Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Генетико-биохимическая гетерогенность рибонуклеаз злаковых культур в связи с разработкой новых методов отбора в селекционном процессе

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Генетико-биохимическая гетерогенность рибонуклеаз злаковых культур в связи с разработкой новых методов отбора в селекционном процессе"

на правах рукописи

Ли

НОВИКОВ Борис Николаевич

ГЕНЕТИКО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ РИБОНУКЛЕАЗ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР В СВЯЗИ С РАЗРАБОТКОЙ НОВЫХ МЕТОДОВ ОТБОРА В СЕЛЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ

Специальность: 06.01.05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар - 2000

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Краснодарского НИИ сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко

Научный руководитель Официальные оппоненты

Ведущее учреждение

доктор биологических наук В.К. Плотников

доктор биологических наук Ю.П. Федулов

кандидат биологических наук P.O. Давоян

Кубанский государственный Университет

Защита диссертации состоится 21 июня 2000 года в 9 часов на заседании диссертационного совета Д120.23.02 при Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета

Автореферат разослан"_" мая 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат с.-х. наук А.Е. Ефремов

?

рш-Я п.о

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Успешное решение таких важных задач практической селекции как повышение качества зерна, устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды и болезням, создание трансгенных растений, обладающих новыми хозяйственно-ценными признаками, невозможно без детального понимания молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов.

Одним из ключевых моментов в регуляции генной экспрессии являются процессы обмена рибонуклеиновых кислот: синтез, функционирование, разруш ение. Многочисленными работами показано, что важную роль при этом играет время жизни индивидуальных матричных РНК. В связи с этим в последние годы особое внимание уделяется изучению механизмов регулирования времени жизни мРНК (Плотников,1992; Green,1993; Ross,1996), а также поиску рибонуклеаз, участвующих в работе механизмов деградации мРНК (мРНКаз). Однако до настоящего времени очень немного известно о мРНКазах растений (Gutiérrez et al.,1999), что делает работу в этой области крайне актуальной.

Растительные рибонуклеазы представляют интерес и как стрессовые белки, изменяющие активность в ответ на изменение условий окружающей среды (Farkas,1982; Barna,1989, Bariola, Green,1997). Более того, на примере цитрусовых было показано, что уровень РНКазной активности связан с морозоустойчивостью растений (Табатад-зе, Джохадзе, 1982). В случае наличия такой связи у злаковых растений возможна разработка быстрого лабораторного метода оценки селекционного материала на морозоустойчивость.

Несмотря на то, что в последнее время наблюдается быстрый рост количества публикаций, посвященных изучению растительных РНКаз (Bariola, Green,1997), роль отдельных ферментов, как и общей РНКазной активности, в рибонуклеиновом обмене клетки остается почти не исследована. Также не определены количество, внутриклеточная локализация и биохимические свойства рибонуклеаз, осуществляющих деградацию мРНК в растениях in vivo.

Цели и задачи. В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось изучение особенностей экспрессии генов рибонуклеаз при формировании у растений неспецифических адаптивных реакций в условиях стресса и выявление изоферментов, участвующих в деградации мРНК. В соответствии с целями были определены следующие задачи исследования:

1. Изучить изоферментный состав и локализацию РНК-деградирующих ферментов проростков озимого ячменя и пшеницы, а также созревающего зерна кукурузы.

2. Изучить изменение активности внутриклеточных и межклеточных РНКаз в условиях засоления, обезвоживания и действия низкой положительной и повышенной температуры у проростков сортов озимого ячменя и пшеницы различной стрессоустойчивости, а также созревающего зерна кукурузы.

3. Изучить с»став и свойства РНКаз, связанных с полирибосомами и матричной РНК ячменя и пшеницы.

Научная новизна.

1. Изучены изоэлектрические спектры РНКаз разных видов злаковых, а также внутри- и межвидовых гибридов. Проведено изучение модуляции РНКазной активности озимого ячменя и пшеницы под воздействием абиотических факторов внешней среды.

2. Показано наличие коррелятивной связи между степенью изменения общей РНКазной активности в растениях при низких положительных температурах и морозоустойчивостью сортов ячменя и пшеницы.

3. Выявлена дополнительная изоэлектрическая форма нуклеазы (pl 4,5; МВ 21 kD), которую регистрировали в межклеточной жидкости проростков озимой пшеницы и ячменя в условиях засоления и повышенной температуры прорастания. Эта изоформа выделена из межклеточной жидкости пшеницы, изучены ее биохимические свойства и субстратная специфичность.

4. Получены результаты, позволяющие предположить, что в растительной клетке существуют два вида магний-зависимых, различающихся по времени жизни РНКаз, ассоциированных непосредственно с мРНК: 1) РНКаза, деаденилирующая мРНК и 2) РНКаза, разрушающая мРНК.

Научно-практическая ценность работы. Полученные в работе данные о контроле активности, изоферментном составе и локализации рибонуклеаз расширяют современные представления о механизмах важнейших молекулярно-биологических процессов в онтогенезе растения - регуляции синтеза белков на уровне стабильности мРНК и формирования адаптационных реакций культивируемых злаковых растений в ответ на стрессовые воздействия. Результаты, полученные при изучении изменений суммарной РНКазной активности в условиях холодового стресса, открывают возможность для разработки метода диагностики сортов озимого ячменя и пшеницы на морозоустойчивость.

Материалы работы были использованы в качестве задачи большого практикума по молекулярной биологии на биологических факультетах Кубанского государственного университета и Кубанского государственного аграрного университета.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 7 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), на 2 симпозиуме "Новые направления биотехнологии растений" (Пущино, 1993), на 3 Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996), на 2 съезде биохимического общества РАН, (Москва, 1997), на межрегиональной конференции "Экология. Культура. Образование" (Сочи, 1997), на VIII Международной конференции "Новые направления биотехнологии" (Москва, 1998), на IV съезде съезда общества физиологов растений России, Москва, 1999.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 142 страницах, содержит 7 таблиц и 18 рисунков.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на 4-7 дневных проростках сортов озимых ячменя (Ног-deum vulgare L.) и пшеницы (Triticum aesíiVum L) селекции КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко, а также созревающем зерне кукурузы (Zea mays L.) линии Висконсин 64А обычной (W64A +/+) и её высоколизиновом спонтанном мутанте opaque-2 (W64A 02/02). При анализе межвидового полиморфизма РНКаз использовали также проростки однозернянки (Triticum топососсит L.), твердой пшеницы (Triticum durum L.), ржи (Seeale cereale L.).

Кукурузу выращивали в полевых условиях. В работе использовали початки после искусственного самоопыления. Семена ячменя и пшеницы проращивали при 20°С между двумя слоями фильтровальной бумаги. На третьи сутки верхний слой бумаги снимали и включали освещение.

При изучении воздействия на уровень РНКазной активности осмотического и солевого стрессов проростки переносили в ванночки с водой (контроль) и растворами 1,4% NaCI или 12% полиэтиленгликоля 8000 (ПЭГ 8000). Для создания температурных стрессов ванночки с проростками или початки выдерживали в термостате при температуре +4°С, +30°С или +40°С. Длительность неблагоприятного воздействия составляла от 1 до 24 часов. Для радиоактивного мечения белков in vivo под корни проростков вносили 15-20 МБк 35S-Met ("Изотоп", Ташкент). Растворы ингибиторов синтеза белка (циклогексимид) и РНК (актиноми-цин Д) вносили под корни в концентрации 20 и 40 мкг/мл соответственно. При обработке ак-тиномицином Д початков кукурузы ингибитор вводили в ножку и основание початка в количестве 500 мкг на початок. По завершению эксперимента растительный материал фиксировали в жидком азоте.

Для приготовления грубых экстрактов замороженные в жидком азоте проростки растирали в ступке и заливали 1-5 объемами ЮмМ Трис-HCI pH 7,2 экстрагирующего буфера, содержащего 0,25М сахарозы, 5мМ аскорбиновой кислоты и 1мМ фенилметилсульфонил-флюорида. Фракционирование экстрактов на субклеточные фракции проводили методом дифференциального центрифугирования (Остерман, 1981). Межклеточную жидкость получали центрифугированием срезанных проростков 15 мин при 10000g. Концентрацию белка в образцах определяли колориметрически по методу Брэдфорда (Bradford, 1976). Уровень РНКазной активности в экстрактах и межклеточной жидкости оценивали по методу Раззела (Razzell,1963) с использованием коммерческого препарата РНК.

Фракционирование белков проводили методами изоэлектрического фокусирования (Остерман, 1983) и полуденатурирующего диск-электрофореза (Laemmli, 1970). Локализацию РНКазной активности в геле после изоэлектрофокусирования определяли модифицированным методом зимограмм (Плутахин, Новиков,1991) с использованием дополнительных суб-

стратных агарозных гелей; после диск-электрофореза - по методу Янг и Грин (Yang, Green,1991). Гель фильтрацию на Sephadex-75 и аффинную хроматографию белков на ге-парин-сефарозе проводили, как описано Л.А. Остерманом (1985).

Выделение полирибосом проводили методом магний-преципитации и ультрацентрифугирования ("Транскрипция и трансляция" под ред. Б. Хеймса и С. Хигтинса, М.: Мир, 1987). Для отделения ассоциированных с полисомами РНКаз полирибосомы обрабатывали KCl в конечной концентрации 0,5 М. Белки концентрировали ацетоном при 0°С и перерастворяли в 2% амфолинах с добавлением 4M мочевины.

Суммарную РНК выделяли экстракцией фенол/хлороформом и осаждением LiCI с мочевиной в конечной концентрации 4 M каждый (Plotnikov, Bakaldina,1996). Экстрагирующий буфер (200 мМ Трис-HCI, pH 8,5; 250 тМ сахароза) содержал либо 50 тМ MgCfc, либо 0,5 M LiCI. При экстракции РНК из проростков пшеницы буфер не содержал сахарозы.

Поли(А)-содержащую мРНК отделяли от суммарной РНК методом аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе. Соотношения молекул с длинными и короткими поли(А)-последовательностями ((А)п65°/(А)п35°) определяли ступенчатой термальной элюцией по-ли^^мРНК с колонки поли(У)-сефарозы при температурах 35°С и 65°С ("Генная инженерия растений" под ред. Дж. Дрейпера и др., М.: Мир, 1991).

Распад РНК in vito осуществляли в простейшей системе, представляющей собой водный раствор высокополимерной РНК, названной оттр системой от латинского выражения "omnia mea тесит porto" - все свое несу с собой (Плотников и др.,1998). Молекулярную гибридизацию на колонке поли(У)-сефарозы проводили, как описано ранее (Плотников, Ба-калдина, 1997) совместно с с.н.с. лаборатории молекулярной биологии КНИИСХ Бакалди-ной Н.Б. Индекс стабильности определяли как долю поли(А)~РНК от поли(А)*РНК при дву-циклической аффинной хроматографии на поли(У) сефарозе (Плотников и др.,1996).

Обработку РНК целитом проводили в водном растворе суммарной РНК в соотношении 1г. прокаленного (3 часа, 180°С) целита на 4мг РНК при комнатной температуре в течение 5 минут при интенсивном перемешивании. Затем раствор РНК декантировали с целита. Олигодезоксирибонуклеотиды метили концевым включением [у-33Р]-АТФ (НПО "Изотоп", Ленинград) при помощи полинуклеотидкиназы фага Т4. Электрофорез РНК в формальдегид-агарозном геле, дот-блот-гибридизацию с радиоактивно мечеными зондами проводили, как описано Маниатис с соавт. ("Методы молекулярного клонирования", М.: Мир, 1984).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение изоферментного состава РНКаз.

В качестве основного метода в изучении изоферментного состава РНК-деградирующих ферментов использовали изоэлектрофокусирование белков с последующей зимографией нуклеолитических ферментов (Thomas, Hodes, 1981). Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в сравнении с электрофорезом обладает рядом преимуществ, среди которых возможность одновременной идентификации противоположно заряженных ферментов.

Кроме того, при получении зимограмм после ИЭФ с использованием дополнительного субстратного геля снижается вероятность появления ложных полос активности в зонах геля с высокой концентрацией ненуклеолитических белков.

3.1.1. Изоэлектрические спектры нуклеаз ячменя и пшеницы.

При изоэлектрофокусировании белков ячменя и пшеницы в диапазоне рН 3,5-8,0 идентифицировали до 12 полос рибонуклеазной активности с изоточками от 4,8 до 7,5 (рис. 1, 2). Наши результаты хорошо согласуются с результатами Prentice SHeisel (1985) по изо-электрическому фракционированию РНКаз корней ячменя, которые показали, что основная активность сосредоточена в диапазоне рН 4,5-5,5, а также с данными о наличии у ячменя и пшеницы РНКаз, выпадающих в

А Б

осадок при значении pH около 5,0 (Chakravorty & Scott, 1979; Chakravorty & Simpson, 1980). Различия в спектрах РНКаз изученных сортов были незначительны и состояли в некотором изменении интенсивности отдельных полос. В процессе развития растений количество регистрируемых изоформ возрастало от стадии зародыша, когда проявлялись только полосы активности с р! 5,0 и 5,2, до стадии пятисуточных проростков и затем стабилизировалось. Изменения состава происходили за счет проявления изоформ с более высокими значениями изо-точек. Зимограммы, полученные после изоэлектрофокусирования экстрактов 30 суточных проростков, а также листьев растений на стадии колошения не выявили дополнительных изоформ.

он ДНК РНК pH

pH 7,5-

6,3-

5,95,75,55,25,04,8-

Рис.1. Изоферментный состав, субстратная специфичность цитоплазматических нуклеаз ячменя.

