.05

15 15

0.15

0.15

глюкоза галактоза фруктоза ацетат глюхоза

медл. шт. медл. шт. медл. шт. мед. шт. быстр, шт.

при

Рис. 6. Содержание углеводов в клетках штаммов R.minimus В293 росте на средах с разными источниками углерода:

максимальная удельная скорость роста, ч'1; содержание углеводов, % от веса сухой биомассы

лерода и энергии (глюкозе, фруктозе, галактозе и ацетате) (рис.6) суммарные уровни запасных углеводов составляли 15-20% вне зависимости от природы источника углерода и от скорости роста, свойственной на нем штамму.

Поскольку количество запасных полисахаридов поддерживается на постоянном уровне от момента засева культуры до поздней стационарной фазы как у медленно-, так и у быстрорастущего штамма, то представилось необходимым провести опыты с длительным голоданием инокулюма по источнику углерода и подробно отследить динамику снижения уровня углеводных компонентов биомассы в процессе голодания. Обнаружено (рис. 7 ). что у медленнорастущего штамма через 15 суток голодания содержание углеводной Фракции в клетке составляло < 1%. Все компоненты (гликоген, трега-лоза и полисахариды клеточной стенки) снижались практически одновременно. При переносе клеток а полноценную питательную среду в течение первых 1,5 часов удельная скорость прироста биомассы была очень высока 0,48 ч"1. что на порядок выше обычной ¡1=0,05ч'1.

У быстрорастущего штамма (рис.7 ) уровень запасных углеводов после 8 суток голодания составлял < 1%. после добавки глюкозы синтез запасных веществ шел с высокой скоростью и через 5 часов уровень запасных Сахаров достигал обычных 15-20%. Скорость синтеза биомассы в течение этих 5 часов была 0,48ч'1, что в 2-2,5 раза выше обычной в условиях периодики О,2ч'1.

На рис.8 представлены максимальные удельные скорости прироста биомассы и ее компонентов в первые 5 часов после добавления глюкозы к голодающей культуре. Как и предполагалось, скорость синтеза углеводной части биомассы значительно опережает скорость синтеза белка. Следовательно. для родококков характерно первоочередное накопление углеводов после появления органического субстрата в среде. Значения скоростей синтеза биомассы, белковой фракции, запасных углеводов значительно выше, чем в обычных условиях. Скорость транспорта глюкозы достаточна для того, чтобы культура росла со скоростью 0,48 ч'1 (выше обычной на порядок) . Таким образом, причиной замедленного роста белковой фракции является высокая активность альтернативного запасающего потока.

При той экологической стратегии, которую реализует R. minimus В293 в олиготрофных условиях, роль транспорта субстрата, вероятно, направлена, в первую очередь, на обеспечение стабильного уровня запасных веществ, а рост и размножение бактерий в данном случае являются производными этого процесса. Такая тактика является оптимальной для того, чтобы популяции сохранять длительное время низкую, но стабильную чис-

запасание, % от с. в.

суши часы ВРЕМЯ

запасание. % от с. в.

Рис. 7. Содержание углеводов в клетках медленно- (верхний рисунок) и быстрорастущего (нижний рисунок) штаммов R. minims В293: А - в период голодания; В - после добавления глюкозы в среду. —ф--полисахариды клеточной стенки, % от сух. веса;

—О— - трегалоза, % от сух.веса; —^— - гликоген, % от сух.веса

- 18 -

макс. уд. скорости прироста, ч~'

ВРЕМЯ, часы макс. уд. скорости прироста, ч"1

ВРЕМЯ, часы

Рис.8. Максимальные удельные скорости прироста биомассы и ее компонентов (Упах, ч"1) после добавления глюкозы в голодающую культуру: А - медленнораст. штамм, В - быстрораст. штамм;

—О--полисахариды клеточной стенки; —о—■ - трегалоза;

—^--гликоген; —^— - белок; —•— . - сухой вес

ценность, метаболическую активность и как следствие высокую жизнеспо-:обность.

Условия голодания провоцируют множественные неориентированные фазовые переходы данного организма, поскольку, распавшись на множество венотипов, культура адаптируется к нестабильной и неблагоприятной сре-це. В таких условиях в популяции происходит отбор быстрорастущего кло-ia (/Vax= ч"1), способного как эффективно накапливать запасные внутриклеточные вещества даже в ненасыщенной среде, так и расти и эазмножаться с высокой скоростью. Таким образом, экологическая тактика цанных организмов предусматривает не только совершенные механизмы переживания . но и возможности увеличения популяции в неблагоприятных /словиях.

ВЫВОДЫ

1. У медленнорастущего штамма R. minimus В293 обнаружено две системы транспорта глюкозы в растущей культуре. Система S1 индуцируется галактозой, система S2 является конститутивной глюкозной системой; энергизация обеих систем осуществляется в основном за счет разности электрохимического потенциала ионов водорода.

2. У быстрорастущего штамма R. minimus В293 обнаружена одна транспортная система глюкозы S3, которая является конститутивной га-чактозной системой, энергизуется за счет разности электрохимического тотенциала ионов водорода.

3. У R.minimus обнаружен отрицательный "глюкозный эффект", действие которого проявляется на двух уровнях: на уровне активности фермента (катаболитная инактивация) он стабилен; на уровне синтеза белка [катаболитная репрессия) он реализуется лишь у некоторых клонов.

4. Показано, что как медленно-, так и быстрорастущий штаммы на-сапливают внутриклеточные запасные вещества углеводной природы, в том меле: гликогена до 10-15%, трегалозы до 10%, гетерополисахаридов клеточной стенки до 6%. Синтез их происходит непосредственно после засева сультуры в свежую среду.

5. Скорость синтеза углеводной части биомассы значительно опере-гает скорость синтеза белка, особенно у быстрорастущего штамма. Уро-¡ень запасных Сахаров не зависит от скорости роста, свойственной штам-iy, и от природы источника углерода.

6. У R. minimus транспорт глюкозы не является лимитирующим звеном i регуляции скорости роста. Причиной низкой скорости роста (замедлен-юй скорости синтеза белковой фракции) является высокая активность альтернативного запасающего потока. Транспорт глюкозы принимает учас-

тие в процессе стабилизации низкой экспоненциальной скорости роста как элемент сложной регуляторной системы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Барышникова Л.М., Шахбазян В. Ю., Соколова Л.М., Всеволодов Н.Н. 1988. Влияние пурпурных мембран на транспорт глюкозы и дыхание Rhodo-coccus minims В293. / Приклад, биохим. и микробиол., т. 24, в. 4, С.529-534.

2. Барышникова Л.М., Аминов Р.И.. Соколова Л.М., Окороков Л.А., Голов-лев Е.Л. 1988. Транспорт глюкозы и рост Rhodococcus minims при высоких концентрациях глюкозы в среде. / Микробиол., т.57, в.4, с.544-549.

3. Барышникова Л.М., Соколова Л.М. 1988. Роль транспорта глюкозы в регуляции скорости роста Rhodococcus minims B293J Тезисы доклада конференции "Биоконверсия - 88". Рига, с. 23.

4. Чемерис Н.А., Акименко Л. В.. Ермакова И.Т., Соколова Л.М. 1988. О фазах экспоненциального роста культуры Rhodococcus minims В293./ Тезисы доклада конференции "Биоконверсия - 88". Рига, с.111.

5. Барышникова Л.М.. Соколова Л.М. 1989. О роли транспорта глюкозы в регуляции скорости роста Rhodococcus minims В293. / Тезисы доклада конференции "Регуляция микробного метаболизма", Пущино, с.90.

6. Барышникова Л.М., Соколова Л.М., Чемерис Н.А., Головлев Е.Л. 1990. О роли транспорта глюкозы в регуляции скорости роста Rhodococcus minims В293. / Микробиол., т. 59, В. 5, С. 738-743.

7. Соколова Л.М., Барышникова Л.М. 1990. Сравнительная характеристика транспорта глюкозы в клетки медленнорастущего и быстрорастущего вариантов Rhodococcus minims В293. / Микробиол., т. 59, в. 4, с. 553-557.

8. Барышникова Л.М.. Сахаровский В.Г., Соколова Л.М., Шульга А.В., Чемерис Н.А., Головлев Е.Л. 1991. Синтез углеводных компонентов биомассы и кинетика роста Rtiodococcus minimus В293. / Микробиол., т. 60, в. 2, с.238-244.

9. Барышникова Л.М.. Соколова Л.М., Головлев Е.Л. 1992. Регуляция систем транспорта углеводов у Rhodococcus minims на уровне синтеза белка. / Микробиол., т.61, в. 5, с.781-785.