Световая регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений

Федорин, Дмитрий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Световая регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Световая регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений"

Федорин Дмитрий Николаевич

На правах рукЙийй КЦ О П 003055404

Световая регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений

Специальность 03.00.12. - физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2007

003055404

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель. доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Федулова Татьяна Петровна кандидат билогических наук Ивентьев Александр Николаевич

Ведущая организация

Институт физиологии растений им. К А.Тимирязева РАН

Защита состоится 20 апреля в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан 19 марта 2007 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета ^¿е^г/^ Брехова Л И

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее интересных проблем современной физиологии растений является взаимодействие процессов дыхания и фотосинтеза. Цикл Кребса играет центральную роль в жизнедеятельности растений, обеспечивая темновое дыхание, а также многие анаплеротические реакции [Beale, 1990; Заленский и др., 1985].

Одной из ключевых реакций цикла, сопряженной с запасанием энергии, является окисление сукцината до фумарата, катализируемое сукцинатдепидрогеназой (СДГ, КФ 1.3.99.1), единственным ферментом цикла трикарбоновых кислот, встроенным во внутреннюю мембрану митохондрий. В процессе протекания данной реакции образуется ФАДН2, который может использоваться как источник энергии для различных процессов. СДГ -компонент не только цикла Кребса, но и ЭТЦ митохондрий, поэтому ее регуляция связана с функционированием сразу двух ключевых процессов.

Изучение роли отдельных метаболитов клетки в регуляции энергетических процессов клетки, в том числе и дыхания, в большинстве своем, направлена на выяснение способов влияния различных интермедиатов (АТФ, различных ионов, оргкислот и др.) на работу целостной митохондриальной системы, а не отдельных ее ферментативных компонентов [Скулачев, 1990; Affourtit et al., 2001; Pereira et al., 2001]. Кроме того, недостаточно много данных о прямом воздействии света различной интенсивности и спектрального состава на ферментативные системы, содержащие хромофорные группировки, такие как ФАД и ФМН [Hockberger et al., 1999]. Такие исследования позволяют оценить механизм прямого и опосредованного влияния света на функционирование фермента.

Обзор литературы показал противоречивость представленных данных по влиянию света на дыхание и ЦТК при изучении ферментативных систем, однако сам факт регуляции их светом уже никем не оспаривается [Мурей и др., 1990; Мамушина и др., 1997]. Данные о действии света на дыхательный метаболизм весьма многочисленны, однако работ, посвященных выяснению механизмов влияния света на активность дыхательных ферментов практически нет.

Одним из возможных опосредованных механизмов, с помощью которого может осуществляться регуляция этих процессов, является фитохромная система. Известно, что фитохромная система участвует в регуляции активности некоторых ферментов дыхания растений [Matthew et al., 2004]. Свое воздействие фитохромая система может осуществлять либо самостоятельно влияя на функционирование ферментов, либо действуя через различные вторичные посредники, такие как ионы Са2+, G-белки, цАМФ [Волотовский, 1998; Wu et al., 1996]. Эффект фитохрома может проявляться в изменении состояния клеточных мембран, в том числе и митохондриальной, или воздействием на генетический аппарат клетки посредством различных сигнальных систем, регулируя интенсивность экспрессии генов.

Не до конца изученным остается вопрос о механизме переключения метаболизма растительной клетки при изменении светового режима. Исследование отдельных ферментативных структур и способов их регуляции необходимо для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение механизмов световой регуляции функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние гетерогенного, красного и дальнего красного света на активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы.

2. Определить роль различных форм фитохрома в регуляции СДГ-активности при действии красного и дальнего красного света на мутантные растения А. гкаНапа.

3. Получить гомогенный препарат СДГ из зеленых листьев кукурузы и определить степень воздействия на него гетерогенного света.

4. Изучить влияние энергетических эквивалентов клетки на активность СДГ.

5. Разработать специфические праймеры для субъединицы А СДГ кукурузы и идентифицировать ее ген в зеленых листьях кукурузы.

6. Методом Нозерн дот-гибридизации определить уровень мРНК гена СДГ в листьях арабидопсиса при изменении светового режима.

7. Провести количественный анализ уровня экспрессии гена .угШ-2 арабидопсиса и кукурузы в условиях разного светового режима методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о способах переключения энергетического метаболизма растительной клеткой при изменении светового режима.

Изучен механизм световой регуляции СДГ активной формой фитохрома А и установлено, что его действие проявляется в регуляции экспрессии гена, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы. Фотоактивный фитохром блокирует транскрипцию гена л5%7-2 в листьях арабидопсиса и йсПш в листьях кукурузы, что приводит к уменьшению количества их мРНК в клетке, что четко коррелирует с угнетением активности фермента в листьях растений под действием красного света.

Получение гомогенного препарата СДГ позволило установить, что его активность сильно зависит от энергетического состояния клетки и концентрации АТФ и АДФ. Показано, что повышение количества АТФ в среде приводит к ингибированию СДГ. Кроме того, выявлена активирующая роль ионов СГ на скорость работы фермента. Установлено, что световая регуляция СДГ опосредованна через фитохромную систему. Исследования мутантных форм А. tha.lia.na позволили установить, что в качестве регулятора функционального состояния фермента выступает фитохром А, активная форма которого ингибирует активность СДГ.

Работа расширяет и углубляет знания о механизмах регуляции СДГ в листьях растений в условиях изменения светового режима. Установленное участие фитохромной системы, в частности фитохрома А, в регуляции СДГ является одним из механизмов координирующих взаимосвязь фотосинтеза и дыхания растений. Полученные данные по экспрессии генов sdhl-2 арабидопсиса и sdha кукурузы указывают на функциональные изменения в работе генетического аппарата клетки в течение суток в зависимости от источника энергии.

Практическая значимость. Знание механизмов взаимодействия энергетического и конструктивного метаболизма клетки открывает возможности регулирования их соотношения, что способствует повышению продуктивности и урожайности растений.

Гомогенные препараты СДГ могут быть использованы для регенерации ФАД или ФАДН при исследовании других ферментных систем, в аналитических измерениях сукцината в биологических образцах, в иммуноферментном анализе многих антигенов в качестве фермента-маркера митохондрий, в пищевой промышленности для исследования качества продуктов.

Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма позволяет приблизиться к пониманию функционирования растительного организма как целостной системы. Полученные данные по экспрессии СДГ при изменении светового режима создают условия для решения проблем, связанных с повышением продуктивности и урожайности, а также устойчивости растений к неблагоприятным факторам.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», «Метаболизм органических кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 7-ой, 9-ой и 10-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2003, 2005, 2006), Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), Научно-практической конференции «Регуляция продуктивного процесса сельскохозяйственных растений» (Орел, 2006), Материалы I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006), ежегодной научной сессии отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2005, 2006).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 17 публикациях - 10 статьях и 7 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (170 источников). Иллюстрационный материал включает 28 рисунков и 6 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объектов исследования использовали 14-дневные проростки Zea mayse L., выращенные в почве по стандартной методике при 16 часовом световом дне с интенсивностью света 25 Ватт/м2. Кроме того изучали 24-дневные проростки Arabidopsis thaliana L., выращенные в почве по стандартной методике [127] при 12-часовом световом дне с интенсивностью света 25 Ватт/м2. В работе использовали семена трех линий растений A. thaliana: растения дикого типа (Со1-0), мутанты по гену фитохрома A (phya-201) и мутанты по гену фитохрома В (phyb-1), полученные из Института Макса Планка (Гольм, Германия).

Постановка эксперимента по созданию светового режима. Белый свет получали от ламп дневного света в установке «Флора-1». Красный (КС) и дальний красный свет (ДКС) получали с помощью светодиодов с областью испускания 640-680 нм (КИПД40М40-К-П6, Россия) и 710-750нм (ЗЛ127А-5, Россия). Опыты по изучению влияния фитохромной системы на растения проводили по следующей схеме. Часть растений выдерживали в течение 48 ч при стандартных условиях выращивания растений (12-часовой фотопериод). Этот вариант обозначен на рисунках как "белый свет". Растения второй группы инкубировали 48 ч в темноте. Третью группу растений после 24-часовой инкубации в темноте освещали КС с длиной волны 660 нм в течение 15 мин и затем инкубировали 24 ч в темноте. И, наконец, четвертую группу растений после 24-часовой инкубации в темноте освещали КС с длиной волны 660 нм в течение 15 мин, затем ДКС с длиной волны 730 нм в течение 15 мин, после чего инкубировали 24 ч в темноте.

Определение активности фермента. Активность фермента определяли спектрофотометрически по падению оптической плотности среды при длине волны 600 нм в течение 5 мин при 25°С, обусловленному обесцвечиванием ДХФИФ в ходе его восстановления. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль продукта за 1 мин при 25°С.

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури [Lowry et al., 1951]. Содержание белка в высокоочищенных препаратах - по поглощению при 280 нм и 260 нм [Землянухин и др., 1996].

Выделение и очистка фермента. Для получения высокоочищенного препарата СДГ из листьев кукурузы были разработаны специальные схемы

очистки, включающие получение гомогената, фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе G-25, хроматографию на ионообменнике ДЭАЭ-целлюлозе.

Аналитический электрофорез. Электрофорез нативного фермента проводили по модифицированной методике Дэвиса [Davis, 1994]. Для универсального окрашивания белков использовали метод проявления нитратом серебра.

Исследование регуляции активности фермента. Регуляторные характеристики фермента изучали на электрофоретически гомогенном препарате.

Выделение РНК и проведение ПЦР. Для выделения суммарной РНК применяли метод гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции [Herrington et al., 1992] с использованием хлорида лития в качестве осаждающего агента. Визуализацию результатов экстракции РНК производили с помощью электрофореза в 1% агарозном геле [Chomczynski et al., 1987]. Для идентификации гена СДГ использовали метод ПЦР со специфическими дегенерированными праймерами. ПЦР проводилась на приборе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия).

Секвенирование ампликона. Очистку ампликона осуществляли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с помощью набора QIAEX® II Gel Extraction Kit (150), согласно рекомендациям производителя. Очищенный ампликон секвенировали в «ВНТК генной активности» Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино).

Проведение Нозерн дот-блоттинга. Нозерн дот-блоттинг проводили с предварительно денатурированной РНК, которую переносили на нейлоновую мембрану Hybond N («Amersham», Англия). РНК фиксировали, облучая мембрану в течение 10 мин УФ (254 нм) с интенсивностью 0.15 Ватт/см2. Специфический зонд получали методом ПЦР с праймерами для гена sdhl-2 с использованием bio-lldUTP. Продукты гибридизации выявляли при помощи набора для нерадиоактивного мечения («Силекс М», Россия).

Проведение ПЦР в реальном времени. ПЦР-РВ проводили на приборе ДТ-322 ("ДНК-Технология", Россия) и ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, США), используя в качестве красителя SYBR Green и праймеры к генам sdhl-2 арабидопсиса и sdha кукурузы. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации 18S рРНК с ген-специфичными праймерами. ПЦР с суммарной РНК, без этапа обратной транскрипции, использовали в качестве отрицательного контроля.

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3-х кратной биологической и аналитической повторности. В таблицах и на рисунках приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. Для построения графиков применяли программы линейной и параболической аппроксимации. При математической обработке использовали статистический критерий Стъюдента [Лакин, 1990].

ДЕЙСТВИЕ ГЕТЕРОГЕННОГО СВЕТА НА АКТИВНОСТЬ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Влияние гетерогенного света на активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы.

Установлено, что световой режим значительно влияет на интенсивность работы фермента. Как видно из данных приведенных на рисунке 1, при освещении интенсивностью 50 Ватт/м2 в течение первых суток активность СДГ в листьях кукурузы уменьшилась в 1.4 по сравнению с растениями, выращенных при интенсивности света 25 Ватт/м2. В темноте максимальная активность СДГ наблюдалась на третьи сутки инкубации в темноте и была 2.5 раза больше контроля. Изменение активности СДГ может быть результатом ее регуляции интермедиатами клетки, в частности АТФ, как продукта фотосинтеза

Рис. 1 Активность

сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы в условиях различного освещения. В качестве точки отчета выбрана активность СДГ в зеленых проростках кукурузы выращенных в условиях освещения 25 Ватг/м2. 1- темнота; 2- 25 Ватт/м2; 3- 50 Ватг/м2.

Неполное ингибирование объяснятся тем, что СДГ может обеспечивать множественные анаплеротические реакции [Гудвин, 1986]. Торможение светом сукцинатдегидрогеназной реакции связано со способностью фотосинтетического АТФ регулировать митохондриальное

фотофосфорилирование [Marketal, 1982].

Изменение активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы при смене светового режима.

Изучение динамики активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы при смене светового режима показало, что перенос растений со света (25 Ватт/м2) в темноту приводил к увеличению активности фермента к 12 часам экспозиции до 85-90% от максимальной его активности через 24 часа инкубации (рис. 2). В первые полчаса активность СДГ возрастала в 1.35 раза (рис. 3).

и электрон-транспортной цепи митохондрии. 0.16

0.12

0,08

< (Ш

экспозиция, час

Рис. 2 Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы при смене светового режима растений. Темнота -перенос зеленых растений кукурузы из условий освещения с интенсивностью света 25 Ватт/м2 в условия темноты. Свет - обратный перенос растений после 24-ти часовой инкубации в темноте на свет той же интенсивности.

В последующие два часа происходило резкое снижение интенсивности работы фермента до 48% относительно контроля (24 часа в темноте), а после 9 часов освещения растений светом СДГ-активность стабилизировалась на уровне 51 % от контроля. Повторное освещение растений кукурузы белым светом вновь приводило к снижению активности СДГ. 0.25т свет

Рис. 3 Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы при смене светового режима. Темнота - активность проростков кукурузы, выдержанных 24 часа в условиях темноты. Свет -перемещение проростков кукурузы из темноты на свет с интенсивностью 25 Ватт/м2.

г 4 6 8 ю Время, ч

Быстрые изменения в активности фермента в растениях кукурузы при смене светового режима могут осуществляться путем метаболической регуляции, при этом АТФ испособен играть основную роль [Affourtit, 2001].

Особый интерес представляет увеличение активности сукцинатдегидрогеназы в первые минуты экспозиции растений после перехода от темноты к свету, когда вероятно требуется увеличение скорости метаболизации запасных органических кислот, обеспечивающих субстратами анаболические процессы [Cooper, 1969].

Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы при деэтиоляции растений.

Изменение активности исследуемого фермента дыхания в процессе зеленения кукурузы представлены в таблице 1. В этиолированных проростках при их освещении наблюдается падение активности СДГ в 2,2 раза к 3 часам почти до минимального значения. Это может быть связано с интенсификацией фотосинтеза и фотофосфорилирования о чем свидетельствует увеличение

количества общего хлорофилла в проростках в этот период (таблица 2). Через 24 час инкубации растений на свету активность СДГ снизилась более чем в 2 раза, а концентрация хлорофилла увеличилась в 6 раз относительно количества пигмента в этиолированных растениях.

Таблица 1.

Динамика активности сукцинатдегидрогеназы при помещении этиолированных

проростков кукурузы на свет с интенсивностью 25 Ватт/м2(п=3, Р < 0,05)

Условия Контроль Свет

опыта 1 час 3 часа 6 часов 9 часов 24 часа

Активность

Е/мг белка 0,069+ 0,035± 0,032+ 0,032+ 0,035± 0,032±

0,008 0,002 0,001 0,004 0,005 0,002

Е/г сырой 0,15± 0,077+ 0,07+ 0,05+ 0,06+ 0,062+

массы 0,002 0,005 0,002 0,007 0,004 0,002

Таблица 2.

Динамика накопления хлорофилла в листьях в процессе зеленения этиолированных проростков кукурузы (п=3, Р < 0,05)

Экспозиция, час 0 1 3 6 9 12 24

Содержание хлорофилла, мкг/г сырой массы 0,368 0,752 1,35 1,765 1,591 1,755 2,225

Исследование влияния света на этиолированные проростки представляет большой интерес, т. к. в данном случае можно наблюдать непосредственное действие света на дыхательный метаболизм при отсутствии фотосинтеза. Влияние света на активность изучаемого фермента может осуществляться несколькими механизмами. In vivo СДГ связана с мембраной митохондрии и может регулироваться как трансформацией ее структуры, так и изменением концентрации ключевых метаболитов, в частности, соотношением АТФ/АДФ. Ранее было установлено, что окисление сукцината зависит от присутствия в среде АТФ [Скулачев, 1990; Affourtit et al., 2001]. Еще одним механизмом изменения активности СДГ может быть участие специальных фоторецепторных систем, характерных для растений. Известно, что фитохром может проявлять свое воздействие путем изменения концентраций цАМФ и цГМФ в клетке, регулируя экспрессию ряда генов [Fankhauser, 2001]. Однако на сегодня нет достоверных данных о специфичном воздействии света различной длины волны на активность СДГ.

ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Очистка фермента из листьев кукурузы.

Результаты типичной 5-ти стадийной очистки представлены в таблице 3. В качестве определяющей стадии очистки можно выделить ионообменную хроматографию. Элюцию фермента с колонки осуществляли линейным градиентом хлорида калия от 50 до 200 мМ и содержанием сукцината в среде 20 мМ.

Таблица 3.

Очистка сукцинатдегидрогеназы из зеленых листьев кукурузы (п=4, Р < 0,05)

Стадия Объем, мл Количество белка, мг Общая активность, Е Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогенат 20 94 8± 4,74 5 76± 0,3 0 061± 0,004 100 1

Митохондрии 4 5 25± 0,26 195± 0,10 0 371± 0,019 34 6,08

Фракционирован ие сульфатом аммония 20*60% насыщения 2 2 19± 0,11 147± 0,07 0 672± 0,034 26 1102

Гель-фнльтрацвя через сефадекс 6-25 2 0 57± 0,03 0 70± 0,03 1 235± 0,062 12 20 25

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-фрактогеле 2 0 34± 0,02 1 51± 0,07 4 467± 0 223 26 73 23

I —г

Рис. 4. Электрофоре! в ПААГ на гомогенность с! кдшытдегцдроген.пы очищенной Я] листьев кл к грузы. р - белковая тшоса с }1[ — и.41, К - фронт

После стадии ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-фрактогеле сукцинатдегидрогеназа из листьев кукурузы была очищена в 73 раза с выходом 26%. Удельная активность ферментативного препарата составила 4,47 Е/мг белка. Методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей окраской нитратом серебра было показано, что получен гомогенный фермент, о чем свидетельствует наличие одной полосы на геле с 11г = 0,41 (рис. 4).

Действие гетерогенного света на изолированную молекулу сукцинатдегидрогеназы.

Действие света различной интенсивности (50 Ватт/м2 и 25 Ватт/м2) на гомогенный препарат СДГ из листьев кукурузы, показало отсутствие прямого регуляторного действия света на активность СДГ, поэтому принципиально важным является выявление иных механизмов регуляции активности сукцинатдегидрогеназы при изменении светового режима.

Влияние АТФ на активность сукцинатдегидрогеназы.

Для выяснения косвенного действия света на СДГ через продукты фотосинтеза, было изучено влияние АТФ на активность фермента. Активность СДГ измеряли в среде с тремя различными концентрациями сукцината. В ходе экспериментов установлено, что в среде, содержащей 2 мМ сукцината,

максимальное увеличение активности наблюдали при концентрации АТФ 5 мкМ, активность СДГ при этом возрастала в 1.9 раз (рис. 5). При увеличении количества сукцината в среде до 5 Мм и 10 мМ пик активности СДГ обнаруживается при концентрации АТФ 2 мкМ в обоих вариантах опыта. При изучении влияния АТФ на активность сукцинатдегидрогеназы наибольший пик активности определяли при концентрации АТФ 2 мкМ и содержании сукцината в среде 10 мМ. Дальнейшее увеличение содержания АТФ приводило к росту активности при более низких концентрациях сукцината, а при превышении количества АТФ 30 мкМ нуклеотид являлся ингибитором работы СДГ (рис. 5), что может объясняться феноменом так называемого «дыхательного контроля» [Скулачев, 1990]. Ранее было показано, что добавление АТФ к изолированным митохондриям приводит к активации окисления ими сукцината [Айоиг& et а1., 2001].

!§ ИЗ й аз

р %

0,016-

0.012-

0.008-.

0,004-

0,000

2 5 10

[АТФ], МКМ

Рис. 5 Влияние аденозинтрифосфата на активность гомогенного препарата

сукцинатдегидрогеназы с разными концентрациями сукцината в среде. 1-2 мМ; 2 -5 мМ; 3-10 мМ.

Действие АДФ на активность сукцинатдегидрогеназы.

Изучив действие другого энергетического эквивалента клетки на активность сукцинатдегидрогеназы, было установлено, что низкие концентрации АДФ приводят к ингибированию работы фермента. Из данных, приведенных на рисунке 6 видно, что при концентрации АДФ в среде ЗмкМ активность фермента составляет 57% от контрольного уровня. С повышением содержания АДФ в среде до 50мкМ активность сукцинатдегидрогеназы увеличивается в 1,7 раза с 0,007 до 0,012 Е/мг белка.

Влияние АДФ на функционирование фермента подтверждает зависимость данного фермента от энергетического заряда клетки и дает основание предположить возможность регуляции ЭТЦ аденозинфосфатами на уровне фермента сукцинатдегидрогеназы. Такой механизм обеспечивает регуляцию состояний 3 и 4 митохондрий физиологическими концентрациями АТФ и АДФ [Ермаков, 2005].

0,014 -,

» 0,01 -s w

ь 0,006 А

0,002 -

fc" т

3 5 10 [АДФ],мкМ

Рис. 6 Влияние

аденозиндифосфата на

активность гомогенного

препарата

сукцинатдегидрогеназы. К -

контроль, активность гомогенного препарата без добавления в среду спектрофотометрирования АДФ.

Влияние различных солей на активность сукцинатдегидрогеназы.

На рисунке 7А представлены данные об изменении активности СДГ в присутствии различных солей, из которых видно, что активаторами работы сукцинатдегидрогеназы являются соли KCl, NaCI и NH4CI, увеличивающие скорость работы фермента в 3.4, 5 и 2 раза соответственно. Такие соли как KJ, K2SO4 и Na2C03 не вызывали значительного изменения в работе СДГ. Полученные результаты свидетельствуют, что активирующий эффект на фермент проявляют ионы CI". Максимальное увеличение работы СДГ наблюдается при содержании KCl 125 - 150 мМ, что приводит к повышению активности более чем в 3 раза (рис. 7Б).

А Б

1 0,015 i

ifi

0,02

е?

£ 0,015

s 0,01 |

1 0,005

и <

90 125 [KCl], мМ

150 200

к к а №<л 1Щ4С] к; №22о4

Рис. 7 Влияние различных солей (А) и хлорида калия (Б) на активность гомогенного препарата сукцинатдегидрогеназы. К - активность гомогенного препарата сукцинатдегидрогеназы.

Регуляция СДГ ионами СГ может осуществляться по сходному механизму с ИЦЛ, когда хлорид ионы могут связываться с активным центром фермента, облегчая присоединение субстрата, что приводит к увеличению скорости работы СДГ. Возможен и другой механизм активации сукцинатдегидрогеназы, когда ионы СГ взаимодействуют с регуляторным центром, что также проявляется в увеличении сукцинатдегидрогеназной активности [Березов и др., 1998; Епринцев и др., 2005]. Т.о. выявленное нами увеличение активности СДГ

в присутствии КС1 позволяет объяснить увеличение активности СДГ после элюции с ДЭАЭ-фрактогеля за счет стабилизации структуры белка [Березов и др., 1998].

РОЛЬ ФИТОХРОМНОЙ СИСТЕМЫ В СВЕТОВОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В РАСТЕНИЯХ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНОГО СВЕТОВОГО РЕЖИМА

Влияние КС и ДКС на активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы.

Установлено, что под влиянием красного света (ббОнм) происходило снижение активности фермента в 5,6 раз относительно контрольного уровня (24 часа в темноте). Воздействие на растения дальнего красного света имело реципрокный красному свету характер, активность СДГ оставалась на уровне 0,07 Е/мг белка (рис. 8). Последовательное действие на растения КС и ДКС вызывало аналогичный эффект, т.е. ферментативная активность СДГ в зеленых листьях кукурузы не изменялась.

0.1

0,05

rii

КС ДКС кс+дкс

условия опыта светом 660 нм и 730 нм

Рис. 8 Активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы под действием света разной длины волны. Темнота - растения, выдержанные в темноте; КС -растения, освещенные светом 660 нм; ДКС - растения, освещенные светом 730 нм; КС+ДКС - растения, последовательно освещенные

Полученные данные о влиянии низкоэнергетического КС и ДКС на функционирование СДГ, свидетельствуют об участии фитохромной системы в регуляции активности фермента. Экспозиция растений в красном свете вызывает конформационные перестройки в структуре фитохрома [Авдонин, 1994; Феденко и др., 1991], активная форма которого ингибирует СДГ. Регуляция фитохромной системой может осуществляться через непосредственное взаимодействие с молекулой фермента, или через изменение экспрессии генетического аппарата клети [Matthew et al, 2004; Smith, 1995].

Поскольку фитохромная система представлена несколькими типами пигментов, принципиально важным является изучение вклада каждого из них в регуляцию активности СДГ. Для решения этой задачи использовали в качестве объектов исследования генмодифицированные организмы, в генетическом аппарате которых отсутствует ген, кодирующий один из типов фитохромов.

Влияние КС и ДКС на функционирование сукцинатдегидрогеназной системы в листьях генмодифицированных форм арабидопсиса.

Показано, что под влиянием КС на А. ЖаИапа дикого типа происходило снижение активности фермента в 6 раз с 0,024 до 0,004 Е/мг белка (рис. 9А). Действие ДКС и последовательное действие КС и ДКС было сходно по своему проявлению и не вызывало ингибирования СДГ. В растениях арабидопсиса мутантных по гену фитохрома А не происходило существенного изменения активности фермента при облучении их КС (рис. 9Б), кроме того, аналогичные результаты наблюдались под влиянием ДКС и при последовательном действии КС и ДКС, что приводило к незначительному увеличению активности фермента. Нечувствительность СДГ к действию красного света в растениях арабидопсиса мутантных по гену ркуа-201 связана с отсутствием в них фитохрома А, влияющего на активность фермента.

№

. НИ

1 на

гЬ

МЗ

< 0,81

д|,г кг+дкс

>ЬЛСТВГ1ЛШШТЯ

1+1

чхювия опыта

0,04

1,0)

■ №

= М1

г4-|

Л1

свет кмжтта кс дас кодке

условия опт я

Рис. 9 Активность сукцинатдегидрогеназы в листьях арабидопсиса под действием света разной длины волны. Дикий тип (А), мутант по гену фитохрома А (Б) и мутант по гену фитохрома В (В). Свет - растения, выращенные на свету; темнота - растения, выдержанные в темноте; КС - растения, освещенные светом 660 нм; ДКС - растения, освещенные светом 730 нм; КС+ДКС - растения, последовательно освещенные светом 660 нм и 730 нм.

Данные по влиянию КС на активность СДГ в растениях арабиопсиса мутантных по гену ркуЬ-1 свидетельствуют, что исследуемый фермент ингибировался в 3,2 раза. На свету интенсивность функционирования СДГ

была в 4 раза ниже, чем в темноте (рис, 9В). Действие ДКС и последовательное действие КС и ДКС не сызывало существенного изменения в активности СДГ.

Полученные данные по влиянию КС и ДКС на активность СДГ' в мутантных растениях арабидопсиса свидетельствуют, что фитохром В не принимает участия в данном процессе. Регуляция СДГ активной формой фи то хром а А может осуществляться через воздействие на генетический аппарат клетки, блокируя экспрессию генов, кодирующих сукцинатдегидрогеназу. Данное предположение основано на известном случай воздействия красного света на ротепоннечувствительные НАДН-дегидрогеназы, приводящее к увеличению концентрации их мРНК [Matthew et al, 2004].

Таким образом, свет оказывает ингибирующее влияние на активность |у кцинатдегидро геназы в листьях арабидопсиса, и механизм этого инптбирования опосредован через рецепцию красного света с длиной волны 660 нм фитохром ом А,

МЕ>АНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ

СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕВАЗЫ ФИТОХРОМНОЙ СИСТЕМОЙ

Идентификация гена sdhl-2 в листьях кукурузы.

Нами были йодобраны праймеры на основе сравнения аминокислотных последовательностей белка СДГ разных организмов, при этом было обнаружено 2 высококонсервативных участка, па основе которых были созданы специфические олигопуклеотиды. Из всех объектов исследования была выделена суммарная ГНК (рис. 10А), на основе которой методом обратной транскрипции получили к ДНК, используемую в дальнейшем для проведения полимеразной цепной реакции.

А Б

ЙШРЯ?

28S рРНК 18SрРНК

1Í1HI. äflfB -

5ÍIU -14HJ -

М ПНР

Рве. J0 Лиа:ш1 суммарно» РНК (А), выделен ной т зеленых листьев кукурузы и ПЦР-продукта (Б) в 1% агарозном геле. М - ДНК маркеры от 100 до 1500 л,и,: Г1ЦР -продукт полимеразной цег ной реакции с ген специфическими праймерами к гену СДГА.

Проведенный ПН?-анализ кДНК с ген-специфическими праймерами и последующий электрофорез продуктов реакции в 1% агарозном геле показали наличие одной полосы на гель-электрофорезе (рис. 10Б), что указывает на

специфичность праймеров. Наличие мРНК гена субъединицы Л СДГ в суммарной вытяжке РНК. свидетельствуют о транскрипции гена, кодирующего субъединицу А СДГ в зелгных листьях кукурузы. Присутствие мРНК СДГА указывает на наличие белковой молекулы СДГ способной осуществлять окисление сукцината, что подтверждается наличием активности СДГ в листьях КУКУРУЗЫ (рис. 1).

Секвеннрование продукта полученного методом ПЦР с гсн-спеццфицескими праймерами.

Было проведено секвеннрование ампликона, полученного ПЦР и установлена 100% гомология с участком гена sdhl-2, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы Arabidopsis thaliana, расположенного а хромосоме II. ПЦР-продукт полностью соответствовал участку гена в области от 835 до 1195 нуклеотида. Помимо этого данная последовательность ПЦР-продукТй имела высский процент сходства (около 80%) с последовательностями генов, ответственных за синтез большой субъсдиницы СДГ разных организмов (Oryza .sativa (japónica cultivar-group), Eaplotes sp. и Яр.}.

МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ

СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Изменение количества мРНК гена sdhl-2 при разных световых режимах

Гибридизация мобилизованной на нитроцеллюлозной мембране РНК со специфическим зондом к гену СДГ A. thaliana показала, что уровень мРНК в растениях на свету значительно ниже, чем в растениях, находящихся в темноте (рис. 11), о чем свидетельствует разница в интенсивности окраски габридизационного пятна. Исследование влияния КС и ДКС на содержаний транскрипта гена sdhl-2 показало, что после облучения растений КС количество мРНК СДГ' з] ачительно меньше, чем в растениях «темнового» варианта. Действие ДКС после КС снимало эффект последнего, и интенсивность окраски гибридизационкого пятна при этом была примерно такой же, как в случае растений, находившихся в темноте.

батай свет темнота КС КС + ДКС

Рие. 11 Дот-1и5ридша ция ГНК с зондом к гену sdhl-2 растений арабндопсиея, выращенных при разные условиях освещения. Свет - растения, освещенные белым светом; темнота - растении, экспонированные н темноте; КС — растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; КС + ДКС - растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 нм и 730 км.

Полученные данные свидетельствуют о разнице в количестве мРНК гена sdhl-2 в листьях арабидопсиса в зависимости от светового режима. В темноте и

после последовательного облучения КС и ДКС ген sdhl-2 транскрибируется значительно сильнее, чем в растениях на свету и при облучении КС, что выражается в увеличении концентрации мРНК в образцах.

Изменение экспрессии сукцинатдегидрогеназы в листьях арабидопсиса при разных световых режимах.

Методом ТТТТР в реальном времени показано, что накопление продукта амплификации в образцах кДНК из растений инкубированных в темноте и после последовательного облучения КС и ДКС происходит значительно быстрее, чем в из растений, экспонируемых на свету и под действием КС. Так, уровень флюоресценции для опыта «темнота» и «КС+ДКС» составляла к 35 циклу 117 и 221 единиц соответственно. В то время как в вариантах «свет» и «КС» этот показатель был 12 и 3 единицы (рис. 12А).

Расчетные значения относительной концентрации в разных образцах кДНК представлены на рисунке 14Б, из которого видно, что в растениях находящихся в темноте концентрация транскрипта гена sdhl-2 выше такового показателя на свету в 48,25 раза и составляет 579 и 12 единиц, соответственно. Количество транскрипта в растениях после облучения КС было в 27,71 меньше, чем в растениях в темноте и после последовательного облучения КС и ДКС, и составило 579 и 860 единиц.

15 20 25 Номер цикла

темнота КС Условия опыта

КС+ДКС

Рис. 12 Кинетика накопления флуоресцентного продукта при амплификации кДНК (А) и относительная концентрация транскрипта (Б) в листьях арабидопсиса при разных световых режимах. Свет — растения, освещенные белым светом; темнота -растения, выдержанные в темноте; КС - растения, освещенные светом 660 нм; КС+ДКС -растения, последовательно освещенные светом 660 нм и 730 нм.

В опытах по влиянию КС и ДКС на уровень экспрессии гена было

показано, что КС уменьшает количество его мРНК в клетках, однако противоположный эффект вызывает последующее действие ДКС. В темноте активная форма фитохрома А (Фк) постепенно переходит в неактивную (Фдк), индуцирующая экспрессию гена что обеспечивает резкое увеличение

количества мРНК СДГ в клетке. При этом выявлена сходная картина в изменении экспрессии гена и каталитической активности фермента.

Известным фактом является участие фитохромной системы в световой регуляции активности ферментов, при этом показано непосредственное

проникновение Фк в ядро и изменение структуры хроматина, и изменение экспрессии генетического аппарата клетки с участием различных мессенжеров [Benvenuto, 2002; Bullís, 2002].

Уровень экспрессии сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы в разных условия освещения.

Результаты исследования экспрессии гена кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы представлены на рисунке 13А, где показано, что флюоресценция продуктов амплификации кДНК из растений выдержанных в темноте и после последовательного облучения КС и ДКС в 9 раз больше этого показателя, чем в растениях экспонируемых на свету и после облучения КС и составляет 112 и 241 единицу для образцов «темнота» и «КС+ДКС», и 12 и 27 единиц для вариантов «свет» и «КС».

А Б

250

г 2оо

£ 150

100

. 2 1 т 9 1, -.1 лт 2т 2а 23 гт га з' зз 35 зи свет темнота КС КС+ДКС

«опер «лил. условия опыта

Рис. 13 Кинетика накопления флуоресцентного продукта при амплификации кДНК (А) и относительная концентрация транскрипта (Б) в листьях кукурузы при разных световых режимах. Свет - растения, освещенные белым светом; Темнота -растения, выдержанные в темноте; КС - растения, освещенные светом 660 нм; КС+ДКС -растения, последовательно освещенные светом 660 нм и 730 нм

Расчетные значения относительной концентрации продукта амплификации для гена кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы представлены на рисунке 13Б. Величина относительной концентрации на свету составляет 14 единиц, что меньше в 14,3 раза значения в образце «темнота» в котором этот показатель равняется 200 единиц. После облучения растений КС концентрация транскрипта составляла 23 единицы, что в 8,7 раза меньше значений этого показателя в опыте «темнота» и в 21,1 раз меньше, чем в образце «КС+ДКС». Данные, полученные методом ПЦР-РВ свидетельствуют, что изменение в работе гена СДГ связаны с участием в регуляции экспрессии гена фитохромной системы. Активная форма фитохрома А воздействует на генетический аппарат клетки, блокируя экспрессию гена, кодирующего субъединицу А СДГ. В темноте и после последовательного действия ДКС света фитохром переходит в неактивную форму и снимает угнетающее действие с гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

биосинтетических процессов [Гудвин и др., 1986; Мурей и др., 1990]. Основным фактором в регуляции процессов дыхания и фотосинтеза является свет, который в растительной клетке может проявлять свое действие, как через фоторецепторы, так и через клеточные метаболиты, синтезированные фотосинтетическим путем.

Получение СДГ в гомогенном состоянии (удельная активность 4,46 Е/мг белка и степень очистки 73,23 раза) позволило установить, что прямое действие света на фермент не приводит к изменениям его активности, хотя в состав имеется ФАД, поглощающий свет с длинной волны 430-450нм. Световая регуляции СДГ может осуществляться опосредованным механизмом через интермедиаты фотосинтеза. Установлено, что работа сукцинатдегидрогеназы в большой степени зависит от содержания энергетических эквивалентов клетки. Высокие концентрации АТФ (более 30 мкМ) вызывают сильное ингибирование фермента, в то время как низкие уровень нуклеотидов (10 мкМ) активирует СДГ, что, по-видимому, связано с эффектом «дыхательного контроля» [Скулачев, 1990]. В последних работах отмечается, что соотношение АТФ/АДФ регулирует функционирование СДГ через опосредованный механизм [Болдырев и др., 2006]. На свету большие концентрации фотосинтетического АТФ угнетают активность СДГ и темновое дыхание в целом. Противоположный эффект наблюдается в темноте, когда количество АТФ снижается и увеличивается концентрация АДФ.

Изучение действия красной части спектра на активность СДГ позволило установить, что фитохромная система принимает непосредственное участие в этом процессе. Анализ генмодифицированных растений Arabidopsis thaliana дефицитных по генам фитохромов А и В показал, что КС влиял на генетический аппарат клетки, уменьшая экспрессию гена sdhl-2 в растениях дикого типа и мутанта по гену phyb-1, что свидетельствует о пассивность фитохрома В в регуляции функционирования СДГ. Дефицит по гену phya-201 в растениях А. Thaliana, указывает что активная форма фитохрома А принимает непосредственное участие в экспрессионной регуляции активности СДГ, угнетая ее функционирование, тогда как неактивная форма оказывает противоположный эффект. Интересно, что ранее в растениях А. thaliana была выявлена регуляция экспрессии генов, кодирующих НАДН-дегидрогеназу фитохромной системой. Активная форма фитохрома А вызывала активацию работы промоторной области гена ndal, что проявлялось в увеличении его экспрессии [Matthew et al, 2004]. Изменения в активности СДГ в мутантах по гену phya-201 под действием белого света можно объяснить метаболитной регуляцией. Так, установлено, что активность СДГ в значительной степени зависит от количества энергетических эквивалентов в клетке. Высокие концентрации АТФ (более 30 мкМ) приводят к снижению интенсивности работы фермента, в то время как большие количества АДФ вызывают противоположный эффект. Сходные результаты были получены ранее при изучении действия различных энергетических эквивалентов на скорость окисления продуктов в интактных митохондриях [Affourtit et al, 2001].

Исследование уровня экспрессии генов, кодирующих комплекс СДГ, позволяет показать, что в зависимости от условий освещения меняется уровень экспрессии гена ответственного за синтез флавин-содержащей субъединицы СДГ. На свету активная форма фитохрома А блокирует экспрессию гена кодирующего субъединицу А СДГ, при этом в клетке снижается уровень мРНК фермента. Противоположный эффект наблюдается в темноте, когда активная форма фитохрома А переходит в неактивную, ген начинает активно транскрибироваться, что приводит к увеличению концентрации мРНК в клетке.

Таким образом, полученные данные позволяют разработать гипотетическую схему биохимического механизма световой регуляции функционирования СДГ в растительной клетке. Выявлено два уровня регуляции активности СДГ - метаболитный и экспрессионный (рис. 14). В светлое время суток доминирует фотосинтетическая ассимиляция, обеспечивающая организм энергией. Фотосинтетический АТФ ингибирует работу СДГ. Важное значение имеет экспрессионная регуляция, в которой участвует фитохромная система. Активная форма фитохрома блокирует экспрессию гена субъединицы А СДГ, уменьшая количество мРНК СДГ. В темноте активная форма фитохрома переходит в неактивную, индуцируя экспрессию гена субъединицы А СДГ и количество мРНК возрастает, что по-видимому обуславливает синтез пептидов СДГ-комплекса, необходимого для активного функционирования ЦТК и ЭТЦ.

Рис. 14 Гипотетическая схема световой регуляции функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений

«+» - активирующее действие на сукцинатдегидрогеназу;

«-» - ингибирование функционирования сукцинатдегидрогеназы.

Выводы

1. Установлено, что гетерогенный белый свет вызывает ингибирование активности СДГ в листьях кукурузы. Однако, световое торможение функционирования исследуемого фермента не полное, что, вероятно, обусловлено его полифункциональностью, в том числе обеспечение анаплеротической функции ЦТК.

2. Показана зависимость величины активности СДГ от состояния фитохромной системы. У растений А. ИгаКапа дикого типа и дефицитных по генам фитохрома В активная форма фитохрома А ингибирует активность СДГ. Мутация по генурЬ.уа снимает данный эффект.

3. Получение в гомогенном состоянии СДГ из зеленых листьев кукурузы (удельная активность 4,47 Е/мг белка, степень очистки - 73,23 раза, выход -26 %) позволило исследовать прямое воздействие гетерогенного света на белковую молекулу. Свет различной интенсивности и спектрального состава не оказывал прямого влияния на активность высокоочищенного препарата сукцинатдешдрогеназы.

4. Показан косвенный механизм световой регуляции СДГ в листьях растений, осуществляемый через изменение концентрации энергетических эквивалентов клетки. Регулирующее действие на гомогенный препарат сукцинатдегидрогеназы оказывает соотношение АТФ/АДФ, что указывает на взаимосвязь активности изучаемой ферментативной системы и энергетического состояния клетки.

5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей субъединицы А сукцинатдегидрогеназы из разных организмов позволил обнаружить 2 высококонсервативных участка, соответствующих активному центру фермента. Сконструированные праймеры обладали высокой специфичностью к гену ййЬа и имеют только одну специфическую мишень в наборе кДНК листьев кукурузы.

6. После секвенированием ПЦР-продуктов установлена специфичность подобранных праймеров. Нуклеотидная последовательность ампликона высокогомологична участку гена $<1М-2 арабидопсиса, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы в генетической базе данных ЫСВ1. Кроме того установлена высокая степень гомологии (около 80%) с генами других организмов, свидетельствующая о консервативности данного фермента у организмов разных таксономических групп.

7. Методом Нозерн дот-гибридизации выявлено, что световой режим оказывал влияние на уровень экспрессии гена кодирующего СДГ арабидопсиса. Красный свет (660нм) снижал концентрацию мРНК исследуемого фермента, однако дальний красный свет (730нм) вызывал обратный эффект. Установлена четкая корреляция между динамикой содержания мРНК и степенью ингибирования активности СДГ.

8. Методом ПЦР-РВ установлена зависимость уровня экспрессии гена $<1Ы-2 арабидопсиса и гена айЬа кукурузы от условий освещения. Низкая экспрессия гена СДГ является следствием его репрессии активной формой фитохрома А. Механизм регуляции экспрессии гена может осуществляться

через изменение активности факторов транскрипции вторичными мессенжерами (Са2+, цГМФ и др.).

9. Предлагается гипотетическая схема световой регуляции функционирования СДГ в растительной клетке. Метаболический уровень обусловлен энергетическим потенциалом клетки, а для экспрессионной регуляции важным механизмом является фитохромная система, и в частности активный фитохром А.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Очистка и регуляторные свойства сукцинатдепздрогеназы из щитков кукурузы / ... Д.Н. Федорин [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2002. - С. 104-108.

2. Федорин Д.Н. Механизм регуляции сукцинатдегидрогеназы из щитков кукурузы / Д.Н. Федорин, Ю.А. Леонова, В.Н. Попов // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2003. - С. 154159.,

3. Федорин Д.Н. Регуляция сукцинатдегидрогеназы в растениях красным светом / Д.Н. Федорин, Ю.А. Леонова, В.Н. Полов // 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Тез. докл. - Пущино, 2003. - с. 385.

4. Регуляция активности сукцинатдегидрогеназы красным и дальним красным светом / Д.Н. Федорин [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2004. - С. 159-164.

5. Регуляция метаболизма растений фитохромной системой / Д.Н. Федорин, В.Н. Попов, А.Т. Епринцев // 9-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Тез. докл. - Пущино, 2005. - С. 100.

6. Выделение и очистка сукцинатдегидрогеназы из изолированных митохондрий листьев кукурузы / Д.Н. Федорин [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы, 2005. - Т.5. - Внп.1. - С.104-108.

7. Регуляция активности сукцинатдегидрогеназы красным светом / Д.Н. Федорин [и др.] // Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». - Вологда, 2005. - С. 102.

8. Light influence on succinate dehydrogenase activity in maize leaves / D N. Fedorin [et al.] // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2005. - Vol. I. - №. 1, P. 30-36.

9. Действие красного и дальнего красного света на активность сукцинатдегидрогеназы Arabidopsis thaliana / Д.Н. Федорин [и ДР-1 Н Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж, -2005. - С.175-180.

10. Федорин Д.Н. Роль красного света в регуляции некоторых ферментов дыхательного метаболизма / Д.Н. Федорин // Труды молодых ученых ВГУ. -Воронеж, 2005. - Вып. 1-2. - С. 112-115.

11. Федорин Д.Н. Экспрессия сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы на свету / Д.Н. Федорин, А.Т. Епринцев, В.Н. Попов // Вестник ВГУ, сер. Химия. Биология. Фармация. - 2005. - № 2. - С. 157-159.

12. Регуляция красным светом активности сукцинатдегидрогеназы, мапатдегидрогеназы и изоцитратлиазы из кукурузы / Д.Н. Федорин [и др.] //

Регуляция продуктивного процесса сельскохозяйственных растений. Материалы научно-практической конференции. - Орел, 2006. - Часть 1. - С. 5558.

13.Федорин Д.Н. Участие фитохромной системы в регуляции энергетического метаболизма зеленых листьев кукурузы / Д.Н.Федорин, В.Н. Попов // 9-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Тез. докл. - Пущино, 2006, - С. 97.

14. Федорин Д.Н. Идентификация сукцинатдегидрогеназы в зеленых листьях кукурузы на свету / Д.Н. Федорин, М.А. Бондаренко, А.Т. Епринцев // Материалы I (IX) Международной конференции молодых ботаников. - Санкт-Петербург, 2006. - С. 208.

15. Экспрессия генов субьединицы А сукцинатдегидрогеназы в щитке и зеленых листьях Zea mayse L. / Д.Н. Федорин [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2006. - С. 206-210.

16. Федорин Д.Н. Анализ экспрессии генов сукцинатдегидрогеназы в щитках и зеленых листьях кукурузы / Д.Н. Федорин, В.Н. Попов, А.Т. Епринцев // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2006. № 2. С. 180-183.

17. Попов В.Н. Световая регуляция экспрессии сукцинатдегидрогеназы в листьях Arabidopsis thaliana. / В.Н. Попов, Д.Н. Федорин, А.Т. Епринцев // Физиология растений, 2007. - Т. 54. - № 3. - С. 1-7.

Статья № 17 опубликована в журнале, входящих в список ВАК.

Подписано в печать 16.03.2007. Формат 60x84/16. Усл. п.л. 1,50. Тираж 100. Заказ 142. Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. 394006, г. Воронеж, Университетская площадь, 1, ком 43, тел.208-853. Отпечатано в лаборатории оперативной печати ИПЦ ВГУ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федорин, Дмитрий Николаевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Фоторецепторные системы растений

1.1.1. Структура и свойства фитохрома

1.1.2. Механизм передачи фитохромного сигнала

1.1.3. Реализация фитохромного сигнала в клетке

1.1.4. Влияние света на темновое дыхание . 20 1.1.4.1. Влияние света на активность цикла трикарбоновых кислот

1.2. Общая характеристика сукцинатдегидрогеназной системы

1.2.1. Метаболические пути, в которых участвует 25 сукцинатдегидрогеназа

1.2.2. Структура белковой молекулы сукцинатдегидрогеназы

1.2.3. Генетическая детерминация сукцинатдегидрогеназы

1.3. Молекулярные аспекты регуляции сукцинатдегидрогеназы

1.3.1. Регуляция работы фермента интермедиатами клетки

1.3.2. Регуляция сукцинатдегидрогеназны светом

1.3.3. Регуляция сукцинатдегидрогеназы на генетическом уровне

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Цели и задачи

2.2 Объекты исследования

2.2.1 Объекты исследования

2.2.2 Постановка эксперимента по созданию светового режима

2.2.3 Определение активности фермента

2.2.5 Схема очистки сукцинатдегидрогеназы из зеленых листьев 51 кукурузы

2.2.6 Электрофоретическое исследование очищенного препарата 52 фермента

2.2.7 Экстракция суммарной РНК из листьев растений

2.2.8 Проведение обратной транскрипции

2.2.9 Подбор специфических праймеров

2.2.10 Проведение полимеразной цепной реакции

2.2.11 Секвенирование ПЦР-продукта

2.2.12 Проведение Нозерн дот-гибридизации

2.2.13 Проведение ПЦР в реальном времени

2.2.14 Статистическая обработка данных 2.3 Результаты и их обсуждение

2.3.1 Действие гетерогенного света на активность 59 сукцинатдегидрогеназы

2.3.1.1 Влияние гетерогенного света на активность 59 сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы

2.3.1.2 Изменение активности сукцинатдегидрогеназы листьев 59 кукурузы при смене светового режима

2.3.1.3 Активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы, 62 экспонируемой в условиях «темнота-свет»

2.3.1.4 Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в листьях 64 кукурузы при деэтиоляции растений

2.3.2. Очистка и физико-химические свойства СДГ

2.3.2.1 Влияние белого света на активность изолированного 69 препарата фермента сукцинатдегидрогеназы

2.3.2.2 Очистка фермента из листьев кукурузы

2.3.2.3 Действие гетерогенного света на изолированную молекулу 69 сукцинатдегидрогеназы

2.3.2.4 Влияние АТФ на активность изолированной 72 сукцинатдегидрогеназы

2.3.2.5 Действие АДФ на активность сукцинатдегидрогеназы

2.3.2.6 Влияние различных солей на активность 76 сукцинатдегидрогеназы

2.3.2.7 Влияние хлорида калия на 'активность сукцинатдегидрогеназы

2.3.3 Роль фитохромной системы в регуляции активности 81 сукцинатдегидрогеназы в растениях в условиях различного светового режима

2.3.3.1 Влияние КС и ДКС на активность сукцинатдегидрогеназы 83 в листьях кукурузы

2.3.3.2 Влияние КС и ДКС на функционирование 86 сукцинатдегидрогеназной системы в листьях арабидопсиса дикого типа

2.3.3.3 Влияние КС и ДКС на сукцинатдегидрогеназу в листьях 89 арабидопсиса, мутантного по гену фитохрома А

2.3.3.4 Влияние КС и ДКС на сукцинатдегидрогеназу листьев 93 арабидопсиса мутантный по гену фитохрома В

2.3.4 Механизм регуляции активности сукцинатдегидрогеназы 96 фитохромной системой

2.3.4.1 Идентификация гена, кодирующего субъединицу А 96 сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы

2.3.4.2. Секвенирование продукта, полученного методом пцр с 101 ген-специфицескими праймерами

2.3.4.3 Механизм регуляции экспрессии сукцинатдегидрогеназы

2.3.4.3.1 Изменение количества мрнк гена sdhl-2 при разных 103 световых режимах

2.3.4.3.2 Изменение экспрессии сукцинатдегидрогеназы в 106 листьях арабидопсиса при разных световых режимах

2.3.4.3.3 Уровень экспрессии сукцинатдегидрогеназы в листьях 112 кукурузы в разных условия освещения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Световая регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений"

Актуальность проблемы. Одной из наиболее интересных проблем современной физиологии растений является взаимодействие процессов дыхания и фотосинтеза. Цикл Кребса играет центральную роль в жизнедеятельности растений, обеспечивая темповое дыхание, а также многие анаплеротические реакций [46, 15].

Одной из ключевых реакций цикла, сопряженной с запасанием энергии, является реакция окисления сукцината до фумарата, катализируемая сукцинатдегидрогеназой (СДГ, КФ 1.3.99.1), единственным ферментом цикла трикарбоновых кислот, встроенным во внутреннюю мембрану митохондрий. В процессе протекания данной реакции образуется ФАДН2, который может использоваться как источник энергии для различных процессов. СДГ -компонент не только цикла Кребса, но и ЭТЦ митохондрий, поэтому его регуляция связана с функционированием сразу двух ключевых процессов.

Изучение роли отдельных метаболитов клетки в регуляции энергетических процессов клетки, в том числе и дыхания, в большинстве своем, направлена на выяснение способов влияния различных интермедиатов (АТФ, различных ионов, оргкислот и др.) на работу целостной митохондриальной системы, а не отдельных ее ферментативных компонентов [35, 109, 120]. Кроме того, недостаточно много данных о прямом воздействии света различной интенсивности и спектрального состава на ферментативные системы, содержащие хромофорные группировки, такие как ФАД и ФМН [44]. Такие исследования позволяют оценить механизм прямого и опосредованного влияния на работу фермента.

Обзор литературы показал противоречивость данных по влиянию света на дыхание и ЦТК при изучении ферментативных систем, однако сам факт регуляции их светом уже никем не оспаривается [30, 27]. Данные о влиянии света на дыхательный метаболизм весьма многочисленны, однако работ, посвященных выяснению механизмов действия света на активность дыхательных ферментов практически нет.

Одним из возможных опосредованных механизмов, с помощью которого может осуществляться регуляция этих процессов, может быть участие фитохромной системы. Ранее было установлено, что фитохромная система участвует в регуляции активности некоторых ферментов дыхания растений [94]. Свое воздействие фитохромая система может оказывать либо самостоятельно влияя на функционирование ферментов, либо проявлять свое действие через различные вторичные мессенжеры, такие как ионы Са2+, в-белки, цАМФ [5, 51]. Эффект фитохрома может проявляться в изменении состояния клеточных мембран, в том числе и митохондриальной, или воздействием на генетический аппарат клетки посредством различных сигнальных систем, регулируя интенсивность экспрессии гейов [34, 95,157].

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние гетерогенного и красного и дальнего красного света на активность сукцинатдегидрогеназы в листьях кукурузы.

2. Определить роль различных форм фитохрома в регуляции СДГ-активности, изучив действие КС и ДКС на мутантные растения А. (ЬаНапа.

4. Исследовать действие различных концентраций АТФ и АДФ на активность перпарата сукцинатдегидргеназы.

7. Провести количественный анализ уровня экспрессии гена б(1И1-2 арабидопсиса и ясИга кукурузы в условиях разного светового режима методом ПЦР в реальном времени.

Изучен механизм световой регуляции СДГ активной формой фитохрома А и установлено, что его действие проявляется в регуляции экспрессии гена, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы. Фотоактивный фитохром блокирует транскрипцию гена зс1111-2 в листьях арабидопсиса и хдка в листьях кукурузы, что приводит к уменьшению количества их мРНК в клетке, что четко коррелирует с угнетением активности фермента в листьях растений под действием красного света.

Получение гомогенного препарата СДГ позволило установить, что его активность сильно зависит от энергетического состояния клетки и концентрации АТФ и АДФ. Показано, что повышение количества АТФ в среде приводит к ингибированию СДГ. Кроме того, выявлена активирующая роль ионов СГ на скорость работы фермента. Установлено, что световая регуляция СДГ опосредованна через фитохромную систему. Исследования мутантных форм А. ШаНапа позволили установить, что в качестве регулятора функционального состояния фермента выступает фитохром А, активная форма которого ингибирует активность СДГ.

Работа расширяет и углубляет знания о механизмах регуляции СДГ в листьях растений в условиях изменения светового режима. Установленное участие фитохромной системы, в частности фитохрома А, в регуляции СДГ является одним из механизмов координирующих взаимосвязь фотосинтеза и дыхания растений. Полученные данные по экспрессии генов яс1И1-2 арабидопсиса и sdha кукурузы указывают на функциональные изменения в работе генетического аппарата клетки в течение суток в' зависимости от источника энергии.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (169 источников). Иллюстрационный материал включает 28 рисунков и 6 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Федорин, Дмитрий Николаевич

Выводы

2. Показана зависимость величины активности СДГ от состояния фитохромной системы. У растений А. йаИапа дикого типа и дефицитных по генам фитохрома В активная форма фитохрома А ингибирует активность СДГ. Мутация по гену рИуа снимает данный эффект.

3. Получение в гомогенном состоянии СДГ из зеленых листьев кукурузы (удельная активность 4,47 Е/мг белка, степень очистки - 73,23 раза, выход - 26 %) позволило исследовать прямое воздействие гетерогенного света на белковую молекулу. Свет различной интенсивности и спектрального состава не оказывал прямого влияния на активность высокоочищенного препарата сукцинатдегидрогеназы.

5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей субъединицы А сукцинатдегидрогеназы из разных организмов позволил обнаружить 2 высококонсервативных участка, соответствующих активному центру фермента. Сконструированные праймеры обладали высокой специфичностью к гену вдка и имеют только одну специфическую мишень в наборе кДНК листьев кукурузы.

6. После секвенированием ПЦР-продуктов установлена специфичность подобранных праймеров. Нуклеотидная последовательность ампликона высокогомологична участку гена арабидопсиса, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы в генетической базе данных ЫСВ1. Кроме того установлена высокая степень гомологии (около 80%) с генами других организмов, свидетельствующая о консервативности данного фермента у организмов разных таксономических групп.

8. Методом ПЦР-РВ установлена зависимость уровня экспрессии гена 8(0x1-2 арабидопсиса и гена зйка кукурузы от условий освещения. Низкая экспрессия гена СДГ является следствием его репрессии активной формой фитохрома А. Механизм регуляции экспрессии гена может осуществляться через изменение активности факторов транскрипции вторичными мессенжерами (Са2+, цГМФ и др.).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные по световой регуляции активности СДГ в растениях показали, что на свету происходит значительное ингибирование исследуемого фермента. Однако сохраняющийся небольшой уровень активности СДГ, вероятно, связан с необходимостью участия ЦТК в поставке субстратов для биосинтетических процессов [9, 30]. Основным фактором в регуляции процессов дыхания и фотосинтеза является свет, который в растительной клетке может проявлять свое действие, как через фоторецепторы, так и через клеточные метаболиты, синтезированные фотосинтетическим путем.

Получение СДГ в гомогенном состоянии (удельная активность 4,46 Е/мг белка и степень очистки 73,23 раза) позволило установить, что прямое действие света на фермент не приводит к изменениям его активности, хотя в состав имеется ФАД, поглощающий свет с длинной волны 430-450нм. Световая регуляции СДГ может осуществляться опосредованным механизмом через интермедиа™ фотосинтеза. Установлено, что работа сукцинатдегидрогеназы в большой степени зависит от содержания энергетических эквивалентов клетки. Высокие концентрации АТФ (более 30 мкМ) вызывают сильное ингибирование фермента, в то время как низкие уровень нуклеотидов (10 мкМ) активирует СДГ, что, по-видимому, связано с эффектом «дыхательного контроля» [35]. В последних работах отмечается, что соотношение АТФ/АДФ регулирует функционирование СДГ через опосредованный механизм [3]. На свету большие концентрации фотосинтетического АТФ угнетают активность СДГ и темновое дыхание в целом. Противоположный эффект наблюдается в темноте, когда количество АТФ снижается и увеличивается концентрация АДФ.

Изучение действия красной части спектра на активность СДГ позволило установить, что фитохромная система принимает непосредственное участие в этом процессе. Анализ генмодифицированных растений ЛгаШорш 1ИаИапа дефицитных по генам фитохромов А и В показал, что КС влиял на генетический аппарат клетки, уменьшая экспрессию гена 8сИ\1-2 в растениях дикого типа и мутанта по гену рЬуЬ-1, что свидетельствует о пассивность фитохрома В в регуляции функционирования СДГ. Дефицит по гену рИуа-201 в растениях А. ТкаИапа, указывает что активная форма фитохрома А принимает непосредственное участие в экспрессионной регуляции активности СДГ, угнетая ее функционирование, тогда как неактивная форма оказывает противоположный эффект. Интересно, что ранее в растениях А. МаИапа была выявлена регуляция экспрессии генов, кодирующих НАДН-дегидрогеназу фитохромной системой. Активная форма фитохрома А вызывала активацию работы промоторной области гена пс1а1, что проявлялось в увеличении его экспрессии [94]. Изменения в активности СДГ в мутантах по гену ркуа-201 под действием белого света можно объяснить метаболитной регуляцией. Так, установлено, что активность СДГ в значительной степени зависит от количества энергетических эквивалентов в клетке. Высокие концентрации АТФ (более 30 мкМ) приводят к снижению интенсивности работы фермента, в то время как большие количества АДФ вызывают противоположный эффект. Сходные результаты были получены ранее при изучении действия различных энергетических эквивалентов на скорость окисления продуктов в интактных митохондриях [109].

Таким образом, полученные данные позволяют разработать гипотетическую схему биохимического механизма световой регуляции функционирования СДГ в растительной клетке. Выявлено два уровня регуляции активности СДГ - метаболитный и экспрессионный (рис. 28). В светлое время суток доминирует фотосинтетическая ассимиляция, обеспечивающая организм энергией. Фотосинтетический АТФ ингибирует работу СДГ. Важное значение имеет экспрессионная регуляция, в которой участвует фитохромная система. Активная форма фитохрома А блокирует экспрессию гена субъединицы А СДГ, уменьшая количество мРНК СДГ. В темноте активная форма фитохрома переходит в неактивную, индуцируя экспрессию гена субъединицы А СДГ и количество мРНК возрастает, что по-видимому обуславливает синтез пептидов СДГ-комплекса, необходимого для активного функционирования ЦТК и ЭТЦ.

ТЕМНОТА

СВЕТ

Фитохром А (активный) цГМФ ! Са2+

Фитохром А (неактивный) отосинтез мРНК

БОНА мРНК

АТФ

АТФ интермедиаты малоактивная) активная)

10мкМ)

30мкМ)

Рис. 28 Гипотетическая схема световой регуляции сукцинатдегидрогеназы в листьях растений - активирующее действие на сукцинатдегидрогеназу;

-» - ингибирование функционирования сукцинатдегидрогеназы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорин, Дмитрий Николаевич, Воронеж

1. Авдонин П.В. Рецепторы и внутриклеточный кальций / П.В. Авдонин,

2. B.А. Ткачук. М. :Наука, 1994. - 285с.

3. Березов Т.Т. Биологическая химия: учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1998. - 704с.

4. Болдырев A.A. Биомембранология: учеб. пособие / A.A. Болдырев, Е.И. Кяйвяряйнен, В.А. Илюха. Петрозаводск: Изд-во Кар НЦ РАН, 2006. -226с.

5. Виноградов А.Д. Сукцинат-убихинон редуктазный участок дыхательной цепи / А.Д. Виноградов // Биохимия. 1986. — Т. 51. — №12.-С. 1944-1973.

6. Волотовский И.Д. Са2+ и внутриклеточная сигнализация вл ,растительной клетке: роль Ca в фитохромной трансдукции / И.Д. Волотовский // Биологические мембраны. 1998. - Т. 15. - №5. - С. 573-587.

7. Волотовский И.Д. Фитохром регуляторный фоторецептор растений / И.Д. Волотовский. - Мн.: Навука i тэхшка, 1992. - 168с.

8. Гаврикова Э.К. Новый каталитический активный центр сукцинатдегидрогеназы: Митохондрии. Аккумуляция энергии и регуляция ферментативных процессов / Э.К. Гаврикова, В.Г. Головешкина, А.Д. Виноградов. Москва, 1977. - С. 123-130.

9. Головко Т.К. Дыхание растений / Т.К. Головко. СПб. : Наука, 1999.1. C. 204.

10. Гудвин Т. Введение в биохимию растений: В 2 т. / Т. Гудвин, Э. Мерсер; Пер. с англ. А.О. Ганаго и др., Под ред. В.А. Кретовича. М.: Мир, 1986. - Т. 1 - 392с., Т. 2 - 312с.

11. Действие красного и дальнего красного света на активность сукцинатдегидрогеназы Arabidopsis thaliana / А.Т. Епринцев и др. //

12. Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. -Воронеж: Центрально-Черноземное книжн. изд-во, 2005. С. 175-180.

13. Епринцев А.Т. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А.Т. Епринцев, Е.А. Москалёв, В.Н. Попов // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. 2001. - № 1. - С. 9-14.

14. Епринцев А.Т. Ферментативная регуляция метаболизма ди- и трикарбоновых кислот в растениях / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов -Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1999. 192 с.

15. Епринцев А.Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, М.Ю. Шевченко. Воронеж. : Центр. Черн. Книжное изд-во, 2005. - 224с.

16. Зайцева М.Г. Наполнение и потери катионов митохондриями при изменении их метаболических состояний / М.Г. Зайцева, Н.К. Зубкова // Физиология растений. 1979. - Т. 26. - С. 1085.

17. Заленский О.В. О метаболических связях между циклом Кальвина и циклом Кребса / О.В. Заленский, Е.К. Зубкова // Физиол. и биохим. культурных растений. 1985. - Т. 17. - С. 253-256.

18. Землянухин A.A. Большой практикум по физиологии растений / A.A. Землянухин, Л.А. Землянухин. Учеб. пособие. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та., 1996. - 188с.

19. Землянухин A.A. Выделение и характеристика изоцитратлиазы из щитка кукурузы / A.A. Землянухин, А.У. Игамбердиев, E.H. Преснякова // Биохимия. 1986. - Т. 51. - Вып. 3. - С. 442-442.

20. Землянухин A.A. Действие видимого света на метаболизм этиолированных растений / A.A. Землянухин, JI.H. Чеботарев // Тезисы докладов всесоюзной конференции. Киев. 1975. - С. 80-86.

21. Землянухин A.A. Метаболизм органических кислот растений / A.A. Землянухин, J1.A. Землянухин. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1995.-С. 150-152.

22. Игамбердиев А.У. Выделение и характеристика сукцинатдегидрогеназного комплекса митохондрий растений / А.У. Игамбердиев, М.И. Фалалеева // Биохимия. 1994. - Т. 59. - №8. - С. 1198-1199.

23. Кондрашова М.Н. Гомеостазирование физиологиеских функций на уровне митохондрий / М.Н. Кондрашова, Е.Б. Григоренко, A.M. Бабский // Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза. 1987. -С. 40-66.

24. Кондрашова М.Н. Терапевтическое действие янтарной кислоты / М.Н. Кондрашова. Пущино, 1996. - 162с.

25. Котляр A.B. Активация комплекса I в реакции окисления НАДН и в Н-зависимом восстановлении НАД+ сукцинатом / A.B. Котляр // Биохимия. 1990.-Т. 55.-№2.-С. 195-200.

26. Котляр A.B. Константы дисоциации комплексов СДГ с сукцинатом, фумаратом и малонатом / A.B. Котляр, А.Д. Виноградов // Биохимия. -1984. Т. 49. - С. 511-518.

27. Кулинский В.И. Передача и трансдукция гормонального сигнала в разные части клетки / В.И. Кулинский // Соросовский образовательный журнал, 1997. - № 8. - С. 14-19.

28. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. Москва: Высш. шк., 1990. -351с.

29. Мамушина Н.С. Взаимодействие фотосинтеза и дыхания в одноклеточных морских водорослях и высших Сз-растениях / Н.С. Мамушина, Е.К. Зубкова, О.В. Войцеховская // Физиология растений. -1997.-Т. 44. №3. - С. 449-461.

30. Мамушина Н.С. Функционирование основных этапов темнового дыхания на свету у Сз растений с разным сезонным ритмом. / Н.С. Мамушина, Б.К. Зубкова // Физиология растений. 1995. - Т. 42. - №1. -С. 30-37.

31. Мурей И.А. Взаимосвязь между фотосинтезом и темновым модифицированным дыханием на свету у кукурузы / И.А. Мурей, З.Ф. Рахманкулова // Физиология растений. 1990. - Т. 37. - №3. - С. 462467.

32. Мурей И.А. Взаимосвязь между фотосинтезом и темновым модифицированным дыханием на свету у кукурузы / И.А. Мурей, З.Ф. Рахманкулова // Физиология растений. 1990. - Т. 37. - №3. - С. 462467.

33. Ракитин A.B. Действие красного света в смешанном светопотоке на продукционный процесс растений. / A.B. Ракитин. Томск, 2001. - 21с.

34. Романова Т.Д. Изменение темнового дыхания и его отдельных компонентов в процессе зеленения и после действия экстремальной температуры / Т.Д. Романова, О.Г. Курбская // Физиология и биохимия культурных растений. 1987. - Т. 19. - №5. - С. 461 -467.

35. Саакян И.Р. Активация и ингибирование сукцинатзависимого транспорта кальция в митохондриях печени при развитии адаптационных реакций / И.Р. Саакян, С.Г. Саакян, М.Н. Кондрашова // Биохимия. 2001. - Т. 66. - №7. - С. 976-984.

36. Синещеков В.А. Система фитохромов: фотобиофизика и фотобиохимия Irt Vivo / В.А. Синещеков // Биол. Мембраны. 1998. - Т. 15.-С. 549-571.

37. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. Биохимия мембран. / В.П. Скулачев. М.: Высш. Школа, 1990.

38. Титок В.В. Активность дыхательного метаболизма в проростках льна-долгунца / В.В. Титок, С.И. Юренкова, JI.B. Хотылева // Физиология и биохимия культурных растений. 2000. - Т. 32. - №3. - С. 184-188.

39. Феденко Е.П. Система цАМФ как посредник фитохрома в действии света / Е.П. Феденко, К.К. Касумов, В.Н. // Лапко Физиология и биохимия культурных растений. 1995. - Т. 27. - № 1-2. - С. 3-11.

40. Физиология растений: учебник для студ. Вузов / под ред. И.П. Ермакова. М.: Издат. центр Академия, 2005. - 640с.

41. Филиппова Л.А. О функционировании основных этапов темнового дыхания во время фотосинтеза / Л.А. Филиппова, Н.С. Мамушина, О.В. Заленский // Ботан. Журнал. 1982. - Т. 67. - №9. - С. 1169-1178.

42. Филиппова Л.А. Развитие представлений о взаимосвязи фотосинтеза и дыхания. / Л.А.Филиппова, Н.С. Мамушина, Б.К. Зубкова // Эколого-физиологическое исследование фотосинтеза и дыхания растений. Л. : Наука, 1989.-С. 168-183.

43. Филиппова Л.А. Эколого-физиологическое исследование фотосинтеза и дыхания растений / Л.А. Филиппова, Н.С. Мамушина, Б.К. Зубкова. -Л.: Наука, 1989.-С. 168-183.,

44. Шахов А.А. Фотоэнергетика растений и урожай / А.А. Шахов. М. : Наука, 1993.-411с.

45. Шумилова А.А. Влияние света на функционирование цикла Кребса в листьях кукурузы / А.А. Шумилова, А.А. Федосенко, A.M. Степанова // Биол. Науки. -1967. №9. - С. 87.

46. Activation of flavin-containing oxidases underlies light-induced production of H202 in mammalian cells / P.E. Hockberger et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - Vol. 96. - P. 6255-6260.

47. Arabodopsis thaliana модельный объект генетических исследований / Т.А. Ершова и др.. - М.: МАКС Пресс, 2003. - 220с.

48. Beale S. Biosynthesis of the Tetrapyrrole Pigment Precursor, -Aminolevulinic Acid, from Glutamate / S. Beale // Plant Physiol. 1990. -Vol. 93.-№4. P. - 1273-1279.

49. Boore J. Animal mitochondrial genomes / J. Boore // Nucleic Acids Res. -1999.-Vol. 27.-P. 1767-1780.

50. Bowler C. Emerging themes of plant signal transduction / C. Bowler, N-H Chua//Plant Cell.-1994.-Vol. 6.-P. 1529-1541.

51. Briggs W.R. Blue-light receptors in higher plants / W.R. Briggs, E. Huala // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. - Vol. 15. - P. 33-62.

52. Bullis B.L. Isolation and characterization of the Saccharomyces cerevisiae SDH4 gene encoding a membrane anchor subunit of succinate dehydrogenase / B.L. Bullis, B.D. Lemire // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 6543-6549.

53. Calcium and cGMP target distinct phytochrome-responsive elements / Y. Wu etal.//Plant J. 1996.-Vol. 10.-P. 1149-1154.

54. Casal J.J. The function of phytochrome A / J.J. Casal, R.A. Sanchez, M.J. Yanovsky // Plant, Cell & Environment. 1997. - Vol. 20. - P. 813-819.

55. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae nuclear gene CYB3 encoding a cytochrome b polypeptide of respiratory complex II / P.R Abraham et al. // Mol. Gen.Genet. 1994. - Vol. 242. - P. 708-716.

56. Chomczynski P. Single-Step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. -1987. Vol. 162. - P. 156-159.

57. Clack T. The phytochrome apoprotein family in Arabidopsis is encoded by five genes: the sequences and expression of PHYD and PHYE. / T. Clack, S. Mathews, R.A. Sharrock // Plant Molecular Biology. 1994. - Vol. 25. - P. 413-427.

58. Clapham D.E. Calcium signaling / D.E. Clapham // Cell. 1995. - V. 80. -№2. - P. 259-268.

59. Cooper T.G. Mitochondria and glyoxysomes from castor bean endosperm, enzyme constitutents and catalytic capacity / T.G. Cooper, H.J. Beevers // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244. - P. 3507-3513.

60. Cyclic GMP and calcium mediate phytochrome phototransduction / C. Bowler et al. // Cell. 1994. - Vol. 77. - P. 73-81.

61. Davis B.J. Disc electrophoresis II. Method and aplication to human serum protein / B.J. Davis // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 121. - P. 404427.

62. De-etiolated 1 (DET1) and damaged DNA binding protein 1 (DDB1) interact to regulate Arabidopsis photomorphogenesis / D.F. Schroeder et al. // Curr. Biol.-2002.-Vol. 12.-P. 1462-1472.

63. Devlin P.F. Phytochrome E influences internode elongation and flowering time in Arabidopsis / P.F. Devlin, S.R. Patel, G.C. Whitelam // Plant Cell. -1998.-Vol. 10.-P. 1479-1487.

64. Differences in protonation of ubiquinone and menaquinone in fiimarate reductase from Escherichia coli / E. Maklashina et al. // J. Biol. Chem. -2006. Vol. 281. - P. 26655-26664.

65. Direct inhibition of plant mitochondrial respiration by elevated CO2 / M.A. Gonzalez-Meier et al. // Plant Physiol. 1996. - Vol. 112. - P. 13491355.

66. Escherichia coli fumarate reductase frdC and frdD mutants: Identification of amino acid residues involved in catalytic activity with quinines / D.J. Westenberg et al. //J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 815-822.

67. Fankhauser C. The Phytochromes, a Family of Red/Far-red Absorbing Photoreceptors / C. Fankhauser // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 11453-11456.

68. Far-red light-insensitive, phytochrome A-deficient mutanfs of tomato / Van Tuinen A. et al. // Mol. Gen. Genet. 1995. - Vol. 246. - P. 133-141.

69. Figueroa P. Three different genes encode the iron-sulfur subunit of succinate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana / P. Figueroa // Plant. Mol. Biol. -2001.-Vol. 46.-P. 241-250.

70. Furuya M. Phytochrome distribution in living organisms / M. Furuya // Plant Phisiol. 1968. - Vol. 41. - P. 1242-246.

71. Gardestrom P. Influence of photorespiration on ATP/ADP ratios in the chloroplasts, mitochondria, and cytosol, studies by rapid fractionation ofbarley (Hordeum vulgare) protoplasts / P. Gardeström, B. Wigge // Plant Physiol. 1988. - Vol. 88. - P. 69-76.

72. Gene organization deduced from the complete sequence of liverwort Marchantia polymorpha mitochondrial DNA. A primitive form of plant mitochondrial genome / K Oda et al. // J. Mol. Biol. 1992. - Vol. 223. - P. 1-7.

73. Genes encoding the same three subunits of respiratory complex II are present in the mitochondrial DNA of two phylogenetically distant eukaryotes / G. Burger et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. - Vol. 93.-P. 2328-2332.

74. Genome structure and gene content in protist mitochondrial DNAs / T.G. Gray et al. // Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26. - P. 865-878.

75. Giege' P. Complex II subunit 4 {sdh4) homologous sequences in plant mitochondrial genomes / P. Giege', V. Knoop, A. Brennicke // Curr. Genet. 1998.-Vol. 34.-P. 313-317.

76. Gonza'lez-Meler M.A. Direct inhibition of mitochondrial respiratory enzymes by elevated CO2: does it matter at the tissue or whole-plant level? / M.A. Gonza'lez-Meler, J.N. Siedow // Tree Physiol. 1999. - Vol. 19. - P. 253-259.

77. Grivennikova V.G. Kinetics of ubiquinone reduction by the resolved succinate: ubiquinone reductase / V.G. Grivennikova, A.D. Vinogradov // Biochem. et Biophys. Acta. 1982. - Vol. 682. -№3. - P. 491-495.

78. Hagerhall C. Succinate:quinone oxidoreductases. Variations on a conserved theme / C. Hagerhall // Biochim Biophys Acta. 1997. - Vol. 1320. - P. 107-141.

79. Harry S. Phytochromes and light signal perception by plants an emerging synthesis / S. Harry // Nature. - 2000. - Vol. 407. - P. 585-591.

80. Hederstedt. Bioenergetics: Respiration without O2 / Hederstedt // Science. -1999.-Vol. 284.-P. 1941-1942.

81. Herrington C.S. Diagnostic Molecular Pathology: A Practical Approach / C.S. Herrington, J.O.D. McGee. Oxford: Oxford Univ. Press, 1992. - P. 296.

82. Hillary E.S. A Quantum Leap in mRNA Quantitation / E.S. Hillary // The Scientist. 2000. - Vol. 14.-P. 22.

83. Identification by large-scale screening of phytochrome-regulated genes in etiolated seedlings of Arabidopsis thaliana using a fluorescent differential display technique / N. Kuno et al. // Plant Physiol. 2000. - Vol. 122. - P. 15-22.

84. Inhibitor probes of the quinone binding sites of mammalian complex II and escherichia coli fumarate reductase / V. Yankovskaya et al. // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 21020-21024.

85. Involvement of phytochrome in regulation of transpiration: red/far red-induced responses in the chlorophyll-deficient mutant of pea / S.V. Sokolovskaya et al. // Functional Plant Biology. 2003. - Vol 30. - №12. -P. 1249-1259.

86. Irena S. Photosynthetic Electron Transport Determines Nitrate Reductase Gene Expression and Activity in Higher Plants / S. Irena // The Journal of Biological Chemistry. 2002. - Vol. 277. - №48. - P. 46594^6600.

87. Kendrick R.E. Photomorphogenesis in Plants / R.E. Kendrick, G. Kronenberg // Martinus Nijhoff Publishers, 1994. 750c.

88. Kerney E.B. Regulatory properties of succinate dehydrogenase activation by succinil-CoA, pH and anions / E.B. Kerney, M. Mayr // Biochem et Biophys. Res. Communs. 1972. - Vol. 46. - P. 531-537.

89. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / / B. Tzachi et al. // Nucleic Acids Research. 2003. - Vol. 31. - P. 105-109.

90. Lagarias D.M. Atypical phytochrome gene structure in the green alga Mesotaenium caldariorum. / D.M. Lagarias, S.H. Wu, J.C. Lagarias // Plant Molecular Biology. 1995.-Vol. 29.-P. 1127-1142.

91. Lang B.F. Mitochondrial genome evolution and the origin of eukaryotes / B.F. Lang, M.W. Gray, G. Burger // Annu. Rev. Genet. 1999. - Vol. 33. -P. 351-397.

92. Lang H. Rat liver dimethylglycine dehydrogenase. Flavinylation of the enzyme in hepatocytes in primary culture and characterization of a cDNA clone / H. Lang, M. Polster, M. Brandsch // Eur. J. Biochem. 1991. Vol. 198.-P. 793-799.

93. Light quality-dependent nuclear import of the plant photoreceptors phytochrome A and B / S. Kircher et al. // Plant Cell. 1999. - Vol. 11.-P. 1445-1456.

94. Light Regulation of the Arabidopsis Respiratory Chain. Multiple Discrete Photoreceptor Responses Contribute to Induction of Type II NAD(P)H Dehydrogenase Genes / A.E. Matthew et al. // Plant Physiol. 2004. - Vol. 136.-P. 2710-2721.

95. Loppert H. Phytochrome-mediated changes in the membrane potential of subepidermal cells of Lemna paucicostata / H. Loppert, W. Kronberger, R. Kandeler// Planta.- 1978.-Vol. 138.-№2.-P. 133-136.

96. Manodori A. (3Fe-4S) to (4Fe-4S) cluster conversion in Escherichia col! fumarate reductase by site directed mutagenesis / A. Manddori, G. Cecchini, M.K. Johnson // Biochemistry. 1992. - Vol. 31. - №10. - P. 2703-2712.

97. Mark S. Adenine nucleotide levels in the cytosol, chloroplasts, and mitichondria of wheate leaf protoplasts / S. Mark, L.McC. Ross, W.H. Hans // Plant Physiol. 1982. - Vol. 70. - P. 971-977.

98. Massey V. The chemical and biological versatility of riboflavin / V. Massey // Biochem. Soc. Trans. 2000. - Vol. 28. - P. 283-296.

99. Mathews S. Phytochrome gene diversity / S. Mathews, R.A. Sharrock // Plant Cell Environment. 1997. - Vol. 20. - P. 666-671.

100. Millar A.J. Phytochrome phototransduction pathways / A.J. Millar, R.B. McGrath, N-H Chua // Annu Rev Genet. 1994. - Vol. 28. - P. 325-349.

101. Mittag T.W. Effects of inorganic ions on rabbit ciliary process adenylate cyclase / T.W. Mittag // Investigative Ophthalmology & Visual Science. -1987.-Vol 28.-P. 2049-2056.

102. Mohr H. Lectures on photomorphogenesis / H. Möhr. Heidelberg. - 1972.

103. Moyse A. La respireition des vegetaux verts a l'obscutile: Les affekts de la lumiere sur cette respiration / A. Moyse // Bull. Soc. Bot frans. 1982. -Vol. 129.-№2.-P. 53-72.

104. Mullis K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. 1987. -№155.-P. 335-350.

105. Multiple losses and transfers to the nucleus of two mitochondrial succinate dehydrogenase genes during angiosperm evolution / K.L. Adams et al. // Adams Genetics. 2001. - Vol. 158. - P. 1289-1300.

106. Mutation of succinate dehydrogenase subunit C results in increased O2 {middle dot}-, oxidative stress, and genomic instability / G.S. Benjamin et al. // Cancer Res. 2006. - Vol. 66. - P. 7615-7620.

107. Nandula R. Light Regulation of Nitrate Reductase Gene Expression in Maize Involves a G-Protein // R. Nandula, R.C. Meena, K.S. Sudhir // Molecular Cell Biology Research Communications. -1999. Vol. 2. - P. 8690.

108. Neuhaus G. Calcium/calmodulin-dependent and -independent phytochrome signal transduction pathways / G. Neuhaus // Cell. 1993. - Vol. 73. - P. 937-952.

109. New Insights into the Regulation of Plant Succinate Dehydrogenase / C. Affourtit et al. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - №35. - P. 3256732574.

110. Newman I.A. Rapid electric responses of oats to phytochrome show membrane processes unrelated to palatability / I.A. Newman // Plant. Phisiol.- 1981.-Vol. 68.-№6.-P. 1494-1499.

111. Norichito K. Phytochrom Regulation of Nuclear Gene Expression in Plants / K. Norichito, F. Masaki // Cell Devel. Biol. 2000. - Vol. 11. - P. 485-493.

112. Nuclear Gene for the Iron-Sulfur Subunit of Mitochondrial Complex II Is Specifically Expressed during Arabidopsis Seed Development and Germination / E. Alvaro et al. // Plant Cell Physiol. 2006. - Vol. 47. - P. 14-21.

113. Occurrence of a Bound Ubiquinone and Its Function in Escherichia coli Membrane-bound Quinoprotein Glucose Dehydrogenase / M.D. Elias et al. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 3078-3083.

114. Oestracher G. Regulatin of succinate dehydrogenase in higher plants. / G. Oestracher// Plant physiol. 1973. - Vol. 52. - P. 622-626.

115. Oyedotun K.S. Identification of the Heme Axial Ligands in the Cytochrome b562 of the Saccharomyces cerevisiae Succinate Dehydrogenase / K.S. Oyedotun, P.F. Yau, B.D. Lemire // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 9432-9439.

116. Parks B.M. Sequential and coordinated action of phytochromes A and B / B.M. Parks, E.P. Spalding // Proc. Natl Acad. Sci. 1999. - Vol. 96. - P. 14142-14146.

117. Pas-Panja K. Activation of enzymatic catalysis / K. Pas-Panja, V.S. Jonnalagadda, S. Jonnalagadda // Indian J. Biochem. and Biophys. 1998. -№ 5. - P. 255-259.

118. Pereira M.M. A novel scenario for the evolution of haem-copper oxygen reductases / M.M. Pereira, M. Santana, M. Teixeira // Biochim. Biophys. Acta. 2001.-Vol. 1505. - P. 185-208.

119. Photoresponses of light-grown phyA mutants of Arabidopsis phytochrome A is required for the perception of daylength extensions / E. Johnson et al. // Plant Physiology. - 1994. - Vol. 105. - P. 141-149.

120. Phytochrome A and phytochrome B have overlapping but distinct functions in Arabidopsis development / J.W. Reed et al. I I Plant Physiol. 1994. -Vol. 104.-P. 1139-1149.

121. Phytochrome E controls light-induced germination of Arabidopsis / L. Hennig et al. // Plant Physiology. 2002. - Vol. 128. - P. 194-200.

122. Phytochrome regulation of nitrate reductase in wheat / O. Ramaswamy et al. //J. Biosci. 1983. - Vol. 5. - P. 63-70.

123. Phytochrome signal transduction pathways are regulated by reciprocal control mechanisms / C. Bowler et al. // Genes Dev. 1994. - Vol. 8. - P. 2188-2202.

124. Phytochromes: photosensory perception and signal transduction / P.H. Quail et al. // Science. 1995. - Vol. 268. - P. 675-680.

125. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. -Vol. 193. - P. 265-275.

126. Purugannan M.D. The molecular genetics of regulatory genes / M.D. Purugannan//Mol. Ecol. 2000. - Vol. 9.-P. 1451-1462.

127. Qin M. Overexpressed phytochrome C has similar photosensory specificity to phytochrome B but a distinctive capacity to enhance primaiy leaf expansion / M. Qin // Plant Journal. 1997. - Vol. 12. - P. 1163-1172.

128. Quail P.H. Photosensory perception and signalling in plant cells: new paradigms? / P.H. Quail // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. - Vol. 14. - P. 180188.

129. Quail P.H. Phytochromes: photosensory perception and signal transduction / P.H. Quail // Science, 1995. - Vol. 268. - P. 675-680.

130. Raghavendra A.S. Links high mitochondrial activity but incomplete engagement of the cyanide-resistant alternative pathway in guard cell protoplasts of pea / A.S. Raghavendra, T. Vani // Plant Physiol. 1994. -Vol. 105.-P. 1263-1268.

131. Reed J.W. Phytochrome A and phytochrome B have overlapping but distinct functions in Arabidopsis development / J.W. Reed // Plant Physiol. 1994. -Vol. 104.-P. 1139-1149.

132. Responses of fern to red light are mediated by an unconventional photoreception / H. Kawai et al. // Nature. 2003. - Vol. 421. - P. 287-290.

133. Riche P.R. The effects of bathophenauthroline bathophenauthrolinessulphonate / P.R. Riche // J. Biochem. 1977. - Vol. 162.-P. 205-208.

134. Robinson K.M. Covalent attachment of FAD to the yeast succinate dehydrogenase flavoprotein requires import into mitochondria, presequence removal, and folding / K.M. Robinson, B.D. Lemire // J. Biol. Chem. -1996. Vol. 271. - P. 4055-4060.

135. Roux S.J. Role of calcium ions in phytochrome responses: An apdate / S.J. Roux, R.O. Mayne, M. Datta // Physiol. Plant. 1986. - Vol. 66. - №2. - P. 344-348.

136. Sarah E.W. Calcium signalling during embryonic development / E.W. Sarah, L.M. Andrew // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2003. - Vol. 4. -P. 539 -551.

137. Scheffler I.E. Molecular genetics of succinate:quinone oxidoreductase in eukaryotes / I.E. Scheffler // Prog. Nucleic. Acid Res. Mol. Biol. 1998. -Vol. 60.-P. 267-315.

138. Schulze-Osthoff K. Redox signalling by transcription factors NF-kb and AP-1 in lymphocytes / K. Schulze-Osthoff, M. Los, P.A. Bauerle // Biochem Pharmacol. -1995. Vol .50. - №6. - P.735-741.

139. Shacklock P.S. Cytosolic free calcium mediates red light-induced photomorphogenesis / P.S. Shacklock , N.D. Read, A.J. Trewavas // Nature. 1992.-Vol. 358.-P. 753-755.

140. Singer T.P. Covalent attachment of flavin to flavoproteins: Occurrence, assay, and synthesis / T.P. Singer, W.S. Mclntire // Methods in Enzymology Methods Enzymol. 1984. - Vol. 106. - P. 369-378.

141. Singer T.P. Solubilisation assay and purification of succinate dehydrogenase / T.P. Singer, E.B. Rsarney // Biochem et Biophys. Akta. 1954. - Vol. 15. -P. 151-153.

142. Smith H. Physiological and ecological function within the phytochrome family / H. Smith // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1995. - Vol. 46.-P. 289-315.

143. Smith H. Rapid phytochrome regulation of wheat seedling extension / H. Smith, G.M. Jackson // Plant Physiol. 1987. - Vol. 84. - P. 1059-1062.

144. Smith H. The shade avoidance syndrome: multiple responses mediated by multiple phytochromes / H. Smith, G.C. Whitelam // Plant, Cell & Environment. 1997. - Vol. 20. - P. 840-844.

145. Structure and regulation of sdh3, the yeast gene encoding the cytochrome b560 subunit of respiratory complex II / B. Daignan-Fornier et al. // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 15469-15472.

146. Taylor B.L. PAS domains: internal sensors of oxygen, redox potential, and light / B.L.Taylor, I.B. Zhulin // Microbiological Molecular Biological Review. 1999. - Vol. 63. - P. 479-506.

147. Terry M.J. Analysis of the association of phytochrome whisin weat leaf plasma membranes by quantitative immuno-assay and western blotting / M.J. Terry, B. Thomas, J.L. Hall // Abstr. Eur. Symp. "Photomorphogenesis in plants".- 1989.-P. 22.

148. Terzaghi W.B. Light-regulated transcription / W.B. Terzaghi, A.R. Cashmore // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1995. - Vol. 46. -P. 445-474.

149. The photomorphogenesis regulator DET1 binds the aminoterminal tail of histone H2B in a nucleosome context / G. Benvenuto et al. // Curr. Biol. -2002.-Vol. 12.-P. 1529-1534.

150. The phytochrome gene family in tomato and the rapid differential evolution of this family in angiosperms / R. Alba et al. // Mol. Biol. Evol. 2000. -Vol. 17.-P. 362-373.

151. The role of mitochondrial electron transport during photosynthetic induction. A study with barley (Hordeum vulgare) protoplasts incubated with rotenone and oligomycin / A.U. Igamberdiev et al. // Physiol. Plant. -1998.-Vol. 104. P. 431—439.

152. The unusual iron sulfur composition of the Acidianus ambivalens succinate dehydrogenase complex / C.M. Gomes et al. // Biochim. Biophys. Acta -Bioenergetics. 1999. -Vol. 1411.-P. 134-141.

153. Tobin E. M. Phytochrome regulated gene expression / E.M. Tobin, D.M. Kehoe // Semin. Cell Biology. 1994. - Vol. 5. - P. 335- 346.

154. Tretin A. The effect of calcium-cannel antagonist, nifedipin and agonist Bay K-8644, on the phytochrome-controlled swetting of etiolated weatprotoplasts / A. Tretin, R.E. Kendrick, V.E. Bossen // Phisiol. Plant. 1990. -Vol. 78.-№2.-P. 230-235.

155. Tretyn A. Calcium-dependent signal transduction pathways in plants-phytochrome mechanism of action as an example / A. Tretyn // Pol. J Pharmacol.-1999.-Vol. 51.-P. 145-151.

156. Tsukaho H. Mechanism of the increase in succinate dehydrogenase activity in wounded sweet potato root tissue / H. Tsukaho, A. Tadashi // Plant and Cell Physiology. 1982. - Vol. 23. - №3. - P. 525-532.

157. Villar R. Dark leaf respiration in the light and darkness of an evergreen and a deciduous plant species / R. Villar, A. Held, J. Merino // Plant Physiol. -1995.-Vol. 107.-P. 421-427.

158. Vinogradov A.D. Reactivity of the sulfgydryl groups of soluble succinate dehydrogenase / A.D. Vinogradov, E.V. Gavricova // Eur. J. Biochem. -1976.-Vol. 63.-P. 365-371.

159. Vinogradov A.D. Reconstraction of succinat-ubiquinon reductaz from the soluble components / A.D. Vinogradov, V.G. Gavrikov, E.V. Gavrikova // Biochem etBiophys. Acta. 1991. - Vol. 1056. -№1.- P. 13-27.

160. Vinogradov A.D. Studies on the succinate dehydrogenating system / A.D. Vinogradov, V.G. Grivennikova, E.V. Gavrikova // Biochem et Biophys. Acta- 1979.-Vol. 545.-№1.-P. 141-154.

161. Webb A.A.R. The physiology of circadian rhythms in plants / A.A.R. Webb // New Phytol. 2003. - Vol. 160. - 281-303

162. Whitelam G.C. Roles of different phytochromes in Arabidopsis photomorphogenesis / G.C. Whitelam, P.F. Devlin // Plant Cell Env. 1997. - Vol. 20. - P. 752-75.

163. Wood D. Nucleotide sequense encoding the flavoprotein and gydrophobic subunist of the succinte dehydrogenase of Escherihia coli / D. Wood // Biochem. J. 1984. - Vol. 222. - P. 519-534.

Информация о работе

Федорин, Дмитрий Николаевич
кандидата биологических наук
Воронеж, 2007
ВАК 03.00.12

Диссертация

Световая регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы в листьях растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы