Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ионов кальция в экспрессионной регуляции сукцинатдегидрогеназы при адаптивной реакции клеточного метаболизма у растений и животных

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ионов кальция в экспрессионной регуляции сукцинатдегидрогеназы при адаптивной реакции клеточного метаболизма у растений и животных"

На правах рукописи

005531ОЬ/

Ал-Саади Али С Махмуд

Роль ионов кальция экспрсссионной регуляции сукцинатдегидрогеназы при адаптивной реакции клеточного метаболизма у растений и животных

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 ИЮН 2013

Воронеж-2013

005531067

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна

доктор биологических наук, доцент. Воронежский государственный университет, профессор кафедры биофизики и биотехнологии

Фоменко Олег Юрьевич

кандидат биологических наук. Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН. заведующий лабораторией патобиохимии

Ведущая организация: Воронежский государственный

университет инженерных технологий

Защита состоится 4 июля 2013 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006. Воронеж. Университетская пл.. д.1, аудитория 59.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и сайте ФГБОУ ВПО «ВГУ»: www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан 3 июня 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович Маргарита Юрьевна

Актуальность проблемы. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.99.1) обеспечивает выполнение нескольких важнейших функций. Фермент обеспечивает протекание реакций цикла трикарбоновых кислот, который, как известно, поддерживает энергетический баланс клетки. Катализ ферментов окисления сукшшата до фумарата необходим не только для протекания никла Кребса, но и является важной реакцией одного из этапов глюкопеогенеза. СДГ является уникальным ферментом, который одновременно обеспечивает функционирование, как дыхательной цепи митохондрий, так и цикла трикарбоновых кислот. Регуляция сукцинатдегидрогеназной активности на экспрессионном уровне осуществляется под действием факторов транскрипции, кроме того важную роль в этом процессе играют различные вторичные мессенджеры, такие как Са2', G-белки, ц-АМФ. В последнее время значительный интерес исследователей был сосредоточен на важной роли универсального посредника двухвалентного иона кальция (Са2+) в механизмах передачи внутриклеточных сигналов, начиная с восприятия начального стимула и заканчивая окончательным адаптивным ответом. Многочисленные наблюдения свидетельствуют, что концентрация кальция, в основном цитозольная, изменяется в ответ на множество абиотических или биотических стрессов (Kudla et al. 2010; McAinsh and Pittman, 2009; Ng and McAinsh, 2003; Sanders et al„ 2002; Schroeder et al., 2001; Scrase-Field and Knight, 2003; White and Broadley, 2003). Большой интерес вызывает роль ионов кальция и других факторов, оказывающих действие на экспрессию генов сукцинатдегидрогеназной системы. Особое место в механизме влияния вторичного мессенджера кальция на ферментативную активность сукцинатдегидрогеназы занимает его внутриклеточный транспорт, в частности, перемещение из цитоплазматических и других фондов в ядро для создания действующей концентрации этого иона. Малоизученными остаются вопросы транедукции фитохромного сигнала, активирующего сукцинатдегидрогеназную активность в растениях, а также реализация стрессовых стимулов (пищевая депривация, аллоксановый диабет и др.), вызывающих активирование глюкопеогенеза и повышение активности сукцинатдегидрогеназы в животных клетках. В связи с этим необходимы исследования биохимических механизмов, осуществляющих экспрессионную регуляцию сукцинатдегидрогеназы в растениях и животных в стрессовых условиях. Отдельного внимания требует изучение роли внутриядерных транскрипционных факторов, индуцируемых изменением концентрации кальция и обуславливающих скорость образования энзима сукцинатдегидрогеназы.

Цель работы. Целью данной работы являлось исследование роли ионов кальция и транскрипционных факторов в регулировании активности сукцинатдегидрогеназы при адаптивной реакции метаболизма в клетках растений и животных.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи:

1. Получить с помощью многостадийной очистки электрофоретически гомогенные препараты сукцинатдегидрогеназы из листьев Zea mays L., Arabidopsis thaliana L. и печепи Raltiis rattus L. и исследовать с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 и денатурирующего электрофореза четвертичную структуру фермента.

2. Изучить возможное прямое действие различных концентраций двухвалентных катионов кальция на функциональную активность препаратов сукцинатдегидрогеназы из животных и растительных объектов.

3. Выяснить роль катионов кальция в биохимическом механизме транедукции фитохромного сигнала в листьях кукурузы и арабидопсиса.

4. Исследовать действие специфического ингибитора ионных каналов -рутения красного и хелатируюшего блокатора ЭГТА на изменение концентрации кальция в ядерной фракции растений под действием стрессовых факторов.

5. Установить возможную коррелятивную зависимость между величиной концентрации ионов кальция и экспрессией гена, кодирующего транскрипционный фактор PIF3 у растений.

6. Исследовать скорость функционирования сукцинатдегидрогеназы в печени крыс и ее изоферментный состав в норме и при пищевой депривации.

7. Изучить зависимость между изменением концентрации двухвалентных ионов кальция и экспрессией гена, кодирующего сукцинатдегидрогеназу, в печени крыс в норме и при пищевой депривации.

Научная новизна. Полученные данные углубляют знания о структурных характеристиках сукцинатдегидрогеназы из растений и животных. Показано, что катионы Са~+ являются посредником в реализации ответа на сигнал от стресс-индуцирующих факторов. Изменение содержания кальция в ядрах клеток растений Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L. вызывает активацию фитохром-индуцирующего фактора PIF3, осуществляющего контроль уровня экспрессии гена субъединицы А сукцинатдегидрогеназы. Установлено, что в условиях пищевой депривации изоферментный состав сукцинатдегидрогеназы постоянен и представлен одной формой. В транедукции внутриклеточного сигнала, вызванного

депривацией, принимают участие катионы кальция, активирующие транскрипцию гена зсИш посредством ядерных факторов транскрипции. Показано, что индукция активности СДГ в условиях пищевой депривации обусловлена увеличением скорости ее синтеза.

Практическая значимость. Получение электрофоретически гомогенных препаратов исследуемого энзима может использоваться в научно-исследовательских лабораториях, как вспомогательный фермент при каскадном способе определения других ферментов. Кроме того, препараты СДГ можно применять для аналитического определения концентрации янтарной кислоты в биологических образцах. Использование чистых препаратов фермента может найти применение в пищевой промышленности при исследовании качества продуктов.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, по физиологии растений, по спецкурсам по энзпмологии, биоэнергетике, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. На гомогенных препаратах сукцинатдегидрогеназы, очищенных из арабидопсиса, кукурузы и печени крыс, показано, что исследуемый энзим является гетеротетрамером, состоящим нз четырех различных по молекулярной массе субъединиц.

2. На высокоочищенных препаратах сукцинатдегидрогеназы было показано, что Са~+ в физиологических концентрациях не оказывали прямого регулирующего действия на ферментативную активность фермента.

3. В механизме трансдукции фитохромного сигнала в листьях кукурузы и арабидопсиса играет важную роль кальциевая сигнальная система. Внутриядерная реализация фитохромного сигнала обеспечивается транскрипционным фактором Р1РЗ, индукция экспрессии которого коррелирует с изменением концентрации катионов кальция.

4. Пищевая депривация вызывает усиление активности сукцинатдегидрогеназы в печени крыс. Установлено, что при этом наблюдается внутриклеточное перераспределение Са~+, обеспечивающее его накопление в ядрах клеток печени. В трансдукции внутриклеточного сигнала, вызванного депривацией, принимают участие катионы кальция, активирующие транскрипцию гена ьсНла.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 14-ой международной Путинской конференции молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2010); Международной научной конференции «Ломоносов-2011» (Москва, 2011); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); VI съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных технологий» (Нижний Новгород, 2011); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2011, 2012, 2013).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 11 публикациях - 8 статьях и 3 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на ..... страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (251 источник). Иллюстрационный материал включает 6 таблиц и 25 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В качестве объекта исследования использовали растения Arabkbpsis thaliana L. и Zea mays L., выращенные гидропонным методом при 25°С, 16-часовом световом дне с интенсивностью света 25 Вт/м2. В работе использовали семена трех линий растений Arabidopsis thaliana L.: растения дикого типа (Со1-0), мутанты по гену фитохрома A (phya-201) и мутанты по гену фитохрома В (phvb-1), полученные из института Макса-Планка (Гольм, Германия).

Кроме того, в качестве объекта исследования использовали самцов беспородных лабораторных крыс (Rattus rattus L.) в возрасте трех месяцев и массой 180-200г, которые выращивались в виварии при нормальном питании.

Создание экспериментальных условий. Для облучения растений красным и дальним красным светом использовали светодиоды с областью испускания 640680 им (КИПД40М40-К-П6, Россия) и 710-750 им (ЗЛ127А-5, Россия), соответственно. Пробы для анализа отбирались через 3 часа с момента облучения.

Животных помещали в условия пищевой депривации при свободном доступе к воде па срок до 7 суток. Для получения печени опытных животных предварительно усыпляли этиловым эфиром и производили декапитацию.

Определение активности сукнинагдегидрогеназы. Активность СДГ определяли в растениях Arabidopsis thaUana L. и Zea mays L. методом, основанным на применении искусственных акцепторов электронов с соответствующим редокс-потенцналом (Епринцев, Попов, 2010).

Очистка сукципатдегидрогепазы из растительных и животных тканей. Очистку фермента осуществляли в несколько стадий при температуре 0-4°С. Для получения высокоочшненных препаратов СДГ из объектов исследования схема очистки включала следующие этапы: 1. Гомогенизация. 2. Фракционирование неразрушенных тканей. 3. Фракционирование сульфатом аммония. 4. Гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-25. 5. Ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Определение молекулярной массы нативного Фермента и субьедннин СДГ. Для исследования четвертичной структуры и определения молекулярной массы нативной СДГ использовали гель-хроматографию через сефадекс G-200 (Детерман, 1970). Определение молекулярной массы СДГ осуществляли методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (Остерман, 1983).

Аналитический электрофорез. Для изучения электрофоретической подвижности и выявления множественных молекулярных форм СДГ в различных бактериальных объектах проводили разделение с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (Davis, Ornstein, 1959).

Определение_гомогенности_препаратов_изоформ

сукиинатдегидрогеиазы. Для определения гомогенности очищенных препаратов СДГ вносили 5-7 мкг белка исследуемого раствора. Идентификацию белка проводили нитратом серебра.

Выделение ядер из растительных и животных тканей. Выделение фракции ядер из исследуемого материала производилось по методике, предложенной Ли и Лин (Lee, Lin, 2005).

Определение концентрации свободных катионов Са2+. Измерение свободного кальция проводилось спектрофотометрическнм методом по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина (Меньшиков, 1987).

Влияние ингибиторов. Действие ингибиторов рутения красного и ЭГТА проводили на растениях A. thaliana L. и Zea mays L. Перед началом эксперимента

растения предварительно выдерживали в 25 мМ растворе рутения красного или 5 мМ растворе ЭГТА в течение 1 часа.

Определение перекрестного загрязнения фракций. Перекрестное загрязнение определяли по активности цитоплазматических маркерных ферментов алкогольдегидрогеназы (Pathuri et al., 2011) и лактатдегидрогеназы (Yang et al, 2010).

Определение активности маркерных ферментов глноксилатного цикла.

Активность изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1) определяли спектрофотометрически при К = 324 нм. Активность малатсинтазы (КФ 4.1.3.2) измеряли при к = 412 им (Епршщев и др. 2005).

Выделение РНК. Суммарную РНК из листьев кукурузы выделяли методом гуанидиитиоцианат-фенол-хлороформной экстракции. В качестве осадителя использовался LiCl (Chomczynski, Sacchi, 1987).

Обратная транскрипция. Получение кДНК на основе суммарной фракции клеточной РНК осуществлялось с использованием фермента M-MuLV обратной транскриптазы (СибЭнзим, Россия) для синтеза первой цепи кДНК согласно инструкции производителя.

Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы. Нуклеиновые кислоты разделяли в 1% геле агарозы, содержащем 0,1% интеркалируюшего красителя - бромистого этидия. Электрофорез проводился в горизонтальной электрофоретической камере в буфере IxTAE (pH 8.5) при напряжении 70 В в течение 50 минут.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I. Нормализатором являлся ген фактора элонгации ef-lA (Nicot et al., 2005). В качестве праймеров использовали следующие нуклеотидные последовательности к гену scihI-2 арабидопснса: прямой - 5'-CAAACGGGTCACTTCCAACT-3'; обратный - 5'-CCAAAACTGTCCCACGTCTT-3'. Последовательности праймеров для гена sdhl-2 кукурузы: прямой - 5'-GAGTTTGTTCAGTTTCATCC-3'; обратный - 5'-GTGCATTATAATATGGGTGG-3'. Последовательности праймеров для гена sdha крыс: прямой - 5'-TGGCTTTCACTTCTCTGTTGG-3'; обратный - 5'-ATCTCCAGTTGTCCTCTTCCA-3 ' Параметры амплификации были следующие: предварительная денатурация - 95°С 5 минут, цикл - 95°С - 30 сек., 60"С - 30 сек., 72"С - 30 сек. (детекция), финальная элонгация - 72 С - 10 минут. В качестве

отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции.

