Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование стрессоустойчивости генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование стрессоустойчивости генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы"

На правах рукописи

Колодяжная Янина Станиславна

Исследование стрессоустойчивости генетически модифицированных растений табака (МсоНапа tabacum 1.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы

Генетика — 03,00 15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2007

003055470

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН, г Новосибирск

Научный руководитель Кандидат биологических наук, доцент

Кочетов Алексей Владимирович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Дорогина Ольга

Викторовна, Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН Кандидат биологических наук Ибрагимова Салмаз Саидовна, Институт цитологии и ■ генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Биолого-почвенный институт ДВО РАН,

г. Владивосток

Защита состоится _ 2007 г. на_

заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу 630090, г. Новосибирск, пр академика Лаврентьева, 10 Факс: (383) 333 12 78; е-таП: сПз50У@Ьюпе{ пес ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан^ / _2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

А Д.Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Неблагоприягные факторы внешней среды, такие как засоление, высокая или низкая температура, недостаток влаги, недостаток кислорода, высокая щелочность или кислотность почвы, оказывают отрицательное воздействие на рост и развитие растений. Одним из существенных факторов, ограничивающих выращивание сельскохозяйственных растений во многих агроклиматических зонах, является засоление почв. Избыточные концентрации соли вызывают осмотический и оксидативный стрессы, а ионы хлора оказывают токсический эффект. Растения реагируют на воздействие внешних стрессорных факторов изменением экспрессии генов, интенсивности метаболизма, проницаемости клеточных мембран, баланса ионов в клетках и др. (Чиркова, 2002; Eimer, 2004; Кузнецов, Дмитриева, 2005; Ермакова и др., 2005). В частности, при стрессовом воздействии на растения в клетках начинают синтезироваться белки, участвующие в транскрипционном контроле, белки теплового шока, осмопротектанты (аккумулируются пролин. бетаины, полиамины и тд.), что обеспечивает нормальное протекание клеточных процессов (Kuznetsov et al., 1993; Кузнецов, Шевякова, 1999, Баранова и др., 2006).

В последнее время для придания растениям полезных признаков в процессе выведения новых сортов для различных зон возделывания широко применяются достижения генетики и молекулярной биологии Одно из таких достижений - получение методами генной инженерии растений, устойчивых к различным неблагоприятным факторам окружающей среды Современный этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". К задачам этой отрасли биотехнологии можно отнести создание растений, накапливающих осмолиты (например, пролин), которые способствуют поддержанию тургора клеток, нейтрализующих радикалы и т.д. В работах многих авторов показана положительная связь между уровнем накопления пролина и стрессоустойчивостью растений (Сохансандж и др., 1997; Кузнецов, Шевякова. 1999), однако, роль пролина в обеспечении устойчивости к различным видам стресса изучена недостаточно. В частности, это касается взаимосвязи между катаболизмом пролина и стрессоустойчивостью: исследования, проведенные на растениях арабидопсиса с супрессированным геном пролиндегидрогеназы (ПДГ), дали противоречивые результаты (Nanjo et al., 1999, Mani et al., 2002).

Цель и задачи настоящего исследования. Целью настоящей работы было исследование взаимосвязи между метаболизмом пролина и устойчивостью к различным видам абиотических стрессов на модели генетически модифицированных (ГМ) растений табака. В связи с этим были поставлены следующие задачи-

1. Получить линии ГМ растений табака, несущие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы (ПДГ) и характеризующиеся повышенным содержанием пролина.

2. Изучить наследование генетической конструкции в потомствах генетически модифицированных растений, полученных от самоопыления растений трансформантов.

3. Проанализировать устойчивость ГМ и контрольных растений к следующим стрессовым факторам: засолению, токсичным аналогам пролина, осмотическому стрессу, воздействию высоких температур, повышенным концентрациям тяжелых металлов

Научная новизна и практическая ценность.

Впервые получены линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. Впервые показана повышенная устойчивость полученных ГМ растений к широкому спектру абиотических стрессовых факторов: засолению, присутствию токсичных аналогов пролина, к токсическим концентрациям тяжелых металлов, к осмотическому стрессу, воздействию засухи и повышенных температур. Стрессовые воздействия окружающей среды угнетают рост и развитие растений, снижая их продуктивность. Важными задачами для современной биотехнологии и селекции является повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к засухе, засолению, заморозкам и другим неблагоприятным средовым воздействиям. Полученные ГМ растения табака можно использовать в качестве модели для изучения роли пролина в обеспечении стрессоустойчивости, Разработанный подход также можно рекомендовать для получения сортов хозяйственно-ценных растений, характеризующихся повышенной комплексной устойчивостью к различным абиотическим стрессам.

Положения, выносимые на защиту.

1. Линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, характеризуются увеличенным содержанием пролина (до пятого поколения от самоопыления включительно).

2. Линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена ПДГ, характеризуются повышенной устойчивостью к широкому спектру абиотических стрессов (засолению, токсическим концентрациям тяжелых металлов, осмотическому стрессу, воздействию засухи, повышенных температур)

Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых, 2002; конференции МОГИС, 2003; Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», Саратов, 2003; Съезде ВОГиС, Москва, 2004; III

международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Украина, Алушта, 2006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы Работа изложена на 97 страницах, включает 19 рисунков и фотографий, 15 таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 206 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение трансгенных растений табака. Для получения трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L в качестве исходного материала был взят сорт табака SRI. Использованная для трансформации табака генетическая конструкция, содержащая участок гена ПДГ арабидопсиса в антисмысловой ориентации, была получена сотрудником лаборатории генной инженерии растений Института цитологии и генетики С.Е Титовым (Кочетов и др, 2004). Трансформация растений табака проведена путем кокультивирования листовых дисков с Agrobacterium tumefaciens (штаммы LBA4404 или PGV3850). Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS с добавлением соответствующих растительных гормонов и селектирующего агента (канамицина, 200 мг/л). В результате самоопыления были получены линии ГМ растений табака, характеризующиеся повышенным уровнем пролина и устойчивостью к канамицину

Анализ наследования встроенных генов. Оценку наследования встроенной конструкции у потомств ГМ растений, полученных в результате самоопыления, проводили, оценивая соотношение зеленых и хлоротичных (неустойчивых к канамицину) проростков

Оценка содержания свободного пролина. Содержание свободного пролина определяли по методу Бейтса (Bates et al., 1973). Измерения проводили на растениях в возрасте 4-5 недель, культивируемых при температуре 23-25°С и 16-часовом световом дне.

Исследование солеустойчивости. Для оценки были взяты растения на разных стадиях развития (семена и проростки, выращенные в нормальных условиях до стадии двух пар настоящих листьев), которые помещались на среду MS с различным содержанием NaCl (в разных опытах - 50, 100, 150,200,300,400, 500 мМ).

Оценка уровня оводненности растений. Оводненность изучали на растениях, выращенных на среде MS (контроль) и на MS с добавлением 200 и 300 мМ NaCl. Через 4-5 недель культивирования надземные части

растений взвешивали (сырая масса); для определения сухой массы растений проводили их высушивание при 70°С в течение суток.

Оценка устойчивости к токсичным аналогам пролина. Исследования проводили на среде MS с добавлением 0.1 мМ Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоты. Оценивали рост и развитие проростков на данной среде, размер семенных коробочек и число семян, сформированных после пересадки растений в теплицу. Для оценки устойчивости ГМ растений к другому аналогу пролина - тиапролину - в среду MS его добавляли в концентрации 0 1, 0.3 и 0.5 мМ. Реакцию растений оценивали по внешнему виду и по массе растений через месяц после начала культивирования.

Оценка устойчивости к повышенному содержанию солей тяжелых металлов. Семена ГМ линий и нетрансгенного copra SRI высевали на среду MS (контроль) и на среду MS с добавлением хлорида кадмия (0.1 мМ; 0.2 мМ), нитрага свинца (0.1 мМ; 0 3 мМ), сернокислого никеля (0.1 мМ; 0.2 мМ; 0 4 мМ) или хлорида ртути (0 05 мМ; 0.1 мМ). На этих средах в условиях климатокамеры (+21°С, 16-часовой световой день) растения выращивали в течение 2 месяцев.

Определение концентрации хлорофиллов а и Ь. Экстракцию пигментов проводили 96%-ным этиловым спиртом; в полученных растворах количественное содержание пигментов оценивали спектрофотометрическим методом (Шлык, 1971).

Оценка повреждаемости мембран в условиях осмотического стресса. Барьерные свойства мембран определяли по степени выхода электролитов после осмотического шока (применяли 40%-й раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000) Для исследований целостности мембран использовали методику, основанную на измерении электропроводности водного раствора, содержащего листовые диски, подвергавшиеся осмотическому стрессу (погружение дисков в 40% раствор ПЭГ-6000, осмотический потенциал этого раствора составлял -4,0 МПа при 21°С) (Riga и Vartanian, 1999).

Всхожесть семян в условиях осмотического стресса. Семена помещали на влажную фильтровальную бумагу, смоченную 1%-м раствором ПЭГ-6000 (опыт). В качестве контроля те же образцы помещали на фильтровальную бумагу, смоченную водой. Подсчет всходов проводили на 21 день после культивирования при 25°С. Также были оценены размеры проростков.

Влияние высоких температур на всхожесть семян. Была проведена оценка всхожести семян после экспозиции в течение 1, 2, 3, 4, 5 суток при температуре 37°С. Для проведения анализа семена предварительно замачивали на сутки, а подсчет проростков (оценку всхожести) проводили на 10 сутки после посева.

Определение активности пролиндегидрогеназы. Активность фермента пролиндегидрогеназы оценивали по методу Маттиони (МаШош й а1.,1997).

Статистические методы. Для статистической оценки экспериментальных наблюдений использовали следующие статистические критерии: / - критерий Стьюдента для сравнения средних арифметических значений малых выборок; и - критерий Фишера (для сравнения долей, выраженных в процентах) (Урбах. 1964) и б - критерий для дискретных признаков (описание сегрегации Т-ДНК инсерций в потомствах ГМ растений табака) (8ока1, Т^оЩ 1995).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение линий ГМ растений табака Мсойапа <аЬасит I.., несущих супрессор гена пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации.

Вследствие экспрессии антисмыслового супрсссора гена ПДГ у полученных трансформактов был отмечен повышенный уровень свободного пролина (таблица 1). Согласно полученным данным, содержание пролина у ГМ растений этого возраста оказалось в среднем в 1 5-2 5 раза выше, чем у контрольных растений сорта БЕЛ. Содержание пролина в тканях растений относится к высоковариабельным признакам и определяется множеством параметров (уровнем освещенности, временем суток, возрастом растений, температурным режимом и т.д.), что отмечают также другие авторы (КлзИог й а1., 1995; БЬеуекуа е! а1, 1997; Zhu е1 а1., 1998)

Таблица 1. Среднее содержание пролина у потомков трансформантов (поколение ТО

Трансформанты Содержание пролина, мкг/г веса Сравнение по содержанию пролина с нетрансгенным контролем,% Значение критерия 1 (опыт/ контроль), *0,99=2,7

1 1722 ±693 248 1.53

2 1348±124 208 4.5"

3 855 ±227 132 0 84

5 1294±126 200 4.17"

6 1115 ±297 172 1.50

8 864 ±306 133 0.67

10 1509 ±839 233 1.02

Контроль 648± 94 100

Содержание пролина у конгрольной линии принято за 100%

" отличия достоверны с вероятностью Р > 0,99

Наследование маркерного гена прШ. У потомков трансформантов, полученных от самоопыления, проведен анализ наследования маркерного гена прШ, который обусловливает устойчивость растений к канамицину: при отсутствии в геноме функционально активного гена прШ происходит побеление и гибель проростков. Полученные ГМ растения были гемизиготами в случае одиночной встройки генетического материала, дигемизиготами, если встроек было две, и т.д. Если считать, что в геном табака попадает единичная иисерция, то при самоопылении следует ожидать моногенного наследования признака в поколении Т) (теоретически ожидаемое соотношение зеленых и хлоротичных проростков при росте на средах с канамицином должно соответствовать пропорции 3 : 1 - (То - гемизигота)). В случае встраивания двух копий генетической конструкции в две разные хромосомы соотношение хлоротичных и зеленых проростков должно быть 15:1 (Т0 - дигемизигота). Известно, что при агробактериальной трансформации в среднем выявляется около 1,4 инсерции на растительный геном, а геми- и дигемизиготы составляют более 90% всех трансформантов (РеЫтапп, 1991, 1еоп й а1., 2000). Т.е. большинство полученных ГМ растений с наибольшей вероятностью были гемизиготами или дигемизиготами

Как следует из данных, представленных в таблице 2, моногенный тип сегрегации фенотипов по устойчивости к канамицину отмечен в потомстве трех трансформантов из семи (трансформанты 1,6 и 8; значения в-критерия не превышают 3,84 (Р>0.95). Можно сделать вывод, что у этих трансформантов произошла единичная иисерция в одну из хромосом табака (или две инсерции попали в одну группу сцепления - однако, это очень редкое событие и мы его не рассматривали). У остальных четырех потомков трансформантов наблюдается либо достоверный недостаток хлоротичных проростков (трансформант 3), либо их достоверный избыток (трансформанты 2, 5, 10). Наиболее вероятно, что причиной таких отклонений является замолкание маркерного гена прП1 у некоторых растений в поколении Т! - в этом случае на фенотипическом уровне должны наблюдаться подобные отклонения. Оценка частоты растений с инактивированным маркерным геном прШ была проведена с помощью правила Харди-Вайнберга и использованием С-критерия (таблица 2).

Таблица 2. Сегрегация по фенотипам проростков в потомствах от самоопыления трансформантов при выращивании на среде с канамицином

(поколение ТО-

Трансформанты Фенотипы проростков Итого Инактивация, % Значение критерия в при гипотезе 3.1

Зеленые Хлоротич ные *

1 199 49 (62) 248 - 3.82

6 196 58 (63) 254 - 0.65

8 71 33 (27) 104 - 2.38"

2 97 50 (37) 147 16 5.94"

5 133 73 (52) 206 19 11 08"

10 84 107(48) 191 52 82.99"

3 194 . 31 (56) 225 22 17.16"

' В скобках указаны теоретически ожидаемые частоты фенотипов для

моногенной схемы сегрегации. " Отличия достоверны с вероятностью Р > 0.95

При применении данной генетической конструкции в клетках ГМ растений синтезируется антисмысловая РНК, которая взаимодействует с мРНК гена ПДГ и ингибирует экспрессию этого гена на иосттранскрипционном уровне: происходит активация ферментного комплекса, разрушающего мРНК ПДГ. Однако, описаны случаи, когда посттранскрипционный сайленсинг у некоторых потомков трансформантов переходит в транскрипционный (81ои1]еяс)пк, 2002; Кленов, Гвоздев, 2005). Это, по-видимому, наблюдается в -случае трансформантов 2, 5 и 10: у части потомков произошло замолкание гена прШ, что обусловило статистически достоверный избыток хлоротичных проростков. Следует отметить, что супрессия маркерного гена прШ говорит о высоком уровне супрессии гена ПДГ, о чем свидетельствует повышенный уровень пролина у этих ГМ растений. Так, у линии № 10 в четвертом поколении от самоопыления происходит 100% замолкание маркерного гена, и растения этой линии характеризовались высоким содержанием пролина и стрессоустойчивостью.

Таким образом, на основании анализа наследования функцонально активных копий гена прШ мы предположили, что растения, полученные от

самоопыления трансформантов, № 1, 2, 5, 6, 8 и 10, являлись гемизиготами с разной степенью выраженности замолкания (сайленсинга). Растение трансформант № 3 несло, по-видимому, двойную инсерцию (дигемизигота) с частичным замолканием экспрессии обеих копий маркерного гена в поколении Т]

2. Стрессоустойчив ость линий ГМ растений табака. На первом этапе исследования мы определили устойчивость ГМ растений к токсичным аналогам пролина. Известно, что растения с повышенным уровнем пролина более устойчивы к таким аналогам (Сохансандж и др., 1997)

Оценка влияния азетидин-2-карбоксмовой кислоты (Azetidine-2-carboxyhc acid, Azc) на рост и развитие растений. Было изучено влияние 1_-азетидин-2-карбоксиловой кислоты на всхожесть семян, рост растений и формирование семян. Согласно полученным результатам, у ГМ растений снижение всхожести было слабо выражено, тогда как у контрольных растений этот показатель снижался более, чем в два раза. Отмечено, что присутствие в среде Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоты угнегает развитие как кош рольных, так и ГМ растений. Однако, после пересадки на среду MS без Г-азетидин-2-карбоксиловой кислоты, ГМ растения были способны к более быстрому восстановлению. Затем растения были высажены в теплицу, где были проведены наблюдения за их ростом и развитием. Согласно полученным данным, не было выявлено различий в сроках цветения и формировании плодов у ГМ растений, выросших на MS и на MS с добавлением Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоты. В противоположность этому, у нетрансгенных (контрольных) растений табака сорта SRI, подвергшихся воздействию Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоты, начато сроков цветения отставало от нормы на 10-14 дней. При дальнейшем анализе влияния Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоты на развитие растений обнаружено, что токсичный аналог пролина отрицательно влияет на размеры и массу семенных коробочек, а также на число сформированных семян в коробочках (таблица 3). Отмечено, что линия № 10 способна полностью компенсировать данное токсическое воздействие. Разница по этому показателю между растениями контрольной линии SRI и опытных линий явно выражена.

Таблица 3. Масса семенных коробочек (г) контрольных и опытных

_растений табака, выращенных в различных условиях. _

■ п Г Среда MS i Среда ^-критерий ^¡»=2.7

i Линия ! ; . MS+O.lmMAzc ! MS i MS+Azc

1 SR (контроль) : 66 0.18^0.013 ! 0.091 ¿0.002 7.45 Г

Гл'о 5 58 ! 0.237±0.004 i 0,187±0.01Ö 4.642'

IX? 8 ! 60 Í0.22U0.013 ! Ö.173±0.Ö08 3.145,"

) № 10 : 89 ) 0.19ч iQ.055 0.190±0.002 _ 0.164

И - число семенных коробочек; Агс - L-азетидин-2-карбоксил о пая кислота

' Отличия достоверны с вероятностью Р > 0.99

Эксперименты с другим аналогом пролина - тиапрош) ном -показали* что он также угнетает развитие как опытных, так ц контрольных растений. При этом ГМ растения способны расти на среде MS с добавлением 0.3 мМ/и тиапролина более длительное время, по сразнению с нечрани'енными контрольными растениями табака cop ra SR. 1 (погибают в течение 7-8 недель). Таким образом, ГМ растения характеризуются значительно более выегкой устойчивостью к токсичным аналогам про ли на.

Солеустййчивоешь ГМ растений табака. Нами было показано, что ГМ растения табака более устойчивы к засолению, чем контрольный. При этом бояьш} ю устойчивость, по сравнению с растениями сорта SRI, проявляли как проростки, так и ГМ растения табака, выращенные н нормальных условиях до стадии двух пар настоящих листьев и пересаженные затем на среду MS с добавлением 300, 400 и 500 мМ хлорида натрия. ¡Ha рисунке приведены типичные растения, выросшие на этих средах (рис.1): для всех контрольных растений концентрация 400 мМ является летальной, в то вэемя как большая часть ГМ растений способна выживать в присутствии 500 мМ NaCI в течение 2-3 недель.

Рис.1. Рост ГМ растений (а) и растений табака сорта SRI (б) на среде MS с добавлением хлорида натрия н различных концентрациях.

Было измерено содержание пролина у растений, выросших на среде МБ с добавлением 300 мМ хлорида натрия (табл.4). В условиях солевого стресса содержание пролина у всех растений выросло до близкого уровня (около 3000 мкг/г). Однако, по отношению к исходному уровню, у ГМ растений содержание пролина увеличилось в 2-3 раза, а у контрольных в 4 раза На основе этой информации мы выдвинули предположение о том, что нетрансгенным растениям требуется гораздо больше времени и энергетических затрат для его синтеза пролина в необходимом количестве.

Таблица 4. Содержание пролина у растений, культивируемых в нормальных условиях (МБ) и в условиях засоления (МБ + 300 мМ №С1).

Линия контроль, мкг/г опыт, мкг/г Сравнение по

зеленой массы зеленой массы (И) содержанию

(I) пролина (ИЛ)

648 ± 94 2589 ±600 4,01

№8 864 ± 306 2944 ±180 3,41

№ 10 1509 ±839 2918 ±821 1,93

Обнаружено, что ГМ растения табака на фоне засоления характеризуются сниженной активностью ПДГ, по сравнению с контролем

Оценка уровня оводненности тканей в норме и в условиях засоления Обнаружено, что при росте на среде МБ и на среде МБ с добавлением 200 мМ КаС1 уровень оводненности у ГМ линий и контрольных растений одинаковый Однако, при культивировании на среде с добавлением 300 мМ хлорида натрия у контрольных растений этот показатель падает до 7580%, в то время как у ГМ растений это значение остается неизменным. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у ГМ растений табака при определенных уровнях засоления среды не происходит нарушения водного статуса, тогда как у нетрансгенных растений водный баланс нарушен По-видимому, в условиях интенсивного засоления у ГМ растений происходит более быстрое накопление пролина, который выполняет в этом случае осмопротекторную функцию.

Исследование устойчивости растений к осмотическому стрессу Оценена степень повреждения мембран в результате погружения листовых дисков в 40%-й раствор ПЭГ-6000, что отражает способность растений удерживать воду внутри клеток и поддерживать осмотическое давление на уровне, предотвращающим плазмолиз клеток. Оценка степени повреждения мембран после осмотического шока показала, что большинство ГМ растений более устойчивы к данному воздействию (рис.2), однако, разные линии показали неодинаковую степень устойчивости. Следует отметить, что линии, показавшие большую

устойчивость к этому воздействию, оказались более устойчивыми и к другим видам исследованных стрессов.

120 г-

SR1 № 1 № 2 № 4 № 6 № 7 № 10 Линия

Рис.2. Степень повреждения мембран при осмотическом стрессе

Засухоустойчивость. Растворы ПЭГ часто используются в качестве индукторов водного стресса у растений. Для моделирования условий водного дефицита при проращивании семян мы использовали I % раствор ПЭГ-6000. При проращивании семян в этих условиях всхожесть у контрольных растений сорта SRI снизилась с 90-95% практически до нуля, в то время как у линий ГМ растений всхожесть снизилась до 22 - 49 %. Отмечено, что при проращивании в течение двух недель на воде проростки контрольных и ГМ растений не отличались по размерам. При росте на растворе ПЭГ контрольные растения были более чем в два раза меньше ГМ растений.

Устойчивость ГМ растений к воздействию повышенных температур. Известно, что длительное воздействие повышенных температур может существенно снижать всхожесть семян. Нами проведена оценка всхожести семян растений табака при температуре 37°С при разных экспозициях (от 1 до 5 суток). Огличия по всхожести были заметны визуально. После подсчета числа проростков обнаружено, что у контрольных растений сорта SRI при экспозиции в течение 5 дней всхожесть снизилась более чем на 30%, в то время как у ГМ линий табака падение составило 10-20%. Таким образом, растения с повышенным уровнем пролина более устойчивы к температурным воздействиям на данной стадии развития (рис.3)

сутки

Рис. 3. Оценка всхожести семян после их экспозиции при 37°С

Устойчивость ГМ растений к токсическим концентрациям солей тяжелых металлов (ТМ). Известно, что пролин стабилизирует молекулы белков' он хорошо растворим в воде, образует коллоидные полимерные структуры, благодаря чему при взаимодействии с белками не денатурирует их, что способствует сохранению их нативной конформации в условиях стресса. Тяжелые металлы, попадая в растения, связываются с вН-группами и нарушают структуру белков; поэтому мы предположили, что полученные нами линии ГМ растений могут быть более устойчивы к этому типу стресса Проведенное исследование устойчивости растений к присутствию в среде солей тяжелых металлов (кадмия, никеля, свинца, ртути) не выявило достоверных отличий при сравнении опытных и контрольной линий по уровню всхожести семян. Однако, при дальнейшем росте на этих средах наблюдалась повышенная устойчивость трансгенных растений табака к токсическим концентрациям солей тяжелых металлов Показано, что ГМ растения характеризовались меньшим отставанием в росте, имели большую массу (рис.4), признаки хлороза были менее выражены или практически отсутствовали. О степени хлороза можно судить по уровню хлорофилла в растениях (таблица 5).

Наблюдалось достоверное изменение соотношения хлорофиллов а/Ь, что, как считается, является адаптивной реакцией ассимиляционного аппарата растений на стрессовое воздействие, при снижении уровня основного фотосинтетического пигмента - хлорофилла а - происходит увеличение синтеза вспомогательного пигмента - хлорофилла Ь.

Рк I

! а № 8 !

и

концентрация ионов металлов, мМ

Рис.4. Средняя масса растений, растущих на среде МЯ и на среде М8 с добавлением солей тяжелых металлов

Таблица 5. Влияние ионов тяжелых металлов на содержание хлорофиллов

Среда хлорофилл а, Соотношение Отношение

мг/г сырого хлорофил- хлорофилла а

Линия веса лов а/Ь на М8 и на

М8 + ТМ

Контроль МБ 4.33 2.12

№8 МБ 4.24 2.28

Контроль М8 + 0.2 мМ Сй 0 03 0.63 144

№8 М8 + 0.2 мМ Сё 0.21 1.86 21

Контроль МЭ + 0 1 мМ N1 0.85 0.88 5 09

№8 МБ+ 0.1 мМ№ 3 81 0.98 1.1

Контроль МБ + 0.3 мМ РЬ 0.11 0 77 39.4

№8 МБ + 0.3 мМ РЬ 0.46 0.63 9.2

Наибольшая разница между опытными и контрольными растениями обнаружена при выращивании на среде с добавлением сернокислого никеля. Измерения концентрации хлорофилла у ГМ растений, росших на среде МЙ и на среде МБ с добавлением сернокислого никеля, не показали значительных различий в соотношении хлорофиллов а и А. У контрольных

растений отмечено большее падение уровня хлорофилла, по сравнению с генетически модифицированными растениями, при выращивании на средах, содержащих нитрат свинца (таблица 5). Согласно полученным данным, тяжелые металлы могут быть расположены (в порядке убывания их токсического действия на растения) следующим образом: Сё > > РЬ

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что частичная супрессия гена ПДГ положительно коррелирует со стрессоустойчивостью растений. Полученные линии ГМ растений характеризуются увеличенным содержанием пролина и обладают увеличенной устойчивостью к широкому спектру абиотических стрессов: способны расти в условиях засоления, на повышенных концентрациях солей тяжелых металлов, выживают в присутствии токсичных аналогов пролина, при повышенных значениях температуры окружающей среды, более устойчивы к осмотическому стрессу. ГМ растения не отличаются фенотипически от растений исходного сорта БЕЛ. По-видимому, этот подход можно применять для модификации растений с целью получения форм, способных лучше расти в условиях абиотического стресса Полученные линии также представляют собой новую генетическую модель для изучения роли пролина в обеспечении стрессоустойчивости.

Выводы:

1. Создана новая генетическая модель - линии генетически модифицированных растений табака, несущие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. Показано, что линии ГМ растений характеризуются повышенным содержанием пролина.

2. Анализ наследования маркерного гена прШ (устойчивость к канамицину) в поколении Т| показал, что у шести из семи трансформантов наблюдалась моногенная сегрегация признака, а у одного - дигенная. В потомстве четырех растений трансформантов наблюдалось частичное замолкание гена маркера прШ\ эти растения также характеризовались повышенным уровнем пролина, что свидетельствует о супрессии гена пролиндегидрогеназы.

3. ГМ растения, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена ПДГ, показали устойчивость к широкому спектру стрессовых воздействий'

а) ГМ растения способны расти на токсических концентрациях хлорида натрия. При этом у ГМ растений отмечено снижение активности ПДГ в 3 раза, по сравнению с контрольными негрансгенными растениями.

б) ГМ растения табака показали повышенную устойчивость к токсичным аналогам пролина. Отмечено, что после стрессорного воздействия ГМ растения быстрее восстанавливают нормальный фенотип и способность к дальнейшему развитию

в) ГМ растения габака способны к длительному росту в присутствии токсических концентраций солей тяжелых металлов (никеля, кадмия, ртути, свинца)

г) ГМ растения оказались устойчивы к воздействию высоких температур и осмотическому стрессу.

Список основных публикаций по теме диссертации.

1. Кочетов A.B., Титов С.Е., Колодяжная Я.С., Комарова М.Л., Коваль B.C., Макарова H.H., Илинский Ю.Ю., Трифонова Е.А., Шумный В.К. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т.40. С. 282-285.

2 Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов A.B., Комарова М.Л., Романова А.В, Коваль B.C., Шумный В К. Оценка солеустойчивости растений табака Nicotiana tabacum, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2006.- Т.42.-№ 2 - с.278-281

3 Колодяжная Я.С., Кочетов А.В , Шумный В.К.. Трансгенез как способ увеличения устойчивости растений к повышенным концентрациям тяжелых металлов //Успехи совр.биоя, 2006, Т. 126, № 5, С 456-461

4. Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов А В. Перспективы получения генетически модифицированных растений, устойчивых к тяжелым металлам // Сб.науч.трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Киев «Логос». 2006. С.586-589

5. Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов A.B., Трифонова Е.А , Романова А.В, Комарова М.Л., Коваль B.C., Шумный В.К.. Трансформанты табака, экспрессирующие антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы, проявляют устойчивость к тяжелым металлам // Генетика. 2007. Т. 43. № 7.

Подписано к печати 15 марта 2007 г

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ.л.1. Уч.изд.л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 26

Ротапринт Института циюлогии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр ак.Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колодяжная, Янина Станиславна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Синтез осмолитов как способ повышения устойчивости к абиотическим 8 стрессовым воздействиям.

1.2. Устойчивость растений к абиотическим стрессам

1.2.1. Солеустойчивость растений.

1.2.2. Засухоустойчивость растений.

1.2.3. Устойчивость к изменениям кислотности почвы

1.2.4. Устойчивость растений к токсическим концентрациям тяжелых 13 металлов.

1.3. Роль пролина при стрессе.

1.4. Методы получения трансгенных растений.

1.5. Явление сайленсинга у трансгенных растений

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.2. Методы получения трансгенных растений табака.

2.3. Анализ наследования маркерного гена прШ в поколениях растений 37 табака.

2.4. Анализ содержания свободного пролина в тканях растений.

2.5. Анализ солеустойчивости ГМ растений.

2.6. Оценка уровня оводненности растений.

2.7. Анализ устойчивости ГМ растений к токсичным аналогам пролина.

2.8. Оценка устойчивости ГМ растений к повышенному уровню солей 39 тяжелых металлов.

2.9. Определение концентрации хлорофиллов а и Ь в листьях растений.

2.10. Оценка степени повреждения мембран в клетках растений в условиях 40 осмотического стресса.

2.11. Оценка роста растений на твердых средах с повышенным 41 содержанием агара.

2.12. Оценка всхожести семян и развития проростков растений табака в условиях осмотического стресса.

2.13. Влияние высоких температур на всхожесть семян табака.

2.14. Определение активности фермента пролиндегидрогеназы в тканях 41 растений.

2.15. Статистические методы исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение генетически модифицированных растений табака.

3.2. Анализ числа встроенных инсерций по фенотипам проростков в 46 поколении Ti.

3.3. Солеустойчивость генетически модифицированных растений.

3.3.1. Влияние засоления на прорастание семян и развитие проростков.

3.3.2. Влияние засоления на развитие растений табака.

3.4. Устойчивость ГМ растений к токсичным аналогам пролина.

3.5. Устойчивость ГМ растений к осмотическому стрессу.

3.6. Устойчивость ГМ растений к воздействию высоких температур.

3.7. Устойчивость ГМ растений к повышенному уровню солей тяжелых 65 металлов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование стрессоустойчивости генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы"

Актуальность проблемы. Неблагоприятные факторы внешней среды, такие как засоление, высокая или низкая температура, недостаток влаги, недостаток кислорода, высокая щелочность или кислотность почвы, оказывают отрицательное воздействие на рост и развитие растений. Одним из существенных факторов, ограничивающих выращивание сельскохозяйственных растений во многих агроклиматических зонах, является засоление почв. Избыточные концентрации соли в почве вызывают осмотический и оксидативный стрессы, а ионы хлора оказывают токсический эффект. Растения реагируют на воздействие внешних стрессорных факторов изменением экспрессии генов, интенсивности метаболизма, проницаемости клеточных мембран, баланса ионов в клетках и др. (Чиркова, 2002; Eimer, 2004; Кузнецов, Дмитриева, 2005; Ермакова и др., 2005). В частности, при стрессовом воздействии на растения в клетках начинают синтезироваться белки, участвующие в транскрипционном контроле, белки теплового шока, осмопротектанты (аккумулируются пролин, бетаины, полиамины и т.д.), что обеспечивает нормальное протекание клеточных процессов (Kuznetsov et al., 1993; Кузнецов, Шевякова, 1999; Баранова и др., 2006).

В последнее время для придания растениям полезных признаков в процессе выведения новых сортов для различных зон возделывания широко применяются достижения генетики и молекулярной биологии. Одно из таких достижений - получение методами генной инженерии растений, устойчивых к различным неблагоприятным факторам окружающей среды. Современный этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". К задачам этой отрасли биотехнологии можно отнести создание растений, накапливающих осмолиты (например, пролин), способствующих поддержанию тургора клеток, нейтрализующих радикалы и т.д. В работах многих авторов показана положительная связь между уровнем накопления пролина и стрессоустойчивостью растений (Сохансандж и др., 1997; Кузнецов, Шевякова, 1999). Однако, роль пролина в обеспечении устойчивости к различным видам стресса изучена недостаточно. В частности, это касается взаимосвязи между катаболизмом пролина и стрессоустойчивостью: исследования, проведенные на растениях арабидопсиса с супрессированным геном пролиндегидрогеназы (ПДГ), дали противоречивые результаты (Nanjo et al., 1999; Mani et al., 2002).

Цель и задачи настоящего исследования. Целью настоящей работы было исследование взаимосвязи между метаболизмом пролина и устойчивостью к различным видам абиотических стрессов на модели генетически модифицированных (ГМ) растений табака. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Получить линии ГМ растений табака, несущие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы (ПДГ) и характеризующиеся повышенным содержанием пролина.

2. Изучить наследование генетической конструкции в потомствах генетически модифицированных растений, полученных от самоопыления растений трансформантов.

3. Проанализировать устойчивость ГМ и контрольных растений к следующим стрессовым факторам: засолению, токсичным аналогам пролина, осмотическому стрессу, воздействию высоких температур, повышенным концентрациям тяжелых металлов

Научная новизна и практическая ценность.

Впервые получены линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. Впервые показана повышенная устойчивость полученных ГМ растений к широкому спектру абиотических стрессовых факторов: засолению, присутствию токсичных аналогов пролина, к токсическим концентрациям тяжелых металлов, к осмотическому стрессу, воздействию засухи и повышенных температур. Стрессовые воздействия окружающей среды угнетают рост и развитие растений, снижая их продуктивность. Важными задачами для современной биотехнологии и селекции является повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к засухе, засолению, заморозкам и другим неблагоприятным средовым воздействиям. Полученные ГМ растения табака можно использовать в качестве модели для изучения роли пролина в обеспечении стрессоустойчивости. Разработанный подход также можно рекомендовать для получения сортов хозяйственно-ценных растений, характеризующихся повышенной комплексной устойчивостью к различным абиотическим стрессам.

Положения, выносимые на защиту.

1. ГМ растения табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы, характеризуются увеличенным содержанием пролина (до пятого поколения от самоопыления включительно).

2. Линии ГМ растений табака, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена ПДГ, характеризуются повышенной устойчивостью к широкому спектру абиотических стрессов (засолению, токсическим концентрациям тяжелых металлов, осмотическому стрессу, воздействию засухи, повышенных температур)

Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых, 2003; конференции МОГИС, 2003; Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», Саратов, 2003; Съезде ВОГиС, Москва, 2004; III международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Украина, Алушта, 2006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 97 страницах, включает 19 рисунков и фотографий, 15 таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 206 источников.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Колодяжная, Янина Станиславна

ВЫВОДЫ

1. Создана новая генетическая модель - линии генетически модифицированных растений табака, несущие антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы. Показано, что линии ГМ растений характеризуются повышенным содержанием пролина.

2. Анализ наследования маркерного гена прШ (устойчивость к канамицину) в поколении "П показал, что у шести из семи трансформантов наблюдалась моногенная сегрегация признака, а у одного - дигенная. В потомстве четырех растений трансформантов наблюдалось частичное замолкание гена маркера лрй/; эти растения также характеризовались повышенным уровнем пролина, что свидетельствует о супрессии гена пролиндегидрогеназы.

3. ГМ растения, экспрессирующие антисмысловой супрессор гена ПДГ, показали устойчивость к широкому спектру стрессовых воздействий: а) ГМ растения способны расти на токсических концентрациях хлорида натрия. При этом у ГМ растений отмечено снижение активности ПДГ в 3 раза, по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями. б) ГМ растения табака показали повышенную устойчивость к токсичным аналогам пролина. Отмечено, что после стрессорного воздействия ГМ растения быстрее восстанавливают нормальный фенотип и способность к дальнейшему развитию. в) ГМ растения табака способны к длительному росту в присутствии токсических концентраций солей тяжелых металлов (никеля, кадмия, ртути, свинца). г) ГМ растения оказались устойчивы к воздействию высоких температур и осмотическому стрессу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

• В ответ на действие абиотических стрессовых факторов растения включают различные механизмы адаптации. Сильный стресс нарушает водный гомеостаз растений и перераспределение ионов внутри клеток и тканей. Нарушение гомеостаза происходит как на клеточном уровне, так и на уровне целого растения. Глубокие изменения в ионном и водном гомеостазе приводят к остановке роста и, возможно, к гибели растений. Для достижения стрессоустойчивости важны следующие взаимосвязанные аспекты функциональной активности растений. Во-первых, последствия стрессорного воздействия могут быть предотвращены или смягчены. Во-вторых, гомеостаз должен быть снова установлен в новых стрессовых условиях. В-третьих, рост может быть продолжен, хотя и с меньшей скоростью (Zhu, 2001). Так, в ответ на неблагоприятные условия окружающей среды растения начинают накапливать специфические низкомолекулярные совместимые осмолиты: аминокислоты, бетаины, сахаро-спирты, полиаминьг и т.п. (Кузнецов, Шевякова, 1999; Eimer, 2004). Самым распространенным осмолитом является пролин, однако, до сих пор его роль в обеспечении стрессорного ответа до конца не выяснена. Известно, что накопление повышенных концентраций пролина происходит в ответ на засуху, засоление, повышение или понижение температуры, при воздействии токсических концентраций тяжелых металлов, загрязнении атмосферы, избытке или недостатке макро- и микроэлементов, воздействии ультрафиолетового излучения, инфекции (Hare, Cress, 1997; Кузнецов, Шевякова, 1999). Однако, такую взаимосвязь между стрессоустойчивостью и накоплением пролина удалось^ продемонстрировать далеко не всегда. Существуют гипотезы о роли метаболизма пролина или продуктов его катаболизма в качестве регулятора соотношения NADP+/NADP-H или индукторов экспрессии генов в ответ на осмотический стресс (Hare, Cress, 1997; Iyer, Caplan, 1998). Защитное действие пролина при стрессе может быть обусловлено тем, что взаимодействуя с белками, он способствует сохранению их пространственной структуры и биологической активности. Пролин может оказывать и опосредованный защитный эффект, проявляя антиоксидантные свойства, инактивируя гидроксильные радикалы, тем самым защищая белки и мембраны (Smirnoff, Cumbes, 1989; Serrano, Gaxiola, 1994; Saradhi et al., 1995),

Известно, что в условиях засухи или засоления при повышении уровня пролина происходит повышение осмотического давления клеточного сока на фоне уменьшения водного потенциала почвенного раствора. Поскольку пролин хорошо растворим в воде, обладает гидрофобной и гидрофильной частью, образуя коллоидные полимерные структуры, то при связывании с белками он сохранению их конформации в условиях стресса (Шевякова, 1983). Таким образом, ясно, что пролин, в конечном итоге поддерживая клеточный гомеостаз, обладает полифункциональным биологическим эффектом.

Однако, механизмы защитного действия пролина изучены недостаточно. Показано, что увеличение содержания пролина вследствие снижения скорости его деградации или усиления синтеза, или обоих событий одновременно приводит к повышению стрессоустойчивости растений (Huang, Redman, 1995; Kishor et al., 1995; Сохансандж и др., 1997; Zhu et al., 1998; Nanjo et al., 1999; Steppuhn et al., 2001; Siripornadulsil et al., 2002; Konstantinova et al., 2002; Ashraf, 2004; Kishor et al., 2005). Однако также существуют работы, в которых показана незначительная корреляция между содержанием пролина и устойчивостью растений к осмотическому стрессу (Maggio et al., 1997; Mani et al., 2002). Таким образом, роль повышенного уровня пролина в обеспечении защитных функций у растений до конца не выяснена.

В растениях пролин синтезируется двумя путями: глутаматным и орнитиновым. Ферменты первого пути локализованы в цитоплазме, а второго - в митохондриях. В первом случае для создания растений с повышенным уровнем синтеза пролина усиливали экспрессию гена пирролин-5-карбоксилатсинтазы или гена пирролин-5-карбоксилатредуктазы (LaRosa et al., 1991; De Ronde et al., 2000; De Ronde et al., 2004; Kishor et al., 2005). Созданные трансгенные растения табака, риса, пшеницы, моркови, • сои и цитрусовых показали повышенную устойчивость к засолению, засухе и воздействию повышенных температур (Hong et al., 2000; Han, Hwang, 2003; Anoop, Gupta, 2003; Su, Wu, 2004; Molinari et al., 2004). Помимо растений, несущих трансгены растительного происхождения, были получены растения табака, экспрессирующие бактериальные гены и характеризующиеся повышенной стрессоустойчивостью (Сохансандж, 1997; Nanjo et al., 1999). В случае повышения уровня пролина через орнитиновый путь, созданные ГМ растения табака Nicotiana plumbaginifolia и риса несли ген орнитин-5-аминотрансферазы, в условиях осмотического стресса имели более высокую всхожесть семян и обладали большей массой (Roosens et al., 2002; Han, Hwang, 2003; Kishor et al., 2005).

Другим путем увеличения содержания пролина является снижение скорости его деградации. Интересно, что некоторые исследователи сообщают о повышении активности ПДГ во время водного дефицита (Kohl et al., 1991). При этом в нормальных условиях синтез ПДГ может индуцироваться высокими концентрациями пролина (Heuer, 1994). Известно, что биосинтез пролина из глутамата проходит с регенерацией НАДФ+, который необходим для регенерации НАДФН и поставки рибозо-5-фосфата для синтеза пиридиннуклеотидов. Таким образом, пролин, накапливаемый в условиях стресса, может служить дополнительным источником восстановителей, обеспечивая синтез НАД+ и НАДФ+, необходимых для дыхательных и фотосинтетических процессов (Fahrendorf et al., 1995; Hare and Cress, 1997).

Ранее было показано, что увеличение содержания пролина вследствие снижения скорости его деградации за счет введения антисмысловых супрессоров гена пролиндегидрогеназы приводит к увеличению содержания пролина и повышению устойчивости к стрессам у растений арабидопсиса (Nanjo et al., 1999). Повышение соле- и осмоустойчивости было выявлено в культуре генетически модифицированных клеток табака, способных к накоплению пролина в результате замолкания гена пролиндегидрогеназы (Tateishi et al., 2005). Хотя, по-видимому, активность ПДГ падает во время стресса (Hare, Cress, 1997), попытки ингибировать экспрессию гена ПДГ дали неоднозначные результаты (Maní et al., 2002). В настоящее время окончательно не выяснена взаимосвязь между катаболизмом пролина и стрессоустойчивостью. Предполагают, при стрессе пролин используется для восстановления окислительно-восстановительного баланса, поэтому изменение активности ПДГ может негативно сказаться на адаптации к стрессу. С другой стороны, перечисленные работы подтверждают, что повышенный уровень пролина может привести к повышению устойчивости к широкому спектру абиотических стрессовых воздействий. Гены ферментов синтеза пролина или супрессоры его деградации давно рассматривают как наиболее удобные для переноса в растения, неустойчивые к абиотическим стрессам (Rudulier et al., 1984; Kishor, 2005).

Нами были получены трансформаты табака Nicotiana tabacum L, несущие аналогичный супрессор, с целью дополнительно исследовать роль катаболизма пролина в стрессорном ответе. Вследствие экспрессии антисмыслового супрессора гена ПДГ в полученных нами ГМ растениях отмечен повышенный уровень свободного пролина (таблица 5). Однако, достоверные отличия по этому параметру показаны лишь у двух ГМ линий. Эти данные согласуются с результатами, полученными другими авторами, которые также отмечают высокую вариабельность этого параметра (Kishor et al., 1995; Sheveleva et al., 1997; Zhuet al., 1998)

Было показано, что ГМ растения табака более устойчивы к засолению. При этом большую устойчивость, по сравнению с растениями сорта SR1, проявляли как проростки, так и ГМ растения табака, находящиеся на стадии двух пар настоящих листьев. Отмечено, что уровень пролина возрастает как у опытных (SR1), так и у контрольных растений. Однако, если у опытных.растений эти значения увеличились приблизительно в 2 раза, то у контрольных в 4 раза. Обнаружено, что у ГМ растений происходит снижение активности фермента ПДГ (таблица 8), это способствует накоплению пролина. В то время как у контрольных нетрансгенных растений в присутствии 200 мМ NaCI отмечено двукратное увеличение активности. Изначальный уровень пролина у контрольных и ГМ растений существенно различался, поэтому можно предположить, что растениям сорта SR1 требуется гораздо больше времени и энергетических затрат для его биосинтеза.

Также был оценен уровень оводненности тканей в норме и в условиях засоления. Обнаружено, что на среде MS и на среде с добавлением 200 мМ NaCI уровень оводненности у всех растений одинаков. Но при культивировании на среде с содержанием соли 300 мМ у контрольных растений этот показатель падает до 75-80 %, в то время как у трансгенных растений это значение остается неизменным. Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что у ГМ растений табака при засолении не происходит нарушения водного статуса.

Известно, что в норме растения не способны к нормальному росту на средах, содержащих токсичные аналоги пролина. Нами были выявлены отличия между контрольными и ГМ растениями при выращивании на средах, содержащих такие аналоги. На этом конкретном примере была проведена оценка влияния Azc на рост и развитие растений, начиная от определения всхожести семян и заканчивая формированием семян у растений, выросших на средах с добавлением Azc. У ГМ растений падение всхожести было менее выражено.

Отмечено, что присутствие 1-азетидин-2-карбоксиловой кислоты угнетает развитие как контрольных, так и ГМ растений. Однако, при пересадке этих растений на среду MS ГМ растения были способны к более быстрому восстановлению нормального фенотипа (рис.8). При дальнейшем исследовании влияния 1.-азетидин-2-карбоксиловой кислоты на развитие растений, обнаружено, что токсичный аналог пролина отрицательно сказался на размерах и массе семенных коробочек, а-также на количестве сформированных семян (таблица 10). Однако, если сравнивать массу семенных коробочек у стрессированных растений табака, то достоверной разницы между ГМ растениями не наблюдается. В то время как разница по этому показателю между растениями контрольной линии SR1 и опытных линий очевидна.

Эксперименты показали, что другой аналог - тиапролин - тоже угнетает развитие как опытных, так и контрольных растений. Но ГМ растения способны расти на среде MS с добавлением 0.3 мМ/л тиапролина гораздо более длительное время, по сравнению с нетрансгенными растениями табака сорта SR1 (рис.9).

Проведенное исследование устойчивости растений к повышенному уровню солей тяжелых металлов (кадмия, никеля, свинца, ртути) не выявило достоверных отличий при сравнении всхожести семян опытной и контрольной линий. При длительном выращивании .на этих средах наблюдалась большая устойчивость трансгенных растений табака к токсическим концентрациям солей тяжелых металлов. Показано, что *ГМ растения характеризовались меньшим отставанием в росте, признаки хлороза были менее выражены или практически отсутствовали. Анализируя выполненные эксперименты и располагая металлы в порядке убывания их токсического действия, мы получили следующий ряд токсичности по тяжелым металлам: Cd > Ni > Pb > Hg.

Были выявлены различия в экспериментах, моделирующих засушливые условия. При выращивании на 1%-м растворе ПЭГ всхожесть контрольных растений резко падала и составляла около 1%, в то время как у ГМ растений составляла примерно 22 - 49 %.

Одним из показателей устойчивости является оценка барьерных свойств клеточных мембран, определяемая по выходу электролитов в раствор. Для этого листовые диски были подвержены осмотическому шоку. Оценка степени повреждения мембран показала, что большинство ГМ растений более устойчивы к данному воздействию (рис.10).

При воздействии повышенной температуры окружающей среды (37°С) на всхожесть семян было обнаружено, что у контрольных растений сорта SR1 при экспозиции в течение 5 дней всхожесть снизилась более, чем на 30%. В то время как у линии № 8 и 10 это падение составило менее 20 и 10 % соответственно (рис.13).

Как было отмечено, многие исследователи на разных ГМ растениях (табаке, арабидопсисе, рисе, пшенице, моркови, сое и др.) наблюдали положительную взаимосвязь между уровнем синтеза пролина и устойчивостью к абиотическим стрессам (LaRosa et al., 1991; Kishor et al., 1995; Zhang et al., 1995; Nanjo T. et al., 1999; De Ronde et al., 2000; Mani et al., 2002; Roosens et al., 2002; Sawahel and Hassan ,2002; Siripornadulsil et al., 2002; Han and Hwang, 2003; Hur et al., 2004; Su and Wu, 2004;Molinari et al., 2004). Созданные нами трансгенные растения обладают повышенной устойчивостью к широкому спектру абиотических стрессов: хорошо росли на повышенных концентрациях токсичных аналогах пролина, солей тяжелых металлов, при повышенных значениях температуры окружающей среды. ГМ растения не отличаются фенотипически от растений исходного сорта SR1. По-видимому, этот подход можно применять для модификации растений с целью получения форм, способных расти в условиях абиотического стресса, а также использовать данный подход для изучения роли пролина в обеспечении устойчивости к различным видам стресса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колодяжная, Янина Станиславна, Новосибирск

1. Андрющенко В.К. Модификация метода определения пролина для выявления засухоустойчивости рода Luopersicon Тот. 1. Известия АН Молдавской ССР, серия биол. И хим. Наук. -1981. -№4. -С.55-60.

2. Аравин A.A., Кленов М.С., Вагин В.В., Розовский Я.М., Гвоздев В.А. Роль двухцепочечной РНК в подавлении экспрессии генов эукариот // Мол.биол. 2002. Т.36. № 2. С.240-251

3. Бабурина О. К., Леонова Т.Г. Динамика содержания Na+ и К" в клетках суспензионной культуры люцерны при высоких концентрациях NaCI // Физиол.растений, 1994, т.41, №3, с.460-463.

4. Бабурина О. К., Шевякова Н. И. Влияние экзогенного глициоетаина на рост и метаболизм люцерны в условиях засоления // Физиол. растений, 1988, т.35, №6,с.1177-1181.

5. Баранова E.H., Гулевич A.A. Проблемы и перспективы генно-инженерного подхода в решении вопросов устойчивости растений к засолению // Сельскохоз.биол. 2006. № 1. С.39-53

6. Ванюшин Б.Ф. Энзиматическое метилирование ДНК эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки // Биохимия. 2005. Т.70. № 5. С.598-611

7. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений: лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. 408 с.

8. Ермакова И.П., Алечина Н.Д., Балнокин Ю.В.,Гавриленко В.Ф. и др. Физиология растений. М.:Изд.центр «Академия». 2005. 640 с.

9. Кабанов В. В., Ценов Е. И., Строгонов Б. П. Влияние NaCI на содержание и синтез нуклеиновых кислот в листьях гороха. // Физиол. Астений. 1973. Т.20. №.3. с.466-472

10. Кленов М.С., Гвоздев В.А. Формирование гетерохроматина: роль коротких РНК и метилирования ДНК// Биохимия. 2005. Т.70. № 11. С. 14451458

11. Колодяжная Я.С., Кочетов A.B., Шумный В.К. Трансгенез как способ увеличения устойчивости растений к повышенным концентрациям тяжелых металлов // Успехи совр. биол. 2006. Т. 126, № 5, С. 456-461

12. Котельников Р.Н., Шпиз С.Г., Калмыкова А.И., Гвоздев В.А. Белки, связывающие РНК, в процессах РНК-интерференции // Мол.биол. 2006. Т.40. № 4. с.595-608

13. Кочетов A.B., Титов С.Е., Колодяжная Я.С. и др. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т.40. № 2. С.282-285

14. Кузнецов Вл. В., КимпелДж., ГокджиянД., КиДж. Элементы неспецифичности реакции генома растений при холодовом и тепловом стрессе//Физиология растений. 1987, т.34, с.859-868

15. Кузнецов Вл. В., Хыдыров Б., Рощулкин Б. В., Борисова H. Н. Общие системы устойчивости хлопчатника к засолению и высокой температуре: Факты и гипотезы // Физиол. Растений. 1990, т.37, вып.5, с.987-996.

16. Кузнецов Вл. В., Старостенко Н. В. Синтез белков теплового шока и их вклад в выживание интактных растений огурца при гипертермии // Физиол. растений, 1994. Т.41. №3. С.374-380.

17. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. М. 2005. 736с.

18. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. М. 2006. 742с.

19. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция //Физиология растений. 1999. Т.46. № 2. С.321-336

20. Лутова Л.А., Проворов H.A., Тиходеев О.Н. и др. Генетка развития растений. СПб.:»Наука». 2000. 539 с.

21. Лутова Л.А. Генетическая инженерия растений: свершения и надежды // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т.6. № 10. С. 10-17

22. Пирузян Э.С., Кобец Н.С., Метт В.Л. и др. Трансгенные растения с экспрессируемыми чужеродными генами как модель для изучения стрессовых ответов и источник создания устойчивых форм II Физиология растений. 2000. Т.47. № 3. С.370-381

23. Полонский В.И., Сурин H.A. Оценка зерновых злаков на устойчивость к неблагоприятным экологическим факторам II Новосибирск.- 2003 -128 с.

24. Ригер Р., Михаэлис А. Генетический и цитогенетический словарь. М.:» Кол ос». 1967. с. 331

25. Саложин C.B., Прохорчук Е.Б., Георгиев Г.П. Метилирование ДНК как один из эпигенетических маркеров // Биохимия. 2005. Т.70. № 5. С.641-650

26. ЩШШ- Концепция стресса. Как мы ее понимаем в 1976 году. Новое о гормонах и механизмы их действия. Киев: Наукова думка. 1977. 27 с.

27. Серегин И.В. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадмия у высших растений//Успехи биохимии. 2001. Т.41. С.289-300

28. Серегин И.В., Иванов В.Б. Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения // Физиол.раст. 2001. Т.48 (4). С.606-630

29. Серегин И.В., Кожевникова А.Д. Физиологическая роль никеля и его токсическое действие на высшие растения // Физиол.раст. 2006. Т.53 № 2. С.285-308.

30. Сохансандж А., Неумывакин Л.В., Мосейко H.A., Пирузян Э.С. Перенос бактериальных генов синтеза пролина в растения и их экспрессия под контролем различных растительных промоторов // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. №7. С.906-913

31. Титов С.Е., Кочетов A.B., Коваль B.C., Шумный В.К. Трансгенез как способ повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам // Успехи совр. биол. 2003. Т.123. № 5. С.487-494

32. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М.: Наука. 1964. 416 с.

33. Феник С.И., Трофимяк Т.Б., Блюм Я.Б. Механизмы формирования устойчивости растений к тяжелым металлам // Успехи современной биологии. 1995. Т.115 (3). С.261-275

34. Холодова В.П., Волков К.С., Кузнецов В.В. Адаптация к высоким концентрациям солей меди и цинка хрустальной травки и возможность ихиспользования в целях фиторемедиации // Физиол.раст. 2005. Т.52. № 6. С.848-858.

35. Ценов Е. И., Строгонов Б. П., Кабанов В. В. Влияние NaCI на содержание и синтез нуклеиновых кислот в тканях томата // Физиол. растений, 1973, т.20, вып.1, с.54-61

36. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. Изд-во СПб университета,- 2002,- 244 с.

37. Шевякова Н. И. Метаболическая роль ди- и полиаминов в растениях // Физиол.раст. 1981, Т.28. №6. С. 1052.

38. Шевякова Н. И. Метаболизм и физиологическая роль пролина в растениях при водном и солевом стрессе // Физиол. раст. 1983. Т.ЗО. №4. С.743-751.

39. Шевякова Н. И., Рощупкин Б. П., Парамонова Н. В., Кузнецов Вл. В.

40. Стрессорный ответ клеток Nicotiana Sylvestris на засоление и высокую температуру. 1. Акуммуляция пролина, полиаминов, бетаинов и Сахаров. // Физиол.раст, 1994,т.41, №4, с.558.

41. Шемякин М. Ф., Шерман М. Ю. Возможные пути решения пробемы солеустойчивости методами генной инженерии. В сб.: "Состояние и перспективы развития с-х биотехнологии". Л.1986. С. 43-47.

42. Шерман М.Ю. Участие белков теплового шока в осморегуляции Escherichia соП//Мол. биол.,1987, т.21, №.1, с. 189.

43. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каратиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений. М.:Наука. 1971. С.154-170.

44. Ahmad J., Hellebust J. A. The Relationship between Inorganic Nitrogen Metabolism and Proline Accumulation in Osmoregulatory Response of Two Euryhaline microalgae//Plant Physiol. 1988, v.88, p.348-354

45. All G., Srivastava P. S., Iqbal M. Proline accumulation, protein pattern and photosynthesis in Bacopa monniera régénérants grown under NaCI stress // Biol. Plant. 1999. V.42. P.89-95

46. Allen R.D. Dissection of oxidative stress tolerance using transgenic plants // Plant Physiol. 1995. V.107. P.1049-1054

47. Ambros P.F., Matzke A.J.M., Matzke M.A. Localization of Agrobacterium rhizogenes T-DNA in plant chromosomes by in situ hybridization // EMBO J. 1986. V.5. P.2073-2077

48. Andre D., Colau D., Schell J., Van Montagu M., Hernalsteens J-P. Gene tagging in plants by a T-DNAinsertion mutagen that generates APH(3')ll-plant gene fusions. //Mol Gen Genet. 1986. V. 204. P.512-518

49. Anoop N. and Gupta A. K. Transgenic indica rice cv IR-50 over-expressing Vigna aconitifolia delta(1)-pyrroline-5-carboxy!ate synthetase cDNA shows tolerance to high salt//J. Plant Biochem. Biotechnol., 2003,12, P.109-116.

50. Arazi T., Sunkar R., Kaplan B., Fromm H. A tobacco plasma membrane calmodulin-binding transporter confers Ni2+ tolerance and Pb2+ hypersensitivity in transgenic plants // Plant J. 1999. V.20(2). P.171-182

51. Ashraf M. Breeding for salinity tolerance in plants // Crit. Rev. plant Sci. 1994. V.13. P. 17-42

52. Ashraf M., McNeilly T. Responses of four Brassica species to sodium chloride // Env. Exp. Bot. 1990. V.30 P.475-187

53. Basu U., Good A.G., Taylor G.J. Transgenic Brassica napus plants overexpressing aluminium-induced mitochondrial manganese superoxide dismutase cDNA are resistant to aluminium // Plant, Cell and Environment. 2001. V.24. P.1269-1278

54. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. Repid determination of free praline for./ water-stress studies // Plant and soil. 1973. V.39. P.205-207.

55. Bird A., Wolffe A.P. Methylation-induced repression — belts, braces, and chromatin // Cell. 1999. V.99. P.451-454

56. Bowler C., Montagu M. V., Inze D. Superoxide Dismutase And Stress Tolerance//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992, V.43, p.83-116

57. Buck S., Van Montagu M., Depicker A. Transgene silencing of invertedly repeated transgenes is released upon deletion of one of the transgenes involved // Plant Molecular Biology 2001. V.46. P.433-445.

58. Chardonnes A.N., W.M. den Bookum, Kuijper et al. // Physiol.Plant. 1998. V.104. P.75-80

59. Choi Y.-E., Harada E., Wada M. et al. Detoxification of cadmium in tobacco plants: formation and active excretion of crystals containing cadmium and calcium through trichomes // Planta. 2001. V.213. P.45-50

60. Clemens S., Kim E.J., Neumann D., Schroeder J.I. Tolerance to toxic metals by gene family of phytochelatin synthases from plants and yeast // EMBO J. 1999. V.18. P.3325-3333

61. Clemens S. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis // Planta. 2001. V.212. P.475-486

62. Cobbet C.S, May M.J., Howden R., Rolls B. The glutathione-deficient, cadmium-sensitive mutant, cad2-1, of Arabidopsis thaliana is deficient in gamma-glutamylcysteine synthetase // Plant J. 1998. V.16. P.73-78

63. Cobbet C.S. Phytochelatin and their roles in heavy metal detoxication // Plant Physiol. 2000. V.123. P. 825-833

64. Cobbett C., Goldsbrough P. Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis // Annu.Rev.Plant.Biol. 2002. V.53. P. 159-182

65. Delauney A., Verma D. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants // Plant J. 1993. V.4. P.215-223

66. Depicker A., Van Montagu M. Post-transcriptional gene silencing in plants //Curr. Opin. Cell Biol. 1997. V. 9. P.373-382.

67. Djilianov D., Dragiiska R., Yordanova R., Doltchinkova V., Yordanov Y., Atassanov A. Physiological Changes in Osmotically Stressed Detached Leaves of Alfalfa Genotypes Selected in vitro // Plant Sci. 1997, V.129, p. 147156

68. Domingez-Solis J.R., Guttierrez-Alcala G., Romero L.C., Gotor C. Thecytosolic O-acetylserine (thiol) lyase gene is regulated by heavy metals and can function in cadmium tolerance//J.biol.Chem. 2001. V.276. P.9297-9302

69. Eimer M. Transgenic drought- and salt-tolerant plant //Genetic Engineering Newsletter. 2004, February, Special Issue 15, p.1-14

70. Elthon T.E., Stewart C.R. Proline oxidation in corn mitochondria // Plant Physiol. 1982. V.70. P.567-572

71. Emani C., Sunilkumar G., Rathor K.S. Transgene silencing and reactivation in sorghum // Plant Science. 2002. V.162. N 2. P.181-192

72. Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Aradidopsis: mutation spectrum // Plant J. 1991. V.1. P.71-82

73. Findenegg G.R. A comparative study of ammonium toxity at different constant pH of the nutrient solution // Plant&Soil.-1987.-V.103, N2,- P.239-243

74. Finnegan E.J., Kovac K.A. Plant DNA methyltransferases // Plant Mol.Biol. 2000. V.43. P.189-201

75. Flowers, T. J., Troke, P. F.,.and Yeo, A.R. The mechanism of salt tolerance in halophytes // Annu. Rev. Plant Physiol. 1977. V.28. P.89-121.

76. Franco O.L., Filho J.E., Prisco J.T., Filho E.G. Effects of CaCI2 on growth and osmoregulator accumulation in NaCI stressed cowpea seedlings //Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 1999,11(3), 145-151

77. Francois L. E., Mass E. V., Donovan T. J., Youngs V. L. Effect of salinity on grain and quality, vegetative growth and germination of semi dwarf and durum wheat//Argon J. 1986, v.78, p. 1053-1058.

78. Freeman J.L., Persans M.W., Nieman K. et al. Invreased glutatione biosynthesis plays a role in nickel tolerance in Thlaspi nickel hyperaccumulators //Plant Cell Preview. 2004. V.16. P.2176-2191

79. Gayoor Ali, Srivastava P.S., Iqbal M. Morphogenic and biochemical responses of Bacopa monniera cultures to zinc toxicity // Plant Science. 1999. V.143. P. 187-193

80. Gelvin S.B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool // Microbiology and molecular biology reviews. 2003. V. 67, No. 1.P. 16-37

81. Gniazdowska-Skoczek H., Bandurska H. Proline Accumulation and Ribonuclease Activity in Three Barley Genotypes during Water Stress // Acta. Physiol. Plant. 1994. V.I 6. P.309-315

82. Gruenbaum Y., Naveh-Many T., Cedar H., Razin A. Sequence specifity of metylation in higher plant DNA// Nature. 1981. V.292. P.860-862

83. Ha S.-B., Smith A.P., Howden R. et al. Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe II Plant Cell. 1999. V.11. P.1153-1164

84. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance // J.Exp.Bot. 2002. V.53 (366). P.1-11

85. Han K.H., Hwang C.H. Salt tolerance enhanced by transformation of P5CS gene in carrot//J.PIant Biotechnology. 2003. V.5. N 3. P.149-153

86. Hare P.D., Cress W.A. Metabolic implications of stress-induced proline *j accumulation in plants// Plant Growth Reg. 1997. V.21. P.79

87. Harrington H. M., Aim D. M. Interaction of heat and salt shock in cultured tobacco cells // Plant. Physiol., 1988, V.88, №3, p.618-625.

88. Hasegawa I., Terada E., Sunairi M. et al. Genetic improvement of heavy metal tolerance in plants by transfer of the yeast metallothionein gene (CL/P1) // Plant and soil. 1997. V.196. P.277-281

89. Herman L., Jacobs A., van Montagu M., Depicker A. Plant chromosome/marker gene fusion assay to study normal and truncated T-DNA integration events // Mol. Gen. Genet. 1990. V.224. P.248-256.

90. Heuer B. Osmoregulatory Role of Proline in Water and Salt-stressed Plants. Hanbook of Plant and Crop Stress. Ed. Pessarakli M. Tucson, Arizona: Arizona Univ. 1994. p.657-701

91. Hirschi K.D., Korenkov V.D., Wilganowski N.L., Wagner G.J. Expression of Arabidopsis CAS2 in tobacco. Altered metal accumulation and increased manganese tolerance//Plant Physiol. 2000. V.124. P.125-133

92. Holliday R. The inheritance of epigenetic defects // Science. 1987. V. 163-170

93. Hobbs S.L.A., Warkentin T.D., DeLong C.M.O. Transgene copy number can be positively or negatively associated with transgene expression // Plant. Mol. Biol. 1993. V.21. P. 17-26

94. Hoopen R., Robbins T.P., Fransz P.F. et al. Localization of T-DNA insertions in Petunia by fluorescence in situ hybridization: Physical evidence for suppression of recombination // Plant Cell. 1996. V.8. P.823-830.

95. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.R., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive, cadi, mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient II Plant Physiol. 1995. V.107.1059-1066

96. Hsu S.Y., Hsu Y.T., Kao C.H. The effect of PEG on proline j accumulation in rice leaves // Biologia Plantarum, 2003, 46 (1), p. 73-78

97. Huang J., Redman R.E. Salt tolerance of Hordeum and Brassicu species during germination and early seedling growth //1995. Can.J. Plant Sci. 75: 815-819.

98. Hur J., Hong Jong K., Lee C-H. and An G. Stress-inducible OsP5CS2 r gene is essential for salt and cold tolerance in rice // Plant Sci. 2004. V.167. P. 417-426

99. Ingle R.A., Mugford S.A., Rees J.D., Campbell M.M., Smith J.A.C.

100. Constitutively high expression of the histidine biosynthetic pathway contributes to nickel tolerance in hyperaccumulator plants II Plant Cell. 2005. V.17. P.2089-2106

101. Iyer S, Caplan A. Products of proline catabolism can induce osmotically regulated genes in rice. Plant Physiol. 1998. V.116. P.203-211.

102. Jensen R. G., Adams P., Jones W. and Bohnert H. J. Water availability and Osmotic Adjustment in the Ice Plant // Plant Physiol. 1994. V.105. №1. P.21

103. Jeon J-S., Lee S., Jung K-H. et al. T-DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice //The Plant J. 2000. V.22. N 6. P.561-570

104. Jones P.A. Altering gene expression with 5-azacytidine II Cell. 1985. V.40. P.485-486

105. Kawashima C.G., Noji M., Nakamura M., Ogra Y., Suzuki K.T., Saito

106. K. Heavy metal tolerance of transgenic tobacco plants over-expressing cysteine synthase // Biotech.Letters. 2004. V.26. P. 153-157

107. Kim S., Takahashi M., Higuchi K., Tsunoda K., Nakanishi H. et al. Increased nicotianamine biosynthesis confers enhanced tolerance of high levels of metals, in particular nickel, to plants // Plant Cell Physiol., 2005; V.46. P.1809 -1818.

108. Kim D.-Y., Bovet L., Kushnir S. et al. AtATM3 is involved in heavy metal resistance in Arabidopsis // Plant Physiol. 2006. V.140. P.922-932

109. Kishor K.P.B. Effect of Salt Stress on Callus Cultures of Oryza sativa L. // Journal of Exp.Bot. 1988. V.39 (2 ). P. 235-240

110. Kishor K.P.B. Salt stress in cultured rice cells: effects of proline and abscisic acid // Plant Cell Environ.1989. V.12. P.629-633

111. Kishor K.P.B, Hong Z., Miao G. et al. Overexpression of A1-pirroline-5-carboxilate Synthetase increases proline production and confer osmotolerance in transgenic plants // Plant Physiol. 1995. V.108. P.1387-1394

112. Kishor K.P.B, Sangam S., Amrutha R. N. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implications in plant growth and abiotic stress tolerance // Current Science. 2005. V. 88. N. 3. P.424-436

113. Knipp G, Honermeier B. Effect of water stress on proline accumulation of genetically modified potatoes (Solanum tuberosum L.) generating fructans // J Plant Physiol. 2006. V.163(4). P.392-397

114. Kohl D. H., Kennelly E. J., Zhu Y., Schubert K. R., Shearer G. Proline accumulation, nitrogenase (C2H2 reducing) activity and activities of enzymes related to proline metabolism in drought-stressed soybean nodules // J. Exp. Bot. 1991. V.42. P.831-837

115. Koncz C., Martini N., Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z., Körbe H., Redei G.P., Schell J. High-frequency T-DNA-mediated gene tagging in plants // Proc Natl Acad Sei USA. 1989. V. 86. N 21. P.8467-8471

116. Kubota H., Sato K., Yamada T., Maitani T. Phytochelatin homologs induced in hairy roots of horseradish // Phytochemistry. 2000. V.53. P.239-245

117. Kumar. D. Salt tolerance in oilseed brassicas—present status and future prospects // Plant Breed. Abst. 1995. V. 65. P.1438-1447.

118. Kumpatla S. P., Teng W., Buchholz W. G., Hall T. C. Epigenetic Transcriptional Silen cing and 5-Azacytidine-Mediated Reactivation of a Complex Transgene in Rice // Plant Physiology. 1997. V.115. N 2. P.361-373

119. Kuy H.H., Cheol H.H. Salt tolerance enhanced by transformation of a P5CS Gene in Carrot//J. Plant Biotechnology. 2003. V.5 (3). P.149-153

120. Kuznetsov VI.V., Rakitin V.Yu., Borisova N.N., Rotschupkin B.V. Why does heat shock increase salt resistance in cotton plants? // Plant Physiol. Biochem. 1993. V. 31. №. 2. P. 181-188.

121. Labirte G.,Hellebust J.A. Pyrroline-5-carboxilate reductace in chlorella antitrophica and chlorella saccharophila in relation to osmoregulation // Plant.Physiol. 1989. V.91. № 93. P.917-923

122. LaRosa P. C., Rhodes D., Rhodes J. C., Bressan R. A., Csonka, L. . Elevated accumulation of proline in NaCI-adapted tobacco cells is not due to altered D1-pyrroline-5-carboxylate reductase // Plant Physiol. 1991. V.96. P.245-250.

123. LeDuc D.L., Tarun A.S., Montes-Bayon M. et al. Overexpression of selenocysteine methyltransferase in aradidopsis and Indian mustard increases selenium tolerance and accumulation // Plant Physiol. 2004. V.135. P.377-383

124. Lee S-B., Kwon H-B., Kwon S-J. et al. Accumulation of trehalose within transgenic chloroplasts confers drought tolerance // Mol.Breed. 2003. V.11. P.1-13

125. Lin C.C, Hsu Y.T., Kao C.H. The effect of NaCI on proline accumulation in rice leaves // Plant Growth Regul. 2002. V. 36. P.275-285

126. Liu J.R., Suh M.Ch., Choi D. Phytoremediation of cadmium contamination: Overexpression of metallotionein in transgenic tobacco plants // Bundesgesundheitsbl-Gesundheitsforsch-Gesundheitsschutz. 2000. V.43. P.126-130

127. Maggio A., Bressan R.A., Hasegawa P.M., Locy R.D. Moderately increased praline level doas not alter osmotic stress tolerance // Physiol. Plant. 1997. V.101. P.240-246

128. Mani S., B.Van de Cotte, M.Van Montagu et al. Altered level of prolinedehydrogenase cause hypersensitivity to proline and its analogs in Arabidopsis // Plant Physiol. 2002. V.128. P.73-83

129. Mattioni C., Lacerenza N. G., Troccoli A., De Leonardis A. M., Di Fonzo N. Water and salt stress-induced alterations in proline metabolism of Triticum durum seedlings // Physiol. Plant. 1997.101, 787-792.

130. Matzke M.A., Matzke A.J.M. Gene interactions and epigenetic variation in transgenic plants // Developm. Genetics. 1990. V.11. P.214-223

131. Matzke A.J.M., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes II Current Opinion in Plant Biology. 1998. V. 1 (2), P.142-148

132. Matzke M.A., Mette M.F., Matzke A.J.M. Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates // Plant Mol. Biol. 2000. 43: 401-415.

133. Morel J.B., Mourrain P., Beclin C., Vaucheret H. DNA methylation and chromatin structure affect transcriptional and post-transcriptional transgene silencing in Arabidopsis // Curr.Biol. 2000. V.10. N 24. P.1591-1594

134. Morris C.A., Nicolaus B., Sampson V. et al. Identification and characterization of a recombinant metallothionein protein from a marine alga, Fucus vesiculosus// Biochem. J. 1999. V.338. P.553-560

135. Murasige T., Skoog G.A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol.Plant. 1962. V.14. P.473-497

136. Noctor G., Arisi A.-C.M., Jouanin L. et al. Glutathione: biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in transformed plants // J. of Exp.Bot. 1998. V.49 (321). P.623-647

137. Nanjo T., Kobayashi M., Yoshiba Y. et al. Antisense suppression of proline degradation improves tolerance to freezing and salinity in Arabidopsis thaliana // FEBS Lett. 1999. V.461. P.205-210

138. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Sythase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans // Plant Cell. 1990. V.2. P.279-289

139. Nicolopoulos D., Manetas Y. Compatible solutes and in vitro stability of salsola-soda enzymes proline incompatibility // Phytochem. 1991-. V.30 (2). P.411-413

140. Noji M., Saito M., Nakamura M., Aono M., Saji H., Saito K. Cysteine synthase overexpression in tobacco confers tolerance to sulfur-containing environment pollutants // Plant Physiol. 2001. V.126. P.973-980

141. Nomura M., Ishitani M., Takabe T. et al. Synechococcus sp. PCC7942 transformed with Escherichia coli bet genes produces glycine betaine from choline and acquires resistance to salt stress // Plant Physiol. 1995. V.107. P. 703-708

142. Pilón M., Owen J.D., Garifullina G.F., Kurihara T., Mihara H., Esaki N., Pilon-Smits E.A.H. Enhanced selenium tolerance and accumulation in transgenic Arabidopsis expressing a mouse selenocysteine lyase // Plant Physiol. 2003. V.131. P.1250-1257

143. Pilon-Smits E.A.H., Zhu Y.L., Sears T., Terry N. Overexpression of glutation reductase in Brassica júncea: effects on cadmium accumulation and tolerance // Physiologia plantarum. 2000. V.110. P.455-460

144. Rajendrakumar C. S. V., Reddy B. V. D., Reddy A. R. Proline-protein interactions: Protection of structural and functional integrity of M4 lactate dehydrogenase//Biochem. Biophys. Res.Comm. 1994. V.201. P. 957-963.

145. Rains D. W., Rauser W.E. Plant tissue and protoplast culture: application to stress physiology and biochemistry. In: Plants Under Stresses. Biochemistry. Physiology and Ecology. Their Application to Plant Improvement, 1989. P. 181—196

146. Rauser W.E. Phytochelatins//Annu Rev Biochem. 1990. V.59. P.61-86

147. Riga P., Vartanian N. Sequential expression of adaptive mechanisms is responsible for drought resistance in tobacco // Austr J Plant Physiol .1999. V.26. P. 211-220

148. Ronde J. A., Spreeth, M. H. and Cress, W. A. Effect of antisense-1 pyrroline-5-carboxylate reductase transgenic soybean plants subjected to osmotic and drought stress // Plant Growth Regul., 2000, 32,13-26.

149. Ronde J.A., Laurie R.N., Caetano T., Greyling M.M., Kerepesi I. Comparative study between transgenic and non-transgenic soybean lines proved transgenic lines to be more drought tolerant // Euphytica. 2004. V.138. P.123-132

150. Roosens N. H., Bitar F. A., Loenders K., Angenon G. and Jacobs M.

151. Overexpression of ornthine-d-aminotransferase increases proline biosynthesis and confers osmotolerance in transgenic plants // Mol. Breed. 2002. V.9. P.73-80

152. Rudulier D., Strom A.R., Dandekar A.M. et al. Molecular biology of osmoregulation //Science. 1984. V.224. P.1064-1068

153. Rugh C.L. Genetically engineered phytoremediation: one man's trash is another man's transgene//Trends in Biotechnology. 2004. V.22. P.496-498

154. Ruiz O.N., Hussein H.S., Terry N., Daniel H. Phytoremediation of organomercurial compounds via chloroplast genetic engineering // Plant Physiol. 2003. V.132. P.1344-1352

155. Sallaud C., Gay C., Larmande P. etal. High throughput T-DNA insertion mutagenesis in rice: a first step towards in silica reverse genetics // Plant J. 2004. V.39. P.450-464

156. Salt D.E., Prince R.C., Pickering I.J. et Raskin I. Mechanisms of cadmium mobility and accumulation in Indian mustard // Plant physiol. 1995. V.109. P. 1427-1433

157. Sandalio L.M., Dalurzo H.C., Gomez M. et al. Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants // J.Exp.Bot.2001. V.52 (364). P.2115-2126

158. Saradhi P. P., Arora S., Prasad V. V. S. K. Proline Accumulation in plants exposed to UV radiation protects them against induced peroxidation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V.290. P.1-5

159. Sawahel, W. A. and Hassan, A. H. Generation of transgenic wheat plants producing high levels of the osmoprotectant proline // Biotechnol. Lett.2002. V.24. P.721-725. .

160. Sawahel W. Improved performance of transgenic glycinbetaine-accumulating rice plants under drought stress // Biologia Plantarum. 2003/4. V.47 (1). P.39-44

161. Serrano R., Gaxiola R. Microbial Models and Salt Stress Tolerance in Plants II Crit. Rev. Plant. Sci. 1994, V.I3, p.121-138

162. Shaw B.P., Rout N.P.Hg and Cd induced changes in proline content and activities of proline biosynthesizing enzymes in Phaseolus aureus and Triticum aestivum/l Biol.Plantarum. 2002. V.45. № 2. P.267-271.

163. Shen Y-G., Du B-X., Zhang W-K., Zhang J-S., Chen S-Y. AhCMO, regulated by stresses in Atriplex hortensis, can improve drought tolerance in transgenic tobacco//Theor.Appl.Genet. 2002. V.105. P.815-821

164. Sheveleva E., Chmara W., Bohnert H.J., Jensen R.G. Increased salt and drought tolerance be D-ononitol production in transgenic Nicotiana tabacum LI! Plant Physiol. 1997. V.115. P.1211-1219

165. Shi H., Lee B.H., Wu S.J., Zhu J.K. Overexpression of a plasma membrane Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in Arabidopsis thaliana//Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P.81-85

166. Shiraishi E., Inouhe M., Joho M., Tohoyama H. The cadmium-resistant gene, CAD2, which is a mutated putative copper-transporter gene (PCA1), controls the intracellular cadmium-level in the yeast S.cerevisiae // Curr.Genet. 2000. V.37. P.79-86

167. Schwab K.B., Gaff D.F. Influence of compatible solutes on soluble enzymes from desiccation-tolerant Sporobolus stapfianus and desiccation-sensitive Sporobolus pyramidalis IIJ Plant Physiol. 1990. V.137. P.208-215

168. Siripornadulsil S., Traina S., Verma D.P.S., Sayre R.T. Molecular mechanisms of praline-mediated tolerance to toxic heavy metals in transgenic microalgae // Plant Cell. 2002. V.14. P.2837-2847.

169. Smirnoff N., Cumbes Q. J. Hydroxyl Radical Scavenging Activity of Compatible Solutes // Phytochemistry. 1989. V.28. P. 1057-1060 Smirnoff,Cumbes, 1989;Saradhi et al, 1995; Serrano Gaxiola, 1994

170. Sokal R.R., Rohlf F.J. Introduction of test for good of fit // Biometry the principles and practice of statistics in biological research. W.H. Freeman and company. New York, 1995. p.686-697.

171. Song W.Y. Engeneering tolerance and accumulation of lead and cadmium in transgenic plants // Nat.Biotechnol. 2003. V.21. P.914-919

172. Song W-Y., Martinoia E., Lee J. et al. A novel family of cys-rich membrane proteins mediates cadmium resistance in Arabidopsis // Plant Physiol. 2004. V.135. P.1027-1039

173. Stam M., Bruin R., Kenter S., van der Hoorn R.A.L., van Blokland R., Mol J.N.M., Kooter J.M. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats II Plant J. 1997. V.12. P.63-82.

174. Stawarek S.J., Rains D.W. Mechanisms for salinity tolerance in plants // J. Research. 1983. V.57. №4. P.457-476

175. Stoutjesdijk P.A., Singh S.P., Liu Q. et al. HpRNA-mediated Targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing II Plant Physiol. 2002. V.129. pp.1723-1731

176. Strohm M., Jouanin L., Kunert K.J., Pruvost C., Polle A., Foyer C.H., Rennenberg H. Regulation of glutathione synthesis in leaves of transgenic poplar (Populus tremula x PI alba) overexpressing glutathione synthetase // Plant J. 1995. V.7. P.141-145

177. Su J., Wu R. Stress-inducible synthesis of proline in transgenic rice confers faster growth under stress conditions than that with constitutive synthesis // Plant Sci., 2004. V.166. P.941-948

178. Suh M.C., Choi D., Liu J.R. Cadmium resistance in transgenic tobacco plants expressing the Nicotiana glutinosa L. metallothionein-like gene // Mol.Cell. 1998. V.8 (6). P.678-684

179. Tang W., Charles T. M., Newton R.J. Overexpression of the Pepper Transcription Factor CaPF1 in Transgenic Virginia Pine (Pinus Virginiana Mill.) Confers Multiple Stress Tolerance and Enhances Organ Growt // Plant mol. Biol. 2005; V.59(4). P.603-617

180. Tarczynski M.C., Jensen R.G., Bohnert H.J. Stress protection of transgenic tobacco by production of the osmolyte mannitol // Science. 1993. V.259. P.508-510

181. Taylor C. B. Proline and Water Deficit: Ups, Down, Ins, and Outs // Plant Cell. 1996. V.8. P.1221-1224

182. Tong Y.-P., Kneer R., Zhu Y.-G. Vacuolar compartmentalization: a second-generation approach to engineering plants for phytoremediation // Trends in Plant Science. 2004. V.9(1). P.7-9

183. Tucker S.L., Thornton C.R., Tasker K. et al. A fungal metallothionein is required for pathogenicity of Magnaporthe grisea II Plant Cell. 2004. V.16. P.1575-1588

184. Vanjildorj E., Bae T.-W., Riu K-Z., Kim S-Y., Lee H-Y. Overexpression of Arabidopsis ABF3 gene enhances tolerance to drought and cold in transgenic lettuce (Lactuca sativa) //Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2005. V.83. P.41-50

185. Venenamp J.H. Regulation of cytosol acidity in plants under conditions of drought //Physiol.Plant. 1989. V.76. P.112-117

186. Verbruggen N., Hua X.-J., May M., Van Montagu M. Environmental and developmental signals modulate proline homeostasis: evidence for a negative transcriptional regulator// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V.93. P.8787-8791.

187. Wojcik M., Tukiendorf A. Response of wild type Arabidopsis thaliana to copper stress // Biologia plantarum. 2003. V.46(1). P.79-84

188. Wolffe A.P. Transcription control: repressed repeats express themselves // Curr. Biol. 1997.7. P.796-798.

189. Wyn Jones. R. G. Salt tolerance. In: Physiological Processes Limiting Plant Productivity. London . 1981 P. 271-292

190. Yamamoto Y., Hachia A., Matsumoto H. Oxidative damage to membranes by a combination of aluminium and iron in suspension-cultured tobacco cells // Plant Cell Physiology. 1997. V.38. P.1333-1339.

191. Yang A.F., Duan X.G., Gu X.F., Gao F., Zhang J.R. Efficient transformation of beet (Beta vulgaris L.) and production of plants with improved salt-tolerance // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2005. V.83. P.259-270

192. Yeo A. Molecular Biology of Salt Tolerance in the Context of Whole-Plant Physiology//J. Exp. Bot. 1998. V.49. P.915-929

193. Zhang C-S., Lu Q. and Verma D. P. S. Removal of feedback inhibition of D1-pyrroline-5-carboylate synthetase, a Afunctional enzyme catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants II J. Biol. Chem. 1995. V.270. V.20491-20496

194. Zhu B., Su J., Chang M. et al. Overexpression of a delta-1 -pirroline-5carboxylase gene and analysis of tolerance to water- and salt stress in transgenic rice II Plant Science. 1998. V.139. P.41-48

195. Zhu J.-K. Plant salt tolerance // Trends in plant science. 2001. V.8. N2. p.66-71.

196. Zhu J.-K. Salt and drought stress signal transduction in plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V.53. P.247-273

197. Wang J., Lewis M.E., Whallon J.H., Sink K.C. Chromosomal mapping of T-DNA inserts in transgenic Petunia by in situ hybridization //Transgenic Res. 1995. V.4. P.241-246.