Получение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы

Титов, Сергей Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы"

□03166900

На правах рукописи

ТИТОВ СЕРГЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ

ТАБАКА (ЛЧСОЛАМ ТАВАСиМЪ ), ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ АНТИСМЫСЛОВОЙ СУПРЕССОР ГЕНА ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ

03 00 15 ГЕНЕТИКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2008

1 6 АПР 2008

003166900

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН, г Новосибирск

Научный руководитель

кандидат биологических наук, доцент Кочетов Алексей Владимирович Институт цитологии и генетики СО РАН, г Новосибирск

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Першина Лидия Александровна

доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович

Ведущее учреждение

Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г Владивосток

Защита диссертации состояться «¡4 » 2008 г на утреннем заседании

диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук (Д-003 011 01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу 630090, г Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел (383) 333-12-78, e-mail dissov^bionet nsc ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан «1>»Н^ТА 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

АД Груздев

ВВЕДЕНИЕ

В процессе эволюции растения выработали механизмы адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды Вместе с тем многие культурные виды в результате однонаправленного отбора на проявление отдельных признаков утратили устойчивость к стрессовым воздействиям, что существенным образом снижает их продуктивность Сравнение рекордных и стандартных урожаев нескольких видов возделываемых растений показало, что урожаи культурных растений обычно составляют не более 20% от их максимально возможного уровня (Воуег, 1982) Хотя такое уменьшение продуктивности отчасти связано с воздействием биотических факторов (болезней, фитофагов и сорняков), считают, что и абиотические стрессы могут играть существенную роль

При изучении механизмов индукции и поддержания стрессоустойчивости к абиотическим факторам у растений особый интерес вызывает роль пролина в этих процессах Это связано с тем, что содержание свободного пролина в растительных клетках многократно возрастает в ответ на различные стрессорные факторы 1) засуху, 2) засоление, 3) повышение или понижение температуры, 4) токсическое действие тяжелых металлов, 5) недостаток питательных веществ (Кузнецов и Шевякова, 1999) Возможно, поэтому, несмотря на значительное количество работ, посвященных защитному действию пролина, его роль по-прежнему остается во многом не ясной Например, согласно некоторым предположениям, значительное накопление пролина в клетках растений во время стресса является не защитной реакцией, а индикатором повреждения клеток стрессовыми факторами (Lutts et al, 1996, Serraj and Sinclair, 2002)

В растениях накопление пролина во время стресса происходит как за счет увеличения скорости его синтеза, гак и за счет ингибирования его деградации Скорость-лимитирующим ферментом деградации пролина является пролиндегидрогеназа (ПДГ). На сегодняшний момент, однако, нет ясности в вопросе о том, какую роль играет катаболизм пролина в стрессоустойчивости и восстановлении растений после стресса Было выдвинуто предположение о важной роли этого процесса, поскольку деградация пролина сопровождается синтезом АТФ и изменением окислительно-восстановительного потенциала (Hare and Cress, 1997) Для изучения роли ПДГ в стрессоустойчивости растений были получены трансгенные растения арабидопсиса с пониженной активностью этого фермента Однако, снижение активности ПДГ в одном случае приводило к увеличению содержания пролина и повышению стрессоустойчивости (Nanjo et al, 1999), а в другом такого эффекта не наблюдалось (Маш et al, 2002), что не позволяло делать каких-либо заключений Баланс синтеза и деградации пролина является одним из важных элементов механизма устойчивости к осмотическому стрессу, поэтому проблема взаимосвязи

между ПДГ и стрессоустойчивостью относилось к числу актуальных задач молекулярной генетики растений

Трансгенные растения с супрессированной активностью ПДГ представляют собой адекватную генетическую модель для исследования этой проблемы Мы предполагали, что снижение активности ПДГ может привести к повышению содержания пролина в клетках трансгенных растений в нормальных условиях и, возможно, к повышению их стрессоустойчивости С другой стороны, снижение активности этого фермента могло негативно сказаться на устойчивости к стрессу, например в том случае, если деградация пролина в условиях стресса важна для поддержания адекватного баланса ИАО/МАОН

Таким образом, цель настоящей работы заключалась в исследовании роли гена ПДГ в устойчивости растений к абиотическим стрессам В рамках данной работы было запланировано решить следующие задачи

1 Создать генетические конструкции, экспрессия которых в геноме растений будет приводить к супрессии гена пролиндегидрогеназы, отвечающего за деградацию пролина

2 Получить растения табака, несущие генетические конструкции -супрессоры пролиндегидрогеназы

3 Исследовать биохимические и физиологические параметры растений-трансформантов, такие как активность пролиндегидрогеназы, содержание пролина, осмотическое давление клеточного сока, солеустойчивость

Научная новизна В результате проведенного исследования создана новая генетическая модель - трансгенные растения табака, несущие гетерологичный антисмысловой супрессор пролиндегидрогеназы Получена новая информация о роли ПДГ в контроле стрессоустойчивости растений показано, что частичная супрессия гена ПДГ сопровождается повышением устойчивости растений к засолению, что позволяет выдвинуть гипотезу о возможности контроля стрессоустойчивости за счет изменения активности этого фермента Предложен новый подход для получения стрессоустойчивых форм растений, основанный на использовании генетических конструкций - супрессоров ПДГ.

Практическая ценность Показано, что супрессоры гена пролиндегидрогеназы могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с увеличенной стрессоустойчивостью Создан набор генетических конструкций, которые могут быть использованы для получения стрессоустойчивых форм растений Показана возможность создания достаточно эффективного супрессора на основе гетерологичного гена Разработан подход, позволяющий исключать из состава генетических конструкций маркерные гены устойчивости к антибиотикам и проводить отбор трансформантов непосредственно на стрессовых фонах Подана заявка на патент «Способ получения

трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина» Генетические конструкции, содержащие супрессоры гена пролиндегидрогеназы, переданы и используются в Институте физиологии растений РАН и ВНИИ картофельного хозяйства РАСХН Положения, выносимые на защиту.

1 Создан антисмысловой супрессор гена ПДГ Показано, что частичная супрессия гена ПДГ увеличивает стрессоустойчивость растений, что подтверждает гипотезу о роли этого гена в контроле стрессоустойчивости

2 Созданы генетические конструкции, не содержащие генов устойчивости к антибиотикам и несущие минимальное количество чужеродной для растения векторной ДНК Показана возможность отбора и получения трансгенных растений, несущих антисмысловой супрессор ПДГ, на средах, не содержащих антибиотики Апробация работы. Результаты работы докладывались на

российских и международных конференциях. 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых, 2003, конференции МОГиС, 2003, Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», Саратов, 2003, Съезде ВОГиС, Москва, 2004, III международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Украина, Алушта, 2006, Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2007

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы Работа изложена на 108 страницах, включает 21 рисунок и фотографии, 2 таблиц в тексте диссертационной работы Библиографический указатель включает 216 источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение генетических конструкций. Для получения генетических конструкций использовали стандартные методы молекулярного клонирования (Маниатис и др, 1984)

Получение трансгенных растений табака. Для получения трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L в качестве исходного материала был взят сорт табака SRI Трансформация растений табака проведена путем кокультивирования листовых дисков с Agrobacterium tumefaciens (штаммы LBA4404 или GV2260) Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS с добавлением соответствующих растительных гормонов и селектирующего агента (канамицина, 200 мг/л) Для

проведения экспериментов трансформанты размножали с помощью микроклонирования

Анализ геномной ДНК растений методом Саузерн-блот-гибридизации. Геномную ДНК выделяли из листьев контрольных и трансгенных растений с использованием набора Genomic DNA purification kit (Fermentas) 10 мкг выделенной геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HmdIII, разгоняли в 0 8% агарозном геле и переносили на заряженную нейлоновую мембрану капиллярным способом В качестве зонда использовалась часть Т-ДНК использованной для трансформации конструкции.

Измерение содержания пролина в листьях растений. Содержание свободного пролина определяли по методу Бейтса (Bates et al, 1973) Измерения проводили в листьях растений в возрасте 5-8 недель, культивируемых при температуре 23-25°С и 16-часовом световом дне, либо у проростков в возрасте трех недель, выращенных на агаризованной среде MS в чашках Петри

Измерение активности фермента пролиндегидрогеназы в листьях трансгенных растений. Активность пролиндегидрогеназы оценивали по скорости использования НАД+ на окисление пролина, измеряя увеличение концентрации образующегося НАДН в единицу времени с помощью метода Маттиони с соавторами (Mattioni et al, 1997) Активность выражали в наномолях НАД+, восстановленного в течение 1 мин в расчете на 1 мг растворимого белка

Измерение осмотического давления клеточного сока в листьях трансгенных растений. Для определения осмотического давления клеточного сока использовали клетки нижнего эпидермиса листа Образцы помещали в гипертонические растворы сахарозы разной концентрации (от О до 50 Атм О.Д) на 40-50 минут Затем проводился их анализ на степень плазмолиза в клетках По изотоническому коэффициенту (Полевой, 1989) определяли осмотическое давление клеточного сока Осмотический потенциал в клетках тех же образцов определяли в Институте физиологии растений РАН (Москва)

Изучение солеустойчивости трансгенных растений. Для оценки были взяты растения на разных стадиях развития (семена и проростки, выращенные в нормальных условиях до стадии двух пар настоящих листьев), которые помещались на среду MS с различным содержанием NaCl (в разных опытах - 150 мМ и 250 мМ)

Прямой отбор трансформантов на стрессовом фоне. Был проведен эксперимент по прямой селекции трансформантов, несущих конструкции pBilOl, pBEF и pBEFmin, на стрессовом фоне Отбор трансформантов проводили на среде MS с добавлением 0 1 мМ азетидин-2-карбоксилата

Определение активности неомицинфосфотрансферазы в трансгенных растениях. Определение активности фермента NPTII в экстрактах из листьев проводилось по (Reiss et al, 1984) с модификациями

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Создание генетических конструкций для получения трансгенных растений с суирессироваииой активностью гена ПДГ. Для получения растений с супрессированной активностью ПДГ был создан ряд генетических конструкций Последовательность гена ПДГ известна далеко не для всех видов растений, но известные последовательности в некоторых участках имеют достаточно большую консервативность, поэюму для конструирования был использован фрагмент одного из известных на момент начала работы генов (A thaliana) В дальнейшем также была сделана конструкция pBi2E, содержащая дуплицированный участок гена ПДГ арабидопсиса, расположенный в виде инвертированного повтора, в результате чего в растениях должна синтезироваться молекула РНК с протяженным двуцепочечным участком Из литературы известно, что использование двуцепочечного супрессора для подавления активности генов более эффективно (Wang and Waterhouse, 2000) (рис 1)

PDH-

Д HOSpro_HOSter_exl/2_HO St er

4П "Pill Я Н~ 3SS pro GUS Ц

ЕВ LB

PDH- PDH-

HOSpro HOSeer exl exl HOSter

[j HPT II ~У| H~3ss"

pro

EB LB

Рисунок 1. Т-ДНК области полученных конструкций А антисмысловой супрессор, рВЕ, Б двуцепочечный супрессор, pBi2E Обозначения 35S pro - промотор вируса мозаики цветной капусты, PDH-exl фрагмент первого экзона гена ПДГ арабидопсиса, NOSter - сигнал полиаденилирования, NOSpro - промотор гена нопалинсинтазы, GUS - ген бета-глюкуронидазы Е coli, NPTII - ген неомицинфосфотрансферазы II Е coli, RB и LB - повторы, ограничивающие Т-область

Доказательство присутствия трансгенных встроек в геномах полученных растений. Для подтверждения наличия инсерций трансгена рВЕ в геном табака и приблизительной оценки их количества был проведен Саузерн-блот анализ отобранных трансформантов Образцы геномной ДНК трансформантов и контрольных нетрансгенных растений в двух разных экспериментах обрабатывались рестриктазой Hindlll В конструкции рВЕ имеется только один сайт рестрикции этой рестриктазы Зонды для гибридизации были подобраны таким образом, что в первом случае одной встройке генетической конструкции должно соответствовать два сигнала, а во втором - один Данные этих двух экспериментов суммированы в таблице 1

Таблица 1. Данные Саузерн-блот гибридизаций о количестве копий

Трансгенное Количество копий

растение трансгена

№1 1

№2 1

№5 4

№6 1

№8 2-3

№10 3-4

Отдельно был проведен анализ числа функционально активных копий Т-ДНК по наследованию репортерного гена nptll в поколении Т) Согласно полученным данным, растения линий № 1, 2, 5, 6, 8 и 10 являются гемизиготами с разной степенью выраженности замолкания (сайленсинга) трансгенных встроек Расхождение данных Саузерн-блот гибридизации и сегрегационного анализа можно, по-видимому, объяснить тем, что часть копий трансгена может находиться в неактивном состоянии (Kumar and Fladung, 2000) При сегрегационном анализе будут определяться только функционально-активные копии трансгена, а при Саузерн-блот гибридизации - все копии Кроме того, работа антисмыслового супрессора может сопровождаться

посттранскрипционным сайленсингом близкорасположенного гена nptll, что не влияет на эффективность супрессии целевого гена ПДГ Таким образом, результаты Саузерн-блот гибридизации показали наличие инсерций Т-ДНК области конструкции рВЕ в исследованных растениях

Измерение содержания пролина в листьях трансгенных растений. Мы предполагали, что снижение активности ПДГ в результате экспрессии антисмыслового супрессора приведет в первую очередь к увеличению содержания свободного пролина Содержание пролина измерялось в зеленых листьях растений в возрасте 5-8 недель, выращенных на керамзите, либо у проростков в возрасте трех недель, выращенных на агаризованной среде MS в чашках Петри Позднее было проведено измерение содержания пролина в листьях некоторых трансформантов, несущих двуцепочечный супрессор, с целью сравнения двух разных типов конструкций Всего было проанализировано 7 независимых трансформантов, несущих антисмысловой супрессор ПДГ (рВЕ) (рис 2) и 7 независимых трансформантов, несущих двуцепочечный супрессор (pBi2E)

№ Ш № № Расгга*«

гЬ

№ .'ИЗ N6

Растай*

Рисунок 2. Содержание пролина в листьях нетрансгенных растений и трансгенных растений несущих конструкцию рВЕ А Трехнедельные растения выращенные на среде М8, Б 5-8 недельные растения, выращенные в теплице (на керамзите) Различия между опытным образцом и контролем достоверны с вероятностью * Р> 0 95, ** Р>0 99, *** Р> 0 999

Из диаграмм, представленных на рисунке (рис 2А и 2Б), видно, что сходное распределение по уровню содержания пролина в общем сохраняется у проростков и взрослых растений (кроме линии №10), хотя у проростков абсолютные показатели по содержанию пролина на порядок больше, чем у взрослых растений Обращает на себя внимание значительная вариабельность этого параметра, особенно у взрослых растений Более того, содержание пролина в образцах, взятых с одного растения, также может существенно различаться Эти данные согласуются с резучьтатами, полученными другими авторами (КвЬог е1 а1, 1995, Zhu й а1, 1998)

По-видимому, содержание пролина зависит от целого ряда факторов, не все из которых известны В целом, уровень пролина в наших экспериментах у трансгенных растений, как у взрослых, так и у проростков, выше чем у контрольных в 1 5-3 раза На основе полученных данных можно заключить, что растения, несущие гетерологичный антисмысловой супрессор, характеризуются в среднем достоверно большим содержанием пролина, однако это повышение относительно невелико (например, в стрессовых условиях содержание пролина может увеличиться на порядок)

Что касается измерений у трансформантов с двуцепочечным супрессором (рис 3), то полученные результаты оказались сходными с вышеприведенными с той лишь разницей, что уровень пролина у трансформантов превышал таковой у контрольных растений не в 1 5-3 раза, а в 1 5-6 раз Эти данные, по-видимому, подтверждают тот факт, что двуцепочечные конструкции более эффективны в качестве супрессоров, чем антисмысловые Таким образом, повышенный уровень пролина у

трансформантов может отражать активность и эффективность использованных конструкций для супрессии гена ПДГ.

Рисунок 3. Содержание пролина в листьях нетрансгенных растений и трансгенных растений, несущих конструкцию р1М2Е. Четырехнедельные растения, выращенные на среде МБ. Различия между опытным образцом и контролем достоверны с вероятностью: * Р> 0.95; ** Р> 0.99; *** Р> 0.999.

№1 №10 №11 №13 №14 №16 №17

Растения

Измерение активности фермента пролиндегидрогеназы в листьях трансгенных растений. Для того чтобы непосредственно оценить, в какой мере введенная конструкция подавляет экспрессию гена ПДГ, было проведено измерение активности этого фермента у некоторых трансформантов и у контрольных растений. В нормальных условиях уровень экспрессии гена ПДГ относительно невысок, а в стрессовых условиях экспрессия этого гена вообще подавляется, однако, когда стрессовые факторы перестают действовать (например, в условиях регидратации после засухи или после снятия солевого стресса), наблюдается значительное увеличение активности ПДГ (ИЬагйв е! а1., 2007). В связи с этим, для измерения растения выращивали на обычной питательной среде и на среде с добавлением соли, а потом переносили на ночь в жидкую питательную среду для включения механизмов восстановления после стресса. Полученные данные приведены в таблице 2.

Как можно видеть, трансгенные растения в нормальных условиях не демонстрируют пониженного уровня активности ПДГ по сравнению с контролем. Однако в условиях восстановления после стресса, у контрольных растений активность ПДГ повышается, в то время как у трансформантов активность ПДГ не только не повышается, но становится меньше. Таким образом, трансформанты характеризуются снижением активности ПДГ, проявляющемся при смене условий норма-стресс-норма.

Таблица 2. Измерение активности ПДГ в листьях трансгенных растений и контроля.__

Образец нмоль НАДН/мин*мгр белка

Растения в нормальных Растения после

условиях регидратации

Линия №4 4.85 ± 1.2 2.82 ± 0.8*

Линия №6 7.14± 1.01 4.21 ±1.15*

Линия №8 3.7 ±0.6 -

Контроль 5.5 ± 1.5 8.1 ±1.2

^Различия между опытным образцом и контролем достоверны (Р> 0.95)

Измерение осмотического давления клеточного сока и осмотического потенциала клеточного сока в листьях трансгенных растений. Характерной особенностью адаптации растений к засухе и засолению является увеличение осмотического давления клеточного сока (ОДКС) и, соответственно, снижение осмотического потенциала (ОПКС) за счет повышения в клетках концентрации осмотически активных соединений. Поэтому можно было ожидать, что повышенное содержание пролина в клетках трансформантов приведет к снижению у них осмотического потенциала, по сравнению с контрольными растениями. Данные, приведенные на рисунке 4, показывают, что у трансгенных растений действительно ОДКС повышалось (в 1.2-1.7 раза), а ОПКС понижался (в 1.2-1.5 раза) по сравнению с контролем. Особенно явные отличия обнаружились у линии №10.

Рисунок 4. ОДКС и ОПКС, в листьях контрольных растений и трансформантов. Различия между опытным образцом и контролем достоверны с вероятностью: * Р> 0.95; ** Р> 0.99' *** Р> 0.999.

-1,5-1

Характерно, что повышение ОДКС и понижение ОПКС у трансформантов слабо коррелирует с уровнем содержания пролина. Более того, наблюдаемое увеличение в содержании пролина явно недостаточно для того, чтобы объяснить этот эффект (эта проблема активно обсуждается: даже многократное увеличение в содержании пролина в

условиях стресса недостаточно для того, чтобы объяснить наблюдаемые изменения осмотического потенциала (Serraj and Sinclair, 2002), что позволяет некоторым автором вообще отрицать роль пролина в стрессоустойчивости (Lutts et al., 1996)). Возможно, что взаимосвязи между содержанием пролина, выполняющего целый ряд специфических функций, и осмотическим давлением клеточного сока неоднозначны и могут находиться под влиянием дополнительных факторов.

Изучение солеустойчивости трансгенных растений. Одним из основных показателей, по которому можно определить силу стрессового воздействия на растения, является интенсивность их роста в условиях засоления, определяемая по накоплению биомассы. Известно так же, что в условиях солевого стресса содержание пролина в клетках растений многократно увеличивается. В связи с этим , был проведен эксперимент, целью которого было установить, дает ли повышенное содержание пролина у трансгенных растений им преимущество в солеустойчивости по сравнению с контролем. Для этого семена трансгенных и контрольных растений высевали на среду MS, затем проростки выращивали до появления пары настоящих листьев и пересаживали на среду MS, содержащую хлорид натрия в концентрации 250 мМ. При культивировании растений на среде с таким содержанием соли было заметно замедление роста как у контрольных, так и у трансгенных растений. Однако, у трансгенных растений этот процесс оказался не так сильно выражен, кроме того у контрольной линии был отмечен хлороз

Рисунок 5. Рост растений на средах с

добавлением 250 мМ хлорида натрия. К -контрольные нетрансгенные растения, №10 -трансгенное растение №10.

Кроме того, для оценки устойчивости растений к повышенному содержанию соли были проведены эксперименты по проращиванию семян на солесодержащих средах: семена трансгенной линии №6 и сорта SRI (контроль) высевали на стандартную среду MS и на среду MS с добавлением соли (150 мМ NaCl). На этой среде в условиях климатокамеры (+24°С, 16 ч световой день) растения выращивали в течение 2 месяцев. Обнаружено, что контрольные растения сорта SRI в условиях солевого стресса были способны формировать только одну пару

листьев (рис. 5, приведены растения линии 10),

настоящих листьев. Рост растений был угнетен, средняя масса растения составляла 0,02 ± 0,001 г. В то же время, трансгенные растения линии № 6 формировали две пары настоящих листьев и лучше адаптировались к стрессу: средняя масса растений составляла 0,04 ± 0,01 г. В нормальных условиях, на среде MS, как контрольные, так и трансгенные растения имели 4 пары настоящих листьев, а длина корней превышала 10 см. В условиях солевого стресса длина корней у табака сорта SRI составляла 1-2 мм, а у линии № 6 - 3.5 ± 1,31 см. Таким образом, было показано, что трансгенные растения более устойчивы к повышенным концентрациям соли, чем растения контрольной линии.

Прямая селекция трансформантов на стрессовом фоне. Тот факт, что трансгенные растения характеризовались увеличенной стрессоустойчивостью, позволил нам выдвинуть предположение о возможности получения растений трансформантов на стрессовых фонах без использования генов-маркеров и антибиотиков. Такой отбор мог проводиться с использованием в качестве селектирующего агента NaCl или токсичных аналогов пролина. Азетидин-2-карбоксилат токсичен для растений с нормальным или пониженным содержанием пролина, растения с повышенным содержанием пролина менее подвержены его токсическому действию. К преимуществам такой методики можно отнести то, что исчезает необходимость введения в генетическую конструкцию гена устойчивости к антибиотику, а также появляется возможность сразу получать растения, характеризующиеся максимально возможным повышением стрессоустойчивости.

Для проведения экспериментов по прямому отбору трансформантов на стрессовых фонах были сделаны две новые конструкции. Была получена конструкция, содержащая полный первый экзон ПДГ - pBEF. Кроме того, была сделана минимальная генетическая конструкция, содержащую только антисмысловой фрагмент - pBEFmin (рис. 6).

РЕН-

NQSp го_HOSter__exl__HP St а г

А ^Ю "Я ц я» УПМ

SB LB

PDH-

exl NOSter ЕВ LB

Рисунок 6. Т-ДНК области полученных конструкций. А: антисмысловой супрессор, pBEF; Б: «минимальная» конструкция, pBEFmin. Обозначения: 35S pro -промотор 35S вируса мозаики цветной капусты; PDH-exl фрагмент первого экзона гена ПДГ арабидопсиса; NOSter - сигнал полиаденилирования; NOSpro - промотор нопалинсинтазы; GUS - ген бета-глюкуронидазы; NPTII - ген неомицинфосфотрансферазы И; RB и LB - повторы, ограничивающие Т-область.

С этими конструкциями и контрольной конструкцией (вектором pBilOl) был проведен эксперимент по селекции трансформантов на

питательной среде с добавлением 0.1 тМ азетидин-2-карбоксилата. Результаты селекции листовых дисков табака, трансформированных конструкцией рВЕИ, минимальной рВЕРтт и контрольной рВИ01 показали, что трансформация с отбором на канамицине дает ожидаемые результаты: конструкции, несущие ген прШ, обеспечивают выживание листовых дисков и появление проростков; листовые диски, трансформированные минимальной конструкцией, погибли. При отборе на азетидин-2-карбоксилате, выживали только растения, несущие конструкциею рВЕР (рис. 7).

Рисунок 7. Прямая селекция трансформантов на стрессовом фоне. Листовые диски, помещались на среду с 0.1 мМ азетидин-2-карбоксилатом. А: трансформация контрольной конструкцией рВПО!; Б: трансформация конструкцией рВЕР.

Многократные повторения этого эксперимента с использованием в качестве селектирующего агента 0,1 мМ азетидин-2-карбоксилата или 200 мМ ЫаС1 всегда показывали однозначный результат: выживали только растения, трансформированные генетическими конструкциями рВЕР (в других экспериментах использовали так же рВ12Е). ПЦР на геномной ДНК трансформантов также показал наличие фрагмента, соответствующего использованному в конструкции фрагменту гена ПДГ. Трансформанты -также были протестированы на активность неомицинфосфотрансферазы с помощью протеста (рис.8).

Р1 ¥2 РЗ Р4 К\У11У К

Рисунок 8. Анализ активности гена неомицинфосфотрансферазы II в листьях 1 трансформантов, полученных с помощью отбора на азетидин-2-карбоксилате. Трансформанты обозначены: Р1, Р2, РЗ, Р"\У1; Р\У1л'; К - нетрансгенное

растение линии 1.

У части растений было измерено содержание свободного пролина (на рис 9 представлены результаты измерений двух таких растений)

Рисунок 9. Содержание пролина в листьях нетрансгенных растений (SRI) и трансгенных растений, несущих конструкцию pBEF (FW1, F2) Различия между опытным образцом и контролем достоверны с вероятностью Р> 0 99

Эти эксперименты продемонстрировали возможность отбора и получения трансгенных растений на средах, не содержащих антибиотики, что позволяет исключить из конструкций соответствующие гены устойчивости Трансформация минимальной конструкцией в ее нынешнем варианте дала отрицательный результат - все проростки были верифицированы, но это можно объяснить тем, что использованный вариант минимальной конструкции не содержал даже промотор, а только фрагмент ПДГ. По-видимому, этого не достаточно и необходимо либо использовать промотор, либо увеличить размер антисмыслового фрагмента, либо использовать вариант с двуцепочечным супрессором

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках диссертационной работы было проведено исследование взаимосвязи между системой катаболизма пролина и стрессоустойчивостью растений С этой целью нами был создан набор генетических конструкций - супрессоров гена пролиндегидрогеназы, кодирующего основной фермент деградации пролина, получены трансгенные растения табака и проведен анализ их морфологических, биохимических и физиологических характеристик Полученные результаты позволяют сделать следующее заключение трансгенные растения характеризуются сниженной активностью пролиндегидрогеназы, что не влияет на их морфологию и параметры развития При этом растения характеризовались увеличенным содержанием пролина и повышенным давлением клеточного - сока в нормальных условиях Исследование характеристик трансформантов показало, что они значительно лучше выдерживают условия стресса (засоления) кроме того, дальнейшие исследования линий трансгенных растений табака, полученных из описанных в работе трансформантов с конструкцией рВЕ, показали, что они характеризуются повышенной устойчивостью к самым разным

абиотическим стрессам (осмотическому, солям тяжелых металлов, высокотемпературному) (Колодяжная, автореферат канд дисс , 2007) Эти данные также подтверждаются результатами, полученными при исследовании растений рапса, несущих конструкцию pBEF (Мохамед, автореферат канд дисс, 2006) В нашей лаборатории были получены трансгенные растения картофеля сорта «Никулинский», несущие конструкцию pBEF и характеризующиеся повышенным содержанием пролина, которые были переданы для оценки их характеристик в ВНИИКХ РАСХН согласно предварительным данным, трансформанты также характеризовались увеличенной устойчивостью к засухе и высокой температуре (Кирсанова, в печати) Таким образом, наблюдается явная взаимосвязь между снижением активности ПДГ и увеличением стрессоустойчивости у растений табака, картофеля и рапса, что согласуется с данными Nanjo с соавторами (1999) и противоречит данным Мат с соавторами (2002) Мы предполагаем, что увеличенная стрессоустойчивость в данном случае может быть связана со следующими механизмами

1 Супрессия ПДГ приводит к увеличению в содержании пролина в 2-3 раза Этот показатель не может объяснить наблюдаемое увеличение ОДКС повышение стрессоустойчивости и ОДКС в данном случае не может быть связано с эффектом пролина как совместимого осмолита Однако, известно, что пролин регулирует экспрессию некоторых генов, связанных со стрессоустойчивостью (Satoh et al, 2002) Возможно, эти гены и опосредуют изменение ОДКС (например, через синтез Сахаров или сахароспиртов или других аминокислот)

2 Относительно небольшое увеличение в содержании пролина, которое наблюдается в трансформантах с супрессированной ПДГ, может оказаться важным на первых этапах стрессового воздействия Известно, что выживание растения при неожиданном наступлении стресса (без акклиматизации) часто определяется скоростью включения защитных механизмов Если растение уже содержит некоторое дополнительное количество защитного агента широкого спектра действия (пролина), то это может придать дополнительную устойчивость клеточным системам, отвечающим за стрессовый ответ например, защитить базовые ферменты транскрипции и трансляции от ингибирования и обеспечить первичный синтез стрессовых белков Этот механизм хорошо согласуется с широким спектром устойчивости растений табака с супрессированной ПДГ (засоление, тяжелые металлы, осмотический стресс, высокая температура (Колодяжная, Титов и др, 2006, 2007))

Полученные данные также показали, что созданные в рамках диссертационной работы конструкции могут использоваться для получения стрессоустойчивых форм трансгенных растений С их помощью были получены растения рапса и картофеля, которые в настоящее время активно изучаются Нами был разработан новый подход, основанный на получении трансгенных растений с супрессированной активностью ПДГ на стрессовых фонах без использования антибиотиков или других репортерных генов Подана заявка на патент «Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина»

Таким образом, разработанный в рамках диссертационной работы подход можно применять для модификации растений с целью получения форм, способных расти в условиях абиотических стрессов, а также для исследования роли пролина в механизмах стрессоустойчивости

ВЫВОДЫ

1 На основе гена ПДГ арабидопсиса созданы три генетические конструкции - супрессоры гена пролиндегидрогеназы

2 Получены трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum SRI), несущие антисмысловой супрессор гена ПДГ Показано, что

• трансгенные растения характеризуются повышенным содержанием пролина по сравнению с контролем в 1 5-3 раза и снижением активности ПДГ в период восстановления после стресса;

• трансгенные растения характеризуются повышенным осмотическим давлением клеточного сока и увеличенной солеустойчивостью,

• трансгенные растения не отличаются от контрольных по морфологическим параметрам и срокам развития

3 На основе совокупности полученных данных выдвинуто предположение о взаимосвязи между катаболизмом пролина и стрессоустойчивостью, которая может быть связана либо с влиянием пролина на экспрессию других генов стрессового ответа растений, либо с позитивным влиянием увеличенного содержания пролина на стрессоустойчивость на ранних этапах развития стресса

4 Созданы генетические конструкции, не содержащие гена устойчивости к антибиотику и несущие минимальное количество чужеродной для растения векторной ДНК Показана возможность отбора и получения трансгенных растений, несущих антисмысловой супрессор ПДГ, на средах, не содержащих антибиотики, что позволяет использовать эту конструкцию в качестве маркера

Публикации

1 Титов С.Е., Кочетов А В , Коваль В С , Шумный В.К Трансгенез как способ повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам // Успехи совр биологии 2003 Т 123 С 487-494

2 Кочетов А В , Титов С.Е., Колодяжная Я С , Комарова М Л, Коваль В С., Макарова Н Н, Илинский Ю Ю , Трифонова Е А , Шумный В К Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы//Генетика 2004 Т 40 С 282-285

3 Колодяжная Я С , Титов С.Е., Кочетов А В , Комарова М Л , Романова А В , Коваль В С , Шумный В К Оценка солеустойчивости растений табака №соиапа ?аЬасит, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы//Генетика 2006 Т 42 С 278-281

4 Колодяжная Я С, Титов С.Е., Кочетов А В Перспективы получения генетически модифицированных растений, устойчивых к тяжелым металлам // Сб науч трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов» Киев «Логос» 2006 С 586-589

5 Колодяжная Я С , Титов С.Е., Кочетов А В , Трифонова Е А, Романова А В , Комарова М Л , Коваль В С , Шумный В К Трансформанты табака, экспрессирующие антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы, проявляют устойчивость к тяжелым металлам // Генетика 2007 Т 43 № 7 С 994-998.

Подписано к печати 18 03 2008 г

Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ л 1 Уч изд л 0,7

Тираж 100 экз Заказ 26

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр ак Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Титов, Сергей Евгеньевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Роль пролина в системе стрессоустойчивости растений.

1.1.1. Стресс у растений.

1.1.2. Сигнальные пути в клетках растений при стрессе.

1.1.3. Роль пролина при стрессе.

1.1.4. Регуляция уровня пролина в клетке.

1.2. Создание стрессоустойчивых форм растений с использованием методов генной инженерии.

1.2.1. Трансгенные растения, экспрессирующие регуляторы стрессорного ответа.

1.2.2. Трансгенные растения, нарабатывающие белки стрессорного ответа.

1.2.3. Трансгенные растения, нарабатывающие белки-регуляторы ионного баланса.

1.2.4. Трансгенные растения с повышенным содержанием пролина и других осморегуляторов.

1.2.5. Перспективы создания стрессоустойчивых форм растений.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Растительный материал.

2.1.2. Бактериальные штаммы.

2.1.3. Плазмиды.

2.1.4. Реактивы.

2.1.5. Ферменты.

2.1.6. Праймеры.

2.1.7. Среды и буферные растворы.

2.2. Методы.

2.2.1. Генноинженерные работы.

2.2.2. Получение трансгенных растений табака.

2.2.3. Молекелярно-генетический анализ трансформантов.

2.2.4. Определение свободного пролина в растительном материале

2.2.5. Определение содержания малонилдиалъдегида в листьях трансгенных растений.

2.2.6. Определение осмотического давления в клетках эпидермиса листьев.

2.2.7. Определение активности пролиндегидрогеназы.

2.2.8. Компьютерная обработка данных.

2.2.9. Статистические методы исследования.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Получение антисмыслового супрессора ПДГ - рВЕ.

3.2. Получение растений-трансформантов табака.

3.3. Доказательство присутствия трансгенных встроек в геномах полученных растений.

3.4. Измерение содержания пролина в листьях трансгенных растений.

3.5. Измерение активности фермента пролиндегидрогеназы в листьях трансгенных растений.

3.6. Измерение содержания малонилдиальдегида в листьях трансгенных растений.

3.7. Измерение осмотического давления клеточного сока и осмотического потенциала клеточного сока в листьях трансгенных растений.

3.8. Изучение солеустойчивости трансгенных растений.

3.9. Получение двуцепочечного супрессора ПДГ - рВ12Е.

3.10. Измерение содержания пролина в листьях трансгенных растений, несущих двуцепочечный супрессор.

3.11. Получение антисмыслового супрессора ПДГ, содержащего полный первый экзон - рВЕБ.

3.12. Получение минимальной конструкции на основе антисмыслового супрессора ПДГ с полным первым экзоном - рВЕРгшп.

3.13. Прямая селекция трансформантов на стрессовом фоне.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Система деградации пролина и ее роль в стрессоустойчивости: инфрмация на момент начала исследований.

4.2. Растения, несущие гетерологичный антисмысловой супрессор гена ПДГ, характеризуются пониженной активностью пролиндегидрогензы и увеличенной устойчивостью к засолению.

4.3. «Минимальная» генетическая конструкция как инструмент отбора растений на стрессовых фонах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы"

В процессе эволюции растения выработали механизмы адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды. Вместе с тем многие культурные виды в результате однонаправленного отбора на проявление отдельных признаков утратили устойчивость к стрессовым воздействиям, что существенным образом снижает их продуктивность. Сравнение рекордных и стандартных урожаев нескольких видов возделываемых растений показало, что урожаи культурных растений обычно составляют не более 20% от их максимально возможного уровня (Воуег, 1982). Хотя такое уменьшение продуктивности отчасти связано с воздействием биотических факторов (болезней, фитофагов и сорняков), считают, что и абиотические стрессы могут играть существенную роль.

При изучении механизмов индукции и поддержания стрессоустойчивости к абиотическим факторам у растений особый интерес вызывает роль пролина в этих процессах. Это связано с тем, что содержание свободного пролина в растительных клетках многократно возрастает в о твет на различные стрессорные факторы: 1) засуху, 2) засоление, 3) повышение или понижение температуры, 4) токсическое действие тяжелых металлов, 5) недостаток питательных веществ (Кузнецов и Шевякова, 1999). Возможно, поэтому, несмотря на значительное количество работ, посвященных защитному действию пролина, его роль по-прежнему остается во многом не ясной. Например, согласно некоторым предположениям, значительное накопление пролина в клетках растений во время стресса является не защитной реакцией, а индикатором повреждения клеток стрессовыми факторами (Lutts et al, 1996; Serraj and Sinclair, 2002).

В растениях накопление пролина во время стресса происходит как за счет увеличения скорости его синтеза, так и за счет ингибирования его деградации. Скорость-лимитирующим ферментом деградации пролина является пролиндегидрогеназа (ПДГ). На сегодняшний момент, однако, нет ясности в вопросе о том, какую роль играет катаболизм пролина в стрессоустойчивости и восстановлении растений после стресса. Было выдвинуто предположение о важной роли этого процесса, поскольку деградация пролина сопровождается синтезом АТФ и изменением окислительно-восстановительного потенциала (Hare and Cress, 1997). Для изучения роли ПДГ в стрессоустойчивости растений были получены трансгенные растения арабидопсиса с пониженной активностью этого фермента. Однако, снижение активности ПДГ в одном случае приводило к увеличению содержания пролина и повышению стрессоустойчивости (Nanjo et al., 1999), а в другом такого эффекта не наблюдалось (Маш е1 а1., 2002), что не позволяло делать каких-либо заключений. Баланс сиитеза и деградации пролина является одним из важных элементов механизма устойчивости к осмотическому стрессу, поэтому проблема взаимосвязи между ПДГ и стрессоустойчивостью относилось к числу актуальных задач молекулярной генетики растений.

Трансгенные растения с супрессированной активностью ПДГ представляют собой адекватную генетическую модель для исследования этой проблемы. Мы предполагали, что снижение активности ПДГ может привести к повышению содержания пролина в клетках трансгснных растений в нормальных условиях и, возможно, к повышению их стрессоустойчивости. С другой стороны, снижсиие активности этого фермента могло негативно сказаться на устойчивости к стрессу, например в том случае, если деградация пролина в условиях стресса важна для поддержания адекватного баланса ЫАО/ЫАОН.

Таким образом, цель настоящей работы заключалась в исследовании роли гена ПДГ в устойчивости растений к абиотическим стрессам. В рамках данной работы было запланировано решить следующие задачи:

1. Создать генетические конструкции, экспрессия которых в геноме растений будет приводить к супрессии гена пролиндегидрогеназы, отвечающего за деградацию пролина.

2. Получить растения табака, несущие генетические конструкции - супрессоры пролиндегидрогеназы.

3. Исследовать биохимические и физиологические параметры растений-трансформантов, такие как активность пролиндегидрогеназы, содержание пролина, осмотическое давление клеточного сока, солеустойчивость. Научная новизна. В результате проведенного исследования создана новая генетическая модель — трансгенные растения табака, несущие гетсрологичный антисмысловой супрессор пролиндегидрогеназы. Получена новая информация о роли ПДГ в контроле стрессоустойчивости растений: показано, что частичная супрессия гена ПДГ сопровождается повышением устойчивости растений к засолению, что позволяет выдвинуть гипотезу о возможности контроля стрессоустойчивости за счет изменения активности этого фермента. Предложен новый подход для получения стрессоустойчивых форм растений, основанный на использовании генетических, конструкций - супрессоров ПДГ.

Практическая ценность. Показано, что супрессоры гена пролиндегидрогеназы могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с увеличенной стрессоустойчивостью. Создан набор генетических конструкций, которые могут быть использованы для получения стрессоустойчивых форм растений. Показана возможность создания достаточно эффективного супрессора на основе гетерологичного гена. Разработан подход, позволяющий исключать из состава генетических конструкций маркерные гены устойчивости к антибиотикам и проводить отбор трансформантов непосредственно на стрессовых фонах. Подана заявка на патент «Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролииа». Генетические конструкции, содержащие супрессоры гена пролиидегидрогеназы, переданы и используются в Институте физиологии растений РАН и ВНИИ картофельного хозяйства РАСХН. Положения, выносимые на защиту.

1. Создан антисмысловой супрессор гена ПДГ. Показано, что частичная супрессия гена ПДГ увеличивает стрессоустойчивость растений, что подтверждает гипотезу о роли этого гена в контроле стрессоустойчивости.

2. Созданы генетические конструкции, не содержащие генов устойчивости к антибиотикам и несущие минимальное количество чужеродной для растения векторной ДНК. Показана возможность отбора и получения трапегенных растений, несущих антисмысловой супрессор ПДГ, на средах, не содержащих антибиотики.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых, 2003; конференции МОГиС, 2003; Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», Саратов, 2003; Съезде ВОГиС, Москва, 2004; III международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Украина, Алушта, 2006; Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 108 страницах, включает 21 рисунок и фотографии, 2 таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 216 источников.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Титов, Сергей Евгеньевич

6. ВЫВОДЫ

1. На основе гена ПДГ арабндопснса созданы три генетические конструкции -супрессоры гена пролиндегидрогеназы.

2. Получены трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum SRI), несущие аптисмысловой супрессор гена ПДГ. Показано, что:

• трансгенные растения характеризуются повышенным содержанием пролина по сравнению с контролем в 1.5-3 раза и снижением активности ПДГ в период восстановления после стресса;

• трансгенные растения характеризуются повышенным осмотическим давлением клеточного сока и увеличенной солестойкостью.

• трансгенные растения не отличаются от контрольных по морфологическим параметрам и срокам развития.

3. На основе совокупности полученных данных выдвинуто предположение о взаимосвязи между катаболизмом пролина и стрессоустойчивостью, которая может быть связана либо с влиянием пролина на экспрессию других генов стрессового ответа растений, либо с позитивным влиянияем увеличенного содержания пролина на стрессоустойчивость на ранних этапах развития стресса.

4. Созданы генетические конструкции, не содержащие гена устойчивости к антибиотику и несущие минимальное количество чужеродной для растения векторной ДНК. Показана возможность отбора и получения трансгенных растений, несущих антсмысловой супрессор ПДГ, на средах, не содержащих антибиотики, что позволяет использовать эту конструкцию в качестве маркера.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках диссертационной работы было проведено исследование взаимосвязи между системой катаболизма пролина и стрессоустойчивостыо растений. С этой целью нами был создан набор генетических конструкций - супрессоров гена пролиндегидрогеназы, кодирующего основной фермент деградации пролина, получены трансгенные растения табака и проведен анализ их морфологических, биохимических и физиологических характеристик. Полученные результаты позволяют сделать следующее заключение: полученные трапсгенные характеризуются частичной супрессией гена ПДГ и сниженной активностью пролиндегидрогеназы, что не влияет на их морфологию и параметры развития. При этом растения характеризовались увеличенным содержанием пролина и повышенным давлением клеточного сока в нормальных условиях. Исследование характеристик трансформантов показало, что они значительно лучше выдерживают условия стресса (засолениея): кроме того, дальнейшие исследования линий трансгенных растений табака, полученных из описанных в работе трансформантов с конструкцией рВЕ, показали, что они характеризуются повышенной стрессустойчивостыо к самым разным абиотическим стрессам (осмотическому, солям тяжелых металлов, высокотемпературному) (Колодяжная, автореферат капд. дисс., 2007). Эти данные также подтверждаются результатами, полученными при исследовании растений рапса, несущих конструкцию рВЕР (Мохамед, автореферат капд. дисс., 2006). В нашей лаборатории были получены трансгенные растения картофеля сорта «Никулинский», несущие конструкцию рВЕР и характеризующиеся повышенным содержанием пролина, которые были переданы для оценки их характеристик в ВНИИКХ СО РАСХН: согласно предварительным данным, трансформанты также характеризовались увеличенной устойчивостью к засухе и высокой температуре (Кирсанова, личной сообщение). Таким образом, наблюдается явная взаимосвязь между снижением активности ПДГ и увеличением стрессоустойчивости у растений табака, картофеля и рапса, что согласуется с данными Капр с соавторами (1999Ь) и противоречит данным Маш с соавторами (2002). Мы предполагаем, что увеличенная стрессоустойчивость в данном случае может быть связана со следующими механизмами:

1. Супрессия ПДГ приводит к увеличению в содержании пролина в 2-3 раза. Этот показатель не может объяснить наблюдаемое увеличение ОДКС, повышение стрессоустойчивости и ОДКС в данном случае не может быть связано с эффектом пролина как совместимого осмолита. Однако, известно, что пролин регулирует экспрессию некоторых генов, связанных со стрессоустойчивостью (Ба1;о11 е1 а1., 2002). Возможно, эти гены и опосредуют изменение ОДКС (например, через синтез Сахаров или сахароспиртов или других аминокислот),

2. То относительно небольшое увеличение в содержании пролииа, которое наблюдается в трансформантах с супрессированной ПДГ, может оказаться важным на первых этапах стрессового воздействия. Известно, что выживание растения при неожиданном наступлении стресса (без акклиматизации) часто определяется скоростью реализации защитных механизмов. Если растение уже содержит некоторое дополнительное количество защитного агента широкого спектра действия, то это может придать дополнительную устойчивость клеточным системам, отвечающим за стрессовый ответ: например, защитить базовые ферменты транскрипции и трансляции от ингибирования и обеспечить синтез стрессовых белков. Этот механизм хорошо согласуется с широким спектром устойчивости растений табака с супрессированной ПДГ (засоление, тяжелые металлы, осмотический стресс, высокая температура (Колодяжная и др., 2006; 2007)).

Полученные данные также показали, что созданные в рамках диссертационной работы конструкции могут использоваться для получения стрессоустойчивых форм трансгенных растений. С этой целью были получены растения рапса и картофеля, которые в настоящее время активно изучаются как потенциальные родоначальники новых сортов. Нами был разработан новый подход, основанный на получении трансгенных растений с супрессированной активностью ПДГ на стрессовых фонах без использования антибиотиков или других репортерных генов. Подана заявка на патент

Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием про лин а».

Таким образом, нами был разработан подход, который можно применять для модификации растений с целыо получения форм, способных расти в условиях абиотических стрессов, а также исследовать роль пролина в обеспечении устойчивости к различным видам стресса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Титов, Сергей Евгеньевич, Новосибирск

1. Колодяжная Я.С. Исследование стрессоустойчивости генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // автореферат канд. дисс. 2006.

2. Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов A.B., Комарова M.JL, Романова A.B., Коваль B.C., Шумный В.К. Оценка солеустойчивости растений табака Nicotiana tabacum, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика 2006. Т. 42. С. 278-281.

3. Крестников И.С., Нецветаев В.П., Бирюков C.B. Генотипическая изменчивость корневой супероксиддисмутазы у ярового ячменя // Науч.-Техн. бюл. Всесоюз. селекцю-генет. ин-та. 1986. № 6. С. 35-40.

4. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 321-336.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М: Мир. 1984.

6. Мохаммед А.М.И. Физиолого-молекулярпые исследования трансгенных солеустойчивых растений Brassica napus II автореферат канд. дисс. 2007.

7. Полевой В.В. Физиология растений. М. "Высшая школа" 1989, 464 с.

8. Сохансандж С., Неумывакин JT.B., Мосейко Н.А., Пирузян Э.С. Перенос генов биосинтеза пролина бактерий в растения и их экспрессия под контролем различных промоторов // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. №7. С. 906-913.

9. Шевякова Н.И. Метаболизм и физиологическая роль пролина при водном и солевом стрессе. // Физиология растений. 1983. Т. 30. С. 768-783.

10. Abraham Е., Rigo G., Szekely G., Nagy R., Koncz C., Szabados L. Light-dependent induction of proline biosynthesis by abscisic acid and salt stress is inhibited by brassinosteroid in Arabidopsis // Plant Mol Biol. .2003. V. 51. P. 363-372.

11. Alexander D.C., McKnight T.D., Williams B.G. A simplified and efficient vcctor-primer cDNA cloning system // Gene. 1984. V. 31. P. 79-89.

12. Alia, Hayashi H., Chen Т.Н.11., MurataN. Transformation with a gene for choline oxidase enhances the cold tolerance of Arabidopsis during germination and early growth // Plant Cell Inviron. 1998a. V. 21. P. 232-239.

13. Alia, Hayashi H., Sakamoto A., Murata N. Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine // Plant J. 1998b. V. 16. P. 155-161.

14. Alia, Mohanty P., Matysik J. Effect of proline on the production of singlet oxygen // Amino Acids. 2001. V. 21. P. 195-200.

15. Alia, Pardha Saradhi P. and Mohanty P. Involvement of proline in protecting thylakoid membranes against free radical-induced photodamage // J. Photochem. Photobiol. 1997. V. 38. P. 253-257.

16. Allen R.D. Dissection of oxidative stress tolerance using transgenic plants // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 1049-1054.

17. Alvim F.C., Carolino S.M.B., Cascardo J.C.M., Nunes C.C., Martinez C.A., Otoni W.C., Fontes E.P.B. Enhanced accumulation of BiP in transgenic plants confers tolerance to water stress // Plant Physiol. 2001. V. 126. P. 1042-1054.

18. Armengaud P., Thiery L., Buhot N., March G.G. and Savoure A. Transcriptional regulation of proline biosynthesis in Medicago truncatula reveals developmental and environmental specific features // Physiol. Plant. 2004. V. 120. P. 442^150.

19. Ayliffe M.A., Mitchcll H.J., Deuschle K., Pryor A.J. Comparative analysis in cereals of a key proline catabolism gene // Mol Gen Genomics. 2005. V. 274. P. 494-505.

20. Bandurska H. Implication of ABA and proline on cell membrane injury of water deficit stressed barley seedlings // Acta Physiol. Plantarum. 1998. V. 20. P. 375-381.

21. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid determination of free Pro for water-stress studies // Plants and Soil. 1973. V. 39. P. 205-207.

22. Baulcombe D. RNA silencing in plants //Nature. 2004. V. 431. P. 356-363.

23. Bohnert H.J. and Shen B. Transformation and compatible solutes // Sci. Ilortic. 1999. V. 78. P. 237-260.

24. Borsani O., Zhu J., Verslues P.E., Sunkar R. and Zhu J-K. Endogenous siRNAs Derived from a Pair of Natural cis-Antisense Transcripts Regulate Salt Tolerance in Arabidopsis // Cell. 2005. V. 123. P. 1279-1291.

25. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding //Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

26. Capell T., Bassie L., Christou P. Modulation of the polyamine biosynthetic pathway in transgenic rice confers tolerance to drought stress // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101. P. 9909-9914.

27. Chadalavada S.V., Rajendrakumar, Reddy B.V.B., Reddy A.R. Proline-protein interactions: Protection of structural and functional integrity of M4 lactate dehydrogenase. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994. V. 201. P. 957-963.

28. Chaudhary M.T., Merrett M.J., Wainwright S.J. Ion accumulation in lucerne plants regenerated from salt-adapted suspension cultures compared with recultured cells from these plants // Plant Cell Report. 1997. V. 17. P. 145-149.

29. Chen L., Song Y., Xu Y., Nie L., Xu L. Comparison for activities of superoxide dismutasc and catalase between scab-resistant and susceptible wheat varieties // Acta Phytophysiol. Sinica. 1997. V. 27. 209-213.

30. Dangl J.L., Wang X., Zhu T. Expression profile matrix of Arabidopsis transcription factor genes suggests their putative functions in response to environmental stresses // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 559-574.

31. Cheong Y.H., Chang H-S., Gupta R., Eang X., Zhu T., Luan S. Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding, pathogen, abiotic stress, and hormonal responses in arabidopsis // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 661-677.

32. Cook D., Fowler S., Fiehn O. and Thomashow M.F. A prominent role for the CBF cold response pathway in configuring the low-temperature metabolome of Arabidopsis // PNAS. 2004. V. 101. P. 15243-15248.

33. Crowe J.H., Hoekstra F.A., Crowe L.M. Anhydrobiosis // Annu Rev Physiol. 1992. V. 54.P. 579-599.

34. Davis J.M., Fellman J.K., Loescher W.H. Biosynthesis of sucrose and mannitol as a function of leaf age in celery (Apium graveolens L.) // Plant Physiol. 1988. V. 86. P. 129133.

35. De Ronde J.A., Cress W.A., Kruger G.H.J., Strasser RJ. and Van Staden J. Photosynthetic response of transgenic soybean plants, containing an Arabidopsis P5CR gene, during heat and drought stress // J. Plant Physiol. 2004. V. 161. P. 1211-1224.

36. De Ronde J.A., Spreeth M.H. and Cress W.A. Effect of antisense Al-pyrroline-5-carboxylate reductase transgenic soybean plants subjected to osmotic and drought stress // Plant Growth Regul. 2000. V. 32. P. 13-26.

37. Deblaere R., Reynaerts A., Hofte II., Hernalstcens J.-P., Leemans J., Van Montagu M. Vectors for cloning in plant cells // Meth. Enzymol. 1987. V. 153. P.277-292.

38. Delauney A.J. and Verma D.P.S. A soybean gene encoding Al-pyrrolinc-5-carboxylate reductase was isolated by functional complementation in Escherichia coli and is found to be osmoregulated // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 221. P. 299-305.

39. Deshnium P., Los D.A., Hayashi H., Mustardy L., Murata N. Transformation of Synechococcus with a gene for choline oxidase enhances tolerance to salt stress I I Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 897-907.

40. Deuschle K., Funck D., Forlani G., Stansky H., Biehl A., Leister D., van der Graff E., Kunze R., Fronimer W.B. The role of delta-l-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase in proline degradation // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 3413-3425.

41. Deuschle K., Funck D., Hellman H., Daeschner K., Binder S., Frommer W.B. A nuclear gene encoding mitochondrial A'-pyrroline-5-carboxylatc dehydrogenase and its potential role in protection from proline toxicity // Plant J. 200l.V. 27. P. 345-355.

42. Elthon T.E. and Stewart C.R. Proline oxidation in corn mitochondria. Involvement of NAD, relationships to ornithine metabolism, and sidedness on the inner membrane // Plant Physiol. 1982. V. 70. P. 567-572.

43. Elthon T.E. and Stewart C.R. Sub-mitochondrial location and electron transport characteristics of enzymes involved in proline oxidation // Plant Physiol. 1981. V. 67. P. 780-784.

44. Fernandez C., Gallego L., Lopez-Bote C.J. Effect of betainc on fat contcnt in growing lambs // Anim. Feed Sc. Technol. 1998. V. 73. P. 329-338.

45. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. V. 391. P. 806-811.

46. Flowers T.J., Troke P.F., Yeo A.R. The Mechanisms of Salt-Tolerance in Ilalophytes. // Annu. Rev. Plant Physiol. 1977. V. 28. P. 89-121.

47. Forlani G., Mangiagalli A., Pinter C. and Nielsen E. Expression of Al-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase and proline/arginine homeostasis in Solarium tuberosum II Physiol. Plant. 2000. V. 110. P. 22-27.

48. Forlani G., Scainelli D. and Nielsen E. Al-Pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase from cultured cells of potato. Purification and properties // Plant Physiol. 1997b. V. 113. P. 1413-1418.

49. Fukuda A., Nakamura A., Tagiri A., Tanaka H., Miyao A., Hirochika H., Tanaka Y.t

50. Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na(+)/H(+) antiporter from rice // Plant Cell Physiol. 2004. V. 45. P. 146-159.

51. Gadallah M.A.A. Effects of proline and glycinebetaine on Vicia faba responses to salt stress // Biol Plant. 1999. V. 42. P. 249-257.

52. Gade G. and Auerswald L. Beetles' choice proline for energy output: control by AKHs // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2002. V. 132. P. 117-129.

53. Garcia-Rios M.G., Fujita T., LaRosa C.P., Locy R.D., Clithero J.M., Bressan R.A. and Csonka L.N. Cloning of polycistronic cDNA from tomato encoding y-glutamyl phosphate reductase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 8249-8254.

54. Garg A.K., Kim J-K., Owens T.G., Ranwala A.P., Choi Y.D., Kochian L.V., and Wu RJ. Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses // PNAS. 2002. V. 99. P. 15898-15903.

55. Gaxiola R.A., Li J., Undurraga S., Dang L.M., Allen G.J., Alper S.L., Fink G.R. Drought-and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVP1 H+-pump // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98. P. 11444-11449.

56. Gilmour S.J., Sebolt A.M., Salazar M.P., Everard J.D., Thomashow M.F. Overexpression of the arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation // Plant Physiol. 2000. V. 124. P. 1854-1865.

57. Gong Z., Koiwa H., Cushman M.A., Ray A., Bufford D., Kore-eda S., Matsumoto TK., Zhu J., Cushman JC., Bressan R.A. Genes that arc uniquely stress regulated in salt overlay sensitive (sos) mutants // Plant Physiol. 2001. V. 126. P. 363-375.

58. Groflhans H. and Filipowicz W. The expanding world of small RNAs // Nature. 2008. V. 451. P. 414-416.

59. Hamilton E.W. Ill and Heckathorn S.A. Mitochondrial adaptation to NaCl. Complex I is protected by anti-oxidants and small heat shock proteins, whereas complex II is protected by proline and betaine // Plant Physiol. 2001. V. 126. P. 1266-1274.

60. Handa S., Handa A.K., Hascgawa P.M. Proline accumulation and the adaptation of cultured plant cells to water stress // Plant Physiol. 1986. V. 80. P. 938-945.

61. Hare P.D. and Cress W.A. Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants // Plant Growth Regulation. 1997. V. 21. P. 79-102.

62. Hare P.D. and Cress W.A., Tissue specific accumulation of transcript encoding Al-pyrroline-5-carboxylate reductase in Arabidopsis thaliana // Plant Growth Regul. 1996. V. 19. P. 249-256.

63. Hare P.D., Cress W.A., Van Staden J. Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress // Plant Cell Environm. 1998. V. 21. P. 535-553.

64. Hellmann H., Funck D., Rentsch D., Frommer W.B. Hypersensitivity of an Arabidopsis sugar signaling mutant toward exogenous proline application // Plant Physiol. 2000. V. 123. P.779-790.

65. Iloekema A., Ilirsch P., Hooykaas J. and Schilperoort R. A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid // Nature. 1983. V. 303. P. 179-180.

66. Hsieh T-H., Lee J., Charng Y., and Chan M-T. Tomato Plants Ectopically Expressing Arabidopsis CBF1 Show Enhanced Resistance to Water Deficit Stress // Plant Physiology. 2002. V. 130. P. 618-626.

67. IIu C-A.A., Delauney A.J. and Verma D.P.S. A Afunctional enzyme (Al-pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 9354-9358.

68. Hu C.-A.A., Lin W.W., Valle D. Cloning, characterization and expression of cDNAs encoding human Dl-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 9795-9800.

69. Hua X.J., Van de Cotte B., Montagu M.V. and Verbruggen N. Developmental regulation of pyrroline-5-carboxylate reductase gene expression in Arabidopsis // Plant Physiol. 1997. V. 114. P. 1215-1224.

70. Hua X.J., Van de Cotte B., Van Montagu M., Verbruggen N. The 5' untranslated region of the At-P5R gene is involved in both transcriptional and post-transcriptional regulation // Plant J. 2001. V. 26. P. 157-169.

71. Huang A.H.C. and Cavalieri A.J. Proline Oxidase and Water Stress-Induced Proline Accumulation in Spinach Leaves // Plant Physiol. 1979. V. 63. P. 531-535.

72. Huang J., Hirji R., Adam L., Rozwadowski K.L., Hammerlindl J.K., Keller W.A. Selvaraj G. Genetic engineering of glycinebetaine production toward enhancing stress tolerance in plants: metabolic limitations // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 747-756.

73. Hwang B.K., Kim K.D., Kim Y.B. Carbohydrate composition and acid invertase activity in rice leaves infected with Pyricularia oryzae II J: Phytopathol. 1989. V. 125. P. 124-132.

74. Iyer S. and Caplan A. Products of proline catabolism can induce osmotically regulated genes in rice // Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 203-211.

75. Jaglo-Ottosen K.R, Gilmour S.J, Zarka D.G, Schabenberger O., Thomashow M.F. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance // Science. 1998. V. 280. P. 104-106.

76. Jain M., Mathur G., Koul S., Sarin N.B. Ameliorative effects of proline on salt stress-induced lipid peroxidation in cell lines of groundnut (Arachis hypogaea L.) // Plant Cell Rep. 2001. V. 20. P. 463-468.

77. Jan F.J., Fagoaga C., Pang S.Z., Gonsalves D. A minimum length of N gene sequence in transgenic plants is required for RNA-mediated tospovirus resistance // J Gen Virol. 2000. V. 81(Pt 1). P. 235-242.

78. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3301-3307.

79. Karakas B., Ozias-Akins P., StushnolT C., Suefferheld M. and Rieger M. Salinity and drought tolerance of mannitol-accumulating transgenic tobacco // Plant, Cell and Environment. 1997. V. 20. 609-616.

80. Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor//Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 287-91.

81. Katiyar-Agarwal S., Agarwal M., Grover A. Heat-tolerant basmati rice engineered by over-expression ofhsplOl // Plant Mol Biol. 2003. V. 51. P. 677-686.

82. Kavi Kishor P.B., Hong Z., Miao G.-H., Hu C.-A. A., Verma D.P.S. Overexpression of a delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1387-1394.

83. Kawasaki S., Borchert C., Deyholos M., Wang H., Brazille S., Kawai K., Galbraith D., Bohnert H.J. Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice // Plant Cell. 2001. V. 13. P. 889-905.

84. Kohl D.H., Keennelly E.H., Zhu Y., Schubert K.R., Shearer G. Proline accumulation, nitrogenase (C2H2 reducing) activity and activities of enzymes related to proline metabolism in drought stressed soybean nodules // J. Exp. Bot. 1991. V. 42. P. 831-837.

85. Konstantinova T., Parvanova D., Atanassov A., Djilianov D. Freezing tolerant tobacco, transformed to accumulate osmoprotectants // Plant Sci. 2002. V. 163. P. 157164.

86. Kovtun Y., Chiu W.L., Tena G., Sheen J. Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 2940-2945.

87. Krall J.P., Edwards G.E., Andreo C.S. Protection of pyruvate, Pi dikinase from maize against cold lability by compatible solutes // Plant Physiol. 1989. V. 89. P. 280-285.

88. Kreps J.A., Wu Y., Chang H-S., Zhu T., Wang X., Harper J.F. Transcriptome changes for arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress // Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 2129-2141.

89. Kumar D. Salt tolerance in oilseed brassicas present status and future prospects // Plant Breed. Abst. 1995. V. 65. P. 1438-1447.

90. Kumar S. and Fladung M. Transgene repeats in aspen: molecular characterisation suggests simultaneous integration of independent T-DNAs into receptive hotspots in the host genome // Mol Gen Genet. 2000. V. 264. P. 20-28.

91. Kuznetsov VI.V., Shevyakova N.I. Stress Responses of Tobacco Cells to High Temperature and Salinity. Proline Accumulation and Phosphorylation of Polypeptides // Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 320-326.

92. LaRosa P.C., Rhodes D., Rhodes I.C., Bressan R.A. and Csonka L.N. Elevated accumulation of proline in NaCl-adapted tobacco cells is not due to altered Al-pyrroline-5-carboxylate reductase // Plant Physiol. 1991. V. 96. P. 245-250.

93. Lee A.S. Mammalian stress response: induction of the glucose-regulated protein family // Curr. Opin. Cell Biol. 1992. V. 4. P. 267-273.

94. Madan S., Nainawatee H.S., Iain R.K. and Chowdhury I.B. Proline and proline metabolising enzymes in in-vitro selected NaCl-tolerant Brassica jiincea L. under salt stress // Ann. Bot. 1995. V. 76 P. 51-57.

95. Mani S., Van de Cottc B., Van Montagu M., Verbruggen N. Altered level of proline-dehydrogenase causc hypersensitivity to proline and its analogs in arabidopsis // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 73-83.

96. Mansour M.M.F. Protection of plasma membrane of onion epidermal cells by glycinebetaine and proline against NaCl stress // Plant Physiol Biochem. 1998. V. 36. P. 767-772.

97. Mattioni C., Lacerenza N.G., Troccoli A., De Leonardis A.M., Di Fonzo N. Water and salt stress-induced alterations in proline metabolism of Trilicum durum seedlings // Physiol. Plant. 1997. V. 101. P. 787-792.

98. Matysik J., Alia, Bhalu B. and Mohanty P. Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by proline under stress in plants // Curr. Sci. 2002. V. 82. P. 525532.

99. Matzke M.A., Aufsatz W., Kanno T., Mette M.F., Matzke A.J. Homology-dependent gene silencing and host defense in plants // Adv Genet. 2002. V. 46. P. 235-275.

100. Matzke A.J.M., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes // Current Opinion in Plant Biology. 1998. V. 1. P. 142-148.

101. McBride K.E. and Summerfelt K.R. Improved binary vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation // Plant Mol Biol. 1990. V. 14. P.269-276.

102. Mestichelli L.J., Gupta R.N., Spenser I.D. The biosynthetic route from ornithine to proline // J Biol Chem. 1979. V. 254(3). P. 640-647.

103. Miller G., Stein H., Ilonig A., Kapulnik Y., Zilberstcin A. Responsive modes of Medicago sativa proline dehydrogenase genes during salt stress and recovery dictate free proline accumulation // Planta. 2005. V. 222. P. 70-79.

104. Murashige T. and Skoog G.A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 14. P. 473-497.

105. Nagaya S., Kato K., Ninomiya Y., Horie R., Sekine M., Yoshida K., Shinmyo A. Expression of randomly integrated single complete copy transgenes does not vary in Arabidopsis thaliana// Plant Cell Physiol. 2005. V. 46. P.438-444.

106. Nanjo T., Fujita M., Seki M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K. Toxicity of free proline revealed in an Arabidopsis T-DNA-tagged mutant deficient in proline dehydrogenase // Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. P. 541-548.

107. Nanjo T., Kobayashi M., Yoshiba Y., Kakubari Y., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Antisense suppression of proline degradation improves tolerance to freezing and salinity in Arabidopsis lhaliana IIFEBS Lett. 1999b. V. 461. P. 205-210.

108. Nelson C.J. and Smith D. Fructans: their nature and occurrence // Curr. Topic Plant Biochem. Physiol. 1986. V. 5. P. 1-16.

109. Nicolopoulos D. and Manetas Y. Compatible Solutes and in vitro Stability of Salsola soda Enzymes: Proline Incompatibility // Phytochemistry. 1991. V. 30. P. 411-413.

110. Novillo F., Alonso J.M., Ecker J.R., Salinas J. CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101. P. 3985-3990.

111. Nuccio M.L., Russell B.L., Nolte K.D., Rathinasabapathi B., Gage D.A., Hanson A.D. The endogenous choline supply limits glycine betaine synthesis in transgenic tobacco expressing choline monooxygenase // Plant J. 1998. V. 4. P. 487-496.

112. Osteras M., Boncompagni E., Lambert A., Dupont L., Poggi M.C., Lc Rudulier D. Isolation and molecular characterization of the Sinorhizobium meliloli bet locus encoding glycine betaine biosynthesis 11 J. Biosc. 1998. V. 23. P. 457-462.

113. Ozturk Z.N., Talame V., Deyhoyos M., Michalowski C.B., Galbraith D.W., Gozukirmizi N., Tuberosa R., Bohnert H.J. Monitoring large-scale changcs in transcript abundance in drought- and salt-stressed barley // Plant Mol. Biol. 2002. V. 48. P. 551-573.

114. Paleg L.G., Douglas T.J., van Daal A., Keech D.B. Proline, betaine and other organic solutes protect enzymes against heat inactivation // Aust. J. Plant Physiol. 1981. V 8. P. 107-114.

115. Pang S.-Z., Jan F.-J., Gonsalves D. Nontargct DNA sequences reduce the transgene length necessary for RNA-mediated tospovirus resistance in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P.8261-8266.

116. Peng Z., Lu Q. and Verma D.P.S. Reciprocal regulation of Al-pyrroline-5-carboxylate synthetase and proline dehydrogenase genes control levels during and after osmotic stress in plants // Mol. Gen. Genet. 1996. V. 253. P. 334-341.

117. Perl A., Perl Treves R., Galili S., Aviv D., Shalgi E., Malkin S., Galun E. Enhanced oxidative-stress defense in transgenic potato expressing tomato Cu, Zn superoxide dismutases // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 568-576.

118. Pharr D.M., Stoop J.M.H., Williamson J.D., Feusi M.E.S., Massel M.O., Conkling M.A. The dual role of mannitol as osmoprotectant and photoassimilate in celery // Ilort. Science. 1995. V.30. P. 1182-1188.

119. Pilon-Smits E.A.H., Ebskamp M.J.M., Paul M.J., Jeuken M.J.W. Wcisbeek P.J., Smeekens S.C.M. Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress//Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 125-130.

120. Qin X. and Zeevaart J.A.D. Overexpression of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene in Nicotiana plumbaginifolia increased abscisic acid and phaseic acid levels and enhances drought tolerance // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 544-551.

121. Queitsch C., Hong S.W., Vierling E., Lindquist S. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 479-492.

122. Rajendrakumar C.S.V., Reddy B.V.D., Reddy A.R. Proline-Protein Interactions: Protection of Structural and Functional Integrity of M4 Lactate Dehydrogenase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 201. P. 957-963.

123. Rayapati P.J. and Stewart C.R. Solubilization of a proline dehydrogenase from maize (Zea Mays L.) mitochondria // Plant Physiol. 1991. Y. 95. P. 787-791.

124. Rhodes D. and Hanson A.D. Quaternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. V. 44. P. 357-384.

125. Ribarits A., Abdullaev A., Tashpulatov A., Richter A.,-Heberle-Bors E., Touraev A. Two tobacco proline dehydrogenases are differentially regulated and play a role in early plant development//Planta. 2007. V. 225. P. 1313-1324.

126. Rizhsky L., Liang H., Mittler R. The combined effect of drought stress and heat shock on gene expression in tobacco // Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 1143-1151.

127. Romero C., Belles J.L., Vaya J.L., Serrano R., Culianez-Macia F.A. Expression of the yeast trehalose-6-phosphate synthase gene in transgenic tobacco plants: pleiotropic phenotypes include drought tolerance //Planta. 1997. V. 201. P. 293-297.

128. Roosens N.H., Bitar F.A., Loenders K., Angenon G. and Jacobs M. Overexpression of ornthine-8-aminotransferase increases proline biosynthesis and confers osmotolerance in transgenic plants // Mol. Breed. 2002. V. 9. P. 73-80.

129. Roosens N.H., Thu T.T., Iskandar H.M. and Jacobs M. Isolation of ornithine-8-aminotransferase cDNA and effect of salt stress on its expression in Arabiodipsis thaliana II Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 263-271.

130. Roy M. and Wu R. Arginine decarboxylase transgene expression and analysis of environmental stress tolerance in transgenic rice // Plant Science. 2001. V. 160. 869-875.

131. Ruiz J.M., Rivero R.M., Romero L. Relationship between proline metabolism and NAD kinase in green bean plants subjected to short-term salt stress // Journal of Food, Agriculture and Environment. 2005. V. 3. P. 195-198.

132. Russo A.T., Rosgen J., Bolen D.W. Osmolyte effects on kinetics of FKBP12 C22A folding coupled with prolyl isomerization. // J. Mol. Biol. 2003. V. 330. P. 851-866.

133. Rustgi S., Joshi A., Moss H., Riesz P. ESR of spintrapped radicals in aqueous solutions of amino acids: Reactions of the hydroxyl radical // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 1977. V. 31. P. 415-440.

134. Sakamoto A., Alia, Murata N. Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold //Plant Mol. Biol. 1998. V. 38. P. 1011-1019.

135. Sakamoto A., Valverde R., Alia, Chen T.H.H., Murata N. Transformation of Arabidopsis with the codA gene for choline oxidase enhances freezing tolerance of plants // Plant J. 2000. V. 22. P. 449-453.

136. Salekdeh G.H., Siopongco J., Wade L.J., Ghareyazie B., Bennett J. Proteomic analysis of rice leaves during drought stress and recovery // Proteomics. 2002. V. 2. P. 1131-1145.

137. Samuel D., Kumar R.K.S., Jayaramoan G., Yang P.W., Yu C. Proline is a Protein Solubilizing Solute // Bioch. Mol. Biol. Intern. 1997. V. 41. P. 235-242.

138. Savoure A., Jaoua S., Hua X., Ardiles W., Montagu M.V., Verbruggen N. Isolation, characterization, and chromosomal location of a gene encoding the Al-pyrroline-5-carboxylate synthetase in Arabidopsis thaliana IIFEBS Lett. 1995. V. 372. P. 13-19.

139. Sawahel W.A. and Hassan A.H. Generation of transgenic wheat plants producing high levels of the osmoprotectant proline // Biotechnology Letters. 2002. V. 24. P. 721-725.

140. Schobert B. and Tshesche H. Unusual Solution Properties of Proline and Its Interaction with Proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 541. P. 270-277.

141. Schubert D., Lechtenberg B., Forsbach A., Gils M., Bahadur S., Schmidt R. Silencing in Arabidopsis T-DNA transformants: the predominant role of a gene-specific RNA sensing mechanism versus position effects // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 2561-2572.

142. Schwab K.B., Gaff D.F. Influence of Compatible Solutes on Soluble Enzymes from Desiccation-Tolerant Sporobolus stapfians and Desiccation-Sensitive Sporobolus pyramidalis II J. Plant Physiol. 1990. V. 137. P. 208-211.

143. Sen Gupta A., Heinen J.L. Holaday A.S., Burke J.J., Allen R.D. Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants that overexpress chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase//PNAS. 1993. V. 90. P. 1629-1633.

144. Serraj R. and Sinclair T.R. Osmolyte accumulation: can it really help increase crop yield under drought conditions? // Plant Cell Environ. 2002. V. 25. P.333-341.

145. Serrano R. and Gaxiola R. Microbial Models and Salt Stress Tolerance in Plants // Crit. Rev. Plant. Sci. 1994. V. 13. P. 121-138.

146. Shen B., Jensen R.G., Bohnert H.J. Mannitol protects against oxidation by hydroxyl radicals // Plant Physiol. 1997. V.115. P. 527-532.

147. Sheveleva E., Chmara W., Bohnert H.J., Jensen R.G. Increased salt and drought tolerance by D-ononitol production in transgenic Nicotiana tabacum L. // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 1211-1219.

148. Shou H., Bordallo P., Fan J-B., Yeakley J.M., Bibikova M., Sheen J., and Wang K. Expression of an active tobacco mitogen-activated protein kinase kinase kinase enhances freezing tolerance in transgenic maize // PNAS. 2004. V. 101. P. 3298-3303.

149. Simon-Sarkadi L., Kocsy G., Varhegyi A., Galiba G. and De Ronde J.A. Stress-induced changes in the free amino acid compositionin transgenic soybean plants having increased proline content // Biologia Plantarum. 2006. V. 50. P. 793-796.

150. Siripornadulsil S., Traina S., Verma D.P.S., Sayre R.T. Molecular mechanisms of proline-mediated tolerance to toxic heavy metals in transgenic microalgae // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 2837-2847.

151. Sirko A. and Brodzik R. Plant ureases: roles and regulation // Acta Biochim Pol. 2000. V. 47. P. 1189-1195.

152. Sivakumar P., Sharmila P., Saradhi P.P. Proline alleviates salt-stress induced enhancement in ribulose-l,5-bisphosphate oxygenase activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 279. P. 512-515.

153. Smirnoff N. and Cumbes, Q.J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes //Phytochemistry. 1989. V. 28. P. 1057-1060.

154. Stewart C., Bogges S., Aspinall D., Paleg L. Inhibition of Proline Oxidation by Water Stress // Plant Physiol. 1997. V. 59. P. 530-532.

155. Stines A.P., Naylor D.J., Hoj P.B. and Heeswijck R.V. Proline accumulation in developing grapevine fruit occurs independently of changes in the levels of Al-pyrroline-5-carboxylate synthetase mRNA or protein // Plant Physiol. 1999. V. 120. P. 923-931.

156. Szoke A., Miao G.-H., Hong Z.A. and Verma D.P.S. Subcellular location of Д1-pyrroline-5-carboxylate reductase in root nodule and leaf of soybean // Plant Physiol. 1992. V. 99. P. 1642-1649.

157. Tarczynski M.C., Jensen R.G., Bohnert H.J. Stress protection of transgenic plants by production of the osmolyte mannitol // Science. 1993. V. 259. P. 508-510.

158. Tepperman J.M. and Dunsmuir P. Transformed plants with elevated levels of chloroplastic SOD are not more resistant to superoxide toxicity // Plant Mol. Biol. 1990. V. 14. P. 501-511.

159. Thomas J.C., McElwain E.F., Bohnert H.J. Convergent Induction of Osmotic Stress-Responses: Abscisic Acid, Cytokinin, and the Effects of NaCl // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 416-423.

160. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools //Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4876-4882.

161. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn В., Schell J., Steinbiss HH. A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 5890.

162. Van Camp W,, Capiau K., Van Montagu M., Inze D., Slooten L. Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts//Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 1703-1714.

163. Vanrensburg L., Kruger G.H.J., Kruger R.H. Proline accumulation as drought tolerance selection criterion: Its relationship to membrane integrity and chloroplast ultra structure in Nicotiana tabacum L. // J. Plant Physiol. 1993. V. 141. P. 188-194.

164. Verbruggen N., Hua X.J., May M. and Van Montagu M. Environmental and developmental signals modulate proline homeostasis: Evidence for a negative transcriptional regulator // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8787-8791.

165. Verbruggen N., Villarrole R., Van Montagu M. Osmoregulation of a pyroline-5-carboxylate reductase gene in Arabdopsis thaliana II Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 771781.

166. Vernon D.M. and Bohnert H.J. A novel methyl transferase induced by osmotic stress in the facultative halophyte Mesembryanthemum crystallinum II EMBO J. 1992. V. 11. P. 2077-2085.

167. Walton E.F., Podivinsky E., Wu R.M., Reynolds P.H.S., Young L.W. Regulation of proline biosynthesis in kiwifruit buds with and without hydrogen cynamide treatment // Physiol. Plant. 1998. V. 102. P. 171-178.

168. Wang M.B. and Waterhouse P.M. High-efficiency silencing of a beta-glucuronidase gene in rice is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation // Plant Mol Biol. 2000. V. 43. P. 67-82.

169. Williamson C.L. and Slocum R.D. Molecular cloning and evidence for osmoregulation of the Al-pyrroline-5-carboxylate reductase (proC) gene in pea {Pisum sativum L.) // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 1464-1470.

170. Winicov I. and Bastola D.R. Transgenic overexpression of the transcription factor Alfinl enhances expression of the endogenous MsPRP2 gene in alfalfa and improves salinity tolerance in plants // Plant Physiol. 1999. V. 120. P. 473-480.

171. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J-K. Cell Signaling during Cold, Drought, and Salt Stress // The Plant Cell. Supplement 2002. P. 165-S183.

172. Xu D., Duan X., Wang B., Hong B., Ho T-H.D., Wu R. Expression of late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice // Plant Physiol. 1996. V. 110. P. 249-257.

173. Yamada M., Morishita H., Urano K., Shiozaki N., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Yoshiba Y. Effects of free proline accumulation in petunias under drought stress //J Exp Bot. 2005. V. 56. P. 1975-1981.

174. Yang C.W. and Kao C.H. Importance of ornithine-8-aminotransferase to proline accumulation caused by water stress in detached rice leaves // Plant Growth Regul. 1999. V. 27. P. 189-192.

175. Yeo A. Molecular Biology of Salt Tolerance in the Context of Whole-Plant Physiology // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 915-929.

176. Zhang C-S., Lu Q. and Verma D.P.S. Characterization of Al-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene promoter in transgenic Arabidopsis thaliana subjected to water stress // Plant Sci. 1997. V. 129. P. 81-89.

177. Zhang C-S., Lu Q., Verma D.P.S. Removal of feedback inhibition of Al-pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzyme catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 20491-20496.

178. Zhang H-X. and Blumwald E. Transgenic salt tolerant tomato plants accumulate salt in the foliage but not in the fruits // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 765-768.

179. Zhang H-X., Hodson J.N., Williams J.P., Blumwald E. Engineering salt-tolerant brassica plants: characterization of yield and seed oil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation // PNAS. 2001. V. 98. P. 12832-12836.

180. Zhang J.Z., Creelman R.A. and Zhu J-K. From Laboratory to Field. Using Information from Arabidopsis to Engineer Salt, Cold, and Drought Tolerance in Crops // Plant Physiology. 2004. V. 135. P. 615-621.

181. Zhao Y., Aspinall D., Paleg L.G. Protection of membrane integrity in Medicago sativa L. by glycinebetaine against the effect of freezing // J. Plant Physiol. 1992. V 140. P. 541543.

182. Zhifang G. and Loescher W.H. Expression of a celery mannose 6-phosphate reductase in Arabidopsis thaliana enhances salt tolerance and induces biosynthesis of both mannitol and a glucosyl-mannitol dimmer // Plant Cell Environ. 2003. V. 26. P. 275-283.

183. Zhu B., Su J., Chang M., Verma D.P.S., Fan Y.-L., Wu R. Overexpression of a delta-l-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water- and salt-stress in transgenic rice // Plant Sci. 1998. V. 139. P. 41-48.

Информация о работе

Титов, Сергей Евгеньевич
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Получение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы