Получение и исследование трансгенных солеустойчивых растений рапса Brassica napus L.

Мохамед Али Махмуд Ибрахим

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и исследование трансгенных солеустойчивых растений рапса Brassica napus L.
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование трансгенных солеустойчивых растений рапса Brassica napus L."

На правах рукописи.

Мохамед Али Махмуд Ибрахим

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА (Brassica napus L.J.

Специальность 03.00.12 - Физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии Аграрного факультета РУДН и в лаборатории молекулярных и физиологических механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Вл. В. Кузнецов

кандидат биологических наук Г.Н. Ралдугина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. А. Пухальский

кандидат биологических наук О. Г. Семенов

Ведущее учреждение:

Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А.Тимирязева

Зашита состоится "__ 2006 г. в _ ч. на заседании

диссертационного совета к 212.203.06 в Российском университете дружбы народов.

Адрес: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д 8, корпус 2 (аграрный факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6

Автореферат разослан "_"_2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета

В Г.Заец

¿лмбА 7-fff

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

На земном шаре около четверти почв сельскохозяйственного назначения в той или иной мере засолены [Строгонов, 1976] и по прогнозам ожидается, что к 2050 году значительному засолению может быть подвергнуто более 50% возделываемых территорий [Ashraf, 1994]. В условиях избыточного засоления ингибируется рост и развитие растений, нарушается водный статус и ионный гомеостаз, наблюдается торможение процессов фотосинтеза и дыхания, падает продуктивность сельскохозяйственных культур [Flowers, 2004].

Одним из путей использования засоленных территорий в интересах аграрного производства и биотехнологии является создание и выращивание солеустойчивых сортов растений, которые способны поддерживать низкий водный потенциал клеточного содержимого, тем самым сохраняя водопоглотительную деятельность клеток корня при высоком содержании солей в почвенном растворе [Ashraf, Harris, 2004].

Эта задача, как правило, решается за счет интенсивной аккумуляции в клетках растений неорганических ионов, которые локализуются в вакуоли. Однако накопление в вакуоли больших концентраций осмолитов может привести к нарушению осмотического равновесия между двумя основными компартментами клетки вакуолью и цитоплазмой. Восстановление нарушенного внутриклеточного равновесия осуществляется, как правило, за счет синтеза и аккумуляции в цитоплазме совместимых осмолитов, таких как свободные аминокислоты, бетаины и сахароспирты.

Универсальным органическим протекторным соединением в растительном мире является пролин (Про), который может действовать в качестве осмолита, антиоксиданта и энергетического субстрата, источника восстановительных эквивалентов, азота и углерода, а также регулятора экспрессии генов осмотического ответа [Кузнецов, Шевякова, 1999; Kavi Kishor et al., 2005]. Кроме того, пролин проявляет функцию "химического шаперона", защищая тем самым нативную конформацию макромолекул и мембран при стрессе [Hamilton, Heckathorn, 2001].

В настоящее время существует несколько подходов для повышения соле> стойчивости растений: 1) методы классической (традиционной) селекции; 2) использование методов клеточной биологии и в частности, методов клеточной селекции; 3) использование генно-инженерных подходов для введения чужеродных генов, обеспечивающих повышение солерезистентности растений.

Цель и задачи исследования. Целью работы было создание трансгенных растеннй рапса с повышенной солеустойчивостью и изучение их физиолого-

молекулярных свойств.

Для достижения этой цели перед нами стояли следующие задачи:

1. Провести сравнительные исследования уровня и физиологических механизмов солеустойчивости растений различных по происхождению сортов рапса.

2. Получить генетически модифицированные растения рапса двух сортов, обладающие способностью к супераккумуляции Про и вследствие этого повышенной солеустойчивостью, путем введение в растение фрагментом гена пролиндегидрогеназы (ПДГ) арабидопсиса в антисмысловой ориентации.

3. Исследовать регенерационную способность и способность к трансформации использованных сортов рапса и доказать трансгенность полученных растений-трансформантов физиологическими и молекулярными методами.

4. Оценить уровень солеустойчивости полученных трансгенных форм и выяснить причины их повышенной резистентности к ЫаС1.

Актуальность работы. Подобная работа крайне актуальна, поскольку в настоящее время в мире остро стоит проблема использования засоленных территорий для с/х производства, а большинство культурных растений, в том числе и растения рапса, являются гликофитами. Известно, что рапс является одним из важнейших масличных растений. Масло рапса содержит самое низкое количество вредных для здоровья насыщенных жирных кислот и широко используется в пищевых и технических целях. Поэтому создание солеустойчивых растений рапса будет способствовать значительному повышению урожайности этой важной сельскохозяйственной культуры и повышению эффективности использования засоленных территорий.

Научная новизна. Впервые проведено обширное исследование влияния соли на некоторые физиологические и биохимические процессы (аккумуляцию биомассы, водный статус, накопление ионов Ыа и К, аккумуляцию совместимых осмопротекторов, активность ПДГ) растений рапса.

Установлено, что одной из возможных причин большей солеустойчивости растений рапса является их способность сохранять водопоглотительную деятельность клеток корня в > словиях интенсивного засоления. Это достигалось за счет падения осмотического потенциала клеточного содержимого благодаря более активному поглощению Ка+

Впервые показано, что в более устойчивом сорте рапса Ольга поддерживается высокое соотношение К7Ка+ и накапливается большее количество свободного Про, тогда как у растений сорта Вестар соотношение К.7Ыа+ было значительно ниже так же. как и содержание свободного Про.

Впервые продемонстрировано, что у менее солеустойчивого рапса сорта Вестар наблюдалось повышение активности стресс-индуцибельного фермента ПДГ, тогда как у более устойчивого сорта Ольга изменения его активности были незначительными.

Впервые получены трансгенные растения масличной культуры - рапса, которые являлись супераккумуляторами Про. Эти растения были более солеустойчивыми и хорошо росли на повышенных концентрациях ЫаС1.

При изучении молекулярных основ большей устойчивости трансгенных растений рапса было впервые показано, что при засолении у трансгенных растений наблюдался пониженный уровень мРНК ПДГ и, таким образом, более низкая активность этого фермента. В соответствии с этим в трансгенных растениях наблюдался повышенный уровень свободного Про, что обеспечивало их большую солеустойчивость.

При изучении физиологических параметров трансгенных растений было показано, что они характеризовались низким значением осмотического потенциала, благодаря чему сохраняли водопоглотительную способность и способность к накоплению биомассы в условиях засоления.

Практическое значение работы. Получены трансгенные растения с/х масличной культуры рапса, характеризующиеся повышенной солеустойчивостью, за счет гипераккумуляции Про. Эти растения могут быть использованы в селекционном процессе для создания других солеустойчивых сортов рапса. Создание и изучение трансгенных растений - гипераккумуляторов Про имеет большое значение для понимания формирования адаптивных процессов у растений. Полученные данные и сделанные на их основе теоретические обобщения могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международной конференции «Филологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток-» (Звенигород, 2005), на 1(1Х) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано (или направлено в печать) 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов работы, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой

литературы Материалы диссертации изложены на_страницах

машинописного текста и содержат_таблиц и_рисунков. Список

цитируемой литературы включает_публикаций, из которых зарубежной

литературы_.

Объект и методы исследований

В работе использовали два сорта рапса (Brassica napus L.): Ольга и Вестар, шведской и канадской селекции, соответственно.

Для опытов по сравнению солеустойчивости (^трансформированных растений дезинфицированные семена высаживали в перлит со средой Хогланда-Снайдерс. Полученные растения выращивали в условиях фитотрона при температуре 25°С, относительной влажности воздуха 60% и 16 часовом световом периоде при освещенности 3.5 клк. Растения через день поливали тем же питательным раствором.

Для биохимических и молекулярно-биологических анализов растительный материал фиксировали жидким азотом (-196°С) и хранили при -70°С.

Измерение биомассы и содержания воды в растительном материале проводили, используя гравиметрический метод. Сухую массу определяли после фиксации при 90 С и высушивания (при 70°С) до постоянного веса, содержание воды (%) рассчитывали, исходя из разности свежей и сухой биомасс (Пустовой с соавт., 1995).

Измерение осмотического потенциала клеточного сока, полученного после замораживания-оттаивания растительного материала, его гомогенизации и последующего центрифугирования (центрифуга Kubota, Japan) в течение 10 мин (И тыс. об/мин), проводили с помощью криоскопического осмометра (Osmomat 030 Cryoscopic Osmometer, Gonotec, Germany).

Содержащие ионов Na и К определяли методом пламенного фотометрирования (Model III Karl Zeiss, Jena, Germany).

Содержание свободного пролина определяли в кислой среде с помощью нингидринового реактива по методу Bates et al. (1973) спектрофотометрически при 520 нм. Для построения калибровочной кривой использовали пролин фирмы «Sen-a». Содержание Про выражали в мкмоль на 1 г свежей массы.

Активность пролиндегидрогеназы оценивали с помощью метода [Mattiom et al., 1997], используя для этого реакционную среду, содержащую L-пролин (15 м.М), НАД* (10 мМ) и грубый препарат фермента в 200 мМ Na2C03-XaHC03 буфере (pH 10.3), полученный после гомогенизации растительных тканей и центрифугирования в течение 10 мин (11 тыс об/мин) За единицу активности фермента принимали восстанавление 1 мкмоль НАД за 1 мин. Растворимый белок определяли с помощью амидового черного [Buzun et а]., 1982]. В качестве стандарта был использован бычий сывороточный альбумин.

Конструкции и бактериальные штаммы: Для трансформации использовали две различные генно-инженерные конструкции R и F (рис.1), созданные на основе бинарного вектора рВ1101 и содержащие консервативный фрагмент гена ПДГ арабидопсиса в антисмысловой ориентации под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК). Конструкция R содержала только антисмысловой фрагмент гена ПДГ под контролем

промотора 35в ВМЦК, а стандартная конструкция (Б) содержала, кроме того, селективный ген пргП устойчивости к канамицину (Км) и фрагмент гена шЛА

Редуцированная конструкция Я, не содержащая селективного гена устойчивости к антибиотику, была нами использована в качестве биологически безопасной конструкции, поскольку существует требование Агенства по стандартизации ГМО и полученных из них продуктов при Организации Объединённых Наций (ООН) избегать введения в трансгенные растения генов устойчивости к антибиотикам. Это снижает потенциальные риски при практическом использовании ГМ растений.

Для трансформации использовали штаммы А^оЬас1егшт гите/ааепя АОЬО и РСУ3850. Выращивание агробактерий проводили при 28°С на среде ЬВ. Векторные конструкции были любезно предоставлены сотрудниками института цитологии и генетики РАН, г. Новосибирск.

* ......J^^i

За 1

МО а. га »)№•< _ Kf МО»««*

I i Iii Ii §

Рис. 1. Схема генетических конструкций, использованных для трансформации рапса

рВЕ2А - конструкция R, pBEF- конструкция F; LB, RB - повторы, ограничивающие Т-область вектора; pNOS - промотор гена нопалинсинтазы; nptU - ген неомицинфосфотрансферазыН; p35S — промотор 35S РНК ВМКЦ; PDH - фрагмент первого экзона гена ПДГ арабидопсиса в антисмысловой ориентации, GUS - ген бета-глюкуронидазы Е coli-, HindLIJ, Xhol, SalGl, BamHl, Smal - сайты рестрикции.

Трансформацию растений рапса проводили по разработанному ранее методу (Малышенко и др., 2003) при совместном культивировании семядольных эксплантов 5-дн. проростков с суспензионной культурой агробактерии, находящейся в логарифмической фазе роста. Для получения проростков in vitro семена стерилизовали стандартным методом, обрабатывая раствором, содержавшим гипохлорит натрия (0.5% активного хлора), и проращивали на половинной среде MC (Murashige, Skoog, 1962) с 5 г/л сахарозы при 16-час освещении. Для регенерации побегов использовали полную среду MC, содержавшую 4 мг/л БАП, 2 мг/л НУК и 10 г/л сахарозы. При проведении генетической трансформации после экспозиции эксплантов с агробактерией в среды добавляли антибиотики клафоран (Кл), ингибирующий развитие агробактерий, и, в качестве селективного фактора при трансформации

? f

конструкцией F, Км.