Для определения скорости экспрессии гена /л/3 использовали следующие нуклеотидные последовательности: прямой - 5'-ССТТАСТАТСТСССАСССССС-3'; обратный - 5'-ТССТААСАААТАААСААТАСАТС-3\ Параметры амплификации были следующие: предварительная денатурация - 95°С 5 минут, цикл - 95 С - 30 сек., 57°С - 40 сек., 72°С - 30 сек. (детекция), финальная элонгация - 72°С - 10 минут. В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции. Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2~ДЛС1-метода (Ыуак, ЗсЬштйеп, 2001).

Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в трехкратной биологической и аналитической повторпостях. В таблицах и на рисунках приводятся данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее арифметическое из трех определений. Для определения достоверности результатов исследовании применяли метод вариационной статистики. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стыодента (Лакин, 1990).

ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Использование пятистадийной очистки позволило получить высокоочишенный препарат фермента из разных растений и печенн крыс (табл. 1). Был получен препарат СДГ с удельной активностью 4,6 Е/мг белка для кукурузы и 4,02 Е/мг белка для арабидопсиса, при этом степень очистки составляла 96,5 раза, а выход 27% (для листьев кукурузы) и 54 раза и выход 31% (для арабидопсиса).

Таблица 1.

Основные параметры высокоочшцеиных препаратов СДГ _из разных объектов (п=3, р<0,05)__

Объект Удельная активность, Е/мг белка Степень очистки Выход, %

Кукуруза Zea mays L. 4,6 27 96,5

Арабидопсис Arabidopsis thaliaria L. 4,02 31 54

Печень крыс Rallus rattus L. 6,27 89,5 18

Применение данной схемы очистки позволило получить препарат СДГ из печени крыс с удельной активностью 0,8 Е/мг белка. При этом выход составлял 26%, а степень очистки 11.4 раза.

Наибольший эффект очистки исследуемого энзима из разных объектов достигался после применения ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Эта стадия была конечной в схеме очистки и позволила получить высокоочищенный препарат исследуемого фермента.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГОМОГЕННОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Получение препаратов СДГ в высокоочищенном состоянии позволяет предположить их гомогенность по величине удельной активности. В нашей работе гомогенность полученных препаратов исследуемого энзима определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

1 2 3

III

Рис.1. Электрофореграммы СДГ после очистки из листьев кукурузы (1), арабидопсиса (2) и печени крыс (3). А - универсальное окрашивание AgNOí. В - специфическое проявление СДГ. Р - белок. Г - фронт красителя.

В качестве универсального красителя использовали нитрат серебра, обладающий высокой чувствительностью.

Результаты электрофоретического анализа высокоочищенных препаратов сукцинатдегидрогеназы из растительной и животной клеток свидетельствуют, что

во всех образцах обнаруживается только одна белковая полоса (рис. 1) с Яг = 0,45, 0,34 и 0,19, соответственно из кукурузы, арабидопсиса и печени крыс.

Таким образом, можно заключить, что высокоочишенные препараты, выделенные из кукурузы, арабидопсиса и печени крыс, являются электрофоретически гомогенными.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ

Анализ полученных значений молекулярной массы нативной сукпинатдегидрогеназы и ее субъединиц приведен в таблице 2. Сравнение данного показателя исследуемого фермента из разных объектов позволяет сделать вывод, что его молекула является гетерополимером.

Таблица 2.

Величина молекулярной массы нативной молекулы сукцинатдегидрогеназы и

субъединиц из растений и печени крыс (п=3, р<0,05)

Показатель 2еа тауч Ь. АгаЫс1ор51$ ¡ИаНапа Ь. ЯаНиБ пшп.ч 1_.

Молекулярная масса нативной молекулы 131 145 133

Молекулярная масса субъединиц А 72,4 68,6 75,4

В 32,5 34,7 27,3

С 15,6 28,3 19,5

О 12,5 15,1 12,3

Количество субъединиц 4 4 4

Расчеты свидетельствуют, что все выделенные препараты сукцинатдегидрогеназы состоят из четырех субъединиц, молекулярная масса которых меняется от 75,4 до 12,3 кДа. Можно заметить, что значение молекулярной массы нативного фермента у исследуемых объектов колеблется незначительно. Так, для кукурузы оно составляет 131, арабидопсиса - 145, печени крысы - 133 кДа.

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ЖИВОТНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ИОНАМИ КАЛЬЦИЯ

Влияние разных количеств ионов кальция на активность сукцинатдегидрогеназы, очищенной из печени крыс, приведены на рисунке 2.

Получение в электрофоретически-гомогенном состоянии препаратов

сукцинатдегидрогеназы из растительных и животных объектов позволило

исследовать действие ионов кальция в физиологических концентрациях на

функционирование этой ферментной системы. Физиологические концентрации

кальция не оказывали сколь-нибудь значимого воздействия на функциональную

активность фермента из разных объектов. При значительных количествах,

превышающих 100 мкМ, наблюдали при длительных экспозициях незначительную

инактивацию функционирования фермента. Данная модификация молекулы энзима

могла объясняться сильным воздействием двухвалентного кальция, в частности,

связыванием его с отрицательно заряженными радикалами, что могло приводить к

изменению конформации сукцинатдегидрогеназы (Ezawa, Ogata, 1977).

Е'мл 0.15 -■

12345 12345 12345 1234

I II III IV

Рис. 2. Влияние ионов двухвалентного кальция па активность препарата сукцинатдегидрогеназы. выделенного из печени крыс. I - 5 мин инкубации;

II - 15 мин инкубации; III - 30 мин; IV - 60 мин. I - без добавления ионов кальция; 2-0,1 мМ ионов кальция; 3 - 1 мМ ионов кальция; 4-10 мМ ионов кальция; 5-50 мМ ионов кальция.

Следовательно, можно предполагать, что двухвалентные ионы кальция могут осуществлять контроль за сукцинатдегидрогеназной активностью исключительно как вторичный мессенджер.

РОЛЬ КАТИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ТРАНСДУКЦИИ ФИГОХРОМНОГО СИГНАЛА В ЛИСТЬЯХ РАСТЕНИЙ

Проведенный анализ содержания катионов кальция в ядрах листьев арабидопсиса показал зависимость данного показателя от состояния фитохромной системы. После облучения растений красным светом уровень Са~ в ядрах увеличился в 2.1 раза по сравнению с растениями, инкубируемыми в темноте (рис. 3). Однако, инсоляция растений А./ИаНапа в условиях дальнего красного и последовательного действия красного и дальнего красного света не приводила к изменению содержания катионов кальция относительно варианта «темнота».

£ свет темнота КС ДКС КС+ДКС

Рис. 3. Зависимость содержания катионов кальция в ядрах в норме (белые столбцы), в присутствии рутения красного (серые столбцы) и ЭГ'ТА (черные столбцы) при облучении растений арабидопсиса светом разной длины волны.

Показано, что в условиях облучения растений красным светом в присутствии рутения красного не наблюдалось изменения его содержания относительно варианта «темнота». Аналогичные данные получены и для растений, инкубированных в присутствии дальнего красного света и при последовательном действии красного и дальнего красного света. Сходная картина содержания Ca" в клетках A.thaliana наблюдалась при инкубации растений с ЭГТА.

Для выяснения участия фактора PI КЗ в трансдукции светового сигнала, проанализирована скорость экспрессии соответствующего гена piß в условиях разного светового режима. Результаты исследования показали, что интенсивность транскрипции гена piß имеет определенную зависимость от состояния фитохромной системы (рис. 4).

1,2

Темнота

ДКС КС+ДКС

Рис. 4. Относительный уровень транскрипции фактора р!/3 в листьях А./ИаНапа в норме (белые столбцы), в присутствии рутения красного (серые столбцы) и ЭГТА (черные столбцы) при разных световых режимах.

1,4 1

Темнота

ДКС КС+ДКС

Рис. 5. Относительный уровень транскрипции гена р//3 в А.1ИаИапа дикого типа (белые столбцы), мутантного по гену фитохрома А (серые столбцы) и мутантном по гену фитохрому В (черные столбцы) в условиях разного светового режима.

Под действием КС наблюдается наиболее высокая скорость экспрессии р//3, также как и в растениях, экспонируемых на свету. Однако, облучение зеленых проростков арабидопсиса дикого типа КС и последовательное облучение КС и

ДКС позволило установить, что скорость транскрипции исследуемого гена в данных условиях снижается на 25-30% (рис. 4), что коррелирует с изменением содержания катионов кальция в условиях разного светового режима.

Для установления роли каждого компонента фитохромной системы в регуляции экспрессии гена piß проведен анализ скорости транскрипции исследуемого гена в растениях A.thalicma, нокаутных по генам phya и phyb. Уровень экспрессии гена piß в растениях мутантных по фитохрому А отличался от дикого типа, при этом ответной реакции при облучении растений красным или дальним красным светом не наблюдалось. В то же время при облучении мутантов по фитохрому В мы получили обратный результат (рис. 5).

Таким образом, в ходе исследования выяснено, что перераспределение внутриклеточного кальция зависит от состояния фитохромной системы. Кальций, выполняя функцию вторичного мессенджера фитохромного сигнала, активирует внутриядерные факторы трапскрпппии посредством различных киназ (Poovaiah, Reddy, 1993). Посредником трапедукшш фитохромного сигнала в ядре является фактор PIF3, фосфорнлированпая форма которого связывается с G-участком промотора гепа-мшиспи и регулирует его экспрессию.

Аналогичные исследования по изучению роли катионов кальция как транедуктора фитохромного сигнала в растительной клетке были проведены на растениях кукурузы. Показано, что увеличение содержания кальция в ядре, обусловленное действием активной формы фнтохрома, вызывает индукцию транскрипции фактора PIF3 путем активации экспрессии renapiß.

РОЛЬ КАТИОНОВ КАЛЬЦИЯ ВТРАНСДУКЦИИ СИГНАЛА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ II ПРИ ПИЩЕВОЙ ДЕПРИВАЦИИ

Пишевая депривация осуществлялась в течение шести дней. В этих условиях в печени крыс индуцируются ферменты глиоксилатного цикла, о чем свидетельствуют данные определения активности изоцитратлиазы и малатсинтазы (табл. 3.). Функционирование сукщшатдсгидрогеназы в опытном варианте было более интенсивным. При этом ее активность увеличивалась примерно в 1,5 раза, что свидетельствует о дополнительном синтезе энзима, осуществляемом с помощью экспрессии соответствующего гена.

Таблица 3.

Активность маркерных ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс в норме и в условиях пищевой депривации (п=3, р<0,05)

Фермент Норма Пищевая депривация

Е/г сырой массы Е/мг белка Е/г сырой массы Е/мг белка

Изоцитратлназа 0 0 3,051±0,027 0,128±0,008

Малатсинтаза 0 0 1,950±0,119 0,071±0,001

Сукшшатдегпдрогеназа 0,044±0,005 0,026±0,002 0,069±0,003 0,048±0,005

СОДЕРЖАНИЕ СВОБОДНОГО КАЛЬЦИЯ В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ПИЩЕВОЙ ДЕПРИВАЦИИ

Для выяснения возможной кальций-зависимой регуляции экспрессии гена сукцинатдегидрогеназы в клетках печени крыс при пищевой депривации нами проведено исследование внутриклеточного перераспределения свободных катионов кальция между цитоплазмой н ядром. Показано, что при пищевой депривации крыс в течение 5 суток происходит изменение содержания кальция в ядерной фракции клеток печени. В опытном варианте концентрация свободного кальция составила 51 мкМ/г сырой массы, что в 1,7 раза больше данного показателя в контрольном образце (рис. 6а).

Увеличение концентрации свободного кальция в ядре приводит к активации транскрипционных факторов, вероятно фактора CREB, обеспечивающих регуляцию экспрессии генов-мишеней. Ранее сходный механизм регуляции экспрессии генов путем изменения его концентрации в животной клетке был показан для ряда генов путем CREB-опосредовапной транскрипции (Zhang et al., 2009).

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА SDH Л СУБЪЕДИНИЦЫ А СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В НОРМЕ И ПРИ ПИЩЕВОЙ ДЕПРИВАЦИИ

Для оценки количественных показателей интенсивности работы гена субъединицы А сукцинатдегидрогеназы применяли метод количественной ПЦР в реальном времени.

Расчетные значения относительной экспрессии гена $с/Иа сукцинатдегидрогеназы показали различие в контрольных и экспериментальных образцах. Результаты исследования приведены на рисунке 66. из которого видно, что в печени крыс при пищевой депривации концентрация транскрипта исследуемого гена вьине такового показателя у контрольных в 1,27 раза, а) б)

2- 60 п л

| 501 40-

I 1 30

^ ГС " 5 2»

о. 0,8 -

Рис. 6. Содержание свободных катионов кальция (а) и относительный уровень транскрипции гена ,1с1Иа в печени крыс в норме (К) при пищевой депривации (О).

Вероятно, в регуляции функционирования сукцинатдегидрогеназы в клетках печени крыс важную роль играет перераспределение свободного кальция между цитоплазмой и ядром. Изменение скорости функционирования сукцинатдегидрогеназы. вызванное пищевой депривацией, обусловлено изменением в скорости экспрессии гена субъединицы А исследуемого фермента. В экспериментальных условиях наблюдается интенсификация транскрипции гена л'с//7я, что проявляется в увеличении каталитической активности СДГ.

Увеличение концентрации катионов кальция в ядерной фракции приводит к активации транскрипционных факторов, таких как СЯЕВ и др., которые в свою очередь, взаимодействуя с промоторами генов-мишеней, регулируют уровень их экспрессии (НагсН^Ьат е1 а!., 2001).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для получения электрофоретически гомогенных ферментных препаратов сукцинатдегидрогеназы из листьев кукурузы, арабидопсиса и печени крыс использовали пятистадийную очистку. Практически все этапы очистки были аналогичны схемам, используемым для получения высокоочищенных препаратов ферментов ЦТК и глиоксилатного пути (Нпринцев и др., 2007). Высокоочищенные препараты сукцинатдегидрогеназы характеризовались высокой удельной

активностью, которая составляла: для листьев кукурузы 4,6 Е/мг белка, для листьев арабидопсиса - 4,02 Е/мг белка и для печени крыс - 6,27 Е/мг белка.

С помощью методов гель-хроматографии на сефадексе G-200 и денатурирующего электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия установлено, что исследуемый фермент является гетеротетрамером. Наиболее распространенными регуляторами метаболических и особенно экспрессионных процессов у эукариот являются двухвалентные ноны кальция. Огромное количество физиологических и биохимических процессов в растительной и животной клетке зависит от концентрации этих ионов.

В нашей работе выяснено, что кальций в физиологических концентрациях не оказывает прямого действия на функционирование сукцинатдегндрогеназы из разных организмов.

Механизм фитохром-зависимой регуляции клеточного метаболизма может осуществляться с помощью специализированных сигнальных путей, регулирующих экспрессию генов. Известно, что генетический аппарат клетки регулируется изменением содержания цАМФ, катионов кальция или их совместным действием. Перераспределение Са"^ может привести к активации или подавлению активности Са"'-зависимых белков (например, протеинкиназы и фосфатазы), а также он может подавлять или усиливать присоединение транскрипционных факторов, и таким образом регулировать транскрипцию генов-мишеней (Hermann et al., 1998).

Полученные в работе данные по содержанию катионов кальция в ядрах листьев арабидопсиса показывают зависимость данного показателя от состояния фитохромноп системы. Посредником фитохромного сигнала в ядре может выступать фактор транскрипции PIF, контролирующий уровень экспрессии генов-мишеней, в частности, sdhl-2 (Popov et al., 2010). Выяснению участия P1F3 в регуляции экспрессии гена sdhl-2 способствует анализ скорости, экспрессии соответствующего гена pij3 в условиях разного светового режима. Выявлено, что интенсивность транскрипции гена pif3 имеет определенную зависимость от состояния фитохромной системы. Изменение концентрации кальция и скорости экспрессии гена pij3 указывает на то, что именно кальций является внутриклеточным интермедиатом, обеспечивающим перенос фитохромного сигнала к геному клетки. Проникая в ядро, катионы кальция активируют транскрипцию гена pif3, регулирующего экспрессию ряда генов, в том числе гена sdhl-2 (Епринцев и др., 2012). После обработки растений A.lhalhma рутением

красным и ЭГТА интенсивность экспрессии гена ¡п(3 во всех вариантах светового режима оставалась на уровне контрольного варианта (темнота).

Таким образом, на основании результатов исследования можно предположить гипотетическую схему регуляции функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений посредством фитохромной системы (рис. 8). Активация фитохрома красным светом приводит к запуску каскадного механизма транедукции сигнала в растительной клетке, где в качестве вторичного мессенджера выступают катионы кальция. Активная форма фитохрома А передает свой сигнал в ядро путем внутриклеточного перераспределения свободного кальция между цитоплазмой н ядром. Увеличение содержания катионов кальция в ядре приводит к активации внутриклеточных протеинкиназ и фосфатаз, осуществляющих фосфорилирование факторов транскрипции. Одним из факторов, регулирующих уровень экспрессии ряда генов, может выступать фитохром-иидуцирующий фактор РШЗ. Фосфорилированная форма Р1БЗ присоединяется к специфическому сайту в составе промотора гена бс1111-2, блокируя свободное присоединение к последнему РНК-полпмеразы, что проявляется в уменьшении скорости транскрипции исследуемого гена. Блокирование работы гена приводит к снижению количества его матричной РНК в клетке, что четко коррелирует с уменьшением активности данного фермента (рис. 8).

Гипотетическая схема регуляции экспрессии гена «//м субъединицы А сукцинатдегидрогеназы при участии Са2+ в качестве вторичного внутриклеточного мессенджера сигнала представлена на рис 9. В условиях нормы в клетках печени крыс наблюдается определенный уровень экспрессии исследуемого гена, что необходимо для нормального функционирования ЦТК. В этих условиях роль цикла Кребса заключается в обеспечении клеток энергетическими эквивалентами в ходе окислительных процессов.

Однако, в стрессовых условиях (пищевая депривация) клетки организма испытывают нехватку субстратов для окислительного метаболизма. В этих условиях происходит индукция глюконеогеиетических процессов. Данный факт, вероятно, приводит к изменению гормонального статуса, что затрагивает весь организм, в том числе и печень (Епринцев и др., 2005). Одним из механизмов внутриклеточной транедукцин гормонального сигнала может выступать кальциевая система сигнализации. В условиях пищевой депривации наблюдается перераспределение внутриклеточного Са"+, что приводит к его накоплению в ядерной фракции.

мгпохондрия

митоконцрш

Рис. 8. Гипотетическая схема механизма трансдукции фитохромиого сигнала в растениях с помощью ионов . Са2^ для регуляции экспрессии гена сукцинатдегидрогеназы.

Норма

Пищевая Оепрнтиня

СУ--

>4 0.1» С'лМ __

I протеинывшл ^

СКЕВ*|

сдг

МТ!Т"":'|НЛ||[Ы

Рис. 9. Гипотетическая схема передачи сигнала стресс-фактора (пищевая депривация) в печени крыс для регуляции экспрессии гена

сукцинатдегидрогеназы.

ВЫВОДЫ

1. С помощью многостадийной схемы очистки получены электрофоретически гомогенные препараты сукцинатдегидрогеназы из разных объектов. Величина удельной активности очищенных препаратов ферментов составляет 4.02 Е/мг белка, выход ферментативной активности равняется 31%, степень очистки 54 раза для арабидопсиса; значение удельной активности 4,6 Е/мг белка, выход ферментативной активности 27%, степень очистки 96,5 раза для листьев кукурузы; для печени крыс удельная активность составляет 6,27 Е/мг белка, выход ферментативной активности равняется 18%, степень очистки 89,5 раза.

2. Установлено, что сукцинатдегидрогеназа, выделенная из разных организмов, является олигомерным белком, состоящим из четырех разных по значению молекулярной массы субъединиц. Величина молекулярной массы пативпого фермента составляет 131 кДа для кукурузы, 145 кДа - для арабидопсиса и 133 кДа - для печени крыс. Комплекс II состоит из четырех классических субъединиц СДГ с разной молекулярной массой. Величина этого показателя для субъединицы А колеблется от 68,6 до 75 кДа; для субъединицы В - от 27,3 до 32,5 кДа; для субъедшшцы С - от 15,6 до 28,3 кДа; для субъединицы D - от 12,5 до 19,5 кДа. Следовательно, • сукцинатдегидрогеназа является гетерополимером.

3. Выявлено на электрофоретически гомогенных препаратах сукцинатдегидрогеназы из растений и животных, что двухвалентные катионы кальция в физиологических концентрациях не оказывали прямого регулирующего действия па ферментативную активность. При значительных количествах (превышающих 100 мкМ) наблюдалась незначительная инактивация функционирования фермента.

4. Установлено, что трапедукция фитохромного сигнала в листьях Zea mays L. и Avahidopsis thaliana L. осуществляется посредством кальциевых сигнальных систем. Активная форма фнтохрома А вызывает увеличение концентрации ионов двухвалентного кальция в ядерной фракции почти в 2 раза.

5. Выявлена прямая корреляция между изменением содержания катионов кальция в ядрах клеток исследуемых растений и гена piß. Фактор P1F3,

вероятно, обеспечивает внутриядерную реализацию фитохромного сигнала, выступая в качестве транскрипционного фактора.

6. Применение специфических ингибиторов RR и ЭГТА позволило установить, что изменение концентрации свободных катионов кальция в ядрах растений осуществляется путем их внутриклеточного перераспределения. Основными транспортными системами выступают ионные каналы и Са"+-АТФазы.

7. Стресс-фактор (пищевая депривация) индуцировал сукцинатдегидрогеназную активность в печени крыс. Увеличение активности СДГ обусловлено ее синтезом de novo и не связано с изменением изоферментного состава фермента.

8. В условиях пищевой депривации наблюдается внутриклеточное перераспределение катионов кхтьция, обуславливающее его накопление в ядрах клеток печени крыс. Следовательно, кальциевые сигналы индуцируют включение адаптивных механизмов функционирования животных клеток в стрессовых условиях.

9. Увеличение содержания свободного кальция в ядрах клеток печени крыс коррелирует с возрастанием скорости транскрипции гена sdha, что может достигаться с помощью транскрипционного фактора CREB или другими активаторами.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Экспрессия генов субъедншшы А сукшшатдегидрогеназы в семенах и зеленых листьях Arabidopsis thaliana L. / Али С. Махмуд [и др.] // Симбиоз Россия 2011: материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов (Воронеж, 23-27 мая 2011 г.: в 2 т., 1 т.-С. 38-41).

2. Механизм регуляции экспрессии растительной сукшшатдегидрогеназы фитохромной системой / Али С. Махмуд [и др.] // Рецепторы и внутриклеточная сигнализация: междунар. конф., 24-26 мая 2011 г., Пущино: сб. ст. — М„ 2011 .— С. 826-830.

3. Влияние метилирования на экспрессию генов субъединицы В сукцинатдегидрогеназы / А.Т. Епрнпцев [и др.] // VI съезд общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная

основа экологии и инновационных технологий». 4-10 июля 2011г.. Нижний Новгород. - С. 239 - 240.

4. Роль катионов кальция в механизме фитохром-зависимой регуляции экспрессии гена sdhl-2 и активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы / А.Т. Епринцев [и др.] // Биологические мембраны. - 2012. - Т 29. №3.-С. 165-168.

5. Роль метилирования промоторов в регуляции генов сукцинатдегидрогеназы в проростках кукурузы / А.Т. Епринцев [и др.] // Физиология растений. - 2012. -Т. 59. № 3. - С. 332-340.

6. Махмуд Али С. Физико-химические и каталитические свойства сукцинатдегидрогеназы из печени крыс Rattus rattus L. / Али С. Махмуд. А.Т. Епринцев // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2012. - № 2. - С. 144-148.

7. Дифференциальная экспрессия генов субьединнцы А сукцинатдегидрогеназы в колеоптилях проростков кукурузы / Н.В. Селиванова [и др.] // Организация и регуляция физиолого-бнохимических процессов. - Воронеж. - 2011. - С. 167-171.

8. Экспрессия генов каталитического димера сукцинатдегидрогеназы в щитках и зеленых листьях кукурузы / Д.Н. Федорин [и др.] // Организация и регуляция физиолого-бнохимических процессов. - Воронеж. - 201 1. - С. 190197.

9. Особенности структуры промоторных областей генов субъединицы А сукцинатдегидрогеназы кукурузы / Али С. Махмуд [и др.] // Организация и регуляция физиолого-бнохимических процессов. - Воронеж. - 2012. - С. 184188.

10. Зависимость экспрессии гена sdha от содержания двухвалентных ионов кальция в ядерной фракции клеток печени крыс в условиях пищевой депривапии / Али С. Махмуд [и др.] // Организация и регуляция физиолого-бнохимических процессов. - Воронеж. - 2013. - С. 118-128.

11. Использование рутения красного и ЭГТА при изучении внутриклеточного распределения кальция в листьях кукурузы / Али С. Махмуд, [и др.] // Организация и регуляция физиолого-бнохимических процессов. - Воронеж. — 2013. - С. 129-137.

Работы №4, №5, №6 опубликованы в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Подписано в печать 29.05.13. Формат 60 84 '/к,. Усл. печ. л. Тираж 100 жз. Заказ 500.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Ииательско-полнграфнческого центра Воронежскою государственного университета. 394000. Воронеж, ул. II)шкинекая. 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ал-Саади Али С Махмуд, Воронеж

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

(ФГБОУ ВПО«ВГУ»)

Роль ионов кальция в экспрессиоиной регуляции сукцинатдегидрогеназы при адаптивной реакции клеточного метаболизма

На правах рукописи

Ал-Саади Али С Махмуд

у растении и животных

О

ю с>

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.04 - Биохимия

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Епринцев А.Т.

О

СМ 00

3 °

ВОРОНЕЖ 2013 г.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ТЕРМИНОВ

АДФ - аденозиндифосфат;

АЛГ - алкогольдегидрогеназа;

АТФ - аденозинтрифосфат;

ГЦ - глиоксилатный цикл;

ДКС - дальний красный свет;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДХФИФ - дихлорфенол индофенол;

ИЦЛ - изоцитратлиаза;

КС - красный свет;

ЛДГ - лактатдегидрогеназа;

МС - малатсинтаза;

НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид;

ОА - оксалоацетат;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СДГ - сукцинатдегидрогеназа;

СДГА - флавопротеин;

СДГВ - железо-серный белок;

СДГС и СДГО - субъединицы С и О сукцинатдегидрогеназы, соответственно;

СУР - сукцинат-убихинон оксидоредуктаза;

ФАД - флавинадениннуклеотид;

Фдк - фитохром дальний красный;

Фк - фитохром красный;

ФМН - флавинмононуклеотид;

ФМС - феназинметасульфат;

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот;

ЭГТА - этиленгуанидинтетраацетат;

ЭТЦ - электронтранспортная цепь;

вТР - гуанозинтрифосфат.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................11

1.1. Функционирование сукцинатдегидрогеназы в растительной

и животной клетках............................................................11

1.2. Регуляция функционирования ферментов окислительного метаболизма.....................................................................15

1.2.1. Функционирования ферментов дыхания и фотодыхания.............. 17

1.2.2. Особенности организации митохондрий в фотосинтезирующих тканях.............................................................................20

1.3. Биохимические и молекулярные механизмы регуляции клеточного метаболизма......................................................24

1.3.1. Фитохром-опосредованная регуляция первичного метаболизма.....24

1.3.1.1. Фитохром-зависимое световое ингибирование сукцинатдегидрогеназы.....................................................30

1.3.1.2. Градиент красного и дальнего красного света в листьях.............32

1.3.2. Регуляторная функция внутриклеточного кальция.....................33

1.3.2.1. Кальциевые сигналы и гомеостаз в ядрах................................35

1.3.2.2. Механизмы ядерной кальциевой сигнализации........................46

1.3.2.3. Механизмы реализации клеточных сигналов в ядрах...............54

1.3.2.3.1. Роль фактора P1F в регуляции экспрессии генов растений.........55

1.3.2.3.2. Роль CREB фактора в регуляции транскрипции генов животных....................................................................59

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..................................62

2.1. Объекты и методы исследования...............................................62

2.1.1. Объекты исследования.........................................................62

2.1.2. Методы исследования..........................................................63

2.1.2.1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы.....................63

2.1.2.2. Очистка сукцинатдегидрогеназы из растительных и животных тканей...........................................................................63

2.1.2.3. Определение молекулярной массы нативного фермента.............65

2.1.2.4. Определение молекулярной массы субъединиц СДГ.................65

2.1.2.5. Аналитический электрофорез..............................................66

2.1.2.6. Определение гомогенности препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы....................................................67

2.1.2.7. Специфическое проявление сукцинатдегидрогеназы................68

2.1.2.8. Выделение ядер из растительных и животных тканей...............68

2.1.2.9. Определение концентрации свободных катионов Са ...............69

2.1.2.10. Влияние ингибиторов......................................................70

2.1.2.11 .Определение перекрестного загрязнения фракций...................70

2.1.2.12. Определение активности маркерных ферментов глиоксилатного цикла....................................................70

2.1.2.13. Выделение РНК.............................................................71

2.1.2.14. Обратная транскрипция...................................................71

2.1.2.15. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот

в геле агарозы...............................................................71

2.1.2.16. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.................72

2.1.2.17. Статистическая обработка экспериментальных данных...........73

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................................... 75

2.3.1. Выделение и очистка сукцинатдегидрогеназы...........................75

2.3.1.1. Выделение сукцинатдегидрогеназы из зеленых листьев кукурузы и арабидопсиса.................................................75

2.3.1.2. Выделение сукцинатдегидрогеназы из печени крыс................78

2.3.1.3. Исследования на гомогенность полученных препаратов сукцинатдегидрогеназы................................................... 80

2.3.1.4. Исследование четвертичной структуры сукцинатдегидрогеназы

из растений и животных...................................................82

2.3.2. Регуляция гомогенных препаратов сукцинатдегидрогеназы

из животных и растительных тканей ионами кальция............... 86

2.3.3. Биохимический механизм действия светового режима

на растительную сукцинатдегидрогеназу.................................90

2.3.3.1. Роль катионов кальция в трансдукции фитохромного сигнала в листьях арабидопсиса.......................................................90

2.3.3.2. Роль катионов кальция в трансдукции фитохромного сигнала в листьях кукурузы............................................................97

2.3.3.3. Роль катионов кальция в трансдукции сигнала в клетках печени крыс в норме и при пищевой депривации.............................106

2.3.3.4. Изоферментный состав сукцинатдегидрогеназы в печени крыс

в норме и при пищевой депривации....................................108

2.3.3.5. Содержание свободного кальция в ядрах клеток печени крыс

в норме и при пищевой депривации....................................109

2.3.3.6. Экспрессия гена sdha субъединицы А сукцинатдегидрогеназы

в норме и при пищевой депривации....................................111

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................113

ВЫВОДЫ..............................................................................122

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ........................124

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.99.1) обеспечивает выполнение нескольких важнейших функций. Фермент обеспечивает протекание реакций цикла трикарбоновых кислот, который, как известно, поддерживает энергетический баланс клетки. Катализ ферментов окисления сукцината до фумарата необходим не только для протекания цикла Кребса, но и является важной реакцией одного из этапов глюконеогенеза. СДГ является уникальным ферментом, который одновременно обеспечивает функционирование, как дыхательной цепи митохондрий, так и цикла трикарбоновых кислот. Регуляция сукцинатдегидрогеназной активности на экспрессионном уровне осуществляется под действием факторов транскрипции, кроме того, важную роль в этом процессе играют различные вторичные мессенджеры, такие как Са2+, G-белки, ц-АМФ. В последнее время значительный интерес исследователей был сосредоточен на важной роли универсального посредника двухвалентного иона кальция (Са2+) в механизмах передачи внутриклеточных сигналов, начиная с восприятия начального стимула и заканчивая окончательным адаптивным ответом. Многочисленные наблюдения свидетельствуют, что концентрация кальция, в основном, цитозольная, изменяется в ответ на множество абиотических или биотических стрессов [144; 155; 208]. Большой интерес вызывает роль ионов кальция и других факторов, оказывающих действие на экспрессию генов сукцинатдегидрогеназной системы. Особое место в механизме влияния вторичного мессенджера кальция на ферментативную активность сукцинатдегидрогеназы занимает его внутриклеточный транспорт, в частности, перемещение из цитоплазматических и других фондов в ядро для создания действующей концентрации этого иона. Малоизученными остаются вопросы трансдукции фитохромного сигнала, активирующего сукцинатдегидрогеназную активность в растениях, а также реализация

стрессовых стимулов (пищевая депривация, аллоксановый диабет и др.), вызывающих активирование глкжонеогенеза и повышение активности сукцинатдегидрогеназы в животных клетках. В связи с этим необходимы исследования биохимических механизмов, осуществляющих экспрессионную регуляцию сукцинатдегидрогеназы в растениях и животных в стрессовых условиях. Отдельного внимания требует изучение роли внутриядерных транскрипционных факторов, индуцируемых изменением концентрации кальция и обуславливающих скорость образования энзима сукцинатдегидрогеназы.

Целью данной работы являлось исследование роли ионов кальция и транскрипционных факторов в регулировании активности сукцинатдегидрогеназы при адаптивной реакции в клетках растений и животных.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи:

1. Получить с помощью многостадийной очистки электрофоретически гомогенные препараты сукцинатдегидрогеназы из листьев Zea mays L., Arabidopsis thaliana L. и печени Rattus rattus L. и исследовать с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 и денатурирующего электрофореза четвертичную структуру фермента.

2. Изучить возможное прямое действие различных концентраций двухвалентных катионов кальция на функциональную активность препаратов сукцинатдегидрогеназы из животных и растительных объектов.

3. Выяснить роль катионов кальция в биохимическом механизме трансдукции фитохромного сигнала в листьях кукурузы и арабидопсиса.

4. Исследовать действие специфического ингибитора ионных каналов -рутения красного и хелатирующего блокатора ЭГТА на изменение концентрации кальция в ядерной фракции растений под действием стрессовых факторов.

5. Установить возможную коррелятивную зависимость между величиной концентрации ионов кальция и экспрессией гена, кодирующего транскрипционный фактор PIF3 у растений.

6. Исследовать скорость функционирования сукцинатдегидрогеназы в печени крыс и ее изоферментный состав в норме и при пищевой депривации.

7. Изучить зависимость между изменением концентрации двухвалентных ионов кальция и экспрессией гена, кодирующего сукцинатдегидрогеназу, в печени крыс в норме и при пищевой депривации.

Научная новизна. Показано, что катионы Са2+ являются посредником в реализации ответа от стресс-индуцирующих факторов. Изменение содержания кальция в ядрах клеток растений Zea mays L. и Arabidopsis thaliana L. вызывает активацию фитохром-индуцирующего фактора PIF3, осуществляющего контроль уровня экспрессии гена субъединицы А сукцинатдегидрогеназы. Установлено, что в условиях пищевой депривации изоферментный состав сукцинатдегидрогеназы постоянен и представлен одной формой. В трансдукции внутриклеточного сигнала, вызванного депривацией, принимают участие катионы кальция, активирующие транскрипцию гена sdha посредством ядерных факторов транскрипции. Показано, что индукция активности СДГ в условиях пищевой депривации обусловлена увеличением скорости его синтеза.

Практическая значимость. Данные, полученные в диссертационной работе, углубляют знания о структурных характеристиках

сукцинатдегидрогеназы из растений и животных. Получение электрофоретически гомогенных препаратов исследуемого энзима может использоваться в научно-исследовательских лабораториях, как вспомогательный фермент при каскадном способе определения других ферментов. Кроме того, препараты СДГ можно применять для аналитического определения концентрации янтарной кислоты в биологических образцах. Использование чистых препаратов фермента может

найти применение в пищевой промышленности при исследовании качества продуктов.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, по физиологии растений, по спецкурсам по энзимологии, биоэнергетике, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. На гомогенных препаратах сукцинатдегидрогеназы, очищенных из арабидопсиса, кукурузы и печени крыс показано, что исследуемый энзим является гетеротетрамером, состоящим из четырех различных по молекулярной массе субъединиц.

2. На высокоочищенных препаратах сукцинатдегидрогеназы было показано, что Са2+ в физиологических концентрациях не оказывали прямого регулирующего действия на ферментативную активность фермента.

3. В механизме трансдукции фитохромного сигнала в листьях кукурузы и арабидопсиса играет важную роль кальциевая сигнальная система. Внутриядерная реализация фитохромного сигнала обеспечивается транскрипционным фактором Р1РЗ, индукция экспрессии которого коррелирует с изменением концентрации катионов кальция.

4. Пищевая депривация вызывает усиление активности сукцинатдегидрогеназы в печени крыс. Установлено, что при этом наблюдается внутриклеточное перераспределение Са2+, обеспечивающее его накопление в ядрах клеток печени. В трансдукции внутриклеточного сигнала, вызванного депривацией, принимают участие катионы кальция, активирующие транскрипцию гена ясИча.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 14-ой международной Пущинской конференции молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино,

2010); Международной научной конференции «Ломоносов-2011» (Москва,

2011); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); VI съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных технологий» (Нижний Новгород, 2011); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2011, 2012, 2013).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 11 публикациях - 8 статьях и 3 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (251 источник). Иллюстрационный материал включает 6 таблиц и 25 рисунков.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функционирование сукцинатдегидрогеназы в растительной

и животной клетках

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ КФ 1.3.5.1) является мембранным ферментом, так как она расположена во внутренней мембране митохондрий и выполняет функции комплекса II электронно-транспортной цепи. Фермент обеспечивает протекание реакции цикла трикарбоновых кислот, который, как известно, поддерживает энергетический баланс клетки. Катализ ферментом окисления сукцината до фумарата необходим не только для протекания цикла Кребса, но и является важной реакцией одного из этапов глюконеогенеза. Метабол изируя янтарную кислоту, образующуюся в глиоксилатном цикле, сукцинатдегидрогеназа выполняет биосинтетическую роль [6, 8, 10]. Сукцинатдегидрогеназа (сукцинат : акцептор-оксидоредуктаза, сукцинат:убихинон-редуктаза) является уникальным ферментным комплексом, который одновременно обеспечивает функционирование как дыхательной цепи митохондрий, так и цикла трикарбоновых кислот.

Реакция, которую катализирует сукцинатдегидрогеназа, обеспечивается отниманием электронов от янтарной кислоты, которые переносятся на ФАД, а затем через Ре8-кластеры на убихинон. Интересно отметить, что данный электронный поток не сопровождается генерацией Д|1рГ в комплексе 11. Возникающие 2 Н+ локализуются на той же стороне мембраны, то есть в матриксе и затем уходят на восстановление хинона. Следовательно, комплекс II не участвует в энергизации мембраны и функционирует только как переносчик электронов от сукцината к убихинону [3, 45]. Таким образом, окисление сукцината является единственной дегидрогеназной реакцией цикла Кребса, в ходе которой наблюдается прямой перенос водорода с субстрата на флавопротеин без участия коферменга [21,

41, 43]. Природными акцепторами электронов в этом случае являются убихиноны, нафтохиноны, неприродными - гексацианоферрат и др. По четвертичной структуре сукцинатдегидрогеназа представляет собой олигомер. В большинстве объектов, описанных в литературе, фермент имеет 4 субъединицы: А, В, С, Б. Молекулярная масса нативной молекулы СДГ варьирует от 90 до 130 кДа. Субъединицы А и В являются гидрофильными периферическими белками, направленными в матрикс: флавопротеин А (СДГ1) и Ге8-белок В (СДГ2). Некоторые авторы субъединицы А и В считают растворимой частью комплекса [10, 128]. Именно эти субъединицы формируют каталитический центр комплекса II. Остальные 2 субъединицы С и Б представляют собо