А - Зимограммы растворимых РНКаз ячменя сорта Радикал. Нанесено 120 (1) и 30 (2) мкг белка Б - Сравнительный анализ РНК- и ДНК - расщепляющих изоформ. В качестве субстрата использовали дрожжевую РНК и денатурированную ДНК тимуса теленка (онДНК)

Для определения субстратной специфичности отдельных изоформ в субстратный гель вводили РНК, двунитевую или однонитевую ДНК (денатурированную нагреванием ДНК тимуса теленка), а также синтетические полинуклеотиды: поли(А), поли(У) и поли(А):поли(У). В цитоплазме, как ячменя, так и пшеницы присутствуют ферменты, способные гидролизовать и РНК, и ДНК. Причем

8

ДНКазная активность в большей степени выражена к однонитевой ДНК. Кроме неспецифических нуклеаз в цитоплазме и ячменя и пшеницы присутствуют специфические РНКазы и ДНКазы. Так у ячменя изоформы с pl около 5,85 и 5,95 гадролизовапи только однонитевую ДНК, а изоформа с pl 4,8 - обладала только РНКазной активностью (рис.1 Б). У пшеницы преимущественно ДНКазной активностью обладала изоформы с pl 5,0 и 5,2 (рис.2 Б), в то время как изоформы с pl 4,6, 4,9 и 5,1 расщепляли преимущественно РНК.

С использованием синтетических гомополимерных субстратов по- Рис2 Изоферментный

состав (А) и субстратная спе-

казано, что регистрируемые на зимо- ц енность (Б) растворимых нуклеаз озимой

граммах нуклеазы являются пирими- пшеницы сорта Краснодарская-39.

динспецифическими, т.к. гидролиз по- в качестве субстрата ИСпользовали дрожжевую

ли(У) протекал со значительно боль- РНК и денатурированную ДНК тимуса теленка

шей скоростью, чем поли(А). Дуплекс (онДНК) поли(А):поли(У) практически не расщеплялся. Несмотря на то, что большинство РНК-деградирующих ферментов растений согласно Фаркаш (Farkas, 1982) являются пуринспецифическими, наши данные не являются уникальными, и скорее подтверждают результаты Чевриера и Саран (Chevrier, Sarahn, 1980), а также Пьетржак (Pietrzak е. а.,1980), описавших ферменты ячменя и пшеницы с относительной специфичностью к уридиновым последовательностям.

Количество изоформ, регистрируемых нами после изоэлектрофокусирования, несколько отличается от описанного другими авторами (Блехман, Творус, 1974; Вата, 1989; Yen,. Baenziger, 1993), использовавшими различные варианты электрофореза. Наблюдаемые отличия в количестве регистрируемых изоформ, по-видимому, связаны с генетическими и возрастными различиями изученных сортов, а также с особенностями использованных методов. Так как при ИЭФ разделение белковых смесей происходит в зависимости от значения изоэлектрических точек индивидуальных белков, то существенное влияние на конечную картину разделения могут оказывать заряды боковых углеводных цепей.

3.1.2. РНК-деградирующие ферменты хлоропластов, митохондрий и межклеточной жидкости проростков ячменя и пшеницы.

В хлоропластных фракциях проростков пшеницы (Краснодарская 39) и ячменя (Радикал) были выявлены по две основные изоэлектрические формы РНКаз, а в митохондриаль-ных - по одной (рис.3). Изоформы с такими же р! присутствуют и в пост-митохондриальной (15000д) фракции исходного гомогената, однако, относительная активность изоформ РНКаз хлоропластной и митохондриальной фракций отличается от распределения активности между изоформами цитоплазмы. Это свидетельствует в пользу того, что регистрируемые изоформы принадлежат органеллам и не являются случайным загрязнением последних цито-плазматическими белками при выделении.

Суммарные РНКазы

пшеница

ячмень

Межклеточная жидкость пшеница ячмень РН 6,8

МИТ ХЛ

ЦП МИТ ХЛ

1-5,0

Рис.3. Зимограммы изоэлектрических форм внутриклеточных РНКаз и РНКаз межклеточной жидкости проростков ячменя (Радикал) и пшеницы (Колос).

ЦП -цитоплазма (постмитохондриальная фракция) ХЛ - фракция, обогащенная хлоропластами МИТ - фракция, обогащенная митохондриями.

Ранее Блехман и Творус (1974) методом нативного диск- электрофореза изучали распределение РНКаз между субклеточными структурами проростков пшеницы. В митохондриальной фракции они также обнаружили один белок (величину изоэлектрической точки и молекулярную массу не определяли). Хлорогшастные РНКазы пшеницы изучались также Кулиговской с сотр. (Ки^оч^ка е.а.,1988). Они выделили и охарактеризовали нуклеазу с молекулярной массой около 29000 Д, гидролизующую РНК и одноцепочечную ДНК. Однако изоточку выделенного белка они не определяли.

Спектры изоформ РНКаз межклеточной жидкости пшеницы и ячменя представлены на рис.ЗВ. Они сходны с цитоплазматическими, однако в межклеточной жидкости пшеницы присутствует изоформа с р! 5,5, активность которой в цитоплазме очень низкая.

3.1.2. Цитоплазматические нуклеазы созревающего зерна кукурузы

Спектр нуклеолитических ферментов зерна линии \N64A на двадцатый день после опыления представлен на рис.4. На рисунке можно различить, по крайней мере, девять полос нуклеолитической активности с изоточками от 4,8 до 6,3. Четыре из них (р1 5.3; 6,0; 6,1; 6.3) расщепляют преимущественно однонитевую ДНК, три (р! 5.2; 5.5; 6.2) - преимущественно РНК Две остальные являются неспецифическими нуклеазами. Среди РНК- гидролизую-щих наиболее активными были изоформы с р1 4,8, 5,2, 5,5 и 5,9; две другие - с р! 6,1 и 6,2 были значительно слабее и проявлялись не всегда.

Изоэле)дричесше спектры рибонуклеаз обычной линии \ZV64A и ее спонтанного мутанта по гену Орацие-2 содержат одинаковый набор изоформ, однако, их активность в эндосперме мутанта значительно выше, чем в обычном. Это свидетельствует о том, что повышенная активность рибонуклеаз обеспечивается не за счет наличия характерных только для мутанта изоферментов, а лишь за счет разницы в уровнях экспрессии.

В целях определения возможности использования РНКаз, как компонента в биохимическом маркировании селекционного материала нами проведена работа по определению изоэлектрических и электро-форетических спектров РНК-деградирующих ферментов различных линий и сортов ячменя, пшеницы, ржи, кукурузы и некоторых видов дикорастущих злаковых. Были выявлены качественные различия в изофер-ментном составе РНКаз между родами и видами исследованных растений (ячмень, рожь, пшеница, кукуруза). При этом некоторые полосы активности присутствуют в изоферментных спектрах большинства изученных растений (р! 4,8, 5,0, 5,2, 5,5, 5,9). Вероятно, консерватизм этого класса ферментов связан с тем, что РНКазы участвуют в базовых процессах клеточного метаболизма.

Несмотря на это, методом полуденатурирующего электрофореза удалось обнаружить различия спектров РНКаз родительских пар и гибридов отдаленных скрещиваний. Эти результаты позволяют надеяться, что удастся использовать видодоспецифические изоформы РНКаз в качестве дополнительного маркера при оценке селекционного материала.

3.1.3. РНКазы, ассоциированные с полирибосомами ячменя и пшеницы

Естественно предположить, что изоферменты, участвующие в гидролизе мРНК, будут ассоциированы в комплексе с полирибосомами. В ряде случаев на животных и раститель-

РНК ДНК

Рис.4. Субстратная специфичность и изоэлектрический спектр цитоплазматиче-ских нуклеаз созревающего зерна обычной линии кукурузы Wisconsin 64А

ных объектах уже показано, что РНКазная активность, ассоциированная с полисомами, расщепляет некоторые транскрипты в системе in vitro аналогично тому, как они распадаются in vivo [Stevens, 1993; Caruccio,1994; Byrne,1993].

Полирибосомы выделяли из проростков ячменя и пшеницы. Анализ полученных препаратов показал, что с полисомами ячменя связано 5, а с полисомами пшеницы 6 изоэлектрических форм РНКаз (рис.5). Часть из них имеют те же изоэлектрические точки, что и в цитоплазматической фракции и, по-видимому, являются идентичными в обеих фракциях.

Характерная черта полисом как пшеницы, так и ячменя - наличие рибонуклеазы с pi 4,5, отсутствующей в цитоплазме. Не исключено, что часть рибонуклеаз ассоциируют с полирибосомами в процессе выделения в результате неспецифических взаимодействий [Шапот,1974], о чем свидетельствует соответствие картин распределения активностей между отдельными рибонук-леазами в полисомной и цитоплазматической фракциях. Для части изоферментов очевидна принадлежность их именно к полирибосомам, и они являются претендентами на роль ферментов, гидролизующих мРНК in vivo.

3.1.4.РНКазы, ассоциированные с мРНК

На клетках животных было показано, что деградация мРНК может осуществляться РНКазами, связанными непосредственно с мРНК (Арион и др.,1982; Bandyopadhyay et al., 1990). Работами лаборатории молекулярной биологии КНИИСХ установлено, что препараты высокоочищенной высокополимерной РНК растений содержат ассоциированный РНК - деградирующий комплекс белковой природы, устойчивый к действию обычных депротеинизи-рующих агентов (фенол, хлороформ, мочевина). Было показано, что степень распада мРНК при двуциклической аффинной хроматографии или прогреве водного раствора суммарной РНК (индекс стабильности мРНК) адекватно отражает стабильность специфических мРНК в интактных клетках и зависит от генотипа растения и его физиологического состояния на момент фиксации (Plotnikov, Bakaldina,1996; Плотников и др.,1996, 1998; Плотников, Бакалди-на,1997).

Эти результаты позволили рассматривать прогрев водного раствора высокоочищенной высокополимерной РНК как простейшую in vitro систему, пригодную для изучения фак-

ЯЧМЕНЬ ПШЕНИЦА

-4,5

Рис.5. Зимограммы изоформ полирибо-сом-ассоциированных и цитоплазмати-ческих РНКаз ячменя (Радикал) и пшеницы (Краснодарская-39).

1 - полисомальная фракция

2 - цитоплазматическая фракция

торов, определяющих дифференциальный распад мРНК в клетке, которая была названа оттр системой распада (Плотников и др.,1998).

В настоящей работе получены результаты, дающие представление о некоторых характеристиках и функциях РНКаз, осуществляющих деградацию РНК в оттр системе

3.1.4.1. Деградация высокоочищенных препаратов РНК in vitro.

Нами было установлено, что распад мРНК в системе оттр сопровождается распадом рРНК. В экспериментах по изучению влияния на стабильность РНК циклогексимида in vivo и катионов магния in vitro отмечали положительную корреляцию между степенью деградации рРНК и индексом стабильности суммарной полиаденилированной мРНК, а также мРНК зеинов 19кД - самой крупной фракции мРНК созревающего зерна кукурузы. Эти наблюдения позволяют надеяться, что на основе определения интенсивности деградации рРНК возможна разработка более простого способа оценки индекса стабильности суммарной мРНК. Однако оставалось неясным: опосредуется ли распад рРНК РНКазами общими для обоих классов РНК или специфическими, связанными только с рРНК. Ответ на этот вопрос позволили получить эксперименты по влиянию разведения суммарной РНК на интенсивность распада рРНК и мРНК зеинов 19 кД в системе оттр.

А

б/п 5 мин. 65°

Б

Концентрация РНК Суммарная радиоактив-

(мг/мл) ность Zi9 мРНК (%)

1,0 (контроль*) 100

1,0 72,3 ± 1

0,33 76 ± 0,5

0,1 75 ± 1,9

- контрольный образец (без прогрева)

1 1 0,33 0,1 концентрация РНК (мг/мл)

Рис.6. Влияние"£эазбавления РНК на интенсивность распада в системе оттр. А - электрофоретический анализ распада рибосомной РНК Б - распад мРНК зеинов 19 кДа б/п - без прогрева

Интенсивность распада рРНК замедлялась с увеличением разведения образца, что было показано электрофоретическим анализом суммарной РНК после прогрева (рис.бА). В то же время, распад мРНК в препарате не зависел даже от десятикратного разбавления, что было установлено дот-гибридизацией на нейлоновых фильтрах суммарной РНК с радиоактивно меченым олигонуклеотидным зондом к мРНК зеинов 19кД (рис.бБ).

Аналогичные результаты были получены при гибридизации поли(А)*мРНК на колонке

поли(У) сефарозы с олигонуклеотидными зондами к мРНК генов opaque-2, актина, фактора элонгации трансляции 1а и р-кето редуктазы (таб.1).

Таблица 1.

Влияние разбавления РНК в оттр системе на модуляцию индекса стабильности некоторых мРНК проростков пшеницы и созревающего зерна кукурузы.

Концентрация РНК Индекс стабильности поли(А)* мРНК (%)

(мг/мл) актин ß-KR1) eEF-1a2> зеин 19кД opaque-2

1,0 117 ± 6 90 ±5 144 ±8 64 ±2 123 ±5

0,1 127 ±8 94 ±3 137 ±7 71 ±4 113 ± 8

ß-KR - ß-кеторедуктаза; 2>- eEF-1a - фактор элонгации трансляции 1а

Полученные результаты можно объяснить тем, что распад индивидуальных мРНК осуществляют ассоциированные с ними РНКазы, тогда как рРНК разрушается не связанными с ней РНКазами.

Сравнительный анализ интенсивности деградации суммарной РНК in vitro (прогрев при 65°С, 5 минут) в присутствии 2мМ Мд(СНзСОг)2, MgCb, MgSÜ4, ZnSC>4, CuSC>4, CaCb, FeSÜ4, KCl, UCI показал, что степень распада РНК значительно возрастала в присутствии катионов магния. При этом стимулирующее действие катиона модулировалось в зависимости от характера аниона. Замена ацетата на сульфат магния вызывало некоторое ослабление деградации, а анион хлора еще больше снижал степень деградации РНК. Инкубирование РНК в растворе, содержащем 5-10 мМ 3flTA-Na2, полностью блокировало процесс распада.

Кроме того, было отмечено стимулирующее действие ионов Mg2* на распад и деаде-нилирование в системе in vitro ро)у(А)* РНК и мРНК зеинов 19 кДа (табл.2). Таким образом, деградация РНК в ommp системе является магний зависимым процессом, что хорошо согласуются с представленными в литературе данными, согласно которым деградация мРНК в клетке опосредуется магний-зависимыми нуклеазами (Ross, 1999).

Предварительная обработка целитом полностью останавливала деаденилирование и распад в системе in vitro всех типов РНК даже в присутствии катионов магния (табл.2), что свидетельствует в пользу предположения о белковой природе РНКаз, ассоциированных с мРНК.

3.1.4.2. Влияние циклогексимида на стабильность мРНК.

Влияние ингибирования синтеза белка в проростках пшеницы циклогексимидом на стабильность РНК in vitro было изучено на 1) суммарной высокополимерной РНК, 2) суммарной полиаденилированной мРНК и 3) трех индивидуальных мРНК: УДФ-глюкозилтрансферазы (waxy), фактора элонгации трансляции 1а (eEF-1a) и актина. Для этого интактные проростки озимой пшеницы обрабатывали циклогексимидом в течение 6 и

10 часов. Чтобы исключить влияние возрастных изменений на стабильность РНК опытные и контрольные проростки срезали одновременно.

Таблица 2

Влияние Мд2*и целита на эффективность распада и деаденилирования поли(А)+мРНК из проростков озимой пшеницы и созревающего зерна кукурузы in vitro (65°С, 5 минут).

Варианты обработки РНК Отношение (А)п657(А)п35° Выход поли(А)* мРНК на колонке поли (У) сефарозы (%) Дот-гибридизация на фильтрах, Z191) (%)

А Б В

- - - 1.29 ±0.09 100 100

+ - - 0.98 ±0.05 73±5 70 ±4

+ + - 0.85 ±0.05 38± 3 54 ±4

+ + + 1.24 ±0.08 97 ±4 104 ±4

РНК из созревающего зерна кукурузы W64A +/+ (20 ДАП)

А - температурная обработка РНК, Б - наличие Мдг+ в инкубационной среде В - предварительная обработка РНК целитом (+) - наличие обработки; (-) - отсутствие обработки

Как 6-ти, так и 10-ти часовая обработка проростков циклогексимидом вызывала, по сравнению с контролем, увеличение выхода поли(А)*мРНК после инкубации высокополимерной РНК в системе in vitro (табл.3). Контролем являлась РНК из проростков, не подвергавшихся обработке циклогексимидом. Выход поли(А)*мРНК и суммарную радиоактивность каждой специфической мРНК, не инкубированных в системе оттр, принимали за 100%. Также наблюдали снижение степени распада в системе in vitro суммарной высокополимерной РНК из растеий, обрабоанных циклогексимидом.

Анализ изменений индекса стабильности специфических мРНК выявил более сложную картину. Как видно из таблицы 3, при инкубации в системе in vitro РНК из контрольных растений происходило деаденилирование и распад мРНК. Об этом свидетельствуют низкие значения индекса стабильности, а также высокая степень деаденилирования и распада по-лиаденилированной мРНК и суммарной высокополимерной РНК.

Блокирование циклогексимидом синтеза белка в течение 6 часов замедляло распад поли(А)*мРНК, но не затрагивало процесса деаденилирования поли(А)*мРНК. Ранее В.К. Плотников и Н.Б. Бакалдина (1997) показали, что деаденилирование сопровождается плавлением вторичной структуры РНК и увеличение сайтов гибридизации. Этим, по-видимому, объясняется увеличение эффективности гибридизации мРНК с олигонуклеотид-ными зондами в результате 6-часовой обработки проростков циклогексимидом.

Таблица 3.

Влияние обработки проростков пшеницы циклогексимидом (ЦГИ) на модуляцию индекса стабильности в оттр системе суммарной полиаденилированной и трех специфических мРНК.

Варианты обработки проростков Отношение (А)п65°/(А)п35° после прогрева в системе in v/7ro1> Выход поли(А)* мРНК (% от непрогрето-го контроля) Индекс стабильности специфических поли(А)* мРНК(%)

waxy актин eEF-1a

Контроль 0,57 63 84 108 126

6 ч. ЦГИ 0,57 73 138 143 182

10 ч. ЦГИ 1,02 76 73 79 114

6 ч. ЦГИ + целит 1,1 100 103 77 122

ч - приводится для суммарной поли(А)+мРНК; отношение (А)П650/(А)П35° непрогретых

образцов составляло 1,25

Увеличение экспозиции до 10 часов полностью останавливало деаденилирование и стабилизировало как рибосомную, так и суммарную полиаденилированную мРНК. Однако эффективность гибридизации зондов с индивидуальными мРНК оставалась на уровне контрольных растений, не обработанных циклогексимидом. Исходя из отмеченной выше зависимости эффективности гибридизации на колонке поли(У)-сефарозы от вторичной структуры РНК, можно предположить, что блокирование деаденилирования и, как следствие, плавления вторичной структуры мРНК приводило к утрате (не проявлению) потенциальных сайтов гибридизации.

Обработка целитом РНК из растений, подвергнутых 6 часовой обработке циклогексимидом, приводила к значительному дополнительному увеличению выхода суммарной по-ли(А)+мРНК, (табл.3), но при этом резко снижалась эффективность гибридизации всех трех специфических мРНК до уровня показателей, полученных при 10 часовой обработке проростков. Принимая во внимание свойство целита останавливать деаденилирование (табл.2,3), можно предположить, что обработка РНК целитом позволяет моделировать in vitro ситуацию, имеющую место in vivo при 10 часовой блокаде синтеза белка.

Эти результаты позволяют предположить наличие, по крайней мере, двух видов ассоциированных с мРНК и различающихся по времени жизни РНКаз: деаденилирующей (относительно долгоживущей) и разрушающей мРНК (относительно короткоживущей), устойчивых к действию традиционных депротеинизирующих агентов (фенол, хлороформ, додецилсуль-фат натрия, мочевина, хлористый литий). Эти РНКазы, по-видимому, являются ключевыми ферментами, контролирующими время жизни мРНК. Данные свойства ферментов деградации мРНК и определяют возможность наблюдать дифференциальный распад мРНК в водном растворе высокоочищенной РНК in vitro.

3.2. РНКазы растений в условиях абиотических стрессов

С целью выяснения роли рибонуклеаз в формировании у растений неспецифических адаптивных реакций в условиях стресса изучили влияние низких положительных температур, засоления, обезвоживания, теплового шока на активность и изоферментный состав РНКаз различных сортов озимых ячменя и пшеницы.

3.2.1. Изменения уровня суммарной РНКазной активности

Анализ динамики изменений суммарной РНКазной активности в условиях температурных стрессов и засоления (от 2 до 24 часов) показал двустадийность этого процесса. Общая активность грубого экстракта проростков достигала максимума через 6-10 часов после начала воздействия и затем снижалась, оставаясь, однако, выше, чем в контрольных растениях. Возможно, увеличение суммарной РНКазной активности в первые часы стрессового воздействия связано с изменением пула транслируемых матриц и снижением уровня метаболизма, что способствует "переживанию" неблагоприятного периода.

В межклеточной жидкости наблюдали первоначальное (до 3 часов) значительное снижение активности РНКаз (на 40%), которое совпадало с динамикой изменения концентрации и скорости синтеза белков межклеточной жидкости, что проявлялось в уменьшении включения в белки радиоактивно меченого метионина (35S-Met). Второй причиной пониженной активности РНКаз межклеточной жидкости в первые часы стрессового воздействия может являться нарушение секреции белков, связанное с изменением структуры мембран в условиях стресса (Quinn,1988). Последующий подъем активности достигал максимума через 15-18 часов после начала воздействия, и сменялся затем медленным спадом.

Возрастание активности рибонуклеаз почти полностью предотвращалось при блокировании транскрипции актиномицином Д или трансляции циклогексимидом. Быстрое снижение РНКазной активности до уровня контроля также наблюдали при прекращении действия стрессового фактора.

Исследование суммарной РНКазной активности проростков семи сортов ячменя и четырех - озимой пшеницы, ранжированных селекционерами в полевых испытаниях по морозоустойчивости показали, что в большинстве случаев стрессовые условия вызывали увеличение РНКазной активности, однако, реакция сортов была различной (табл. 4). Изученные сорта можно разделить на две группы: реагирующие на стрессовые условия значительным увеличением РНКазной активности (Радикал, Скороход, 303/1) и те, у которых активность увеличивалась незначительно или даже несколько уменьшалась (Вавилон, Циклон, Иверия).

. Степень прироста активности РНКаз соответствует уровню стрессоустойчивости сортов, определенному селекционной практикой. Так, сорт озимого ячменя "Радикал", который наряду с хорошей урожайностью обладает и высокой адаптивной способностью, отличался наиболее значительным приростом РНКазной активности. Коэффициент корреляции был равен -0,8. Исключение составил относительно морозоустойчивый сорт " Метеор ", который не по-

казал статистически значимого прироста РНКазной активности в условиях опыта. Эта закономерность сохранялась и при других стрессах.

Таблица 4.

Изменение общей РНКазной активности сортов ячменя под воздействием стрессовых условий.

Сорт Ранг морозоустойчивости" РНКазная активность (% от контроля)

+4°С 12% ПЭГ 1,5% №С1

Радикал 1 138 + 5 126 ±6 125 ±6

Скороход 2 134 ±14 111 ±4 114 ± 2

303/1 4 121±2 115±2 117± 2

Вавилон 5 113 ±3 98 ± Г 104 ± Г

Циклон 6 111 ±6" 127 ±5 103 ±8"

Метеор 3 104 ± 3" - -

Иверия 7 101 ±1" - -

Р<0,05

' - приводится по мере убывания морозоустойчивости " - не достоверные различия между контролем и опытом

Использованные нами сорта пшеницы также различались по интенсивности и направленности изменений РНКазной активности в ответ на стрессовое воздействие. Причем, в отличие от ячменя здесь мы наблюдали обратную зависимость между морозоустойчивостью сорта и величиной возрастания активности РНКаз (табл.5).

Таблица 5.

Изменение общей РНКазной активности сортов пшеницы под воздействием низкой положительной температуры.

Сорт Ранг морозоустойчивости* РНКазная активность (% от контроля)

Зимородок 1 89± 7

Краснодарская-39 1 89 ±10"

Краснодарская-70 2 124 ±7

Безостая-1 3 135 ±10

Р<0,05

* - приводится по мере убывания морозоустойчивости " - не достоверные различия между контролем и опытом

Так, в проростках сортов озимой пшеницы Безостая-1 и Краснодарская-70 холодовой стресс (+4°С, 6 часов) увеличивал уровень РНКазной активности. В тоже время более морозостойкий сорт Краснодарская-39 в тех же условиях снижал активность РНКаз (табл.5). Коэффициент корреляции между величиной изменения РНКазной активности и морозоустойчивостью сорта в этом случае был равен +0,71

Важно отметить, что при холодовом стрессе изменения РНКазной активности озимого ячменя и пшеницы совпадали с полевыми оценками морозоустойчивости сортов селекционерами, а также с изменением индекса стабильности полиаденилированной мРНК. Ранее Плотниковым и др. (1997) было показано, что у наиболее морозостойкого сорта Радикал при низких положительных температурах индекс стабильности поли(А)*мРНК снижался, тогда как у Вавилона в тех же условиях он повышался.

У пшеницы наблюдали обратную реакцию: наиболее морозостойкий сорт Краснодар-скаяЗЭ отличался значительным увеличением индекса стабильности, в противоположность Безостой 1, у которой он снижался. Нами были сделаны аналогичные наблюдения при изучении модуляции индекса стабильности мРНК фактора элонгации 1а в условиях холодового стресса у различающихся по морозостойкости сортов озимого ячменя и пшеницы.

Эти результаты свидетельствуют о наличии тесной связи между суммарной активностью РНКаз и стабильностью мРНК в клетке, а также адаптационной способностью сортов. Различия в ответе РНК-деградирующих систем ячменя и пшеницы на холодовое воздействие, по-видимому, свидетельствует о различных механизмах их холодовой адаптации.

3.2.2. Изменения изоферментного состава РНКаз

Зимограммы РНКаз экстрактов, полученных из контрольных и опытных проростков, показали, что увеличение активности происходит не за счет появления новых, а за счет возрастания активности уже существующих изоформ. При этом наблюдали дифференциацию в изменении активности индивидуальных изоформ на различные виды воздействия. При действии на проростки озимого ячменя низких положительных температур преимущественно повышалась активность изоформ с р1 5,7 и 5,9 изоэлектрического спектра и 43 кД - элек-трофоретического (рис.7). Принимая во внимание различие в субстратной специфичности изоформ с р! 5.7 и 5.9 (см. рис.1), можно предположить соответствие изофермента с молекулярной массой 43кд, по крайней мере, с одной из отмеченных изозлектрических изоформ. Относительное увеличение активности этих изоформ свидетельствует либо о прямом или опосредованном (через вторичного мессенджера) контроле их генов температурочувствительным промотором, либо об их тесном сцеплении с генами системы морозоустойчивости.

А Б

12 12 Рис.7. Изменение изоэлектрического (А) и электрофоретического (Б) спектров цитоплазматических РНКаз проростков озимого ячменя (Радикал) при холодовом стрессе (+4°, 6 часов) 1 - контроль ; 2- опыт

При длительном (более 1 месяца) выдерживании проростков ячменя на холоде (+4°), а также в условиях некоторых других видов абиотических стрессов отмечали появление в д к межклеточной жидкости дополнительной

изоформы с изоточкой около 4,5. Так у "Радикала" эта изоформа появлялась при засолении (1.4% МаС1), у "Циклона" при засолении и обезвоживании (12% ПЭГ). Изоформа с р14,5 появлялась в стрессовых условиях и в межклеточной жидкости проростков пшеницы (рис.8).

Кроме засоления и обезвоживания ее появление вызывало повышение температуры проращивания до 29-30°С. Однако реакция изученных сортов была различной. Так, при засолении мы регистрировали ее у сортов Колос, Краснодарская-39 и Мироновская 38. При обезвоживании - только у Безостой-1, а при 30°С - у Колоса, Краснодарской-39 и Безостой-1. Эти отличия могут быть объяснены не только отсутствием такой изоформы у отдельно взятого сорта, но и различной скоростью ответа сортов на неблагоприятный фактор.

Рис. 8. Изменение изоэлектрического спектра РНКаз межклеточной жидкости (А) озимой пшеницы сорта "Колос" и (Б) ячменя сорта "Радикал" при солевом стрессе (1,4% №С1,18 час.) 1 - контроль ; 2- опыт

рН 1-7,0

кД •-67

У —•-25

|М|

■Ш- «г-12,3

1 2 3 4

Рис.Э.Очистка и определение типа действия РНКазы с pl 4.5 из межклеточной жидкости озимой пшеницы сорта "Колос". А-1) повторное фокусирование очищенной РНКазы, 2) исходный препарат межклеточной жидкости; 3) электрофорез в присутствии SDS-Na2 выделенной изоформы; 4) маркерные белки (BSA, хи-мотрипсиноген А, цитохром С) Б - гель хроматография на Сефадексе G-75 продуктов гидролиза дрожжевой РНК. Прямоугольниками обозначено положение на хроматограмме пиков рРНК и АМФ, полученное при калибровке колонки.

рРНК

контроль 3 ч.,37°С

АМФ

О 2 4 6 8 10 номер фракции

Изоформу с pl 4.5 из межклеточной жидкости пшеницы (Колос) отделили от других РНКаз с помощью препаративного изоэлектрофокусирования и определили ее некоторые биохимические свойства (рис.9). Фермент активен в диапазоне рН от 5,4 до 7,5 и имеет по результатам гель электрофореза в полуденатурирующих условиях молекулярную массу около 21 кД (рис.9А). Жидкостная хроматография на колонке Сефадекс-С75 и электрофорез продуктов ограниченного гидролиза синтетических поли(А) и поли(У), рРНК и двуцепочечной РНК из дрожжей, плазмидной ДНК (pUC18) и ДНК фага лямбда показали, что по характеру действия фермент является неспецифической эндонуклеазой (рис.ЭБ), способной расщеплять как одноцепочечную РНК, так и ДНК, но не двуцепочечную РНК. Эта изоформа расщепляла поли(У) с большей скоростью, чем поли(А). Активность по отношению к двуцепочечной ДНК была настолько слабой, что ее удалось определить только с помощью гель электрофореза продуктов гидролиза.

Таким образом, можно заключить, что стрессовые условия вызывают генетически детерминированные изменения суммарной активности и качественного состава изоформ РНКаз в растениях. Величина изменения РНКазной активности при холодовом стрессе прямо коррелирует с морозоустойчивостью сорта у озимого ячменя, в то время как у пшеницы наблюдали обратную корреляцию.

4. ВЫВОДЫ

1) Изучен изоферментный состав рибонуклеаз проростков пшеницы и ячменя, а также созревающего зерна кукурузы. Выявлена высокая степень внутривидового консерватизма изоэлектрического и электрофоретического спектраов изоформ РНКаз этих растений.

2) Стрессовые условия (низкая положительная и повышенная температура, засоление, обезвоживание) вызывают изменения как суммарной активности, так и качественного состава изоэлектрического спектра РНКаз ячменя и пшеницы. Направленность изменений РНКазной активности не зависит от вида стресса.

3) Выявлены изоэлектрические формы РНК-деградирующих ферментов озимого ячменя (pl 5,7 и 5,9), преимущественно повышающих активность при действии низкой положительной температуры, а также появление новой изоформы (pl 4,5) в межклеточной жидкости озимой пшеницы и ячменя при абиотических стрессах

4) Частично очищена эндонуклеаза с pl 4,5, появляющаяся в межклеточной жидкости озимой пшеницы и ячменя в ответ на повышение температуры, засоление и обезвоживание. Этот фермент имеет молекулярную массу около 21 кД и гидролизует следующие по-линуклеотиды (в порядке уменьшения активности): РНК> поли(У) >поли(А)>> онДНК »днДНК. Двунитевая РНК этой РНКазой не гидролизуется.

5) Распад мРНК осуществляется прочно связанным с ней магний зависимым деградирующим комплексом и инициируется процессом деаденилирования. Ингибирование синтеза белка в растениях циклогексимидом ¡n vivo и обработка РНК целитом (SÍO2) /л vitro позволяют предположить, что существуют два вида магний-зависимых РНКаз, различающихся по времени жизни: 1) РНКаза, деаденилирующая мРНК и 2) РНКаза, разрушающая мРНК.

6) Деградация рРНК, сопутствующая распаду мРНК в оттр системе, коррелирует с изменениями индекса стабильности суммарной полиаденилированной мРНК. Влияние степени разведения на интенсивность распада in vitro рибосомной РНК свидетельствует об отсутствии РНКаз связанных с этим типом РНК и возможном участии ассоциированных с мРНК РНКаз в деградации рРНК in vitro.

7) Уровень изменений РНКазной активности при стрессе отражает генетически детерминированные различия в механизмах адаптации растений к стрессовым условиям и положительно коррелирует со стрессоустойчивостью сорта у озимого ячменя, в то время как у озимой пшеницы наблюдается обратная корреляция.

8) Коэффициент корреляции между рангом морозоустойчивости сортов ячменя и величиной изменения РНКазной активности составил -0,8, а пшеницы - +0,71, что позволяет использовать РНКазы в качестве тест системы для первичной оценки морозоустойчивости селекционного материала.

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

1. Представленные в данной работе результаты по изменению суммарной РНКазной активности сортов озимого ячменя и пшеницы при холодовом стрессе позволяют, при условии адаптации метода определения РНКазной активности к потребностям массового анализа, использовать его для предварительной оценки селекционного материала на морозоустойчивость. Это позволит сократить объемы работ по оценке морозоустойчивости селекционного материала традиционными методами.

2. Выявленный межвидовой полиморфизм РНКаз злаковых и гибридов отдаленных скрещиваний позволяет использовать их в качестве дополнительного маркера в паспортизации сортов и подтверждении транслокаций генетического материала диких сородичей пшеницы в геном гибридов отдаленных скрещиваний.

6. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Плотников В.К., Киль В.И., Бибишев В.А., Новиков Б.Н. Влияние теплового шока на бело-ксинтезирующий аппарат зерна обычной и опак-2 кукурузы.// Физиология растений, 1990, т. 37, вып. 2, с. 302-307.

2. Плутахин Г.А., Новиков Б.Н. О полиморфизме изменения РНКазной активности проростков ячменя и пшеницы в ответ на стресс II Материалы 7-го Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990, с.96.

3. Плотников В.К., Киль В.И., Бибишев В.А., Новиков Б.Н., Парадес Ж.Р. Молекулярно-генетические аспекты термоадаптации созревающего зерна кукурузы II Материалы 7-го Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва, 1990, с. 167 -168.

4. Плутахин Г.А., Новиков Б.Н., Бибишев В.А., Плотников В.К. К вопросу о роли рибонуклеаз в регуляции активности генов // Материалы 2-го Всесоюзного совещания "Генетика развития", Ташкент, 1990, с. 138.

5. Плутахин Г.А., Новиков Б.Н. Изоэлектрическое фокусирование РНКаз пшеницы и ячменя, ассоциированных с полирибосомами// Физиология растений. 1991. Т.38. Вып.2. с.222-227.

6. Новиков Б.Н., Плутахин Г.А. Экспрессия генов нуклеаз межклеточной жидкости злаковых в ответ на абиотические стрессы II Материалы II Симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993, с.325.

7. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Алексеенко Ж.В., Бибишев ВА, Новиков Б.Н., Ненько Н.И. Некоторые аспекты молекулярного действия препарата фуролан и янтарной кислоты на рост яровой пшеницы // Материалы 3-ей международной конференции "Регуляторы роста и развития растений", Москва, 1995, с.101-102.

8. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В. Дифференциальная стабильность мРНК in vitro: новый класс молекулярно-генетических маркеров сельскохозяйственных растений. II Материалы научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", Москва, 1996, с.65.

9. Жогин А.Ф., Новиков Б.Н., Зима В.Г. Получение, идентификация и использование гибрида мягкой пшеницы Triticum aestivum L.sub.sp. eligulatum (Vav.) Kudr со свинороевыми cynodonteae Dum II Труды Краснодарского НИИ сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко 1996 с.138-147.

Ю.Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В., Бибишев В.А., Полежаев С.Л., Рядчиков В.Г. Дифференциальная стабильность мРНК эукариот в ommp системе: основа новых методов биотехнологии. II Материалы 2 съезда биохимического общества РАН, Москва, 1997, ч.2, с.525.

11.Новиков É.H., Плутахин Г.А. Рибонуклеазы возделываемых злаков и их участие в формировании устойчивости к экологическим стрессам II Материалы межрегиональной конференции "Экология. Культура. Образование", Сочи, 1997, с.24.

12.Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов растений: ряды индексов стабильности специфических мРНК in vivo и in vitro.// Генетика, 1998, Т.34. N 7,869-875.

13.Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В., Полежаев СЛ., Рядчиков В.Г. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов растений: влияние стрессов на стабильность мРНК in vitro II Генетика, 1998, N 9, с.1205-1211.

14.Бакалдина Н.Б., Плотников В.К., Алексеенко Ж.В., Новиков Б.Н. Дифференциальная стабильность мРНК eEF-1a in vitro - новый биотехнологический метод оценки морозоустойчивости зерновых культур II Материалы VIII Международной конференции "Новые направления биотехнологии", Москва, 1998,

15.Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В. Роль стабильности мРНК в формировании качества зерна кукурузы II Проблемы повышения качества зерна пшеницы и других зерновых культур - Сборник научных трудов РАСХН, М.: 1998, с.237-248

16.Бакалдина Н.Б., Плотников В.К., Алексеенко Ж.В., Новиков Б.Н. Холодо- и светоиндуци-рованная модудуляция стабильности мРНК проростков озимых сортов пшеницы и ячменя // Материалы IV съезда общества физиологов растений России - Москва, 1999, т.1, с.318.

17.Новиков Б.Н. Плутахин Г.А., Плотников В.К. Рибонуклеазы озимого ячменя в условиях хо-лодового стресса II Материалы IV съезда общества физиологов растений России - Москва, 1999, т.1, с.430431.

18.Новиков Б.Н. Экспресс-метод определения активности РНКаз в экстрактах тканей и хро-матографических фракциях: Информ. Листок № 68-2000. - Краснодарский центр научн,-техн. информации.

19.Новиков Б.Н. Активность рибонуклеаз ячменя и пшеницы в условиях низких положительных температур как биохимический маркер морозоустойчивости сортов II Вестник Краснодарского научного центра Адыгейской (Черкесской) международной академии наук, 2000, Вып.8., (в печати).

Тип. КубГАУ Заказ ¿¿-3 / . Тираж А^ экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новиков, Борис Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация нуклеаз растений.

1.1.1. Биохимическая классификация.

1.1.2. Сходство аминокислотных последовательностей рибонуклеаз.

1.2. Локализация РНК-деградирующих ферментов в растении.

1.2.1. РНКазы клеточных ядер.

1.2.2. Цитоплазматические РНКазы.

1.2.3. РНКазы, связанные с рибосомами и микросомами.

1.2.4. РНКазы митохондрий и хлоропластов.

1.2.5. Секретируемые РНКазы.

1.3. Модуляция активности рибонуклеаз факторами окружающей среды.

1.3.1. Засоление и обезвоживание.

1.3.2. Температурный стресс.

1.3.3. Поранение и болезни.

1.4. Изменения уровня активности и изоферментного состава РНКаз в онтогенезе растений.

1.5. Регуляция активности рибонуклеаз в растении.

1.5.1. Регуляция активности на уровне транскрипции и трансляции.

1.5.2. Взаимодействие с эффекторными молекулами и посттрансляционная модификация.

1.6. рибонуклеазы В деградации МРНК.

1.6.1. Удаление кэп-структуры на 5'-конце мРНК.

1.6.2. Экзорибонуклеазы.

1.6.3. Эндонуклеазы.

1.6.4. Деаденилирование мРНК.

1.6.5. РНКазы, связанные с мРНК.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Генетико-биохимическая гетерогенность рибонуклеаз злаковых культур в связи с разработкой новых методов отбора в селекционном процессе"

Постоянное усиление антропогенного давления на окружающую среду приводит к ухудшению экологической ситуации в большинстве районов Земли, глобальным изменениям климата, уменьшению площадей, пригодных для земледелия и обострению продовольственной проблемы. В связи с этим, возрастает значение разработок методов мониторинга состояния и отбора сельскохозяйственных растений, сочетающих высокую урожайность и пищевую ценность с повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды, а также низкой требовательностью к химической защите.

Селекция продуктивных сортов возделываемых злаковых в этих условиях должна опираться на ясное понимание механизмов биологических процессов генной экспрессии, лежащих в основе формирования основных хозяйственно-ценных признаков сортов и гибридов сельскохозяйственных растений (стрессоустойчивость и адаптивность, пищевая ценность зерна, урожайность).

Многочисленными работами показано, что в регуляции экспрессии генов важную роль играет время жизни индивидуальных матричных РНК, обеспечивая гибкое и быстрое изменение пула синтезируемых белков. В связи с этим особое внимание уделяется изучению механизмов регулирования времени жизни мРНК [Арбузов, 1977; Ross,1988; Плотников, 1992; Green, 1993; Brawerman,1993]. При этом, если элементы структуры мРНК, ответственные за дестабилизацию (стабилизацию) молекулы (цис-фактор) изучены уже довольно хорошо [Klausner, Harford, 1989; Green, 1993; Brawer-man,1993], то природа и характер взаимодействия с мРНК дестабилизирующих её белков (транс-факторов) остаются до сих пор во многом неизвестны. Структура зрелых мРНК, по всей вероятности, не несет последовательностей, способных к рибозимному саморасщеплению и необходимым условием для регулируемой деградации является мРНК-белковое взаимодействие

Ross, 1993]. Поэтому в настоящее время актуальным является идентификация и изучение РНКаз, участвующих в регуляции времени жизни мРНК.

Традиционные методы селекции на морозостойкость, засухоустойчивость и другие виды абиотичесих стрессов крайне трудоемки и требуют больших финансовых затрат. В связи с этим до настоящего времени также остается актуальной разработка лабораторных экспресс методов, позволяющих в строго контролируемых условиях проводить оценку селекционного материала на стрессоустойчивость.

Одним из путей создания подобных тест систем на морозоустойчивость злаковых растений может стать оценка активности ферментов нуклеинового обмена в клетке. Ферменты этого класса играют ключевую роль в регуляции метаболизма нуклеиновых кислот на посттранскрипционном уровне. Контролируя скорость обращения нуклеотидного материала, они оказывают существенное влияние на темпы смены пула синтезируемых белков, а значит и адаптивных реакций растения в ответ на изменение условий окружающей среды.

Первые успешные попытки использования рибонуклеаз в качестве тест систем для прогнозирования морозоустойчивости растений были сделаны в 80-х годах Кенефиком и Блэйком на ячмене, а также Джохадзе и Табатадзе на цитрусовых [Kenefick & Blake, 1986; Табатадзе и Джохадзе, 1982]. В одном случае определяли активность и изоферментный состав рибонуклеаз го-могената проростков, в другом - дополнительно анализировали РНКазную активность клеточных органелл. В обоих случаях была показана обратная коррелятивная связь между активностью РНКаз, определяемой в оптимальных для роста растений условиях, и морозоустойчивостью сортов.

Морозоустойчивость растений является сложным признаком, определяемым координированной работой множества генов на разных уровнях организации [Удовенко, 1979, Войников,1989, Пахомова, 1995]. Определяющим этапом при этом является период закаливания в условиях низкой положительной температуры. Поэтому нам кажется оправданным и перспективным разработка тест систем морозоустойчивости на основе изучения молекулярных процессов, протекающих в клетке на начальных этапах охлаждения до замораживания растений. Изучение регуляции экспрессии генов нуклеаз растений в стрессовых условиях позволяет выявить конкретные подходы к решению этой задачи.

Изменения в стрессовых условиях активности РНКаз растений различных таксонов и типов развития многократно наблюдались и ранее: при охлаждении у пшеницы [Бабенко и др. 1971]; засолении - у пшеницы, вигны, фасоли и риса [Кабанов, Червина,1973; Удовенко, Чудинова,1986; Filho, So-dek,1988; Rouxel,1989; Чудинова,1989; Mittal, Dubey,1990]; почвенной засухе - у пшеницы [Блехман, Творус,1974; Генкель,1978]; при поранении - у турнепса, томата, картофеля [Sacher et.al.,\915\ Sacher et.al, 1982; Pitt, Galpin, 1971; Isola, Franzoni,1986]. При заражении грибными патогенами и вирусами - у пшеницы, ячменя, картофеля, томата и ржи [Тютерев, Халезо-ва,1985; Barna et al 1989 Chacravorty,1979; Chacravorty, Scott,1979; Matousek, Dëdic, 1988; Sindelar et al.,1990]. Причем Чакраворти с соавт. отмечали, что в ответ на заражение возбудителем ржавчины у ячменя возможно не только увеличение общей нуклеолитической активности, но и появление новых изоферментов РНКаз [Chacravorty et.al., 1979; Chacravorty, Scott,1979а].

Эти эффекты принято связывать с прямым ингибирующим действием РНКаз на патогенные организмы, а также с участием нуклеаз в процессах формировании неспецифического адаптационного синдрома, понимаемого как комплекс однотипных, не зависящих от конкретного типа стресса процессов, направленных на переживание неблагоприятного периода. Основными составляющими этого комплекса реакций являются накопление свободных аминокислот, замедление белкового синтеза с одновременным изменением спектра синтезируемых белков (синтез так называемых стрессовых белков - белков теплового шока, PR-белков и др.), увеличение активности окислительно-восстановительных, гидролитических ферментов и др. [Александров,1975; Удовенко,1979; Браун, Моженок1987; Пахомова,1995].

Однако, направленность изменений активности нуклеолитических ферментов, наблюдаемая разными группами исследователей не всегда совпадает. Например, в то время как многие авторы отмечают возрастание активности РНКаз в ответ на повышение концентрации соли в среде [Кабанов, Червина,1973; Удовенко, Чудинова,1986; Яоихе1 е/.я/., 1989; РПИо, 8о-с!ек,1988; М1йа1, БиЬеу,1990] в литературе имеются сведения об ингибирова-нии РНКазной активности томатов при засолении [Охрименко и др., 1987].

Несмотря на большое количество частных исследований, комплексного изучения модуляции активности РНК-деградирующих ферментов в условиях различных стрессов на одном объекте не проводилось. Физиологическая роль и функции отдельных РНКаз в процессе клеточного ответа на внешние воздействия до настоящего времени остаются во многом неясными.

Растительные рибонуклеазы представляют интерес и как белки, выполняющие в организме трофические и защитные функции, а также, активно участвующие в процессах органогенеза, старения и программируемой гибели клеток.

Кроме того, в современных экономических условиях все более настоятельной становится потребность в паспортизации создаваемых сортов, для контроля над соблюдением патентных прав владельцев, миграцией генного материала при скрещиваниях и оценке генетической чистоты коммерческих партий семян. В мировой селекционной практике в этих целях используются анализ полиморфных фракций запасных белков, а также некоторых изофер-ментов. В связи с этим является актуальным поиск новых биохимических маркеров, позволяющих более полно описывать селекционный материал.

До настоящего времени рибонуклеазы практически не использовались ни для одной из этих целей. Во многом это связано с внутривидовой консервативностью множественных молекулярных форм РНКаз, выявляемой с помощью электрофореза белков, а также недостаточной изученностью генетики этого класса ферментов.

В связи с выше изложенным, целью настоящей работы являлось изучение внутри и межвидового полиморфизма РНКаз, особенностей их экспрессии в стрессовых условиях, а также выявление изоферментов, участвующих в деградации мРНК. Результаты работы позволят определить подходы к созданию новых лабораторных экспресс методов для оценки и браковки селекционного материала.

В соответствии с целями были определены следующие задачи исследования:

Изучить изоферментный состав и локализацию РНК-деградирующих ферментов проростков озимого ячменя и пшеницы, а также созревающего зерна кукурузы.

Изучить состав и свойства РНКаз, связанных с полирибосомами и матричной РЖ ячменя и пшеницы.

Изучить изменение активности внутриклеточных и межклеточных РНКаз в условиях засоления, обезвоживания и действия низкой положительной и повышенной температуры у сортов озимого ячменя и пшеницы различной стрессоустойчивости, а также созревающего зерна кукурузы.

Объектами исследования являлись сорта и гибриды ячменя и пшеницы селекции Краснодарского НИИСХ, так как это позволяло круглогодично иметь семенной материал широкого спектра генотипов. Кроме того, непосредственное общение с авторами сортов давало возможность учитывать особенности роста индивидуальных сортов и линий. Третий объект исследований - созревающее зерно кукурузы линии Висконсин 64А обычной и ее спонтанного мутанта Opaque-2, отличающегося повышенным в 2-3 раза уровнем РНКазной активности, позволял изучать особенности обмена нуклеиновых кислот и белкового синтеза на естественном повышенном фоне РНКазной активности.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Ферменты, деградирующие РНК эукариотов изучаются уже много лет. Накоплено огромное количество фактического материала об их структуре и биохимических свойствах [Farkas,1982; Blackburn, Moore, 1982; Stevens, 1993; Deutscher, 1993 ; Green, 1994 Bariola, Green, 1997]. Первые исследования РНКаз проводили в основном на животных и долгое время считалось, что основная функция РНК - деградирующих ферментов - гидролиз пищевой РНК. Однако, очень скоро стало ясно, что РНКазы обладают противоопухолевой, нейроток-сической, иммуномодулирующей активностью [Константинова и др., 1967, 1971; Ardelt et.al., 1991; Griffiths et.al.Д997]. На прокариотах было показано наличие в клетке большого количества РНКаз и их участие в процессах созревания и регуляции времени жизни различных классов РНК [Deutscher, 1988,1993]. Растительные РНКазы активно изучались до начала 80-х годов, и накопленные данные были обобщены в обзорных статьях Фар-каша [Farkas,1982] и Уилсона [Wilson, 1982]. Затем наблюдался некоторый спад количества публикаций во многом из-за того, что не было зафиксировано устойчивой корреляции между активностью РНКаз и содержанием РНК в растении, а также из-за неудачных попыток определить функции отдельных изоферментов. Однако, очень скоро работы, показавшие участие РНКаз в регуляции развития и формировании самонесовместимости у растений [McClure et al, 1989,1990], а также высокую степень гомологии внутриклеточной рибонуклеазы и PR белков [Moiseyev et al, 1993], безусловно, стимулировали изучение нуклеаз высших растений. Большое значение в интенсификации изучения растительных РНКаз играет поиск ферментов, ответственных за распад мРНК

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Новиков, Борис Николаевич

5. ВЫВОДЫ.

1. Изучен нзоферментный состав рибонуклеаз проростков пшеницы и ячменя, а также созревающего зерна кукурузы. Выявлена высокая степень внутривидового консерватизма изоэлектрического и электро-форетического спектра изоформ РНКаз этих растений.

2. Стрессовые условия (низкая положительная и повышенная температура, засоление, обезвоживание) вызывают изменения как суммарной активности, так и качественного состава изоэлектрического спектра РНКаз ячменя и пшеницы. Направленность изменений РНКазной активности не зависит от вида стресса.

3. Выявлены изоэлектрические формы РНК-деградирующих ферментов озимого ячменя (pi 5,7 и 5,9), преимущественно повышающих активность при действии низкой положительной температуры, а также появление новой изоформы (pi 4,5) в межклеточной жидкости озимой пшеницы и ячменя при абиотических стрессах

4. Частично очищена эндонуклеаза с pi 4,5, появляющаяся в межклеточной жидкости озимой пшеницы и ячменя в ответ на повышение температуры, засоление и обезвоживание. Этот фермент имеет молекулярную массу около 21 кД и гидролизует следующие полинуклеотиды (в порядке уменьшения активности): РНК> поли(У) >поли(А)>> онДНК »днДНК. Двунитевая РНК этой РНКазой не гидролизуется.

5. Распад мРНК осуществляется прочно связанным с ней магний зависимым деградирующим комплексом и инициируется процессом деа-денилирования. Ингибирование синтеза белка в растениях циклогек-симидом in vivo и обработка РНК целитом (Si02) in vitro позволяют предположить, что существуют два вида магний-зависимых РНКаз, различающихся по времени жизни: 1) РНКаза, деаденилирующая мРНК и 2) РНКаза, разрушающая мРНК.

122

6. Деградация рРНК, сопутствующая распаду мРНК в оттр системе, коррелирует с изменениями индекса стабильности суммарной поли-аденилированной мРНК. Влияние степени разведения на интенсивность распада in vitro рибосомной РНК свидетельствует об отсутствии РНКаз связанных с этим типом РНК и возможном участии ассоциированных с мРНК РНКаз в деградации рРНК in vitro.

7. Уровень изменений РНКазной активности при стрессе отражает генетически детерминированные различия в механизмах адаптации растений к стрессовым условиям и положительно коррелирует со стрессо-устойчивостью сорта у озимого ячменя, в то время как у озимой пшеницы наблюдается обратная корреляция.

8. Коэффициент корреляции между рангом морозоустойчивости сортов ячменя и величиной изменения РНКазной активности составил -0,80, а пшеницы - +0,71, что позволяет использовать РНКазы в качестве тест системы для первичной оценки морозоустойчивости селекционного материала.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее десятилетие стало очевидно, что просттранскрипционная модуляция времени жизни мРНК является одним из основных механизмов регуляция экспрессии генов в клетках эукариот вообще и высших растений в частности [Green,1993; Brawerman, 1993; Sullivan, Green, 1994; Ross,1996; VanHoof, Green, 1997]. Дифференциальное изменение стабильности транс-криптов играет важную роль в процессах синтеза запасных белков и адаптации растений к неблагоприятным факторам внешней среды. Как показывает анализ литературы, структура зрелых мРНК, по всей вероятности, не несет последовательностей, способных к рибозимному саморасщеплению, и необходимым условием для регулируемой деградации является мРНК - белковое взаимодействие. Поэтому идентификация и изучение РНКаз, участвующих в регуляции времени жизни мРНК, является в настоящее время крайне актуальным.

Неспецифический адаптационный синдром, развивающийся в растении при воздействии стрессовых факторов внешней среды, представляет собой прекрасную модель, для изучения молекулярных и биохимических механизмов саморегуляции генной экспрессии растительной клетки и выявления рибонуклеаз, выполняющих критические функции в процессе изменения пула транслируемых мРНК до адекватного изменившимся условиям.

Полученные в настоящей работе данные показывают, что проростки озимого ячменя и пшеницы, как и созревающее зерно кукурузы, содержат большое количество (до 12) изоэлектрических форм РНК-деградирующих ферментов. Причем, качественный состав РНКаз характеризуется высокой степенью внутривидового консерватизма. Вероятно, консерватизм этого класса ферментов связан с тем, что РНКазы участвуют в базовых процессах метаболизма критичных для функционирования организма и кодирующие их гены не испытывают давления искусственного отбора на продуктивность.

Однако, выявленные различия в спектрах рибонуклеаз гибридов отдаленных скрещиваний, а также геном-замещенных форм пшеницы и близких диких форм злаковых растений позволяют использовать их при оценке родительских форм и гибридов в селекционном процессе.

Стрессовые условия вызывают неспецифические к виду стресса изменения как суммарной активности, так и качественного состава изоэлектриче-ского спектра РНКаз ячменя и пшеницы. Для увеличения активности РНКаз необходимы процессы как транскрипции, так и трансляции, т.е. стрессовые условия вызывают активизацию генов РНКаз. Динамика изменения РНКаз-ной активности имеет двухстадийный характер, при котором первоначальное относительно быстрое увеличение сменяется пологим спадом.

Выявлены изоэлектрические формы РНК-деградирующих ферментов (pl 5,7 и 5,9), преимущественно повышающие активность во время охлаждения, а также появление новой изоформы (pl 4,5) в межклеточной жидкости озимой пшеницы и ячменя при абиотических стрессах. Однако, принимая во внимание, сходство ее субстратной специфичности с основными ферментами, нельзя исключить того, что этот белок может являться продуктом посттрансляционной модификации одного из постоянно присутствующих в межклетниках изоферментов.

Ярко выраженная компартментализация РНКаз внутри растительной клетки, при которой до 80 % активности локализовано в вакуолях, ограничивает доступ РНК - деградирующих ферментов к потенциальному субстрату. Поэтому естественно было предположить, что изоферменты, участвующие в гидролизе мРНК, ассоциированы в комплексе с полирибосомами. В ряде случаев на животных и растительных объектах показано, что это действительно так [Bandyopadhyay е.а.1990; Byrne et.al, 1993; Caruccio, Ross,1994].

Анализ препаратов полирибосом, выделенных из проростков озимого ячменя и пшеницы показал, что с ними связаны несколько изоформ РНКаз. Отсутствие жестких условий при выделении не позволяет однозначно утверждать, что эти ферменты структурно входят в состав полирибосом. Однако наличие на полисомах даже слабо связанной РНКазной активности может отражать реальный процесс взаимодействии рибонуклеаз цитоплазмы с полирибосомами in vivo. Ранее было показано наличие коррелятивной связи между уровнем РНКазной активности цитоплазмы и дифференциальным распадом мРНК [Плотников и др., 1984]. С этой точки зрения изменение активности или количества рибонуклеаз, связанных с полирибосомами, в результате обмена с пулом цитоплазматических ферментов приводит к распаду или стабилизации короткоживущих мРНК, что, в свою очередь, является причиной изменений в спектре синтезируемых белков.

Еще более сузить круг поисков в растениях РНКаз, непосредственно участвующих в регуляции времени жизни мРНК, позволил описанный В.К. Плотниковым и Н.Б. Бакалдиной феномен дифференциальной деградации мРНК в препаратах высокоочищенной РНК. Проведенные ими исследования позволили разработать простейшую систему мониторинга модуляции стабильности общего пула матричных РНК и индивидуальных транскриптов, названную оттр-системой распада мРНК (от латинского выражения "omnia mea mecum porto" - все свое ношу с собой) [Plotnikov, Bakaldina,1996; Плотников, Бакалдина, 1997].

Анализ процесса распада РНК в оттр системе показал, что деградация тесно связана с процессом деаденилирования и осуществляется рибонуклеа-зами белковой природы, устойчивыми к действию традиционных депротеи-низирующих агентов, активность которых стимулируется катионами Mg2+. Распад мРНК сопровождается деградацией рибосомной РНК, причем степень деградации рРНК коррелирует с индексом стабильности суммарной по-лиаденилированной мРНК.

Результаты, полученные в экспериментах с целитом и циклогексими-дом, позволяют сделать заключение о наличии в клетках растений двух видов тесно ассоциированных с мРНК магний-зависимых РНКаз, различающихся по времени жизни: РНКаза, деаденилирующая мРНК и РНКаза, разрушающая мРНК. Очевидно наличие рибонуклеаз, связанных с мРНК и полирибосомами, определяет сходство процессов дифференциального распада мРНК in vivo и в бесклеточных системах анализа стабильности мРНК.

Вероятно тесно связанные с мРНК рибонуклеазы играют определяющую роль в деградации мРНК in vivo и смене пула транслируемых транс-криптов в стрессовых условиях. Относительно слабо связанные с матричными рибонуклеопротеидами и полирибосомами РНКазы, а также цитоплазма-тические ферменты могут определять скорость оборота рибосомной и транспортной РНК. Кроме того, они также могут принимать участие в гидролизе продуктов распада мРНК.

Однако остается неясно, происходят ли эти процессы в цитоплазме или первоначально фрагментированные молекулы РНК транспортируются в вакуоли, где локализована основная часть нуклеолитических ферментов клетки. Наличие в вакуолях значительного количества олигонуклеотидного материала (по данным Абель и Глунд до 10% от общего количества в клетке), позволяет предположить, что вакуоли играют существенную роль в метаболизме нуклеиновых РНК.

Можно предположить следующий сценарий развития изменения активности и роли РНК-деградирующих ферментов в растении при стрессах. Изменение внешних условий приводит с одной стороны к активизации транскрипции генов РНКаз, с другой - изменение физико-биохимических параметров цитоплазмы (например, рН) и клеточных мембран может способствовать "скрытому" возрастанию РНКазной активности цитоплазмы за счет нарушения секреции в вакуоли и межклеточное пространство. Это, в свою очередь, может увеличивать в цитоплазме количество, как свободных, так и полисомсвязанных РНКаз. Повышенный фон нуклеолитической активности приводит к снижению общего уровня трансляции и клеточного метаболизма в целом, за счет повышенной скорости распада рибосомной и транспортной

РНК. В тоже время это способствует увеличению "оборачиваемости" нуклео-тидного материала и быстрой смене набора транслируемых мРНК и, как следствие, замены нормального набора клеточных белков на характерный для стрессовых условий. В пользу такого предположения свидетельствуют известные данные о том, что спустя три часа после начала воздействия на растения стрессового фактора большая часть РНК в клетке представлена вновь синтезированными молекулами [КЬаг1ашоу, 1994]. В сумме эти процессы способствуют переживанию неблагоприятного периода.

Механизмы активизации РНКазных генов при стрессах до сих пор не раскрыты, но на основании анализа литературных данных можно предположить, что активную роль при этом могут играть реакции аденилат-циклазного пути передачи сигнала в растении.

Важно, что уровень изменений РНКазной активности при стрессе отражает генетически детерминированные различия в механизмах адаптации растений к стрессовым условиям и связан со стрессоустойчивостью сорта прямой корреляционной зависимостью у озимых ячменей и обратной - у пшеницы. Эти результаты, свидетельствуют о наличии тесной связи между суммарной активностью РНКаз и стабильностью мРНК в клетке, а также адаптационной способностью сортов. Различия в ответе РНК-деградирующих систем ячменя и пшеницы на холодовое воздействие отражают генетически детерминированные различия в механизмах их холодовой адаптации.

Полученные данные позволяют, при условии адаптации метода определения РНКазной активности к потребностям массового анализа, использовать его для предварительной оценки селекционного материала на морозоустойчивость.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Новиков, Борис Николаевич, Краснодар

1. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура Л., Наука, 1975.-330 с.

2. Арбузов В.А. Регуляция синтеза белка. Стабильность мРНК как один из факторов регуляции синтеза белка в клетках эукариотов // Успехи соврем. биологии. -1977. Т.83. - № 2. - С. 163

3. Арион В.Я., Гребцова Л.Б., Короткова М.Н., Бекман Э.М. Обнаружение "скрытых" рибонуклеаз в высокоочищенных препаратах РНК // Молекулярная биология. 1982. - Т. 16. - № 1. - С.201-208.

4. Бабенко В.И., Бирюков C.B., Комарова В.П. Влияние длительного охлаждения семян озимой пшеницы на РНКазную активность и фотопериодическую реакцию // Физиология растений. 1971. - Т. 18. - №.5. -С.932.

5. Безбородова С.И. Рибонуклеазы и родственные им белки, а также ингибиторы рибонуклеаз белковой природы // Прикл. Биох. Микробиол. -1991. Т.27. - №.3. - С.308-329.

6. Бекман Э.М., Денисенко М.Ф., Григорьев М.Ю., Арион В.Я. Автолити-ческая деградация РНК: влияние различных факторов на динамику процесса // Молекулярная биология. 1986. - Т.20. - № 2. - С.527-534.

7. Блехман Г.И. Возможный механизм образования и накопления 2:3- ри-бонуклеозидциклофосфатов в листьях пшеницы при водном дефиците// Физиология растений. 1989. - Т.36. - №.2. - С.351-364.

8. Блехман Г.И. Новое о структуре и действии РНКаз // Успехи Совр. Биол. 1983. -Т.95. -№.2. -С.181-208.

9. Блехман Г.И. Образование и накопление циклической формы рибонук-леозидмонофосфатов в листьях пшеницы при обезвоживании// Физиология растений. 1987. - Т.34. - №.2. - С.390-399.

10. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. JL: Наука, 1987. - 232 с.

11. Войников В.К. Стрессовые белки растений при действии высокой и низкой температуры // Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1989. - С.5-19.

12. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. . М.: Колос, 1979. - 416 с.

13. Генкель П.А. Адаптация растений к экстремальным условиям окружающей среды // Физиология растений. 1978. Т.25. - №.5. - С.889-902.

14. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982

15. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.-544 с.

16. Кабанов В.В., Червина Э.П. Влияние хлористого натрия на состав легкорастворимых белков и РНКазную активность ферментов листьев гороха // Физиология растений. 1973. - Т.20. - №.5. С. 1044-1051.

17. Каплан И.Б., Атабеков И.Г. Влияние интерферона человека и (2'-5')-олигоаденилатов на синтез белка в тканях растений // Докл. АН СССР. -1987. -Т.297. -№.4. С.1018-1021.

18. Каримов Х.Х., Донцова A.C. Влияние абсцизовой кислоты на активность РНКазы прорастающих семян хлопчатника // Докл. АН Тадж. ССР. 1985. - Т.28. - №.7. С.422-424.

19. Каримова Ф.Г., Тарчевская О.И., Леонова С.А., Жуков С.Н. Некоторые характеристики цАМФ-зависимой протеинкиназной активности и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков листьев гороха // Физиология растений. 1991. - Т.38. - №.5. - С.923-930.

20. Киль В.И., Бибишев В.А., Плотников В.К. Неспецифический прирост трансляционной активности in vitro полисом из проростков ячменя ипшеницы под действием стрессов // Физиология растений. 1991. -Т.38. - №.4. - С.730-735.

21. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос, 1983.-320 с.

22. Константинова И.В., Ванько JI.B., Фукс Б.Б., Борман Е.А. Исследование механизма действия актиномицина Д и РНКазы на биосинтез антител и других белков при вторичном ответе in vitro // Докл. АН СССР. 1967. -Т. 176. -№ 4. - С.942-945.

23. Константинова И.В., и др. Исследование действия РНКазы на синтез антител при вторичном иммунологическом ответе in vivo и in vitro II Докл. АН СССР. 1971. - Т. 199. - № 4. - С. 948-951.

24. Корочкин Л.И., Серов О.Л., Пудовкин А.И., и др. Генетика изофермен-тов.-М.: Наука. 1977.

25. Креславский В.Д., Василенко В.Ф., Кузнецов Е.Д., Музафаров У.Н. О первичных этапах трансдукции светового сигнала в растительной клетке // Успехи совр. биол. 1993. - Т. 113. - №.14. - С.415-424.

26. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений. М.: Наука - 1986. -145с.

27. Маниатис, Фрич, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. М.: Мир, 1984. - 479 с.

28. Матвиенко H.H., Железная Л.А., Чернышева Я.И., Бурьянов Я.И., Матвиенко Н.И. Особенности экспрессии генов системы модификации рестрикции EcoRII //Биохимия. 1997. - Т.62. -№.10. - С. 1314-1318.

29. Одинцова М.С. Раковская М.В., Сисакан Н.М. Активность некоторых ферментов фосфорного обмена в хлоропластах, выделенных в неводной среде // Биохимия. 1963. - Т.28. - №.4. - С.616-621.

30. Остерман Л.А Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. - 288 с.

31. Остерман JI.А. Исследование биологических макромолекул изоэлектро-фокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами -М.: Наука, 1983.-304 с.

32. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот М.: Наука, 1985.-536 с.

33. Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология. -1995. Т.37. -№.1-2. - С.66-91.

34. Питерман М. Физические и химические свойства рибосом. М.: Мир, 1967.-304 с.

35. Плотников В.К., Рядчиков В.Г., Букреева Г.И., Лебедев A.B. Некоторые особенности популяции мРНК созревающего эндосперма кукурузы опак2 // Физиология растений. 1983. - Т.30. - № 1. - С.63-72.

36. Плотников В.К., Рядчиков В.Г., Филичкин С.А., Неудачин В.П., Филипас Т.Б., Долгих Ю.Р. К выяснению причин перераспределения белковых фракций в эндосперме кукурузы опак-2 //Физиология и биохимия культурных растений. 1984. - Т.16. - №.5. - С.459-467.

37. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Ефимов В.А. Стабильность мРНК зеи-на кукурузы в условиях нормальной и высокой температур // Физиология растений. 1991. - Т.38. - В.5. - С.981-989.

38. Плотников В.К. Стабильность мРНК как фактор регуляции экспрессии генов в клетках эукариот.//Успехи совр. биол. 1992. - Т. 112 - N.2. -С.186.

39. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов: изучение стабильности мРНК растений in vivo и in vitro II Генетика. 1997. - Т.ЗЗ. - № 3. - С.343-349.

40. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.: Наука 1985. - 272 с.

41. Спирин A.C., Гаврилова Л.П. Рибосома. М.: Наука, 1971.

42. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. 1985

43. Рубин А.Б. Биофизика, Кн. 1 М.: Высшая школа, 1987, 319 с.

44. Табатадзе Н.Г., Джохадзе Д.И. О связи морозостойкости некоторых цитрусовых с РНКазной активностью клеточных органе л л // Физиология растений. 1982. - Т.29. - №.6. - С. 1062-1066.

45. Таланова В.В., Титов A.B., Боева Н.П. Изменение уровня эндогенной абсцизовой кислоты в листьях растений под влиянием холодовой и тепловой закалки // Физиол. растений. 1990. - Т.38. - №.5. - С.991-998.

46. Тютерев С.Л., Халезова Л.А Влияние бурой ржавчины на содержание нуклеиновых кислот и активность рибонуклеазы в устойчивых и восприимчивых растениях пшеницы // Бюл. ВНИИ защиты растений. -1985. Вып.61. - С.67-71.

47. Удовенко Г.В. Чудинова А.И. Влияние засоления среды на изменение активности РНКазы и ДНКазы у растений разного уровня солеустойчи-вости // Физиол. Растений. 1986. - Т.ЗЗ. - №.6. - С. 1166-1172.

48. Удовенко Г.В. Физиологические механизмы адаптации растений к различным экстремальным условиям // Труды прикл. ботан. генет. селекции. 1979. - Т.64. - №.3. - С.337-349.

49. Феденко Е.П., Касумов К.К., Крицкий М.С. Регуляция фосфодиэстеразы цАМФ проростков кукурузы красным дальним красным светом // Физиол. растений. 1991. - Т.З8. - №.5. - С.917-923.

50. Чудинова А.И., Кречетова Г.Д., Шапот B.C. Выделение высокоочищен-ных цитоплазматических рибосом животной клетки// Биохимия. 1969. - Т.34. - №.5. - С.1021-1027.

51. Чудинова А.И., Кречетова Г.Д., Шапот B.C. Некоторые свойства нукле-аз, связанных с рибосомами печени // Биохимия. 1965. - Т.30. - №.4. -С.759-763.

52. Чудинова JT.A. Влияние засоления среды на обмен нуклеиновых кислот у растений пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. -1989. Т.21. - №.4. - С.373-378.

53. Шапот B.C. Нуклеазы. М.: Медицина, 1968. - 189 с.

54. Шалот B.C., Кречетова Г.Д., Лунц М.Г. Пушкина И.П., Сухова Т.П. О некоторых свойствах свободных рибосомам печени крысы // Докл. АН СССР. 1974. - Т.217. - № 2. - С.485.

55. Abel S., Glund К. Localization of RNA-degrading enzyme activity within vacuoles of cultured tomato cells // Physiol. Plant. 1986. - V.66. - P.1163-1186.

56. Abel S., Glund K. Ribonuclease in plant vacuoles: purification and molecular properties of the enzyme from cultured tomato cells // Planta. 1987. -V.172. - P.71-78.

57. Acton G.J. Phytochrome controlled acid RNase: an "attached" protein of ri-bosomes//Phytochemistry. 1974. -V.13. - P.1303-1310.

58. Acton G.J., Schopfer P. Phytochrome-induced synthesis of ribonuclease de novo in lupin hypocotyl sections // Biochem. J. 1974. - V.142. - P.449-455.

59. Altman S. Ribonuclease P. Postscript // J. Biol. Chem. 1990. - V.265. -P.2053-20056.

60. Anderson M.A., Cornish E.C., Mau S.-L., Williams E.G., Hoggard R. et al. Cloning of cDNA for a stylar glycoprotein associated with expression of self-incompatibility in Nicotiana alata // Nature. 1986. - V.321. - P.38-44.

61. Ardelt W., Mukulski S.M., Shogen K. Amino acid sequence an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos // J. Biol. Chem.1991. V.266. - P.245-251.

62. Astrom J., AstromA., VirtanenA. Properties of HeLa cell 3'- exonuclease specific for degrading poly(A) tails of mammalian mRNA // J. Biol. Chem.1992. V.267. - P. 18154-18159.

63. Baker E.J. Control of Poly(A) length. In.: G.Brawerman, J.Belasco, eds, Control of mRNA stability. Academic Press, New York. 1993, P.329-365.

64. Bandyopadhyay R., Brawerman G. Secondary structure at the beginning of the poly-A- sequence of mouse (3-actin messenger RNA // Biochemie. -1992.-V.74.-P. 1031-1034.

65. Bandyopadhyay R., Coutts M., Krowzynska A., Brawerman G. Nuclease activity associated with mRNA in its native stage: possible basis selectivity in mRNA decay // Mol. Cell. Biol. 1990. - V.10. - P.2060-2065.

66. Bariola P.A., Green P.J. Plant Ribonucleases In: Ribonucleases: structures and functions. Academic Press 1997, P. 163-190.

67. Barna B., Ibental W.D., Heitefuss R. Extracellular RNase activity in healthy and rust infected wheat leaves // Physiological and Molecular Plant Pathology. 1989. - V.35. - P. 151.

68. Baumgartner B., Matile P. Immunochemical localization of acid ribonuclease in morning glory flower tissue // Biochem. Physiol. Pflanz. 1976. - V.170. -P.279-285.

69. Beelman C.A., Parker R. Degradation of mRNA in eukaryotes // Cell. 1995. - V.81. -P.179-183.

70. Belanger F.C., Brode M.R., Ho T.D. Heat shock causes destabilization of specific mRNA and destruction of endoplasmic reticulum in barley aleurone cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. -P.1354.

71. Benner S.A., Alleman R.K. The return of pancreatic ribonuclease // TIBS. -1989. V.14. -P.396-398.

72. Blackburn P., Moore S. Pancreatic ribonuclease. Enzymes XV.1982.P.317-433.

73. Blank A., McKeon T.A. Single-strand-preferring nuclease activity in wheat leaves is increased in senescence and is negatively photoregulated // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V.86. - P.3169-3173.

74. Blank A., Sugiyama R.H., Dekker C.A. Activity staining of nucleolytic enzymes after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis: use of aqueous isopropanol to remove detergent from gels// Anal. Biochem. -1982. V.120. -P.267-275.

75. Blekhman G.I. Quaternary structure and activity changes of soluble ribonuclease in desiccated and rehydrated wheat leaves // Biochem. Physiol. Pflanzen.- 1978.- V. 172.- P.379.

76. Boiler T., Kende H. Hydrolytic enzymes in the central vacuole of plant cells // Plant Physiol. 1979. -V.63. - P. 1123-1132.

77. Bourque J.E. Antisense strategies for genetic manipulations in plants // Plant Sci. 1995,- V.105.-P.125-149.

78. Brawerman G. mRNA degradation in eukaryotic cells: an overview In Control of mRNA stability, pp.149-159. Academic Press, New-York 1993, 635p.

79. Brewer G., Ross J. Regulation of c-myc mRNA stability in vitro by a labile destabilizer with an essential nucleic acid component // Mol.Cell.Biol. -1989.-V.9.-P. 1996-2006.

80. Brown B.D., Harland R.M. Endonucleolytic cleavage of a maternal homeo-box mRNA in Xenopus oocytes // Genes Dev. 1990. - V.4. - P. 1925-1935.

81. Brown R.H., Ho Tuan-Hua D. Barley aleurone layers secrete a nuclease in response to gibberellic acid// Plant Physiol. 1986. - V.82. - P.801-806.

82. Byrne D., Seeley K.A., Colbert J.T. Half-lives of oat mRNA in vivo and in a polysome-based in vitro system // Planta. 1993. - V.189. - P.249-256.

83. Caruccio N., Ross J. Purification of a human polyribosome-associated 3' to 5' exoribonuclease // J. Biol. Chem. 1994. - V.269. - P.31814-31821.

84. Chacravorty A., Scott K. J. Changes in two barley leaf ribonuclease fractions during infection by the powdery mildew fungus // Physiol. Plant Pathology. -1979. V.14. - P.85-97.

85. Chakravorty A.K., Scott K.J. Changes in barley leaf ribonucleases during early stages of infection by Erysiphe graminis f. sp. hordei II Phytopathology.- 1979. V.69. - P.369-371.

86. Chang Su-Chin, Gallie D.R. RNase activity decreased to following a heat shock in wheat leaves and correlates with its posttranslational modification // Plant Physiol. 1997. - V.l 13. - P. 1253-1263.

87. Chevrier N., Sarhan F. Partial purification and characterization of two RNases and one nuclease from wheat leaves // Plant Sci. Lett. 1980. - V.19.- P.21-31.

88. Cossu G., Pirastru M.G., Satta ML, Chiari M., Chiesa C., Righetti P.G. Carrier ampholyte mediated oxidation of proteins in isoelectric focusing // J. Chromatography. - 1989. - V.475. - P.283-292.

89. Curtis D., Lehmann R., Zamore Ph.D. Translation regulation in development. Cell. 1995,-V.81.-P.171-178.

90. Deutscher M.P. The metabolic role of RNases // TIBS. 1988. - V.13. -P. 136-139.

91. Deutscher M.P. Ribonuclease multiplicity, diversity, and complexity // J. Biol. Chem. 1993. - V.268. -N. 18. - P. 13011-13014.

92. Devis B.J. Disk electrophoresis. Method and application to human serum protein//Annals N.Y. Acad. Sci. 1964. - V.121. - P.404-427.

93. Drager R.G., Girard-Bascou J., Choquet Y., Kindle K.L., Stern D.B. In vivo evidence for 5'~>3' exoribonuclease degradation of an unstable chloroplastmRNA // Plant J. 1998 - V. 13. - P.85-96.

94. Farkas G.L. Ribonucleases and ribonucleic acid breakdown // Nucleic acids and proteins in plant II. Structure, biochemistry and physiology of nucleic acids. Berlin.: Springer Verlag, 1982. p.224-262.

95. Filho E.G., Sodek L. Effect of salinity on ribonuclease activity of Vigna un-guiculata cotyledons during germination // J. Plant Physiol. 1988. - V.132. - P.307-311.

96. Furuichi Y., LaFiandra A., Shatkin A.J. 5'-terminal structure and mRNA stability // Nature. 1977. - V.266. - P.235-239.

97. Gallie D.R., Caldwell C., Pitto L. Heat shock disrupts cap and poly(A) tail function during translation and increases mRNA stability of introduced reporter mRNA // Plant Physiol. 1995.- V. 108,- N.4.- P. 1703-1713.

98. Green P.J. Control of mRNA stability in higher plants // Plant Physiol. -1993.-V. 102.-P. 1065-1070.

99. Green P.J. The ribonuclease of higher plants // Ann. Rev. Plant. Physiol Plant Mol. Biol. 1994. - V.45. - P.421-445.

100. Griffiths S.J., Adams D.J., Talbot S.J. Ribonuclease inhibits Kaposi's sarcoma // Nature. 1997. - V.390. - P.568.

101. Gruisem W., Schuster G. Control mRNA degradation in organelles In: G.Brawerman, J. Belasco, eds., Control of mRNA stability, pp. 329-365. Academic Press, New York. 1993.

102. Guerrier-Takada C., Gardiner K., Marsh T., Pace N., Altman S. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme// Cell. 1983. V.35. - N.3. - P.849-857.

103. Hentze M.W. Determinants and regulation of cytoplasmic mRNA stability in eukaryotic cells // Biochim. et Biophys. Acta. 1991. - V.1090. - 281-292.

104. Higgs D.C., Colbert J.T. Oat phytochrome A mRNA degradation appears to occur via two distinct pathways // Plant Cell. 1994. - V.6. - P. 1007-1019.

105. Ide H., Kimura M., Arai M., Funatsu G. The complete amino acid sequence of ribonuclease from the seeds of bitter gourd (Momordica charantia) II FEBS Lett. 1991. - V.284. - P. 161-164.

106. Isola Maria Clara, Franzoni Luis Mechanism of the increase in ribonuclease activity in potato tuber slices // Plant and Cell. Physiol. 1986. - V.27. - N.2. - P.331-335.

107. Jain C., Belasco J.G. RNase E autoregulates it's synthesis by controlling the degradation rate of its own messenger RNA in E.coli. Unusual sensitivity of the rne transcript to RNase E activity // Genes and Development. 1995. -V.9. -N.l. -P.84-96.

108. Jiang C-Z., Kliebenstein D., Ke N., Rodermel S. Destabilization of rbcS sense transcripts by antisense RNA // Plant.Mol.Biol. 1994. - V.25. -P.569-576.

109. Kapoor H.C. The nature of the increase in ribonuclease activity in germinating seeds of cowpea treated with gibberellic acid or cyclic-AMP // Phyto-chemistry. -1981,- V.26. N. 12. - P.2617-2619.

110. Kenefick D.G., Blake T.K. Low ribonuclease activity prior to cold acclimation in freeze selected winter barley // Crop Sci. 1986. - V.26. - N.6. -P. 1099-1103.

111. Key J.I., Lin C.Y., Chen Y.M. Heat shock proteins of higher plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V.78. -N.6. - P.3526-3530.

112. Kharlamov A.V. Response of wheat meristematic cells to heat shock: Flow cytometric and radioisotopic studies // Biol. Plant. 1994. - V.36. - Suppl. P. 10.

113. Klausner R.D., Harford J.B. Cis-trans models for post-transcriptional gene regulation // Science. 1989. - V.246. - P.870-872.

114. Kock M., Loffler A., Abel S., Glund K. cDNA structure and regulatory properties of a family of starvation-induced ribonucleases from tomato// Plant Mol. Biol. 1995. - V.27. - P.477-485.

115. Kuligowska E., Klarkowska D., Szarkowski J.W. // Phytochemistry. 1988. -V.27.-N.5.-P. 1275-1279.

116. Kuligowska E., Klarkowska D., Szarkowski J.W. Alcaline ribonuclease from rye germ cytosol // Acta. Biochim. Pol. 1976. - V.23. - P. 115-126.

117. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the heat of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V.227. - N.5259. - P.680-685.

118. Lawton M.A., Yamamoto R.T., Hanks S.K., Lamb C.J. Molecular cloning of plant transcripts encoding protein kinase homologs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989.-V.86.-P.3140-3144.

119. Leone E., Farina B., Faraone Minella M.R. Reversible inactivation of ribonucleases by ADP-ribosylation // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V.871. -P. 182-188.

120. Lers A., Khalchitski A., Burd S., Green P.J. Senescence-induced RNases in tomato // Plant. Mol. Biol. 1998. V.36. - P.439-449.

121. Lieberman A.P., Pitha P.M., Shin M.L. Poly(A) removal is the kinase regulated step in tumor necrosis factor mRNA decay // J. Biol. Chem. 1992. -V.267. - N.4. - P.2123-2126.

122. Liere K, Link G. Chloroplast endoribonuclease p54 involved in RNA 3'-end processing is regulated by phosphorylation and redox state // Nucleic Acids Res. 1997. - V.25. -N.12. P.2403-2408.

123. Loffler A., Abel S., Jost W., Beintema J.J., Glund K. Phosphate-regulated induction of intracellular ribonucleases in cultured tomato (Lycopersicum es-culentum) cells // Plant Physiol. 1992. - V.98. - P. 1472-1478.

124. Manrow R.E., Shapiro R.A., Herrick D., Steel L.F, Blinder D., Jacobson A. Regulation of mRNA stability and the poly(A) problem in Dictyostelium dis-coideum // Developmental Genetics. 1988. - Y.9. - P.403-419.

125. Matousek J., Dedic P. Acid nucleases in PSTV-infected tomato (Lycopersicum esculentum L.) I. Levels of acid nuclease activity in healthy and PSTV-infected tomato leaves and callus tissues // J. Plant Physiol. 1988. -V.133. -N.3. -P.340-344.

126. McClure B.A., Haring V., Ebert P.R., Anderson M.A., Simpson R.J., Saki-yama f., Clarke A.E. Style self-incompatibility gene products of Nicotiana alata are ribonucleases // Nature. 1989. - V.342. - P.955-957.

127. McClure B.A., Gray J.E., Anderson M.A., Clarke A.E. Self-incompatibility in Nicotiana alata involves degradation of pollen rRNA // Nature. 1990. -V.347. - N.6295. - P.757-760.

128. Merlo E., Matilla A. Decrease in ribonuclease activity in embryonic axes isolated from chickpea (Cicer arientum L.) induced by abscisic acid // J. Exp. Bot. 1985. - V.36. -N.172. - P.1780-1786.

129. Mertz E.T. Genetic and biochemical control of grain protein synthesis in normal and high lysine cereals // Wld. Rev. Nutr. Diet. 1986. - V.48. -P.222-262.

130. Meza-Basso L., Del Pino C., Cardenas J., Rosas A. Purification and propertes of a ribonuclease from corn leaf tissues // Phytochemistry. 1986. - V.25. -N. 11. - P.2489-2492.

131. Mittal R., Dubey R.S. Effect of NaCl salinity on RNA level as well as activity and molecular forms of ribonuclease in germinating rice seeds differing in salt tolerance// Indian J. Plant Physiol. 1989. -V.XXXIII. -N.l. - P.32.

132. Muramoto Y., Watanabe A., Nakamura T., Takabe T. Enhanced expression of a nuclease gene in leaves of barley plants under salt stress // Gene 1999. — V.234.-P.315-32

133. Nguyen T.T., Paltic M.M., Hadziyev D. Caracterization of cell-wall-bound nuclease and ribonuclease from potato tuber // Agric. Biol. Chem. 1988. -V.52. - P.957-965.

134. Nishimura ML, Beevers H. Hydrolases in vacuoles from castor bean endosperm // Plant Physiol. 1978. - V.62. - P.44-48.n

135. Nuss D.L., Furuichi Y, Characterization of the m G(5')pppN-pyrophosphatase activity from HeLa cells // J. Biol. Chem. 1977. - V.252. - P.2815-2821.

136. Ohashi Y. Effect of ionic strength on chain elongation in ADP-ribosylation of various nucleases // J. Biochem. (JP). -V.99. -N.3. -P.971-979.

137. Ohh M., Takei F. Regulation of ICAM-1 mRNA stability by cycloheximide. Role of serine-treonine phosphorylation and protein synthesis // J. Cell. Biochem. 1995. - V.59. -N.2. -P.202-213.

138. Ong H.T. Effects of actinomycin D, cycloheximide and kinetin on ribonucle-ase and beta-fructofuranosidase in water stressed tomato cotyledons // Biología Plantarum (Praha). 1980. - V.22. -N.4. - P.245-248.

139. Pietrzak M., Cudny H., Maluszynski M. Purification and properties of two ribonucleases and a nuclease from barley seeds // Biochim. Biophys. Acta. -1980. V.614. — P. 102-112.

140. Pitt D., Galpin M. Increase in ribonuclease activity following mechanical damage to leaf and tuber tissue of Solanum tuberosum L. // Planta. 1971. -V.101.-P.317-332.

141. Plotnikov V.K., Bakaldina N.B. Differential stability of zein mRNA in developing corn kernel// Plant Mol. Biol. 1996. - V.31. - P.507-515.

142. Pokalsky A.R., Hiatt W.R., Ridge N.,Rasmussen R., Houck C.M., Shewmaker C.K. Structure and expression of elongation factor la in tomato// Nucleic Acids Research. 1989. - V. 17. -N. 12. -P.4661-4673.

143. Prentice N., Heisel S. Purification and characterization of a ribonuclease from barley roots// Phytochemistry. 1985. - V. 24. - P. 1451- 1457

144. Przykorska A., Kuligowska E., Wagner E.G.H., Szarkowski J.W., Nordstrom K. Two plant nucleases as tools for structural analysis of RNA // Phytochemistry. 1989. - V.28. - P.1585-1588.

145. Quinn P.J. Effects of temperature on cell membranes // Plants and temperature: Symp. of Soc. for Exp. Biol., Fasex 8-10 Sept. 1987.

146. Razzell W.E. The precipitation of polyribonucleotides with magnesium salt and ethanol// J.Biol.Chem. 1963. - V.238. P.3053.

147. Righetti,1983; Righetti P.G. // Isoelectric focusing: theory, methodology and applications. Amsterdam: Elsevier Biomedical Press, 1983, 296p.

148. Rijven A.H.G.C. Ribosomal wash ribonucleases from fenugreek (Trigonella foenum graecum L.) and soybean (Glycine max (L) Merr.) cotyledons and their interactions with poly(A) and some modified nucleosides // Plant. Sci. Lett. 1978,-V. 11.-P.293-303.

149. Ross J. Control of messenger RNA stability in higher eukaryotes // Trends in Genet. 1996,- V.12. - P.171-175.

150. Ross J. Messenger RNA turnover in eucaryotic cells// Mol. Biol. Med. -1988. V.5. - P. 1-14.

151. Ross J. mRNA decay in cell-free systems. In: G.Brawerman, J. Belasco, eds., Control of mRNA stability, pp. 417-448. Academic Press, New York. 1993.

152. Ross J., Kobs G. H4 histone messenger RNA decay in cell-free extracts initiates at or near the 3' terminus and proceeds 3' to 5' // J. Mol. Biol. 1986. V.188. - P.579-593.

153. Ross J., Kobs G., Brewer G, Peltz S.W. Properties of the exonuclease activity that degrades H4 histone mRNA // J. Biol. Chem. 1987. - V.262. - P.9374-9381.

154. Rouxel M.F., Billard J.-P., Boucaud J Effect of NaCl salinity in vivo and in vitro on ribonuclease activity in the halophyte Saueda maritima // Physiol. Plantarum. 1987. - V.69. - P.330-336.

155. Rouxel M.F., Singh J.P, Beopoulos N., Billard J.-P., R. Esnault Effect of salinity stress on ribonucleolytic activities in glycophytic and halophylic plant species// J. Plant Physiol. 1989. - V.133. - P.738.

156. Sacher G.A., Morgan E.G., Ross D.D. Paradoxical effect of actinomicin D regulation of synthesis of RNase at translation in turnip tissue // Plant Physiol. 1975. - V.56. - P.442.

157. Sacher J.A., Tseng J., Wiliams R., Cabello A. Wound-induced RNase activity in sweet potato. Evidence for regulation at transcription // Plant. Physiol. -1982.-V.69.-P.1060-1065.

158. Sachs A.B. Messenger RNA degradation in eukaryotes // Cell. 1993. -V.74. -P.413-421.

159. Sarhan F., Chevrier N. Regulation of RNA synthesis by DNA-dependent RNA polymerases and RNases during cold acclimation in winter and spring wheat // Plant Physiol. 1985. - V.78. - P.250-255.

160. Sawai Y., Sugano N., Tsukada K. Ribonuclease H activity in cultured plant cell//Biochim. Biophys. Acta. 1978.-V.518.-P. 181-185.

161. Schmidt R.I. Opaque-2 and zein gene expression. In: Control of plant gene expression. Verma DPS (ed.), pp 337-355. CRC Press, Boca Ration FL 1993.

162. Sharma J.P., Chawla H.S. Ribonuclease isozymes at early germination stages in leaf-rust resistant isolines of wheat // Current Science. 1989. - V.58. -P.144-145.

163. Shimotohno K., Miura K. A novel 5'-exonuclease which degrades uncapped mRNA In Proceedings of the 1977 Molecular Biology Meeting of Japan, pp.83-85. (1977)

164. Sindelar L., Sindelarova M., Cerovska N., Hanusova M. Changes in ribonuclease and glucose-6-phosphate dehydrogenase activities during PVY-RNA biosynthesis in potato leaf discs // Biological Plantarum (Praha). 1990. -V.32. - P. 119-127.

165. Siwecka M.A., Rytel M., Szarkowski J.W. Purification and characterization of nuclease of nuclease I associated with rye germ ribosomes // Acta Bio-chem. Pol. - 1989. - V.36. - P.45-62.

166. Siwecka M.A. Purification and some properties of a novel dsRNA degrading nuclease bound to rye germ ribosomes // Acta Biochim. Pol. 1997. V.44 - 1 -P. 61-68.

167. Skoczek H. Electrophoretic studies of ribonuclease in different parts of barley embryo roots // Acta Physiol. Plant. 1980. - V.2. - P.243-246.

168. Srivastava B.I.S., Matsumoto H., Chadha K.C. Studies on chromatin-associated nuclease from barley leaves // Plant Cell Physiol. 1971. - V. 12. -P.609-618.

169. Stevens A. A. 5'—>3' exoribonuclease of Saccharomyces cerevisiae: Size and novel substrate specificity // Arch. Biochem. Biophys. 1987. - V.252. -P.339-347.

170. Stevens A. mRNA-decapping enzyme from Saccharomyces cerevisiae: Purification and unique specificity for long RNA chains // Mol. Cel. Biol. 1988. - V.8. - P.2005-2010.

171. Stevens A. Eukaryotic nucleases and mRNA turnover. In: Control of mRNA stability, pp.429-486. Academic Press, New-York 1993, 635p.

172. Sullivan M.L., Green P.J. Post-transcriptional regulation of nuclear-encoded genes in higher plant: the role of mRNA stability and translation // Plant. Mol. Biol. 1993. - V.23. - P. 1091-1104.

173. Sunitha I., Slobin L.I. An in vitro system derived from Friend erythroleuke-mia cells to study messenger RNA stability // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. - V. 144. - P.560-567.

174. Tanzer M.M., Meagher R.B. Degradation of the soybean ribuloso-1,5-bisphosphate carboxylase small-subunit mRNA, SRS4, initiates with endonu-cleolytic cleavage // Mol. Cel. Biol. 1995. - V. 14. - P.6641-6652.

175. Taylor C.B., Bariola P.A., delCardayre S.B., Raines R.T., Green P.J. RNS2: a senescence-associated RNase of Arabidopsis that diverged from the S-RNases before speciation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V.90. -P.5118-5122.

176. Taylor C.B., Green P.J. Genes with homology to fungal and S-RNases are expressed in Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1991. - V.96. - P.980-984.

177. Thelen M.P., Northcote D.H. Identification and purification of a nuclease from Zinnia elegans L.: potential molecular marker for xylogenesis// Planta. -1989.-V.179.-P.181-195.

178. Thomas J.M., Crisp M., Hodes M.E. Sialic acid residues contribute to the heterogeneity of human serum ribonuclease: demonstration by isoelectric focusing and neuraminidase treatment of serum // Clinica Chimica Acta. -1984.- V.142.-P.73-81.

179. Thomas J.M., Hodes M.E. Improved method for ribonuclease zymogram // Anal.Biochem. 1981. -V. 113. -P.343-351.

180. Thompson A.J., Evans I.M., Boulter D., Croy R.D., Gatehouse J. A. Transcriptional and posttranscriptional regulation of seed storage protein gene expression in pea (Pisum sativum L.) // Planta. 1989. - V.179. - N.3. - P.279-287.

181. Tomkins G.L., Gelehrter T.D., Granner D., Martin D., Samuels H.H., Thompson E.B. Control of gene expression in higher organisms // Science. 1969. -V. 166.-P. 1474-1480.

182. Tomkins G.M., Levinson B.B., Baxter G.D., Dethlifsen L. Further evidence for posttranscriptional control of inducible tyrosine aminotransferase synthesis in cultured hepatoma cells. // Nature New Biology. 1972. - V.239. - P.9-14.

183. Van Hoof A., Green P.J. Control of mRNA decay in plants // In: mRNA Metabolism and Post-Transcriptional Gene Regulation, pp 201-216. Wiley-Liss, Inc. 1997

184. Wager R.E., Assoian R.K. A phorbol ester-regulated ribonuclease system controlling transforming growth factor (31 gene expression in hematopoetic cells // Mol. Cell. Biol. 1990. - V. 10. - P.5983-5990.

185. Wang M.J., Davis N.W., Gegenheimer P. Novel mechanisms for maturation of chloroplast transfer RNA precursors // EMBO J. 1988. - V.7. - P. 15671574.

186. Wessler S.R., Marquerite V.I. Molecular basis of mutations at the waxy locus of maize: Correlation with the structure genetic map //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985.- V.82.-P.4477-4481.

187. Wilson C.M. Plant nucleases. III. Polyacrilamide gel electrophoresis of corn ribonuclease isoenzymes // Plant Physiol. 1971. - V.48. - P.64-68.

188. Wilson C.M. Plant nucleases. IY. Genetic control of ribonuclease activity in corn endosperm // Biochem. Genetics. 1973. - V.9. - P.53-63.

189. Wilson C.M. Plant nucleases // Ann. Rev. Plant Physiol. 1975. - V.26. -P. 187-298.

190. Wilson C.M., Apel G.A. Effect of Helminthosporium maydis, race T, patho-toxin on growth and ribonuclease levels of corn roots // Crop Sci. 1975. -V.15. - P.385-389.

191. Wilson C.M. Plant nucleases. YI. Genetic and developmental variability in ribonuclease activity in inbred and hybrid corn endosperm // Plant Physiol. -1980. V.66. - P.119-125.

192. Wilson C.M. Plant nucleases: biochemistry and development of multiple molecular forms // Isozymes: Cur. Top. Biol. Med. Res. 1982. - V.6. - P.33-54.

193. Wreshner D.H., Rechavi G. Differential mRNA stability to reticulocyte ribo-nucleases correlates with 3' non coding (U)nA sequences // Eur. J. Biochem. 1988. - V.172. -P.333-340.

194. Yang, J., Stern, D. B. The spinach chloroplast endoribonuclease CSP41 cleaves the 3'-untranslated region of petD mRNA primarily within its terminal stem-loop structure // J. Biol. Chem. 1997 - V.272. - P. 12874-12880.

195. Yen Y., Baenziger PS. Identification, characterization and comparison of RNA-degrading enzymes of wheat and barley // Biochem. Genet. 1993. -V.31. — P. 133-145.

196. Yen Y., Green P.J. Identification and properties of the major ribonucleases of Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1991. - V.97. - P. 1487-1493.

197. Zalewski K. The metabolism of aged seeds. The ribonucleolytic activity of rye grain embryos of different ages // Acta Soc. Bot. Pol. 1986. - V.55. -P.45-51.