Анализ растений-трансформантов проводили несколькими методами:

1) по росту в селективных условиях на среде, содержавшей Км (только с конструкцией F).

2) по присутствию встроенного фрагмента гена ПДГ в полученных растениях-трансформантах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) по общепринятым методикам, применяя следующие праймеры: Р1- 5'-GAGATGTTGGTCTAGATTTGGCAGC-3' и Р2- 5*-GATACAGTCTCAGAAGACCA-3', комплементарные участку промотора 35S ВМЦК и фрагменту ПДГ.

3) по экспрессии встроенного гена ПДГ с помощью метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) [Sambrook et al., 1989) при использовании праймеров: PI - 5'-AACAA-ACTGG-ATCCG-GCGAT-СТТАС-3' и Р2 - 5,-GAGAT-GTTGG-TCTAG-ATTTG-GCAGC-3•.

Тотальную РНК "выделяли фенольным методом (Westhoff et al., 1981). Очистку от примесей ДНК, обратную транскрипцию и ПЦР проводили с использованием ферментов и реактивов фирмы «Fermentas» (Литва) по инструкциям данной фирмы. Для оценки результатов ПЦР проводили электрофорез нуклеиновых кислот в 1,3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.

Тотальную (геномную) ДНК: из растительного материала выделяли фенольным методом [Дрейпер, Скотт, 1991]

Выращивание растений in vitro. После получения доказательств трансгенности из полученных трансформантов рапса, содержавших фрагмент гена ПДГ в антисмысловой ориентации; были произвольно выбраны- 2 линии сорта Ольга - At-PDH-O-R-52 с конструкцией R (линия R) и At-PDH-O-F-43 с конструкцией F (линия F); 2 линии сорта Вестар - At-PDH-B-R-22 с конструкцией R (линия R) и At-PDH-B-F-32 с конструкцией F (линия F). Размноженные черенкованием и укорененные на питательной среде, содержащей неорганические компоненты по МС в концентрации '/i, растения, имеющие 2 пары листьев, переносили на среды 'Л МС, дополненные различными концентрациями NaCl (100, 150, 200 мМ), а затем помещали в светлую камеру при температуре 20°С, относительной влажности воздуха 60% и 16 часовом световом периоде при интенсивности освещения 2.5 kJIk и через 30 дней исследовали их свойства.

Опыты ставили в 3-х кратной биологической повторности при 2-3-х аналитических повторнЬстях для каждой из них. На рисунках размеры бар обозначают ошибку среднего статистического отклонения. Статистическую обработал полученных результатов осуществляли с использованием программы «Costat». > -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Действие засоления на растения рапса

Прежде чем начать генно-наженерное получение трансгенных растений мы провели сравнительное исследование солеустойчивости выбранных сортов рапса для их последующего использования в экспериментах по трансформации. К 20-дневным растениям, выращенным из семян в перлите и достигшим стадии 3-4 настоящих листьев, был добавлен раствор ЫаС1 до конечной концентрации от 50 до 400 мМ. Через 7 дней роста растений в условиях засоления исследовали физиологические механизмы их адаптации к хлоридному засолению.

1.1. Динамика роста растений при действии засоления

Солеустойчивость исследуемых сортов рапса оценивали по способности растений накапливать в условиях засоления биомассу. Как следует из данных, представленных на рис. 2, растения обоих генотипов реагировали на слабое засоление (50 и 100 мМ) некоторым увеличением накопления биомассы, что характерно для относительно солеустойчивых видов. Дальнейшее повышение концентрации №С1 в среде от 200 до 400 мМ сопровождалось заметным ингибированием роста. При этом степень ингибирования накопления свежей биомассы была выше у растений сорта Вестар по сравнению с растениями сорта Ольга. Так, если в первом случае величина ингибирования биомассы при концентрациях №01 300 и 400 мМ составляла 36 и 45%, то во втором случае -лишь 18 и 23%, соответственно. Это свидетельствовало о том, что растения сорта Ольга характеризовались более высокой солеустойчивостью, чем растения сорта Вестар и способностью поддерживать большую оводненность тканей.

Для проверки этого предположения исследовали способность растений двух генотипов аккумулировать в условиях засоления сухую биомассу (рис. 3) Полученные результаты показали, что растения изучаемых сортов обнаруживали общую тенденцию в способности стимулировать аккумуляцию биомассы в ответ на действие 50 и 100 мМ КаС1. При этом сухая биомасса растений сорта Ольга в присутствии 50 и 100 мМ ЫаС1 составляла 114 и 126% по сравнению с контролем, тогда как аналогичные значения сухой биомассы \ растений сорта Вестар были заметно ниже (102 и 110%).

Более высокое содержание соли в питательной среде приводило к ингибированию накопления сухой биомассы. Существенно отметить, что сухая масса растений сорта Ольга уменьшалась до 88 и 82% от контрольных величин при 300 и 400 мМ №С1, соответственно, у сорта Вестар аналогичные значения составляли 80 и 66%. Полученные результаты однозначно говорят о более

высокой солеустойчивости растений сорта Ольга по сравнению с растениями сорта Вестар.

Ольга

Котопрчшъа/М) ПО В 50

Вестар 1100 (D200 ПЗОО CU0

Рис. 2. Влияние различных концентраций ЫаС1 на накопление свежей надземной биомассы растениями двух сортов рапса.

1 s

1.6

Iм

: и

и ; 1

¿0,

50$

О 04

0 +

Отьга В«стар

КонцентратыNaCI(мМ)К0 050 Е100 11200 В300 П400

Рис. 3. Влияние различных концентраций NaCI на накопление сухой надземной биомассы растениями двух сортов рапса. Бары на рисунках обозначают ошибку среднего статистического отклонения.

Полученные в данной работе результаты свидетельствуют, прежде всего, о том, что растения рапса характеризовались относительно высокой солеустойчивостью, о чем говорит стимуляция накопления сухой биомассы при слабом засолении (50 и 100 мМ №С1) и лишь небольшое (12-20%) ингибирование роста в условиях сильного засоления ООО мМ ЫаС1), что характерно скорее для галофитоз, нежели для гликофитов, к которым традиционно относят данный вид Помимо этого было установлено, что из двух исследованных генотипов растения сорта Ольга более солеустойчивы по сравнению с растениями сорта Вестар.

1.2. Влияние различных концентраций КаС1 на осмотический потенциал тканей листа

Низкий осмотический потенциал обеспечивает интенсивную водопоглотительную способность клеток корня при низком водном потенциале питательной среды. Измерение осмотического потенциала в тканях листа (рис. 4) у растений двух сравнивае\гых генотипов свидетельствовало о том, что в условиях интенсивного засоления (400 мМ №С1) растения сорта Ольга обладали способностью к более сильному снижению осмотического потенциала (до -2.3 МПа) по сразнению с растениями сорта Вестар (-1.85

МПа), что позволяло им поддерживать интенсивную водопоглотительную способность клеток корня при низком водном потенциале питательной среды.

Коншжтраши ьиа (кМ) ВО 050 BI00 О 200 ПЗОО Q400

Веспр

Рис.4. Влияние различных концентраций ЫаС1 на величину осмотического потенциала (Ч^) клеточного содержимого листьев различных генотипов рапса (через 7 дней).___

15 •

13 -

а? II

3s 3

*■ * п ЙЙ I

• м 77 - Цй 3

* м 75 (ЖЗ 3

Is 73 Щ 1

71 - Ц

69 -^

0лм1 Веспр

Кояиентрашм НЮ! (мМ)во 050 е 100 П 200 Е 300 0400

Рис. 5. Содержание воды в надземной биомассе растений двух сортов рапса после выращивания при различных концентрациях ЫаС1 в течение 7 дней.

1.3. Водный статус растений при действии засоления

Одним из важных показателей, характеризующих водный статус растения, является уровень оводненности тканей листьев. Растения сорта Ольга имели большую водоудерживающую способность тканей в условиях интенсивного засоления по сравнению с растениями сорта Вестар, о чем свидетельствуют данные, представленные на рис. 5. Они показывают, что при увеличении концентрации NaCl в среде до 300 и 400 мМ содержание воды в листовых тканях у растений сорта Ольга снижалось лишь на 1.4-1.5% по сравнению с контролем, тогда как у растений сорта Вестар это падение составляло 5.8-5.9%.

1.4. Влияние различных концентраций NaCI на поглощение неорганических ионов

Полученные нами данные позволили высказать предположение, согласно которому более сильное падение осмотического потенциала в растениях сорта Ольга при засолении могло быть обусловлено их способностью к более интенсивному поглощению неорганических ионов и синтезу совместимых осмолитов. Измерение содержания ионов в листьях растений рапса показало,

что содержание Ыа+ возрастало в растениях обоих генотипов при увеличении степени засоления питательного раствора, однако для сорта Ольга эти значения были заметно выше, чем для сорта Вестар (рис. 6).

2 i И • Ольга =• Вспгв? г^^ JM т * 39* т т — 0»ы> / Ч, ° (ютяр

S 8 » i к 2 «• / г i • / t п \ " 1 - т

z и я я i. » 3 / I /\ I X i с • « 1« i ' { *

0 |М 2М ««• SM коаа*втр«а«я N*C1 (мМ) « |м iw JM «м 5т

Рис. 6. Аккумуляция ионов Рис. 7. Влияние различных конц.

натрия в листьях растений рапса при NaCl на содержание ионов калия в

их выращивании в присутствии листьях растений рапса после 7-

различных концентраций №С1. дневного засоления.

Причем растения сорта Ольга в отличие от растений сорта Вестар обладали способностью аккумулировать значительные количества ионов натрия (до 60 мкэкв на 1 г свежей массы) при низком уровне хлоридного засоления (50 и 100 мМ) В присутствии 50 и 100 мМ NaCl в питательной среде содержание ионов Na" в растениях сорта Ольга возрастало в 1.5 и 3 раза по сравнению с контрольными растениями, тогда как при дальнейшем увеличении степени засоления субстрата (до 400 мМ) внутриклеточное содержание ионов натрия оставалось практически на одном и том же уровне. В тканях растений сорта Вестар, напротив, содержание ионов Na" увеличивалось равномерно, достигая уровня 42-47 мкэкв на 1 г свежей массы при 300-400 мМ NaCl в среде.

Др>тим признаком солеустойчивости растений является способность стабильно поддерживать на достаточно высоком уровне соотношение внутриклеточного содержания K*VNa~ в условиях засоления.

Содержание ионов К+ (рис. 7) значительно возрастало у растений обоих сортов (в 1 6 раза у растений сорта Ольга и в 1.2 раза у растений сорта Вестар) в ответ на слабое хлоридное засоление (50 мМ NaCl) При дальнейшем увеличении концентрации NaCl в среде (до 400 мМ) содержание К+ постепенно снижалось, оставаясь, тем не менее, довольно высоким у растений сорта Ольга (212 3 мкэкв К '/г свежеД массы), и резко падая в тканях растений сорта Вестар (96.4 мкэкв К7г свежей массы)

Это означает, что в отличие от растений сорта Вестар, растения сорта Ольга обладали выраженной способностью поддерживать значительную

концентрацию К+ в условиях интенсивного засоления, сохраняя тем самым 5-8-кратное превышение К* над Ыа*, что, очевидно, и способствовало сохранению внутриклеточного ионного гомеостаза в растениях сорта Ольга при интенсивном засолении.

1.5. Аккумуляция свободного пролина в листьях растений при действии засоления

Сравниваемые генотипы рапса существенно различались по их способности аккумулировать свободный Про в ответ на засоление. Как видно из представленных на рис.8 данных, в растениях обоих сортов содержание свободного Про увеличивалось при повышении концентрации ЫаС1 в среде. Однако в растениях сорта Ольга уровень свободного Про при 400 мМ №С1 был значительно выше (50.9 мкмоль/ г свежей массы), чем в растениях сорта Вестар (21.1 мкмоль/г свежей массы). При этом первый генотип характеризовался способностью к относительно равномерному увеличению содержания Про в ответ на прогрессирующее засоление. В растениях сорта Вестар увеличение уровня свободного Про происходило в значительно меньшей степени, чем в растениях сорта Ольга, а его внутриклеточное содержание было, по меньшей мере, в два раза ниже практически при любой из использованных концентраций ШС1.

1.6. Влияние различных концентраций КаС1 на активность ПДГ

Можно предположить, что более низкий уровень Про в растениях сорта Вестар, по сравнению с сортом Ольга, при засолении объясняется более высокой скоростью его окисления. Как известно, скорость-лнмитирующим ферментом деградации Про является ПДГ, активность которой в контрольных растениях двух исследованных генотипов была невысока и практически не различалась (рис. 9). Изучение активности данного фермента при засолении показало, что она возрастала в 5-8 раз в ответ на слабое засоление (50 и 100 мМ 1МаС1) у растений обоих сортов При этом активность ПДГ при 100 мМ ЫаС1 была выше в листьях растений сорта Вестар (87 1 ед./мг белка), чем в листьях растений сорта Ольга (61.7 ед./мг белка) Дальнейшее возрастание концентрации КаС1 в I питательной среде сопровождалось некоторым снижением активности фермента

у обоих сортов рапса Тем не менее, уровень активности ПДГ у растений сорта Вестар всегда превосходил ее уровень у растений сорта Ольга, что могло быть одной из возможных причин более низкого содержания свободного Про в > растениях сорта Вестар при засолении.

Представленные данные показали, что растения сорта Ольга являются более солеустойчивыми по сравнению с растениями сорта Вестар. При этом одним нз важных механизмов солеустойчнвости является их способность к более интенсивной аккумуляции пролина. обладающего, как мы отмечали ранее, множественными стресс-протекторными свойствами. Это позволило

г ° i

i S 50

г' I

= ;40 J x £

S ü 30

* 'S !

II 204

U ' i 1 10-

Ольга Веспр

Концентра^« N»01 (мМ)В0 050 В100 П 200 В МО □ 400 Рис 8. Содержание свободного Про в листьях растений рапса при выращивании в течение 7 дн. в присутствии различных концентраций

Ольга

Вегар

КонцентрацияNaCI(мМ) fl0 050 Ш100 Ш 200 П 300 О 400

Рис. 9. Влияние различной интенсивности засоления на активность пролиндегидрогеназы в листьях растений двух сортов рапса (через 7 дн.). _

нам предположить, что создание трансгенных растений, обладающих способностью к супераккумуляции пролина, будет сопровождаться повышением их солеустойчивости.

2. Получение трансгенных растений рапса, экспрессирующих

фрагмент гена ПДГ арабидопснса в антисмысловой ориентации

Известно, что уровень Про у растений контролируется двумя основными ферментами: ключевым ферментом его синтеза - дельта пирролин-5-карбоксилатсинтазой и ключевым ферментом его распада -пролиндегидрогеназой. Существуют две принципиальные стратегии создания трасгенньтх растений - супераккумуляторов Про: 1) усиление синтеза Про путем встраивания в растения генов ферментов синтеза Про и 2) ингнбирование экспрессии гена ПДГ за счет трансформации растений фрагментом гена ПДГ в антисмысловой ориентации. Традиционно генные инженерь' используют первую стратегию, мы выбрали - вторую, как наиболее перспективную стратегию в данной системе, с нашей точки зрения.

2.1. Влияние различных штаммов агробактерий на эффективность трансформации

Как показывают данные табл. 1 частота регенерации после проведения трансформации достигала 5-27%, а эффективность трансформации 2-21% При сравнении эффективности трансформации растений разных сортов было

показано, что экспланты сорта Ольга были больше способны к трансформации, чем экспланты сорта Вестар. Кроме того, эффективность трансформации была значительно выше при использовании супервирулентного штамма АвЬО, чем РСУ3850, и векторной конструкции Р, несмотря на ее большие размеры.

Таблица 1. Частота регенерации и эффективность трансформации растений рапса сортов Ольга и Вестар двумя штаммами агробактерии. содержавшими различные векторные конструкции с антисмысловым супрессором ПДГ арабидопсиса

Сорт Конструкция Штамм агробакте- рий Общее число эксплантов Частота регенерации, % Эффекта вность трансформаци, %

R PGV3850 248 27 2

Ольга AGLO 238 17 12

F PGV3850 264 21 7

AGLO 239 13 21

R PGV3850 185 17 2

Вестар AGLO 176 16 9

F PGV3850 126 5 5

AGLO 197 8 10

Частота регенерации - отношение числа эксплантов с регенерацией к общему числу эксплантов.

Эффективность трансформации - отношение числа трансгенных побегов к общему числу побегов-регенерантов

2.2. Доказательства трансгенности растений-трансформантов

Создание трансгенных растений предполагает, прежде всего, доказательство их трансгенности, то есть включения в их геном чужеродного гена или его фрагмента, в данном случае фрагмента гена ПДГ в антисмысловой ориентации.

1) В пользу трансгенности полученных растений (только для конструкции Р) говорит способность регенерантов расти на среде в присутствии антибиотика Км.

2) Более прямым доказательством наличия в геноме полученных растений рапса нужного нам гена - фрагмента гена ПДГ в антисмысловой ориентации является его обнаружение с помощью метода ПЦР. Об этом свидетельствуют результаты ЭФ разделения продуктов ПЦР (рис.10), среди которых четко обнаруживался фрагмент ДНК, представляющий собой копию

части гена ПДГ и 358 промотора ВМЦК. Как видно из электрофореграммы, этот фрагмент отсутствовал в отрицательном контроле и обнаруживался в ДНК всех полученных нами растеннй-трансформантов.

Рис.10. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК растений с праймерами (комплементарными участку промотора 35Б и фрагменту ПДГ) после трансформации конструкциями И (А) и Р (Б).

1 дорожка - маркер (ДНК фага лямбда/ЕсоШ+НтсНИ), 2 дорожка -положительный контроль (плазмидная ДНК), 6 дорожка - отрицательный контроль (ДНК нетрансформированного растения), 3,4,5,7,8,9 дорожки - ДНК растений-трансформантов.

3) Крайне важным показателем трансгенности растения является доказательство экспрессии вставленного в его геном чужеродного гена. Для доказательства экспрессии гена ПДГ в антисмысловой ориентации на уровне синтеза соответствующей мРНК нами использовался метод ОТ-ПЦР.

Как сказано в разделе «Материалы и методы» растения выбранных линий, размноженные черенкованием, были высажены в питательную среду, содержавшую NaCl в различных концентрациях. После 30 дней роста in vitro из их листьев выделяли тотальную РНК и оценивали уровень мРНК ПДГ (рис 11). Результаты оценки показали, что содержание мРНК ПДГ в трансгенных растениях было ниже по сравнению с исходными контрольными формами. Это свидетельствует о подавлении экспрессии гена ПДГ в трансгенных растениях, д

что достигалось, по-видимому, за счет синтеза антисмысловой мРНК данного фермента и образования комплементарных дуплексов двух мРНК, кодирующих ПДГ в нормальной и антисмысловой ориентации.

О 100 150 200 0 100 150 200 О 100 150 200

ПДГ Актин

* нетрансгенное растение АьР0Н-0-Я-52 А1-Р0Н-0-К-43

Сорт Ольга

^ I ~ ^

ШЛ (ЁОЬщШЛчЩ тат **

ПДГ Ш шЗШШ

Актин

нетрансгенное растение А1-РОН-В-Я-22 А1-РОН-В-Р-32

- Сорт Вестар

Рис. 11. Экспрессия гена ПДГ в нетрансформированных и трансформированных растениях рапса сортов Ольга и Вестар при действии NaC! (100, 150, 200 мМ), определенная методом ОТ-ПЦР. Для реакции обратной транскрипции использовали по 5 мкг тотальной РНК. Электрофорез ДНК проводили в 1.3% агарозноч геле в присутствии бромистого этидия. Содержание мРНК актина использовано в качестве контроля

2.3. Влияние различных концентраций NaCI на активность ПДГ в листьях трансформированных растений рапса

Следствием ингибирования экспрессии гена ПДГ в трансгенных растениях, прбдемонстрированного нами выше, ябляется более низкая активность данного фермента в трансформированных формах растений по £ сравнению с контрольными в условиях засоления Так, как видно на рис 12, в

У контрольных растениях в условиях засоления активность ПДГ увеличивалась в

7 раз, тогда как в трансгенных растениях она возрастала значительно слабее.

Совокупность этих данных однозначно доказывает, что полученные нами растения являлись трансгенными и содержали чужеродный ген ПДГ в антисмысловой ориентации Это приводило к ингибированию экспрессии нормального гена ПДГ и снижению интенсивности деградации пролина

Ла-ГОНО* ¡2 *< РШ-О-Г.;

Лт^т,^,м> 60 В100 3150 1200

Каюра» ВО В100 В150 1 200

Рис.12. Влияние различных концентраций ЫаС1 на активность ПДГ в растениях разных линий сортов Ольга и Вестар.

2.4. Влияние различных концентраций N80 на содержание пролина в листьях трансформированных растений рапса

Определение накопления свободного Про в условиях засоления показало, что его содержание в траисгенных растениях было в 8-10 раз выше, чем в контрольных (рис.13). Причем, необходимо отметить, что растения сорта Ольга характеризовались большим содержанием Про по сравнению с растениями сорта Вестар, а растения линии Л обоих сортов рапса содержали пролина примерно на 20% больше, чем растения линии Р.

«1р>»сфор«»(ч4шрон-о-к-н * ГОН 0-М! рктенм

кмитрьм \л ВО 8100 =150 Ш200

иетрмфт-мроы..*: ЛгРСЖ-МГ А1-ЮН В П!

ргсям

(■.^■■л,:»«, ВО Н ¡00 В150 Ш200

Рис.13 Влияние различных концентраций ЫаС,1 на содержание Про в растениях двух сортов рапса.

На последнем этапе работы нам предстояло проверить, являются ли полученные нами трансгенные растения более солеустойчивыми.

2.5. Влияние различных концентраций N801 на осмотический потенциал листьев рапса

Аргументом в пользу более высокой солеустойчивости является способность трансгенных растений поддерживать осмотический потенциал клеток корня на более низком уровне по сравнению с исходными контрольными растениями. Так, у линий Я обоих сортов его значения составили приблизительно -2,3 МПа, а у линий Р -1,5 МПа (рис.14). Для сравнения можно отметить, что снижение осмотического потенциала у нетрансформированных растений обоих сортов достигало величины лишь -1,1 МПа. Эта их способность может повышать водопоглотительную функцию корня и тем самым устойчивость растений к условиям солевого стресса.

2.6. Влияние различных концентраций №С1 на содержание и К* в листьях растений рапса

Мы предположили, что более значительное снижение осмотического потенциала в трансгенных растениях было связано с усиленным поглощением ионов этими растениями. При проверке этого предположения, было показано, что при засолении (200 мМ №С1) содержание ионов

Рис.14. Влияние различных концентраций №С1 на осмотический потенциал (Ч'б) в листьях растений различных линий двух сортов рапса.

в трансгенных растениях обоих сортов увеличивалось сильнее, чем в нетрансформированных растениях (рис. 15). При этом растения линий Я поглощали в среднем на 15% больше, чем растения линии Р.

""^■"«ао В100 0150 « 200 К(«ИТ1«И1КЮОМ во В 100 §150 И200

Рис.15. Влияние различных концентраций №С1 на содержание Ка* в растениях различных линий двух сортов рапса.

Количество К* в трансгенных растениях под действием небольших концентраций соли также увеличивалось (рис. 16). Напротив, в нетрансформированных растениях наблюдалось снижение внутриклеточных концентраций калия. При увеличении концентрации ЫаС1 содержание калия в трансгенных растениях немного снижалось, однако, оно по-прежнему было значительно выше контрольного уровня. Это говорит о том, что трансгенные растения в условиях засоления поддерживали высокое соотношение К "/К а , в отличие от исходных форм.

иетрычфоричюмнны« V PDH-G-R 52 Ai-PD-i-O-F-43 нярми^тлиромкиж чг РС<-> В R " Л1PDH 3-'

рхтемм рккяия

Kiwotmpiehjcn«.«! go 3 100 =150 1 200 tarawuaNiii«« Э0 & 100 S150 ■ 20С

Рис. 16. Влияние различных концентраций NaC! на содержание К* в растениях двух сортов рапса.

2.7. Влияние различных концентраций N>0 на накопление биомассы растениями рапса

Прямым доказательством большей солеустойчивости трансгенных растений рапса является их способность к более активному накоплению биомассы в условиях интенсивного засоления. Из рис. 17. можно видеть, что при увеличении концентрации ЫаС1 до 200 мМ у нетрансформированных растений происходило заметное ингибирование роста, тогда как у трансгенных форм накопление биомассы снижалось незначительно. Накопление биомассы у трансгенных растений всех линий было в 4-12 раз выше, чем у нетрансформированных растений. Необходимо отметить, что накопление свежей биомассы у растений линии Я было несколько выше, чем у растений линии Р обоих сортов рапса.

Н А| РШ ОГ-4! иетуисфцимромммм А**ОН В-К 23 А1РОН В^ 12

растем*

каимслрмма N>0 (иМ) о О В 100 В 150 ■ 200 Ко.«.*«.« »МП (-Ы) ВО 6100 В 150 В200

Рис.17. Влияние различных концентраций ЫаС1 на накопление биомассы растениями разных линий сортов Ольга и Вестар.

Таким образом, совокупность представленных экспериментальных данных четко показывает, что созданные трансгенные растения обладали повышенной солеустойчивостью и хорошо росли на повышенных концентрациях №С1. При этом они накапливали больше Про при засолении по сравнению с исходными формами Эта их способность явилась следствием нарушения экспрессии гена ПДГ в результате трансформации растений геном ПДГ арабидопсиса в антисмысловой ориентации и блокированием процесса деградации Про.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЫаС1), о чем свидетельствует большая оводненность тканей растений данного сорта. Это достигалось за счет сильного падения осмотического потенциала клеточного содержимого (до -2.3 МПа) при низком водном потенциале питательного раствора благодаря более активному поглощению Ыа+ (57-61 мкэкв / г свежей массы) и К+ (210-270 мкэкв / г свежей массы), а также интенсивной аккумуляции Про (30-50 мкмоль / г свежей массы). Последнее обусловлено пониженной активностью пролиндегидрогеназы и замедленным процессом деградации данного осмолита. Существенно, что растения рапса солеустойчивого сорта, в отличие от менее устойчивого генотипа, характеризовались способностью поддерживать на довольно высоком уровне соотношение К+/Ыа+ при разной степени засоления, что позволяло сохранять ионный гомеостаз в экстремальных условиях.

Созданные трансгенные растения обладали повышенной устойчивостью и хорошо росли на повышенных концентрациях ШС1 за счет уменьшения активности ПДГ при экспрессии антисмыслового фрагмента этого гена. В нетрансгенных растениях, наряду с небольшим ростом концентрации Про, резко усиливалась экспрессия стресс-индуцируемого фермента ПДГ, что не позволяло растениям выживать при повышении концентрации соли. Можно предположить, что супрессия ПДГ привела к изменению баланса синтеза и деградации Про, повысив его содержание в тканях растения. Полученные нами результаты показывают, что растения рапса отличались по уровню экспрессии гена ПДГ в условиях стресса, поскольку и уровень транскрипции, и уровень ферментативной активности ПДГ увеличиватись в нетрансгенных растениях при выращивании их на солевых средах. Ранее неоднократно было показано, что индукция ПДГ происходила при снятии стрессового фактора, когда индуцированное стрессом повышенное содержание Про начинало снижаться. Возможно, наблюдаемый нами феномен связан с конкретными условиями эксперимента: растения продолжительное время выращивали в присутствии соли, возможно, при росте в таких условиях катаболизм Про используется для коррекции некоторых клеточных биохимических процессов, в частности, есть предположение о роли катаболизма Про в контроле оксилительно-восстановительного баланса в клетках растений.

ВЫВОДЫ

1. Исследование адаптации к засолению растений двух сортов рапса различного происхождения показало, что сорт Ольга характеризуется повышенной солеустойчивостью по сравнению с сортом Вестар Повышенная устойчивость к засолению растений этого сорта проявлялась в их способности к более активному накоплению сырой и сухой биомассы в условиях интенсивного засоления (200-400 мМ МаС!), в поддержании более высокой оводненности тканей и более низкого осмотического потенциала клеточного содержимого при солевом стрессе.

2. В основе большей солеустойчивости растений сорта Ольга лежит их способность к более интенсивному поглощению ионов натрия при засолении, сохранению ионного гомеостаза, что, в частности, проявляется в поддержании соотношения внутриклеточных ионов калия и натрия и аккумуляции пролина. Более высокий уровень Про в растениях сорта Ольга при засолении объясняется замедленным процессом его деградации, о чем свидетельствует меньшая активность пролиндегидрогеназы - ключевого фермента окисления пролина.

3. Трансформация изолированных семядолей двух сортов растений рапса различными векторными конструкпиями рВЕ2Д и рВЕР, содержавшими фрагмент гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации, позволила установить, что эффективность трансформации и частота регенерации зависели от генотипа растения, штамма агробактерии и используемой генно-инженерной конструкции. Установлено, что большая эффективность трансформации характерна для растений сорта Ольга при использовании супервирулентного штамма агробактерии АвЬО и конструкции рВЕИ. Конструкция рВЕР, в отличие от рВЕ2А, содержала в своем составе в качестве селективного маркера ген устойчивости к канамицину.

4. Использование метода ПЦР позволило показать, что полученные трансгенные растения обоих сортов рапса содержали последовательность фрагмента гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса в антисмысловой ориентации. Экспрессия этого фрагмента при засолении приводила к ингибированию синтеза пролина на уровне блокирования трансляции мРНК пролиндегидрогеназы растений рапса. Об этом свидетельствуют данные, полученные методом ОТ-ПЦР, снижением уровня мРНК пролиндегидрогеназы у трансгенных растений при воздействии ЫаС1, а также пониженной активностью кодируемого ими ферментного белка и к повышению уровня аккумулируемого пролина.

5. Полученные трансгенные растения, содержащие супрессор пролиндегидрогеназы и способные накапливать более высокий уровень пролина при засолении, характеризуются более высокой солеустойчивостью. В пользу их большей резистентности к засолению свидетельствует способность трансгенных растений при солевом стрессе (а) к более интенсивной аккумуляции биомассы, (б) к поддержанию более низкого осмотического потенциала клеточного содержимого и сохранению водопоглотительной функции клеток корня, а также (в) к сохранению ионного гомеостаза, в частности, высокого соотношения между ионами калия и натрия.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ:

1 Мохамед А.М, Ралдугина Г.Н., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Аккумуляция осмолитов растениями различных генотипов рапса при хлоридном засолении // Физиология растений. 2006. Т.52. № 5. (в печати).

2. Мохамед A.M., Титов С.Е., Ралдугина Г.Н. Получение трансгенных растений рапса, экспрессирующих фрагмент гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса в антисмысловой ориентации. Межвузовский сборник научных трудов «Проблемы сельского хозяйства», ЮТУ, Калининград, 2005 г. С.191-199.

3. Мохамед A.M., Титов С.Е., Ралдугина Г.Н. Получение трансгенных растений рапса с фрагментом гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса в антисмысловой ориентации / Материалы VI Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток". 12-17 декабря 2005 г., г. Звенигород. Москва. 2005. С.60-61.

4 Мохамед A.M., Титов С.Е., Ралдугина Г Н. Получение трансгенных растений рапса, экспрессирующих фрагмент гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса в антисмысловой ориентации / Тезисы докладов Международной конференции «Физиология и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». Годичное собрание ОФР. Вологда, 19-23 сентября 2005 г. С.206.

5. Мохамед A.M., Титов С.Е., Кочетов A.B., Ралдугина Г.Н., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Физиолого-молекулярные характеристики трансгенных растений рапса, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы / Материалы 1(1Х) Международной конференции молодых ботаников в г. Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург 2006 г. (в печати)

6. Мохамед A.M., Титов С.Е., Кочетов A.B., Ралдугина Г.Н., Холодова В П., Кузнецов Вл.В. Трансгенные растения рапса, несущие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы приобретают устойчивость к повышенным концентрациям NaCl // Доклады академии наук (рукопись подготовлена к печати)

Мохамед Али Махмуд Ибрахим (Египет) Получение и исследование трансгенных солеустойчивых растений рапса

(Brassica napus L.)

Проведено сравнительное изучение солеустойчивости дв>^с сортов рапса различных по происхождению. Исследованы физиологические и виохимические свойства (рост, водный статус, соотношение FC+/Na\ аккумуляция пролина, активность пролиндегидрогеназы) при воздействии различных концентраций NaCI.

Эти же свойства были изучены у трансгенных растений рапса со встроенной последовательностью фрагмента гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса в антисмысловой ориентации. Доказано, что трансгенные растения, содержащие супрессор пролиндегидрюгеназы, накапливали более высокий уровень пролина при засолении, что способствовало их более высокой солеустойчивости. Об этом свидетельствовала способность трансгенных растений при солевом стрессе к более интенсивному накоплению биомассы, к поддержанию более низкого осмотического потенциала клеточного содержимого и сохранению водопоглотительной функции клеток корня, а также к сохранению ионного гомеостаза, в частности, высокого соотношения между ионами калия и натрия по сравнению с нетрансформированными растениями

Mohamed Ali Mahmoud Ibrahim (Egypt)

Generation and investigation of transgenic salt-tolerant rapeseeds ( Brassica

napus L.)

Comparative studies for rwo rapeseed cuhivars differed by origin were performed to characterize their salt tolerance. Physiological ind biochemical parameters ( growth, water status, osmotic potential, K+/Na ratio, proline accumulation and proline dehydrogenase activity ) were investigated under different concentrations of NaCi . These parameters also were studied in Tansgenic plants which transformed with fragment gene coding praline dehydrogenase from Arabidopsis in antisense orientation. It was proved that transgenic plants contained suppressor for proline dehydrogenase. As a result, they accumulaied high levels of proline under salt stress which increased their salt tolerance. T-ansgenic plants showed high accumulation of biomass, low osmotic potential and stable maintained intracellular ion homeostasis m particular, a high K+ / Naf ratio, compared to non transgenic plants under salt stress

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н. профессору Владимиру Васильевичу Кузнецову, а также *.б.н. Галине Николаевне Ралдугиной за поддержку и внимание и бесценную помощь не только в научной работе, но и в различных жизненных ситуациях. Моя глубокая благодарность к.б.н. Холодовой Валентине Павловне и д.б.н. Кузнецову Виктору Васильевичу за помощь в работе и обсуждение результатов; а также всем сотрудникам и аспирантам лаборатории молекулярных и физиологических механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН за поддержку и дружеское отношение. Автор искренне благодарен сотрудникам института цитологии и генетики СО РАН к.б.н. Кочетову Алексею Владимировичу и м.н.с. Титову Сергею Евгеньевичу за предоставленные вектора и постоянный интерес к нашей работе. Я благодарю также свою маму и жену за любовь, доброту, понимание и терпение.

Подписано в печать-^ Формат 60x84/16. Тиражэкз. Усл. печ. л. -¡СГ" . ЗаказЗ&Ц

Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3

»-7B55

7fff

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мохамед Али Махмуд Ибрахим

• ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ботаническое описание растений рода Brassica.

1.2. Представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам.

1.3. Особенности адаптации галофитов и гликофитов.

1.3.1. Рост и развитие растений при засолении.

1.3.2. Водный статус растений при засолении.

1.3.3. Осмотический потенциал растительных тканей.

1.4. Аккумуляция осмотически активных веществ в растительных тканях при засолении.

1.4.1. Накопление неорганических ионов.

1.4.2. Накопление осмолитов.

1.4.3. Осморегуляторная роль пролина.

1.4.4. Биологическая роль пролина.

1.4.5. Биосинтез и катаболизм пролина.

1.4.6. Регуляция активности ферментов биосинтеза пролина в норме и при стрессе. ф 1.5. Увеличение солеустойчивости видов рода Brassica с помощью генной инженерии.

1.5.1. Трансгенные растения с повышенным содержанием пролина.

1.5.2 Повышение содержания пролина у трансформантов, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Действие засоления на растения рапса.

3.1.1. Динамика роста растений при действии засоления.

3.1.2. Влияние различных концентраций NaCl на осмотический потенциал тканей листа.

3.1.3. Водный статус растений при действии засоления.

3.1.4. Влияние различных концентраций NaCl на поглощение неорганических ионов.

3.1.5. Аккумуляция свободного пролина в листьях растений рапса при действии засоления.

3.1.6. Влияние различных концентраций NaCl на активность ПДГ.

3.2. Получение трансгенных растений рапса, экспрессирующих фрагмент гена ПДГ арабидопсиса в антисмысловой ориентации.

3.2.1. Влияние различных штаммов агробактерий на эффективность трансформации.

3.2.2. Доказательства трансгенности растений-трансформантов.

3.2.3. Влияние NaCl на активность ПДГ в листьях трансформированных растений рапса.

3.2.4. Влияние NaCl на содержание пролина в листьях трансформированных растений рапса.

3.3. Солеустойчивость полученных трансгенных растений.

3.3.1. Влияние NaCl на осмотический потенциал листьев рапса.

3.3.2. Влияние NaCl на содержание Na+ и К+ в листьях растений рапса.

3.3.3. Влияние NaCl на накопление биомассы растениями рапса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и исследование трансгенных солеустойчивых растений рапса Brassica napus L."

На земном шаре около четверти почв сельскохозяйственного назначения в той или иной мере засолены [Строганов, 1976] и по прогнозам ожидается, что к 2050 году значительному засолению может быть подвергнуто более 50% возделываемых территорий [Ashraf, 1994]. В условиях избыточного засоления ингибируется рост и развитие растений, нарушается водный статус и ионный гомеостаз, наблюдается торможение процессов фотосинтеза и дыхания, падает продуктивность сельскохозяйственных культур [Flowers, 2004].

Эта задача, как правило, решается за счет интенсивной аккумуляции в клетках растений неорганических ионов, которые локализуются в вакуоли. Однако накопление в вакуоли больших концентраций таких ионов может привести к нарушению осмотического равновесия между двумя основными компартментами клетки - вакуолью и цитоплазмой. Восстановление нарушенного внутриклеточного равновесия осуществляется, как правило, за счет синтеза и аккумуляции в цитоплазме совместимых осмолитов таких как свободные аминокислоты, бетаины и сахароспирты.

Универсальным органическим протекторным соединением в растительном мире является пролин (Про), который может действовать в качестве осмолита, антиоксиданта и энергетического субстрата, источника восстановительных эквивалентов, азота и углерода, а также регулятора экспрессии генов осмотического ответа [Кузнецов, Шевякова, 1999; Kavi Kishor et al., 2005]. Кроме того, пролин проявляет функцию "химического шаперона", защищая тем самым нативную конформацига макромолекул и мембран при стрессе [Hamilton, Heckathorn, 2001].

Рапс является одним из важнейших масличных растений. Масло рапса содержит самое низкое количество вредных для здоровья насыщенных жирных кислот и широко используется в пищевых и технических целях. Работа по получению растений рапса с повышенной солеустойчивостыо крайне актуальна, поскольку в настоящее время в мире остро стоит проблема использования засоленных территорий для с/х производства, а большинство культурных растений, в том числе и растения рапса, являются гликофитами. Создание солеустойчивых растений рапса будет способствовать значительному повышению урожайности этой важной сельскохозяйственной культуры и повышению эффективности использования засоленных территорий.

В настоящее время существует несколько подходов для повышения солеустойчивости растений: 1) методы классической (традиционной) селекции; 2) использование методов клеточной биологии и, в частности, методов клеточной селекции; 3) использование генно-инженерных подходов для введения чужеродных генов, то есть получение трансгенных растений, обладающих новыми свойствами.

Цель и задачи исследования. Целью работы было создание трансгенных растений рапса с повышенной солеустойчивостью и изучение их физиолого-молекулярных свойств.

Для достижения этой цели перед нами стояли следующие задачи!

2. Получить генетически модифицированные растения рапса двух сортов, обладающие способностью к супераккумуляции Про и вследствие этого повышенной солеустойчивостыо, путем введение в растения фрагмента гена пролиндегидрогеназы (ПДГ) арабидопсиса в антисмысловой ориентации.

4. Оценить уровень солеустойчивости полученных трансгенных форм и выяснить причины их повышенной резистентности к NaCl.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Мохамед Али Махмуд Ибрахим

ВЫВОДЫ

1. Исследование адаптации к засолению растений двух сортов рапса различного происхождения показало, что сорт Ольга характеризуется повышенной солеустойчивостью по сравнению с сортом Вестар. Повышенная устойчивость к засолению растений этого сорта проявлялась в их способности к более активному накоплению сырой и сухой биомассы в условиях интенсивного засоления (200—400 мМ NaCl), в поддержании более высокой оводненности тканей и более низкого осмотического потенциала клеточного содержимого при солевом стрессе.

3. Трансформация изолированных семядолей двух сортов растений рапса различными векторными конструкциями рВЕ2Д и pBEF, содержавшими фрагмент гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации, позволила установить, что эффективность трансформации и частота регенерации зависели от генотипа растения, штамма агробактерии и используемой генно-инженерной конструкции. Установлено, что большая эффективность трансформации характерна для растений сорта Ольга при использовании супервирулентного штамма агробактерии AGL0 и конструкции pBEF. Конструкция pBEF, в отличие от рВЕ2А, содержала в своем составе в качестве селективного маркера ген устойчивости к канамицину.

4. Использование метода ПЦР позволило показать, что полученные трансгенные растения обоих сортов рапса содержали последовательность фрагмента гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса в антисмысловой ориентации. Экспрессия этого фрагмента при засолении приводила к ингибированию синтеза пролина на уровне блокирования трансляции мРНК пролиндегидрогеназы растений рапса. Об этом свидетельствуют данные, полученные методом ОТ-ПЦР, снижением уровня мРНК пролиндегидрогеназы у трансгенных растений при воздействии NaCl, а также пониженной активностью кодируемого ими ферментного белка и к повышению уровня аккумулируемого пролина.

5. Полученные трансгенные растения, содержащие супрессор пролиндегидрогеназы и способные накапливать более высокий уровень пролина при засолении, характеризуются более высокой солеустойчивостъю. В пользу их большей резистентности к засолению свидетельствует способность трансгенных растений при солевом стрессе (а) к более интенсивной аккумуляции биомассы, б) к поддержанию более низкого осмотического потенциала клеточного содержимого и сохранению водопоглотительной функции клеток корня, а также в) к сохранению ионного гомеостаза, в частности, высокого соотношения между ионами калия и натрия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показали, что одной из возможных причин большей солеустойчивости растений сорта Ольга, по сравнению с растениями сорта Вестар, являлась их способность сохранять водопоглотительную деятельность клеток корня в условиях интенсивного засоления (300-400 мМ NaCl), о чем свидетельствует большая оводненность тканей растений данного сорта. Это достигалось за счет сильного падения осмотического потенциала клеточного содержимого (до -2.3 МПа) при низком водном потенциале питательного раствора благодаря более активному поглощению Na+ (57-61 мкэкв/г свежей массы) и К+ (210-270 мкэкв/г свежей массы), а также интенсивной аккумуляции Про (30-50 мкмоль/г свежей массы). Последнее обусловлено пониженной активностью пролиндегидрогеназы и замедленным процессом деградации данного осмолита. Существенно, что растения рапса солеустойчивого сорта, в отличие от менее устойчивого генотипа, характеризовались способностью поддерживать на довольно высоком уровне соотношение K+/Na+ при разной степени засоления, что позволяло сохранять ионный гомеостаз в экстремальных условиях.

Созданные трансгенные растения обладали повышенной устойчивостью и хорошо росли на повышенных концентрациях NaCl за счет уменьшения активности ПДГ при экспрессии антисмыслового фрагмента этого гена. В нетрансгенных растениях, наряду с небольшим ростом концентрации Про, резко усиливалась экспрессия стресс-индуцируемого фермента ПДГ, что не позволяло растениям выживать при повышении концентрации соли. Можно предположить, что супрессия ПДГ привела к изменению баланса синтеза и деградации Про, повысив его содержание в тканях растения. Полученные нами результаты показывают, что растения рапса отличались по уровню экспрессии гена ПДГ в условиях стресса, поскольку и уровень транскрипции, и уровень ферментативной активности ПДГ увеличивались в нетрансгенных растениях при выращивании их на солевых средах. Ранее неоднократно было показано, что индукция ПДГ происходила при снятии стрессового фактора, когда индуцированное стрессом повышенное содержание Про начинало снижаться. Возможно, наблюдаемый нами феномен связан с конкретными условиями эксперимента: растения продолжительное время выращивали в присутствии соли, возможно, при росте в таких условиях катаболизм Про используется для коррекции некоторых клеточных биохимических процессов, в частности, есть предположение о роли катаболизма Про в контроле оксилительно-восстановительного баланса в клетках растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мохамед Али Махмуд Ибрахим, Москва

1. Андреищева Е.Н., Соарес М.И.М., Звягильская Р.А. Энергетический обмен дрожжей Candida (Yarrowa) lipolitica в норме и при солевом стрессе//Физиология растений. 1997.Т. 44. С. 658-664.

2. Андрющенко В.К., Саянова В.В., Жуненко А.А. Модификация метода определения пролина для выявления засухоустойчивых форм рода Lycopersicon Tourn./Изд. АН Молд. ССР. Сер. биол. и хим. наук. 1981. №4. С.55-60.

3. Бабурина O.K., Леонова Т.Г. Динамика содержания Na+ и К+ в клетках ^ суспензионной культуры люцерны при высоких концентрациях

4. NaCl //Физиология растений. 1994. Т.41. №3. С.460-463.

5. Бабурина O.K., Шевякова Н.И. Влияние экзогенного глицинбетаина на рост и метаболизм люцерны в условиях засоления//Физиология растений. 1988. Т.35. №6. С.1177-1181.

6. Баранова Е.Н., Гулевич А.А. Проблемы и перспективы генно-инженерного подхода в решении вопросов устойчивости растений к засолению//Сельскохозяйственная биология. 2006. №1. С.39-56.

7. Генкель П.А. Солеустойчивость растений и пути ее направленного повышения. (Тимирязевские чтения XII, 4 июня 1950г). М.: Изд-во Акад. наук• СССР. 1954.

8. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитедж Ф. Генная инженерия растений М.: 1991. 408 с.

9. Ермакова И.П., Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф.//Физиология растений. Учебник. М.Изд. Центр Академия. 2005. 640 с.

10. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи. Д.: Колос. 1971. С.862.

11. Захарин А.А. Быстрая кинетика роста растений при солевом стрессе//Физиология растений. 1994. Т.41. №1. С. 101-106.

12. Захарин А. А. Особенности водно-солевого обмена растений при солевом стрессе//Агрохимия. Москва: Наука. 1990. №8. С.69-79.

13. Кабанов В.В., Ценов Е.И., Строганов Б.П. Влияние NaCl на содержание и синтез нуклеиновых кислот в листьях гороха//Физиология растений. 1973.1. Ф Т.20. Вып.З. С.466-472.

14. Калинкина Л.Г., Наумова Т.Г. Роль фотодыхания в накоплении пролина в клетках Chlorella stigmatophora при засолении//Физиология растений. 1993. Т.40. Вып. 4. С.577-585.

15. Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов А.В., Комарова М.Л., Романова А.В., Коваль B.C., Шумный В.К. Оценка солеустойчивости растений табака Nicotiana tabacum, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы//Генетика. 2006. №2. С.278-281.

16. П.Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция//Физиология растений. 1999. Т.46. №2. С.321-336.

17. Кузнецов Вл.В. Индуцибельные системы и их роль при адаптации растений к стрессорным факторам. Диссертация в форме научного доклада. Кишинев. 1992. 74 с.

18. Кузнецов Вл.В., Кнмпел Д., Гокджнян Д., Ки Д. Элементы неспецифичности реакции генома растений при холодовом и тепловом стрессе//Физиология растений. 1987. Т.34. №6. С.859-868.

19. Кузнецов Вл.В., Старостенко Н.В. Синтез белков теплового шока и их вклад в выживание интактных растений огурца при гипертермии//Физиология растений. 1994. Т.41. №3. С.374-380.

20. Кузнецов Вл.В., Хыдыров Б., Рощупкин Б.В., Борисова Н.Н. Общие системы устойчивости хлопчатника к засолению и высокой температуре: Факты и гипотезы//Физиология растений. 1990. Т.37. Вып.5. С.987-996.

21. Кузнецов Вл.В.Дмитриева Г.А. Физиология растений. Учебник. М.: Высш.шк. 2005. 763 с.

22. Лапина Л.П., Соколова Т.В. Изменение содержания элементов питания подсолнечника в условиях засоления NaCl и ^гБО^/Агрохимия. 1981. №1. С.79-84.

23. Лапина Л.П., Соколова Т.В., Строгонов Б.П. Локализация хлора у гликофитов и галофитов при засолении//Физиология растений. 1980. Т.27. вып.2. С.278-280.

24. Лапина Л.П., Строгонов Б.П. Локализация солей в клетках в связи с приспособлением растений к условиям засоления/ Успехи совр. биол. 1979. Т.88. вып.1. С.93-99.

25. Малышенко С.И., Тюлькина Л.Г., Зверева С.Д., Ралдугина Г.Н. Получение трансгенных растений Brassica campestris, экспрессирующих ген gfpZ/Физиология растений. 2003. №2. С.309-315.

26. Милащенко Н.З., Абрамов В.Ф. Технология выращивания и использования рапса и сурепицы. М.: Агропромиздат. 1989. 223 с.

27. Нобель П. Физиология растительной клетки. М.: Мир. 1973. 187с.

28. Полевой В.В. Физиология растений. Учебник. М.: Высшая школа. 1989. 464с.

29. Прусакова Л.Д., Аль-Карим Л., Мещеряков А.Б. Влияние хлорхолинхлорида на устойчивость яровой пшеницы к хлоридному засолению//Физиология растений. 1993. Т.40. №5. С.776-780.

30. ЗЬПустовой И.В., Филин В.И., Корольков А.В. Практикум по агрохимии. М.: Колос. 1995.336 с.

31. Селье Г. Концепция стресса. Как мы ее понимаем в 1976 году. Новое

32. О гормонах и механизмы их действия. Киев: Наукова думка. 1977. 27 с.

33. Семихатова О.А., Иванова Т.И., Юдина О.С. Дыхательная цена произрастания растений в условиях засоления//Физиология растений. 1993. Т.40. №4. С.558-566.

34. Строганов Б.П. Метаболизм растений в условиях засоления. М.: Наука. 1976. 646 с.

35. Строгонов Б.П. Метаболизм растений в условиях засоления. XXXIII Тимирязевские чтения. М. Наука. 1973. 52 с.

36. Строгонов Б.П. Физиологические основы солеустойчивости растений. М.: Изд-во АН СССР. 1962. 366с.

37. Сохансандж А., Неумывакин Л.В., Мосейко Н.А., Пирузян Э.С. Перенос бактериальных генов синтеза пролина в растения и их экспрессия под контролем различных растительных промоторов//Генетика. 1997. Т.ЗЗ. №7. С.906-913.

38. Третьякова Н.Н., Карнаухова Т.В., Паничкин Л.А. Практикум по физиологии растений. М.: Агропромиздат. 1990. 271 с.

39. Удовенко Г.В. Солеустойчивость культурных растений. Л.: Колос. 1977. 215с.

40. Удовенко Г.В., Семушина Л.А., Синельникова В.Н. Изменение водно-осмотических свойств растений при засолении. В кн. Водный режим растений в связи с разными экологическими условиями. Изд-во Казанского университета. 1978. 136-141 с.

41. Утеуш Ю.А. Рапс и сурепица в кормопроизводстве. Киев.: Наукова думка. 1979. 227 с.

42. Хочачка Г., Семеро Д. Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир. 1977. 124 с.

43. Цеиов Е.И., Строганов Б.П., Кабанов В.В. Влияние NaCl на содержание и синтез нуклеиновых кислот в тканях томата//Физиология растений. 1973. Т.20. вып.1. С.54-61.

44. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. Изд во С.Петерб.ун-та. 2002. 244 с.

45. Шевякова Н.И. Метаболизм и физиологическая роль пролина в растениях при водном и солевом стрессе//Физиология растений 1983. Т.30. №4. С.743-751.

46. Шевякова Н.И. Метаболическая роль ди- и полиаминов в растениях//Физиология растений 1981. Т.28. №6. С. 1052-1061.

47. Шевякова Н.И., Рошупкин Б.П., Парамонова Н.В., Кузнецов Вл.В. Стрессорный ответ клеток Nicotiana sylvestris на засоление и высокую температуру. 1. Аккумуляция пролина, полиаминов, бетаинов и сахаров//Физиология растений 1994. Т.41. №4. С.558-567.

48. Шемякин М.Ф. и Шерман М.Ю. Возможные пути решения проблемы солеустойчивости методами генной инженерии. /В сб.: "Состояние и перспективы развития с-х биотехнологии" (Матер, всес. конф. Москва, июнь 1986) Л.: 1986. С.43-47.

49. Шерман М.Ю. Участие белков теплового шока в осморегуляции Escherichia coli/Mon. биол. 1987. Т.21.№.1. С. 189-193.

50. Adams P., Thomas J.С., Veron D.M., Bohvert H.J., Jonsen R.G. Distinct cellular and organismic responses to salt stress//Plant Cell Physiol. 1992. V.33. №8. P.1215-1223.

51. Ahmad J., Hellebust J.A. The Relationship between inorganic nitrogen metabolism and proline accumulation in osmoregulatory response of two Euryhaline microalgae//Plant Physiol. 1988. V.88. P.348-354.

52. Ali G., Srivastava P.S. and Iqbal M. Proline accumulation, protein pattern and photosynthesis in Bacopa monniera regenerants grown under NaCl stress//Biol. Plant. 1999. V.42. P.89-95.

53. Alia P., Sardhi P., and Mohanty P. Proline in relation to free radical production in seedlings of Brassica juncea raised under sodium chloride stress//Plant Soil. 1993. V.155. P.497-500.

54. Andolfatto P., Bomhouser A., Bohnert H.C., Thomas J.C. Transformed hairy roots of Mesembryanthemum crystallinum: gene expression pattern's upon salt stress//Physiologia Plantarum. 1994. V.90. P.708-714.

55. Anoop N. and Gupta A.K. Transgenic indica rice cv IR-50 over expressing Vigna aconitifolia delta (l)-pyrroline-5-carboxylate synthetase cDNA shows tolerance to high salt//J. Plant Biochem. Biotechnol. 2003. V.12. P.109-116.

56. Ashraf M., McNeilly T. and Nazir M. Comparative salt tolerance of amphidiploid and diploid Brassica species//Plant Sci. 2001. V. 160. P.683-689.

57. Ashraf M., Harris P.J.C. Potential biochemical indicators of salinity tolerance in plants//Plant Science. 2004. V.166. P.3-16.

58. Ashraf M, McNeilly T. salinity tolerance in brassica oilseeds//Critical Reviews in Plant Sciences. 2004. V. 23. P. 157-174.

59. Ashraf M. Breeding for salinity tolerance in plants//Crit. Rev. plant Sci. 1994. V.13. P.17-42.

60. Ashraf M. Relationships between growth and gas exchange characteristics in some salt-tolerant amphidiploid Brassica species in relation to their diploid parents//Env. Exp. Bot. 2001. V.45. P.155-163.

61. Ashraf M., McNeilly T. Responses of four Brassica species to sodium chloride//Env. Exp. Bot. 1990. V. 30. P.475-187.

62. Ashraf M. and Naqvi M.I. Effect of varying Na/Ca ratios in saline sand culture on some physiological parameters of four Brassica species//Acta. Physiol. Plant. 1992. V.14. P. 197-205.

63. Ashraf M., Bokhari M.H., and Mahmoud S. Effects of four different salts on germination and seedling growth of four Brassica species//Biologia. 1989. V.35. P.173-187.

64. Bates L.S., Waldren R.P. and Teare I.D. Rapid Determination of Free Proline for Water-Stress Studies//Plant and Soil. 1973. V. 39. P. 205-207.

65. Binzel M.L., Hasegawa P.M., Rhodes D. Solute accumulation in tobacco cells adapted to NaCl//Plant Physiol. 1987. V.84. P. 1408-1415.

66. Bird C.R. and Ray J.A. Manipulation of plant gene expression by antisense RNA//Biotechnical Genetic Engineering Reviews. 1991. V.9. P.207-227.

67. Blum A. Stress tolerance in plants: What are we looking for? In Biochemical and cellular mechanisms of stress tolerance in plants, edited by J. H. Cherry. NATO ASI series, Berlin «Springer-Verlag». 1994. V. 86. P.315-324.

68. Bohnert H.J., Nelson D.E., Yensen R.G. Adaptations to environmental stress.// Plant Cell. 1995. V.7. P.1099-1111.

69. Borodina R.A. Accumulation of free proline in seedlings of swede rape under salt stress//Seleskokhozyaisnennaya-Biologiya. 1991. V.l. P.119-124.

70. Bourque J.E. Antisense strategies for genetic manipulation in plants//Plant Sci. 1995. V.105. V. 125-149.

71. Bowler C., Montagu M.V., Inze D. Superoxide dismutase and stress tolerance // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. V.43. P.83-116.

72. Buzun G.A., Dzhemukhadze K.M., Mileshko L.F. Determination of protein in plants with the aidofamidoblack//Sov.Plant Physiol. 1982. V.29. P.156-165.

73. Chandler S.F. and Thorpe T.A. Characterization of growth, water relation and proline accumulation in sodium sulfate tolerant callus of Brassica napus L. cv. Westar//Plant Physiol. 1987. V.84. P.106-112.

74. Chaudhaiy M.T., Merret M.J., Wainwright M.S. Growth, ion content and proline accumulation in nacl-selected and non-selected cell lines of lucerne cultured on sodium and potassium salts//Plant Sci. 1997. V.127. P.71-79.

75. Cheeseman J.M. Mechanisms of salinity tolerance in plants//Plant. Physiol. 1988. V.87. P.547-558.

76. Cheeseman J.M. and Wickens L.K. Control of Na+, K+ transport in Spergularia marina. II. Effect of plant size, tissue ion contents and roots- shoot ratio at moderate salinity//Physiol. Plant. 1986. V.67. P.7-14.

77. Clarkson D.T. and Hanson J.B. The mineral nutrition of higher plants//Ann. Rev.Plant Physiol. 1980. V.31. P.239-250.

78. Cram W. J. Negative feedback regulation of transport in cells. The maintenance of turgor, volume and nutrient supply. In: Encyclopaedia of Plant Physiology. New Series, Luttge, U. and Pitman, M. G.,Eds., Springer-Verlag. Berlin. 1976. V.2. P.284-316.

79. Datta K.S. and Sharma D.D. Effect of chloride and sulphate types of salinity on characteristics of chlorophyll content, photosynthesis and respiration of chick pea (Cicer arientum L.)//Physiol. Plant. 1990. V.32. P.391-395.

80. Day S. Switching off genes with antisense//New Sci October. 1989. P.50-55.

81. De Ronde J.A., Spreeth M.H. and Cress W.A. Effect of antisense-1 pyrroline-5-carboxylate reductase transgenic soybean plants subjected to osmotic and drought stress//Plant Growth Regul. 2000. V.32. P. 13-26.

82. De Ronde J.A., Cress W.A., Kruger G.H.J., Strasser R.J. and Van Staden J. Photosynthetic response of transgenic soybean plants, containing an Arabidopsis

83. P5VR gene, during heat and drought stress//J. Plant Physiol. 2004. V.161. P. 12111224.

84. Delauney A.J., Ни C.A.A., Kishor K.P.B., Verma D.P.S. Cloning of ornithine-aminotransferase cDNA of Vigna aconitifolia by trans complementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis//J. Biol. Chemistry. 1993. V.268. P.18673-18678.

85. Delauney A.J. and Verma D.P.S. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants//Plant J. 1993. V.4. P.215-223.

86. Djilianov D., Dragiiska R., Yordanova R., Doltchinkova V., Yordanov Y., Atassanov A. Physiological changes in osmotically stressed detached leaves of alfalfa genotypes selected in vitro//Plant Sci. 1997. V.129. P.147-156.

87. Ecker J. and Davis R. Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V.83 P.5372-5376.

88. Ellerstrom S. Interspecific hybrydisation in breeding work. Artkorsuingar i foradlingsorbeter//Sveriges Utsadesforenings Tibskrif. 1977. V.87. P.363-367.

89. Elthon Т.Е., Stewart C.R. Submitochondrial location and electron transport characteristics of enzymes envolved in proline oxidation//Plant.Physiol. 1982. V.67. P.780-784.

90. Flowers T.J. Improving crop salt tolerance//J. Exp. Bot. 2004. V. 55. P. 307-319.

91. Flowers T.J., Troke P.F. and Yeo A.R. The mechanism of salt tolerance in • halophytes//Annu. Rev. Plant Physiol. 1977. V.28. P.89-121.

92. Francois L.E., Mass E.V., Donovan T.J., Youngs V.L. Effect of salinity on grain and quality, vegetative growth and germination of semi dwarf and durum wheat//Argon J. 1986. V.78. P. 1053-1058.

93. Gadallah M.A.A. Effects of proline and glycine betaine on Vicia faha responses to salt stress//Biol. Plant. 1999. V.42. P.249-257.

94. Gniazdowska-Skoczek H. and Bandurska H. Proline Accumulation and ribonuclease activity in three barley genotypes during water stress//Acta. Physiol. Plant. 1994. V.l 6. P.309-315.

95. Gorham J. Salt tolerance in the Triticeae: Ion discrimination in Rye and Triticalelli. Exp. Bot. 1990. V.41. P.609-614.

96. Gorham J., Wyn Jones R.G. and Bristol A. Partial characteristics of the trait for enhanced K+/Na+ discrimination in the D genome of wheat//Planta. 1990. V.I80. P.590-597.

97. Green P.J., Pines O. and Inouye M. The role of antisense RNA in gene regulation//Ann. Rev. Biochem. 1986. V.55. P.569-597.

98. Greenway H. and Munns R. Mechanisms of salt tolerance in non halophytes/Annu. Rev. Plant. Physiol. 1980. V.31. P.417-423.

99. Hamdy A., Abdul-Dayem S. and Abu-Zeid M. Saline water management for optimum crop production. Auric.Water Management Institute Agronomico Mediterraneo Valenzano, Bari, Italy. 1993. V.24. P. 189-203.

100. Hamilton E.W. and Heckathom S.A. Mitochondrial adaptations to NaCl. Complex I is protected by anti-oxidants and small heat shock proteins, whereas complex ii is protected by proline and betaine//Plant Physiology. 2001. V.l26. P.1266-1274.

101. Han K.H. and Hwang C.H. Salt tolerance enhanced by transformation of a P5CS gene in carrot//J. Plant Biotechnol. 2003. V.5. P. 149-153.

102. Hanson A.D. and Burnet M. Evolution and metabolic engineering of osmoprotectant accumulation in higher plants. In: Biochemical and Cellular Mechanisms of Stress Tolerance in Plants, Cherry, J. H., Ed., Springer-Verlag , Berlin. 1994. P.291-301.

103. Harrington H. M., Aim D. M. Interaction of heat and salt shock in cultured tobacco cells//Plant. Physiol. 1988. V.88. P.618-625.

104. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.-K. and Bohnert H.J. Plant cellular and molecular responses to high salinity//Ann.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol. 2000. V.51. P.463-499.

105. Hasson-Porath E., Kahana I. and Poliakoff-Mayber A. The effect of chloride and sulphate types of salinity on growth and osmotic adaptation of pea seedlings//Plant and Soil. 1972. V.36. P.449-454.

106. Hellebust J.A. Osmoregulation//Ann. Rev. Plant Physiol. 1976. V.27. P.485-505.

107. Heuer B. Osmoregulatory role of proline in water and salt-stressed plants. Hanbook of Plant and Crop Stress. Ed. Pessarakli M. Tucson, Arizona: Arizona Univ. 1994. P.657-701.

108. Hill A.E. and Hill B.S. Elimination processes by glands. Mineral Ions in: Encyclopedia of Plant Physiology. New series vol.2, part B, «Springer-Verlag» Berlin. 1976. P.225-243.

109. Hong Z., Lakkineni K., Zhang Z. and Verma D.P.S. Removal of feedback inhibition of pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline• accumulation and protection of plants from osmotic stress//Plant Physiol. 2000.1. V.122.P.1129-1136. ?

110. Huang A.H.C. and Cavalieri A.J. Proline oxidase and water stress-induced proline accumulation in spinach leaves//Plant Physiol. 1979. V.63. P.531-535.

111. Huang J. and Redman R.E. Salt tolerance of Hordeum and Brassica species during germination and early seedling growth//Can.J. Plant Sci. 1995. V.75. P.815-819.

112. Hur J., Hong Jong K., Lee C-H. and An G. Stress-inducible OsP5CS2 gene is essential for salt and cold tolerance in rice//Plant Sci. 2004. V.167. P.417-426.

113. Inomata N. Hybrid progenies of the cross, Brassica campestris x B.oleracea II. Crossing ability of F1 hybrids and their progenies//Jap. J. of Genet. 1983. V.58. P.433-449.

114. Iyer S. and Caplan A. Products of proline catabolism can induce osmotically regulated genes in rice//Plant Physiol. 1998. V.l 16. P.203-211.

115. Jaglo-Ottosen K.R., Gilmour S.J., Zarka D.G., Schabenberger O., Thomashow M.F. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance//Science. 1998. V.280. P. 104-106.

116. Jensen R.G., Adams P., Jones W. and Bohnert H.J. Water availability and osmotic adjustment in the ice plant//Plant Physiol. 1994. V.105. P.21-29.

117. Jones M.M., Osmond C.B. and Turner N.C. Accumulation of solutes in leaves of sorghum and sunflower in response to water deficits//Aust. J. Plant Physiol. 1980. V.7. P. 193-205.

118. Kalaji M.H. and Pietkiewicz S. Salinity effects on plant growth and other physiological processes//Acta Physiol. Plantarum. 1993. V.15. P.89-124.

119. Kavi Kishor P.B. Salt stress in cultured rice cells: effects of proline and abscisic acid//Plant Cell Environ. 1989. V.12. P.629-633.

120. Kavi Kishor P. В., Hong Z., Miao G., Ни C-A.A., and Verma D.P.S. Overexpression of Dl-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline overproduction and confers osmtolerance in transgenic plants//Plant Physiol. 1995. V.108. P.1387-1394.

121. Kochetov A.V. et al. Tobacco transformants bearing antisense suppressor of proline dehydrogenase gene are characterized by higher proline content and cytoplasm osmotic pressure//Russ. J. Genet. 2004. V.40. P.216-218.

122. Kohl D.H., Kennelly E.J., Zhu Y., Schubert K.R. and Shearer G. Proline accumulation, nitrogenase (c2h2 reducing) activity and activities of enzymes related to proline metabolism in drought-stressed soybean nodules//J. Exp. Bot. 1991. V.42. P.831-837.

123. Kumar D. The value of certain plant parameters as an index for salt tolerance in Indian mustard (.Brassica juncea L.)//Plant Soil. 1984. V.79. P.261-272.

124. Kumar D. Salt tolerance in oilseed brassicas—present status and future prospects//Plant Breed. Abst. 1995. V.65. P. 1438-1447.

125. Kuznetsov VI.V., Rakitin V., Borisova N.N., Rotschupkin B.V. Why does heat shock increase salt resistance cotton?//Plant Physiol. Biochem. 1993. V.31. P. 181188.

126. Kuznetsov VI.V. and Shevyakova N.I. Stress responses of tobacco cells to high temperature and salinity, proline accumulation and phosphorylation of polypeptides //Physiol. Plant. 1997. V.100. P.1035-1040.

127. Labirte G. and Hellebust J.A. Pyrroline-5-carboxilate reductace in chlorella antitrophica and chlorella saccharophila in relation to osmoregulation.// Plant.Physiol. 1989. V.91. №93. P.917-923.

128. LaRosa P.C., Rhodes D., Rhodes J.C., Bressan R.A. and Csonka L.N. Elevated accumulation of proline in NaCl-adapted tobacco cells is not due to altered D1-pyrroline-5-carboxylate reductase//Plant Physiol. 1991. V.96. P.245-250.

129. Lessani H. and Marscher H. Relation between salt tolerance and long distance transport of sodium and chloride in various crop species//Austr.J. Plant.Physiol. 1978. V.5. P.27-37.

130. Levitt J. Response of plants to environmental stresses. V.I- chilling, freezing and high temperature stresses. Acad. Press. New York. V.2- Water, Radiation, Salt and Other Stresses. Acad. Press. New York. 1980. 607.p.

131. Liu J. and Zhu J-K. Proline accumulation and salt stress-induced gene expression in a salt-hypersensitive mutant of Arabidopsis//Plant Physiol. 1997. V.l 14. P.591-596.

132. Lopez F., Vansuyt G., Fourcroy P. and Cassedelbart F. Accumulation of a 22 Kda protein and its messenger RNA in the leaves of Raphanus sativus in response to salt stress or water deficit//Physiol. Plantarum. 1994. V.91. P.605-614.

133. Luttge U. Structure and function of plant glands//Annu.Rev.Plant. Physiol. 1971. V.22. P.23-44.

134. Lutts S., Kinet J.M. and Bouharmont J. Effect of various salts and mannitol on ion and proline accumulation in relation to osmotic adjustment in rice (Oryza sativa L.) callus cultures//! Plant Physiol. 1996. V.l 40. P. 186-195.

135. Madan S., Nainawatee H. S., Jain R. K. and Chowdhury J. B. Proline and proline metabolizing enzymes in in vitro selected NaCl-tolerant Brassica juncea L. under salt.stress//Ann.of Bot. 1995. V.76. P.51-57.

136. Malabika R., Rajinder K., Jai Singh R. and Ray W. Production of agronomically superior transgenic rice plants using Agrobacterium transformation methods: Present status and future perspectives//Current Science. 2000. V.7. P.954-960.

137. Mani S., Van de Cotte В., Van Montagu M. and Verbruggen N. Altered levels of proline dehydrogenase cause hypersensitivity to proline and its analogs in Arabidopsis//Plant Physiol. 2002. V.128. P.73-83.

138. Mansour M.M.F. Nitrogen containing compounds and adaptation of plants to salinity stress//Biol.Plant. 2000. V.43. P.491-500.

139. Mattioni С., Lacerenza N.G., Troccoli A., De Leonardis A.M., Di Fonzo N. Water and salt stress-induced alterations in proline metabolism of Tritictim durum L. seedlings//Physiol.Plant. 1997. V.101. P.787-792.

140. Mauch F., Dudler R. Differential induction of distinct glutathione-s transferases of wheat by xenobiotics and by pathogen attack//Plant Physiol. 1993. V.102. P.l 193-1201.

141. Moftah A.E. and Michel B.E. The effect of sodium chloride on solute potential and proline accumulation in soybean leaves//Plant Physiol. 1987. V.83. P.238-240.

142. Molinari H.B.C. et al. Osmotic adjustment in transgenic citrus rootstock Carrizo citrange (Citrus sinensis Osb. Poncirus trifoliate L. Raf.) overproducing proline//Plant Sci. 2004. V.167. P.1375-1381.

143. Morgan J.M. Osmoregulation and water stress in higher plants//Ann. Rev. Plant Physiol. 1984. V.35. P.299-319.

144. Munns R. Comparative physiology of salt and water stress//Plant Cell Environ. 2002. V.25. P.239-250.

145. Munns R., Hare R.A., James R.A. and Rebetzke O.J. Genetic variation for improving the salt tolerance of durum wheat//Aust.J.Res. 2003. V.l. P.69-74.

146. Murashige T. and Skoog E.A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures//Physiol. Plant. 1962. V.15. P.473-497.

147. Nanjo T. Kobayashi M., Yoshiba Y., Kakubari Y., Yamaguchi Shinozaki K. and Shinozaki K. Biological functions of proline in morphogenesis and osmotolerance revealed in antisense transgenic Arabidopsis thaliana//?\ant J., 1999 b. V. 18. P.185-193.

148. Nanjo Т., Kobayashi M., Yoshiba Y., Kakubari Y., Yamaguchi Shinozaki K. and Shinozaki K. Antisense suppression of proline degradation improves tolerance to freezing and salinity in Arabidopsis thalianallFEBS Lett. 1999 a. V.461. P.205-210.

149. Nicolopoulos D. and Manetas Y. Compatible solutes and in vitro stability of Salsola soda enzymes: proline incompatibility//Phytochemistry. 1991. V.30. P.411-413.

150. Plesset J., palm C. and McLaughlin C.S. Introduction of heat shock proteins an termotolerance by ethanol in Saccharomyces cereviasiae!IBiochzm. Biophys. Res. Commun. 1982. V.108. P.1340-1345.

151. Puppala N., Fowler J.L., Poindexter L. and Bhardwaj H.L. Evaluation of salinity tolerance of canola germination. In: Perspectives on New Crops and New Uses, Janick, J., Ed., ASHS Press, Alexandria, VA. 1999. P.251-253.

152. Qasim M. Physiological and biochemical studies in a potential oilseed crop canola {Brassica napus L.) under salinity (NaCl) stress. Ph.D thesis.Department of Botany, University of Agriculture, Faisalabad, Pakistan. 2000.

153. Rabe B. Stress physiology; the functional significance of the accumulation of nitrogen containing compounds // J. Hort. Sci. 1990. V.65. P.231-243.

154. Rajendrakumar C.S.V., Reddy B.V.D., Reddy A.R. Proline-protein interactions: protection of structural and functional integrity of m4 lactate dehydrogenase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V.201. P.957-963.

155. Ramagopal S. Salinity stress induced tissue specific proteins in barley seedlings //Plant Physiol. 1987. V.84. P.324-331.

156. Rayapathi P.J. and Stewart C.R. Solubilization of a proline dehydrogenase from maize (Zea Mays L.) mitochondria//Plant Physiol. 1991. V.95. P.787-791.

157. Redman R.E., Qi, M.Q. and Belyk M. Growth of transgenic and standard canola (.Brassica napus L.) varieties in response to soil salinity//Can. J. Plant Sci. 1994. V.74. P.l 11-118.

158. Reviron M.P., Vartanian N., Sallantin M., Huet J.C., Pernollet J.C. and Vienne D. Characterization of a novel protein induced by progressive or rapid drought and salinity in Brassica napus leaves//Plant Physiol. 1992. V.100. P. 1486-1493.

159. Rodriguez H.G., Roberts J.K.M., Jordan W.R., Drew M.C. Growth, Water Relations and accumulation of organic and inorganic solute in roots of maize seedlings during salt stress//Plant Physiol. 1997. V.I 13. P.881-893.

160. Roosens N.H., Bitar F.A., Loenders K., Angenon G. and Jacobs M. Overexpression of ornithine-d-aminotransferase increases proline biosynthesis and confers osmotolerance in transgenic plants//Mol. Breed. 2002. V.9. P.73-80.

161. Rudolph A.S., Crowe J.H., and Crowe L.M. Effect of three stabilizing agents proline, betaine and trehalose on membrane phospholipids//Arch. Biorhem. Biophys. 1986. V.245. P. 134-143.

162. Sairam R.K. and Tyagi A. Physiology and molecular biology of salinity stress tolerance in plants//Current Science. 2004. V.86. P.407-421.

163. Sambrook J., Fritsch E.P., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual -Cold Spring Harbor. 1989.

164. Saradhi P.P., Arora S., Prasad V.V.S.K. Proline Accumulation in plants exposed to uv radiation protects them against induced peroxidation//Biochem.Biophys. Res. Commun. 1995. V.290. P. 1-5.

165. Sawahel W.A. and Hassan A.H. Generation of transgenic wheat plants producing high levels of the osmoprotectant proline // Biotechnol. Lett. 2002. V.24. P.721-725.

166. Schwab K.B. and Gaff D.F. Influence of compatible solutes on soluble enzymes from desiccation-tolerant sporobolus stafians and desiccation sensitive Sporobolus pyramidalis//. Plant Physiol. 1990. V.I37. P.208-211.

167. Schwarz M., Lerner H.R. and Reinhold L. Mitochondrialsolated from NaCl adapted tobacco cell lines {Nicotiana tabaccum. Gossi) maintain their phosphorylativ capacity in highly saline media//Plant Physiol. 1991. V.96. P.69-76.

168. Serrano R. and Gaxiola R. Microbial models and salt stress tolerance in plants//Crit. Rev. Plant. Sci. 1994. V.13. P.121-138.

169. Shannon M.C., Grieve C.M. and Francois L.E. Whole-plant response to salinity. In: Plum-Environment Interaction, Wilkins, R. E., Ed., Marcel Dekker. New York. 1994. P. 199-244.

170. Shannon M.C. Adaptation of plants to salinity//Adv. Agron. 1998. V.60. P. 75119.

171. Siripornadulsil S., Traina S., Verma D.P.S. and Sayre R.T. Molecular mechanisms of proline-mediated tolerance to toxic heavy metals in transgenic microalgae//Plant Cell. 2002. V.14. P.2837-2847.

172. Smirnoff N. and Cumbes Q.J. Hydroxyl Radical Scavenging Activity of Compatible Solutes // Phytochemistry. 1989. V.28. P. 1057-1060.

173. Soufi S.M. and Wallace A. Sodium relations in desert plants. Differential effects of NaCl and Na2S04 on growth and composition of Atriplex hymenoptera (Desert Holl.)//Soil. Sci. 1982. V.I34. P.69-70.

174. Stam M., De Bruin R., Van Blokland R., et al. Distinct features of post transcriptional gene silencing by antisense transgenes in single copy and inverted T-DNA repeat loci//Plant J. 2000. V.21. P.27-42.

175. Stawarek S.J. and Rains D.W. Mechanisms for salinity tolerance in plants//Iowa state J. Of Research. 1983. V.57. P.457-476.

176. Su J. and Wu R. Stress-inducible synthesis of proline in transgenic rice confers faster growth under stress conditions than that with constitutive synthesis//Plant Sci. 2004. V.166. P.941-948.

177. Taylor C.B. proline and water deficit: ups, down, ins, and outs//Plant Cell. 1996. V.8. P.1221-1224.

178. Tester M. and Davenport R. Na+ tolerance and Na+ transport in higher plants//Ann. Bot. 2003. V.91. P.503-527.

179. Thomas J.C., De Armond R.L. and Bohnert H.J. Influence of NaCl on growth, proline and phosphoenolpyruvate carboxylase levels in Mesembryanthemum crystallinum//Plant Physiol. 1992. V.98. P.626-631.

180. Venekamp J.H., Lampe J.E.M., Koot J.T.M. Organic acids as sources of drought-induced proline synthesis in filed bean plants Vicia faba L. // J. Plant Physiol. 1989. V.133. P.654-659.

181. Verbruggen N., Villarrole R. and Montague M.V. Osmoregulation of a pyrroline-5 carboxylate reductase gene in Arabidopsis thalianallPlant Physiol. 1993. V.103. P.771-781.

182. Verbruggen N., Hua X.J., May M. and Van Montagu M. Environmental and developmental signals modulate proline homeostasis: Evidence for a negative transcriptional regulator//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. P.8787-8791.

183. Wang S.S. and Brandriss M.C. Proline utilization in Saccharomyces cerevisiae: sequence, regulation, and mitochondrial localization of the PUT1 gene product//Mol. Cell. Biol. 1987. V.7. P.4431-4440.

184. Westhoff P., Nelson N., Bunemann H., Herrman R.G // Curr. Genet. 1981. V.4. P.109-120.

185. Willenbrrink M.E., Husemann W. Photoautotrophic cell suspension cultures from Mesembryanthemum crystallinum and their response to salt stress//Botanica Acta. 1995. V.108. P.497-504.

186. Wright P.R., Morgan J.M. and Jessop R.S. Turgor maintenance by osmoregulation in Brassica napus and B.juncea under field conditions//Ann.Bot. 1997. V.80. P.313-319.

187. Wu L.Q., Fan Z.M., Guo L., Li Y.Q., Zhang W.J., Qu L.J. and Chen Z.L. Over-expression of an Arabidopsis delta-OAT gene enhances salt and drought tolerance in transgenic rice//Chin. Sci. Bull. 2003. V.48. P.2594-2600.

188. Wyn Jones R.G. Salt tolerance. In: Physiological Processes Limiting Plant Productivity. 1981. P.271-292. Johnson, С. В., Ed., Butterworths, London.

189. Yancey P.H. Compatible and counteracting solutes. Cellular and molecular physiology of cell volume regulation. Ed. Strange K. Boca Raton: CRC Press. 1994. P.81-109.

190. Yeo A. Molecular biology of salt tolerance in the context of whole plant physiology//J. Exp. Bot. 1998. V.49. P.915-929.

191. Zhang C-S., Lu Q. and Verma D.P.S. Removal of feedback inhibition of Dl-pyrroline-5-carboylate synthetase, a bifunctional enzyme catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants//J.Biol.Chem. 1995. V.270. P.20491-20496.

192. Zhu В., Su J., Chang M., Verma D.P.S., Fan Y.L. and Wu R. Overexpression of a Dl-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water-and salt-stress in transgenic rice//Plant Sci. 1998. V.139 P.41-48.

193. Zhu J.K. Salt and drought stress signal transduction in plants//Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V.53. P.247-273.

194. Zhu J.K Regulation of ion homeostasis under salt stress//Curr. Opin. Plant Biol. 2003. V.6. P. 441-445.

Информация о работе

Мохамед Али Махмуд Ибрахим
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Получение и исследование трансгенных солеустойчивых растений рапса Brassica napus L. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы