Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности организации и регуляции ферментативного окисления сукцината митохондриями летательных мышц Bombus terrestris (L.)

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности организации и регуляции ферментативного окисления сукцината митохондриями летательных мышц Bombus terrestris (L.)"

На правах рукописи

005062117

Горбачева Татьяна Михайловна

ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ II РЕГУЛЯЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОКИСЛЕНИЯ СУКЦИНАТА МИТОХОНДРИЯМИ ЛЕТАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ КОМ ВИН Г£7г/г£ЗТЯ/5 (М

Специальность 03.01.04. - биохимия

10 ! !:СН 2и13

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 2013

005062117

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионазьного образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Попов Василий Николаевич

Официальные оппоненты: Корнеева Ольга Сергеевна,

доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный университет инженерных технологий, зав. кафедрой микробиологии и биохимии

Дмитриев Евгений Владиславович,

кандидат биологических наук, Воронежская государственная медицинская академия имени Н. Н. Бурденко, зав. кафедрой физики, информатики и медицинской статистики

Ведущая организация: НИИ Физико-химической биологии

имени А. Н. Белозерского, Московский государственный университет

Защита состоится 4 июля 2013 года в 13.30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и сайте ФГБОУ ВПО «ВГУ»: wvvvv. vsu. ru

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ФГБОУ ВПО Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан 3 июня 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета, ¿/f

доктор биологических наук, профессор / и Грабович Маргарита Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Шмели - эффективные опылители ряда важных сельскохозяйственных культур, таких как томаты, болгарски» перец, огурец (Torres-Ruiz, Jones, 2012; Lye et at., 2011; Julier, Roulston, 2009). Экономическая важность насекомых-опылителей обусловила особое внимание к исследованиям физиолого-биохимических процессов, протекающих в них.

Насекомые, в частности земляные шмели Bombus terrestris (L.), используются в качестве модельного объекта для изучения окислительного стресса, так как они отличаются интенсивным дыхательным метаболизмом, обусловленным высокими затратами энергии во время полета (Suarez R.K., 2000; Suarez R.K. et al., 2005). Интенсификация энергетического метаболизма насекомых, повышение скорости работы ЭТЦ и, как следствие, высокий уровень образования АФК обусловливают важность изучения биохимических процессов, протекающих в митохондриях летательных мышц. Как известно, 2-5% потребляемого кислорода идет на образование АФК (Harman, 2006.). При усиленном поступлении кислорода в клетки или нарушении работы ЭТЦ митохондрий образование АФК может значительно возрастать (Murphy, 2009). Высокая интенсивность дыхания насекомых обусловлена не большим количеством ферментов, а их высокой удельной активностью (Suarez, 2000). Интересно, что в летательных мышцах насекомых цикл Кребса характеризуется большей интенсивностью в сравнении с другими животными, что достигается высокой активностью ряда катаболических ферментов (Гилмур, 1968).

Основные субстраты дыхания у насекомых - пролин, пнруват, а-глицерофосфат, характерной чертой летательных мышц является то, что митохондриальная и цитоплазматическая формы фермента а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) образуют мощный каталитический цикл, передающий электроны на ЭТЦ (Suarez et al., 2005; Carmon, Maclntyre, 2010). Функционирование а-ГФДГ хорошо изучено в организмах разных таксономических групп, в том числе насекомых (Agboola et al., 2003; Miwa, Brand, 2005; Yeh et at., 2008; Carmon, Maclntyre, 2010; Orr et al., 2012; Mracek et al., 2013). Известно, что сукцннат является субстратом дыхания в стрессовых условиях (Кондрашева и др., 1987; Zakharchenko et а/., 2013). Более того, сукцинат -компонент множества метаболических реакций, что позволяет ему осуществлять гибкий контроль соотношения метаболических потоков, т.е. играть роль регуляторного фактора. Изучение роли окисления сукцината заслуживает более пристального внимания. Реакция превращения сукцината в фумарат с

образованием энергетического эквивалента в виде восстановленного флавинадениндинуклеотида (ФАДН2) катализируется сукцинатдегидрогеназой (СДГ).

Выделение и изучение свойств СДГ сопряжено с рядом трудностей, так как в процессе очистки, отделяясь от мембранных компонентов, фермент становится крайне лабильной структурой. Впервые очищенный препарат растворимой СДГ был получен из животных тканей Сингером (Singer, Kearney, 1954). В литературе описано несколько методов выделения комплекса II из митохондрий животных тканей, микроорганизмов (Moll, Schafer, 1991; Yu, Yu, 1993) и растений (Игамбердиев, Фалалеева, 1994). Однако работ по экстракции данного фермента из летательных мышц насекомых, в частности В. terrestris, не проводилось.

Структурная организация молекулы СДГ устроена таким образом, что данный белок расположен вблизи источников генерации АФК - компонентов ЭТЦ. В связи с этим представляется чрезвычайно важным изучить и охарактеризовать особенности организации окисления сукцината в митохондриях летательных мышц В. terrestis и функционирования СДГ, ее регуляторные свойства и молекулярную структуру. Также данные исследования имеют научный и практический интерес, в связи с тем, что нарушения в структуре фермента и работе генов, кодирующих отдельные субъединицы белковой молекулы, сопряжены, в частности, с развитием канцерогенеза (Weihua, Shimin, 2013; Baysal, 2013; Kluckova et а/., 2012).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение молекулярной организации и регуляции окисления сукцината как резервного субстрата дыхания при адаптации к стрессовым факторам шмелей В. terrestris.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. измерить максимальную скорость поглощения кислорода в летательных мышцах В. terrestris при использовании сукцината в качестве субстрата дыхания в состоянии покоя и при нагрузке;

2. определить интенсивность образования АФК при утилизации сукцината в качестве единственного субстрата дыхания;

3. оценить степень повреждения митохондриальной и ядерной ДНК из летательных мышц В. terrestris в модельном эксперименте;

4. выявить динамику активности СДГ и восстановленного глутатиона на разных этапах в процессе индивидуального развития В. terrestris;

5. выявить корреляцию активности ключевых ферментов энергетического метаболизма - СДГ и АГ - и динамику концентрации глутатиона в митохондриях в зависимости от продолжительности полета;

6. исследовать изоферментный состав СДГ в митохондриях самок и самцов шмелей В. terrestris с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;

7. получить гомогенный препарат СДГ из летательных мышц самцов шмелей и изучить физико-химические, кинетические и некоторые регуляторные свойства СДГ.

Hay чная новизна. Установлено, что сукцинат может выступать в качестве резервного субстрата дыхания при адаптации насекомых, в частности шмелей В. terrestris, к стрессовым факторам. Возможно, это обусловлено тем, что сукцинат является компонентом множества метаболических реакций. Это позволяет осуществлять гибкий контроль соотношения метаболических потоков, т.е. играть роль регуляторного фактора. Определен уровень продукции пероксида водорода при использовании сукцината в качестве субстрата дыхания, произведена оценка % потребленного кислорода, который идет на выработку Н202. Полученные данные о степени повреждения митохондриалыгой и ядерной ДНК из летательных мышц В. terrestris в модельном эксперименте показали возможность использования метода long range ПЦР для интегрального определения уровня повреждений, и вполне вероятно, для мониторинга репараций этих повреждений.

Выявлена обратная зависимость активности СДГ и концентрации глутатиона в процессе развития В. terrestris, что соответствует существующим представлениям об оксидативном статусе клетки и подтверждает роль глутатиона как маркера окислительного стресса. Показано, что во время продолжительной нагрузки наблюдается двукратное повышение удельной активности СДГ, трехкратное снижение активности АГ и 30% снижение концентрации восстановленого глутатиона в митохондриях летательных мышц В. terrestris.

Обнаружены различия в изоферментпом составе СДГ между самками и самцами В. terrestris - у самок выявлена дополнительная изоформа СДГ в абдомене, возможно, участвующая в утилизации жирового тела, локализованного в данном отделе. Данная черта является отличительной для самок В. terrestris.

Впервые получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ из летательных мышц В. terrestris, охарактеризованы некоторые кинетические (константа Михаэлиса), физико-химические (молекулярная масса нативной молекулы и двух субъединиц фермента) и регуляторные свойств СДГ (влияние рН и солей), чувствительность к действию Н,02. Проведен сравнительный анализ свойств СДГ В. terrestris с СДГ представителей других таксономических групп.

Практическая значимость.

Научно-практическая значимость полученных результатов состоит в первую очередь в диверсификации существующих представлений о путях

превращения сукцината - использование в качестве резервного субстрата в условиях стресса - у насекомых и свойствах ферментной системы -сукцинатдегидрогеназы, участвующей в превращениях сукцината, обладающей рядом адаптационных преимуществ.

Постановка и оптимизация метода long range ПЦР показала возможность его использования для интегрального определения уровня повреждений, и вполне вероятно, для мониторинга репараций этих повреждений.

Наличие дополнительной изоформы СДГ в митохондриях самок шмелей В. terrestris поднимает спорный вопрос о функционировании глиоксилатного цикла в животных (Епринцев и др., 2005).

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии, молекулярной биологии, спецкурсов этимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Сукцинат является резервным субстратом дыхания у насекомых при адаптации к стрессовым факторам, которым может являться продолжительный полет.

2. Митохондриальная ДНК насекомых более склонна к повреждениям, чем ядерная. Несмотря па наличие антиоксидантной системы и ферментов систем репарации, митохондрии не обеспечивают высокого, подобного ядерному, уровня защиты генома от АФК.

3. Выявлена динамика некоторых биохимических показателей в процессе индивидуального развития и во время продолжительного полета В. terrestris.

4. Обнаружена одна изоформа СДГ в митохондриях самцов шмелей, тогда как в митохондриях самок - две изоформы фермента, выполняющих, вероятно, различные метаболические функции.

5. Получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ из летательных мышц шмелей самцов, определены молекулярные массы нативной молекулы СДГ и двух субъединиц А и В, изучены некоторые кинетические и регуляторные характеристики фермента.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 13-ой, 14-он международных Пущинских школах-конференциях «Биология - наука 21 века» (Пущино-на-Оке, 2009, 2010, 2012); на 3-й международной научно-технической конференции инновационных технологий

(Воронеж, 2009), XV, XLIX МЭСК «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010, 2011), Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации растений и животных» (Махачкала, 2010), IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз России» (Воронеж, 201 1).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 17 публикациях, из них 7 тезисов, 10 статей, 4 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (237 источников). Иллюстрационный материал включает 31 рисунок и 2 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Основным объектом исследования служили самцы шмеля Bombus terrestris (L.) в возрасте 10 суток.

В ы д ел ен и е м и то х о н л р и й. Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования с модификациями (Северин С.Е., Соловьева Г.А, 1989; Starkov А.А, 2011).

ПолягроФический метол определения уровня поглощения кислорода. Скорость поглощения кислорода митохондриями регистрировали полярографически с использованием кислородного электрода типа Кларка (Hansatech Instruments, USA) (Malinska D. et al., 2009).

Определение уровня образования АФК в митохондриях. Уровень продукции митохондриалыюго Н202 измеряли по методу с использованием Amplex red ultra, основанного на образовании устойчивого флуоресцентного комплекса резоруфина (Kudin, 2008; Mishin et al, 2010; Starkov, 2010).

Метол выделения тотальной ДНК. Для получения тотальной ДНК применялся набор для выделения Genomic DNA Purification Kit (Fermentas, Литва).

Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот.

Для анализа качества выделенной ДНК, продуктов ПЦР использовали электрофорез в 1% агарозном геле (Helicon, Россия).

Метол long range ПЦР. Для определения уровня повреждения митохондриальной и ядерной ДНК проводили ПЦР протяженных фрагментов (long

range ПЦР) с набором Encyclo PCR kit (Evrogen, Россия) на приборе ДТ-332 (ДНК-технология, Россия).

Метод определения повреждения ядерной и митохондриальной ДНК. Подбор праймеров осуществляли на основе базы данных GeneBank и программы Primer 3. Были подбирали специфические праймеры к митохондриалыюму - 11198 п.о. - и ядерному - 10578 п.о. - участкам. По формуле Пуассона была вычислена частота повреждений на фрагмент: Х=-1пА[/А0, где "к - частота повреждений, А0 -уровень амплификации поврежденной цепи, А0 - уровень амплификации неповрежденной цепи (Santos, 2002; Jarrett et al, 2013).

Определение активности ферментов. Активность СДГ определяли спектрофотометрически на СФ-2000 (Ломо, Россия). Для этого использовали метод Cooper (Cooper, 1976). Определение общего количества белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951 ).

Определение концентрации восстановленного глутатиона. Определение концентрации восстановленного глутатиона (GSH) проводили спектрофотометрически при длине волны 412 им с использованием реактива Эллмана (Бузлама, 1997).

Выделение и очистка Фермента. Очистку фермента проводили по четырехстадийной схеме при 0-4°С, которая включала в себя этапы: выделение митохондрий методом дифференциального центрифугирования; высаливание сульфатом аммония в пределах 15-45 % насыщения (NH4)iS04; гель-фильтрация на сефадексе G-25 (1,7 * 15 см) (Pharmacia, Швеция); хроматография на ионообменнике DEAE-Toyopearl (1,8 х 20 см) (Toyosoda, Japan) (Кочетов, 1980).

Аналитический электрофорез белков. Электрофорез нативного фермента проводили по методике Девиса (Davis, Ornstein, 1959). Для специфического проявления СДГ применяли тетразолиевый метод (Гааль и др., 1982). Универсальное окрашивание белков осуществляли, используя методику с нитратом серебра (Nesterenko et. al, 1994; Shevchenko et. al, 1996).

Определение молекулярной массы нативного фермента. Для исследования молекулярной массы нативной СДГ использовали гель-хроматографию на Toyopearl HW-65 (Детерман, 1970).

Определение массы субъеднниц фермента. Для определения массы субъединиц применяли метод SDS-ПААГ-электрофореза (Остерман, 1983).

Исследование кинетических параметров. Кинетические и регуляторные свойства СДГ изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение константы Михаэлиса осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Диксон, Уэбб, 1982).

С|атлетическая обработка результатов. Опыты проводили в 8-10 биологических повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Обработку результатов опытов проводили с использованием стандартных методов. Обсуждаются статистически достоверные различия при р< 0,05 (Лакин, 1990; Чернышев, Стариков, 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Особенности окисления сукцината митохондриями летательных мышц В. ¡еггеэ/гй в покое и при нагрузке

Была определена интенсивность дыхания митохондрий летательных мышц у летавших и не летавших самцов шмелей. Для проведения эксперимента насекомых разделили на две группы: контроль (не летавшие) и опыт (активно летавшие в течение часа). После постановки эксперимента из летательных мышц В. /еггет/гй были выделены митохондрии и проведено полярографическое определение интенсивности дыхания в присутствии сукцината (рис. 1).

Рис. 1. Кривые дыхания суспензии митохондрий

; летательных мышц насекомых: А - контроль (шмели в состоянии покоя), В - опыт (активность в течение 1 часа под лампой дневного света). 1 -интенсивность дыхания

митохондрий,

2 - концентрация кислорода.

Скорость дыхания митохондрий, выделенных из летательных мышц шмелей контрольной группы, составила 289 нмоль 02/ (мин • мг белка), тогда как в опытной группе данное значение увеличилось в 2,15 раза и составило 621,35 нмоль су (мин ■ мг белка). Обнаруженное повышение скорости дыхания в присутствии сукцината больше, чем в два раза во время нагрузки, можно объяснить ролью сукцината как субстрата дыхания при адаптации к стрессовым факторам, которым может являться продолжительный полет. Более того, сукцинат является компонентом множества метаболических реакций, что позволяет осуществлять

гибкий контроль соотношения метаболических потоков, т.е. играть роль регуляторного фактора (Кондрашева и др., 1987; Zakharchenko M.V. et а!., 2013.). Продукция Н;02 митохондриями летательных мышц в присутствии

сукцината

Значение продукции Н202 при дыхании с использованием сукцината составило 1,72 нмоль Н202 /(мин- мг белка), что соответствует 0,23% потребленного кислорода, который идет на выработку Н202, тогда как для глутамата+малата - 1,11% (данные не представлены). Таким образом, на продукцию Н202 в присутствии сукцината идет в 4,83 раз меньше количества потребленного кислорода, чем в присутствии глутамата+малата. Оценка уровня повреждения митохондриальной и ядерной ДНК

Предварительно гомогенат клеток инкубировали в среде in vitro с АФК - 200 мкМ Н202 в течение 15 и 30 мин. Выделенную ДНК (рис. 3) использовали в последующей постановке ПЦР с применением ПЦР-смеси набора Encyclo PCR kit (Евроген, Россия). В результате было получено: в случае ядерной ДНК (яДНК) - уровень амплификации протяженного участка при 15 мин обработке на 15% ниже контроля, при 30 мин - около 100% (в пределах ошибки) (рис. 4). Вычисленная по формуле Пуассона частота повреждений для участка яДНК при экспозиции с Н202 в течение 15 и 30 мин -соответственно 0,16 и 0,03 (рис.5). Таким образом, при 15 мин обработке повреждений больше, чем при 30 мин.

Рис 2. Уровень продукции перекиси водорода митохондриями летательных мышц В. terrestris

-ДНК

1031 п.о.

80 п.о.

Рис. 3. Тотальная ДНК из летательных мышц самцов

шмелей В. 1031, 80 п.о. - маркеры

шгграть 15 31» ^ контроль !5 30

Обработка Н.О,, чин Обработка И.О.. мин

Рис. 4. Относительный уровень Рис. 5. Частота повреждений яДНК амплификации фрагмента яДНК при 15 и 30 мин экспозиции

Для митохондриальной ДНК (мтДНК) зависимость уровня амплификации от времени экспозиции с перексидом водорода имеют другую картину в сравнении с ядерной ДНК. При 15 мин воздействии наблюдается снижение на 15% относительно контроля. Тогда как при 30 мин - происходит драматическое снижение количества продукта Г1ЦР до 30% от контроля (рис. 6). Для фрагмента мтДНК - частота повреждений при экспозиции с Н202 в той же концентрации в течение 15 и 30 мин - соответственно 0,04 и 1,1 (рис.7).

Рис. 6. Относительный уровень Рис. 7. Частота повреждений фрагмента амплификации фрагмента мтДНК мтДНК при 15 и 30 мин экспозиции с

перексидом водорода Обработка Н202 в течение 30 мин вызывает повреждения в обоих геномах, но в мтДНК повреждения в 14 раз сильнее. Несмотря на наличие антиоксидантных систем и ферментов систем репарации, митохондрии не обеспечивают высокого, подобного ядерному, уровня защиты генома от АФК.

Полученные данные позволяют сделать выводы, что 15 мин НтО^-индуцируемые повреждения в яДНК и мтДНК имеют одинаковую степень выраженности, тогда как при 30 мин экспозиции с Н202 - в митохопдриальном фрагменте повреждения в 14 раз сильнее (рис. 8). Таким образом, кратковременная экспозиция яДНК и мтДНК с АФК вызывает повреждения одинакового уровня.

долговременная - значительные и интенсивные повреждения в мтДНК в сравнении с я ДНК (рис. 8).

Рис. 8. Частота повреждений мтДНК и яДНК при 15 и 30 мин экспозиции с перексидом водорода

«ДНК м 1. [ и к

яДНК М1ДНК

Закономерности II биохимические особенности на разных этапах индивидуального развития В. ¡еггеьЫь

Выявлено закономерное повышение активности фермента СДГ с 0,1 17 Е/мг белка (стадия личинки) до 0,484 Е/мг белка (30 дневное взрослое насекомое), что можно связать с увеличением мышечной нагрузки на последующих стадиях развития (рис. 9). Повышение активности СДГ на стадии куколки обусловлено растущими потребностями в энергетических эквивалентах во время перестройки организма (стадии ранняя куколка и поздняя куколка являются условным разделением по морфологическим признакам).

¿¡"^«Р* ^^ **

стадия ра тнтия

Рис. 9. Динамика активности СДГ в Рис. 10. Динамика концентрации процессе индивидуального развития В. глутатиона в процессе индивидуального /еттед/га развития В.

Динамика же содержания восстановленного глутатиона в летательных мышцах показывает обратную тенденцию — уменьшается с 1,552 мМ/л до 0,416 мМ/л, что можно объяснить интенсификацией работы ЭТЦ (рис. 10). Это приводит к большему образованию АФК, на обезвреживание которых и расходуется восстановленный глутатион.

С развитием особи В. геггет/гй возрастает мышечная нагрузка, энергетические потребности клетка покрывает за счет интенсификации работы

цикла Кребса, повышения активности ряда катаболических ферментов, в частности СДГ (ОПтоиг, 1961). Тогда как система глутатионпероксидаза глутатионредуктаза является одним из механизмов защиты клетки от АФК. Концентрация восстановленного глутатиона - чувствительный показатель оксидативного состояния организма (Тиунов. 1995).

Влияние продолжительности полёта В. /спся/т на некоторые биохимические

показатели

Для выявления действия АФК в контрольных нелетающих особях и у шмелей, которые летали 1, 3. 6 часов были измерены: активности СДГ и аконитатгидратазы (АГ) как возможных маркеров оксидативного стресса, а также определена концентрация восстановленного глутатиона в митохондриальной фракции.

* 0,8 « 0,7

■7 0.6

й 0.5 й' 0.4

= 0.3 | 0,2 * 0.1

Рис. 11. Динамика активности СДГ в Рис. 12. Динамика активности АГ в митохондриальной фракции в митохондриальной фракции в

зависимости от продолжительности зависимости от продолжительности полёта полёта

Активность СДГ в течение первого часа повысилась с 0,31 Е/мг белка до 0,58 Е/мг белка, что составляет примерно увеличение в 2 раза и практически не изменялась на протяжении 3 и 6 часов (рис. 11). Таким образом, при интенсификации метаболизма в митохондриях летательных мышц насекомых наблюдалось двукратное повышение удельной активности СДГ относительно контрольной группы.

Активность АГ после первого часа полёта уменьшилась почти в 3 раза и оставалась примерно на том же уровне (рис. 12). Это свидетельствует о том, что происходит ингибирование активности митохондриальной АГ, так как данный фермент наиболее сильно подвержен воздействию АФК из-за повреждения структурных железо-серных кластеров фермента.

Концентрация восстановленного глутатиона снижалась с увеличением продолжительности полёта насекомых и после 6 часов концентрация ОЗН составила 72% от значения в контрольной группе - снизилась на 30% (рис. 13). Это доказывает то, что в летательных мышцах насекомых интенсификация

окислительного процессами.

^ 0.8 4 0,6

фосфорилирования сопровождается свободнорадикальыыми

Рис. 13. Изменение концентрации восстановленного глутатиона в митохондриальной фракции в зависимости от продолжительности полёта

Таким образом, уменьшение концентрации восстановленного глутатиона и значительное снижение активности АГ после нагрузки говорит о том, что происходит интенсивное образование свободных радикалов в летательных мышцах насекомых в активном состоянии. Однако ингибирование активности СДГ в течение полёта не наблюдалась, что может быть связано со структурными особенностями данного фермента и его мембранного окружения.

Получение гомогенного препарата СДГ В результате четырехстадийной очистки был получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ с удельной активностью 7.14 Е/мг белка, степень очистки составила 81,55 раз и выход 21,24 %.

Таблица очистки СДГ из летательных мышц В. ГеггеяПчя

Стадия очистки Объем, мл Количество белка, мг Общая активность, Е Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки, раз

Гомогенат 5.50 59.14±0,2 5,18 ±0.04 0,09 ± 0,02 100 1

Митохондриальная фракция 2.20 14,04±0,06 8,20 ± 0,03 0.58 ± 0.05 158 6,67

Фракционирование (ЫН4);304. 15^5% 2.20 10,04±0,02 3,10 ±0,04 0,31 ±0,03 59.85 3.45

Гель-фильтрация на сефадексе С-25 2.00 8,10 ±0,05 2.85 ± 0.02 0,35 ± 0,02 55,02 4.02

Хроматография на [)ЕАЕ-Тоуореаг1 2,00 0.15 ± 0,01 1.10 ± 0,03 7,14 ±0.32 21,24 81,55

Электрофоретический анализ очищенных препаратов сукцинатдегидрогеназы

Методом диск-электрофореза было показано, что ферментативный препарат является гомогенным (рис. 14а). Специфическое окрашивание тетразолиевым методом (на активность) показало, что фермент в митохондриях самцов шмелей В. ¿еггеа/ш представлен 1 изоформой, при этом электрофоретическая подвижность (Я,) оказалась равной 0,24 (рис. 146). Тогда как в митохондриях летательных мышц самок шмелей - 2 изоформами: 1^=0,24 и =0.123 (рис. 14с).

Таким образом, было обнаружено, что в самцах СДГ представлена одной изоформой, а в самках - двумя. По-видимому, первая изоформа участвует в цикле Кребса. Тогда как. известно, что у самок в абдомене находится жировое тело в большом количестве, где, возможно, вторая изоформа принимает участие в утилизации жирных кислот через один из этапов глюконеогенеза, осуществляющего процесс превращения запасных жиров в углеводы. В данном случае, возможно, СДГ выполняет биосинтетическую роль, осуществляя метаболизацию сукцината, образующегося в результате работы глиоксилатного цикла (Епринцев, 2007).

II

I ^ " ^ кЗ!

Рис. 14. Электрофореграммы препаратов СДГ из летательных мышц В. terrestris:

(а) - окрашивание нитратом серебра;

(б) - специфическое проявление СДГ из самцов В. terrestris; (с) - специфическое проявление СДГ из самок В. terrestris.

F - фронт красителя бромфеиолового синего, Р - белковая полоса. Rn -белковая полоса с R, 0,24, Rl2 - белковая полоса с R, 0.123

Молекулярная масса и субьединичное строение. С помощью гель-хроматографии па Toyopearl HW-65 определена молекулярная масса нативной молекулы СДГ из В. terrestris, которая составила ~115 кДа (рис. 15).

Рис. 15. Определение

молекулярной массы нативной молекулы

СДГ с помощью гель-хроматографии на

Toyopearl HW-65:

1 - катазала;2 - ВСА;

3 - яичный альбумин;

г. мл 4 - пероксидаза;

40 60 80 5-СДГ.

Электрофоретическое исследование белка в присутствии додецилсульфата натрия и последующее построение калибровочной кривой позволило определить

lg м 6

величины молекулярных масс двух субъединиц СДГ из В. /еггет/га: субъединица А -75 кДа и субъединица В ~39 кДа (рис. 16). Очевидно, две мембранные субъединицы С и О были потеряны в процессе экстракции из мембраны или во

время очистки. Рис. 16. Определение молекулярной массы

субъединиц СДГ из В. гет«/га методом ДДС-Ыа-электрофореза: 1-14 -рекомбинантиые белки-маркеры; 15,16 -

субъединицы А и В СДГ.

0.2

Влияние концен трации сукцината на акт ивность СДГ

Изучение каталитических характеристик СДГ из летательных мышц самцов В. показало, что фермент подчиняется кинетике Михаэлис-

Ментен. Константа Михаэлиса, характеризующая сродство фермента к субстрату -сукцинату, составляет 0,33 мМ.

Рис. 17. Определение IV константы Михаэлиса по

сукцинату для СДГ из летательных мышц В. 7еп-ел'/га.

IS. мМ

Влияние концентрации ионов водорода в среде на активность СДГ

Значение оптимума рН составляет 7,8. По литературным данным, значение рН-оптимума для СДГ значительно варьирует от 5,8 до 7,8 в зависимости от температуры раствора и наличия ионов в инкубируемой смеси (Kearney Е.В.. 1974). Более того, значение рН может выступать фактором, регулирующим ассоциацию комплекса II (Grimm S., 2013).

Рис. 18. Определение рН-оптимума СДГ из летательных мышц В. terrestris.

Влияние ионов неорганической природы на активность СДГ

Анализ действия различных солей на каталитическую активность в нашем случае позволяет говорить, что степень активации анионами растворимой СДГ

уменьшается в ряду Cl", NOi", SO4"". что согласуется с литературными данными

(Кондрашева, 1987). Также положительное влияние

оказывают такие катионы как Са2+. Mg2+.

Рис. 19. Влияние солей па активность СДГ. Концентрации солей, при которых наблюдалась наибольшая активность,

соответствовала следующим значениям: NaCl - 1 мМ. КО - 1 мМ, NaN03 - 1 мМ, KNOi - 1 мМ, Na2S04 - 0,2 мМ. K:S04 - 0,2 мМ. Mg(CH,COO), - 0,8 мМ, Са(СН,СОО)2 - I мМ: и наименьшая активность в присутствии Zn(CH,COO)i - 0,8 мМ.

Следует отметить, что при сокращении мышц млекопитающих имеет место выход Са~ в цитоплазму (Das-Panaja et al.. 1999) и в этом случае, возможно, его перераспределение в клетке и повышение концентрации в митохондриях. У насекомых с асинхронным типом мышц механизм сокращения регулируется изменением копцентации Са2 в клетке (Iwamoto et al., 2010). На Drosophila показано, что сила сокращения асинхронных мышц повышается с увеличением Са" (Wang et al., 2011). Сходный механизм может играть ключевую роль в энергетическом обеспечении полета насекомых, оказывая активирующее действие на ряд ферментов катаболизма, в частности, на СДГ. Действие ионов Zn2 вызывает резкое снижение активности путем неконкурентного ингибирования фермента.

Е/МГ 5 елка 24

Влияние иероксида водорода на активность СДГ из летательных мышц В. terrestris и сравнение с СДГ организмов разных таксономических групп

В эксперименте были использованы митохондрии из печени крыс, летательных мышц насекомых, и растительных объектов: клубней картофеля и проростков кукурузы (рис. 20). Так, при концентрации Н:СЬ 100 мкМ наблюдалось снижение активности СДГ из животных объектов на 10% у шмелей (В. terrestris) и 1 5% у крыс (R. norvégiens), тогда как активность СДГ из растительных объектов снижалась на 43% в картофеле (S. tuberosum) и 34% в кукурузе (Z. mars).

xu >

К'ЪА

и 0.1 1 КонцентрацияН Сь, иМ

Рис. 20. Влияние Н:02. на активность СДГ в митохондриально обогащенных фракциях. В кюветы вносили 100-120 мкг белка.

Рис.

активность гомогенных

0,1 1 Концентрация НО;. мМ

21 Влияние Н2СК на электрофоретически препаратов СДГ. В

кюветы вносили 20-25 мкг белка.

1 - СДГ летательных мышц шмелей. 2 - СДГ печени крысы, 3 - СДГ проростков кукурузы, 4 - СДГ клубней картофеля.

Следовательно. СДГ из животных организмов более устойчива к действию АФК, тогда как растительная СДГ из митохондрий клубней картофеля и проростков кукурузы, как видно из полученных данных, более чувствительна к пероксиду водорода.

Анализ действия пероксида водорода на изучаемый фермент в гомогенном состоянии позволил установить определенные закономерности (рис. 21).

Показано, что при 100 мкМ Н:0: происходит снижение активности СДГ из летательных мышц шмелей на 10%, на 17% из печени крысы, что незначительно

отличается от результатов проведенного ранее действия Н202 на СДГ в суспензии интактиых митохондрий. Тогда как для растительных объектов было выявлено больше иигибиругощее влияние Н202. Для клубней картофеля обнаружено падение активности фермента на 52% и на 30% из проростков кукурузы.

Соответственно, в присутствии Н202 нами показано снижение активности СДГ как для фермента, состоящего из четырех субъединиц, локализованного в изолированных митохондриях из изучаемых объектов, так и для гомогенного препарата данного фермента, в структуре которого как минимум две субъединицы А и В (активность его измеряли с использованием искусственного акцептора электронов, получающего электроны с Fe-S содержащей субъединицы В. Полученные нами результаты позволяют сделать вывод, что одной из мишеней действия АФК, в частности Н202, является мембранно-связанная СДГ, в структуре которой также имеются три вида железосерных кластера: один двуядерный (S-1), один трехъядерный (S-3) и один четырехъядерный (S-2). Важно отметить, что самую высокую устойчивость к действию Н202 демонстрирует препарат СДГ из летательных мышц шмелей, возможно в силу адаптивных особенностей насекомых, в частности, В. terrestris, на молекулярном уровне к высоким внутриклеточным концентрациям АФК, образующихся при интенсивном дыхательном метаболизме во время полета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные об увеличении дыхания при использовании сукцината в качестве источника электронов позволяют сделать вывод, что янтарная кислота является одним из резервных метаболитов в энергообеспечении клетки насекомых в стрессовых условиях.

Определен уровень продукции Н202 при дыхании с использованием сукцината в качестве субстрата, т.е. произведена оценка % потребленного кислорода, который идет на выработку Н202. Минимальный % АФК, образующего в данном случае, видимо, обуславливает преимущественное использование сукцината в стрессовых условиях насекомыми. Полученные данные об уровне амплификации и степени повреждения митохондриальной и ядерной ДНК из летательных мышц В. terrestris в модельном эксперименте показали возможность использования метода long range ПЦР для интегрального определения уровня повреждений, и вполне вероятно, для мониторинга репараций этих повреждений.

Выявлена обратная зависимость активности СДГ - повышении - и концентрации восстановленного глутатиона - снижении - в процессе развития В. terrestris, что соответствует существующим представлениям. Это можно связать с увеличением мышечной нагрузки на последующих стадиях развития и

соответственно растущий % образования АФК, на обезвреживание которых и расходуется восстановленный глутатион. Данные результаты подтверждает роль глутатиона как маркера окислительного стресса.

Показано, что во время продолжительной нагрузки наблюдается двукратное повышение удельной активности СДГ, трехкратное снижение активности АГ и 30% снижение концентрации восстановленого глутатиона в митохондриях летательных мышц В. 1егге.ч1г1х.

Обнаружены различия в изоферментном составе СДГ между самками и самцами В. гет?л?т, связанные, возможно, с физиологическими и биохимическими особенностями организмов и поднимает вопрос о функционировании глиоксилатного никла в животных.

Впервые получен получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ из летательных мышц В. /егге.у/га. Данную схему очистки можно использовать для получения гомогенного препарата СДГ с целью дальнейшего изучения его кинетических свойств. Охарактеризованы некоторые кинетические (константа Михаэлиса), физико-химические (молекулярная масса нативной молекулы, субъединиц фермента) и регуляторные свойства СДГ. Обнаружена устойчивость к воздействию Н202, отличающая данный фермент от СДГ из других организмов и обеспечивающая ряд адаптационных преимуществ В. гепта/га.

На основе полученных данных представлена гипотетическая схема организации и регуляции окисления сукцината как резервного субстрата насекомых в стрессовых условиях, которым может выступать продолжительный полет (рис. 22).

Рис. 22.

Гипотетическая схема организации и регуляции окисления сукцината как

резервного субстрата в стрессовых

условиях, одним из которых может выступать продолжительный полет.

Таким образом, нами показана возможность использования сукцината как резервного субстрата при адаптации насекомых к стрессовым условиям, одним из которых может являться продолжительный полет. При этом утечка электронов на уровне комплекса II минимальна, что возможно, объясняет преимущественное использование ФАД -зависимых субстратов над НАД -зависимыми субстратами в данных условиях. Образующиеся избыточные АФК в стрессовой ситуации окисляют как локализованные вблизи ферменты, так и митохондриальную ДНК, повреждения которой на порядок выше, чем ядерной ДНК. Однако СДГ из летательных мышц В. /етм/га показывает большую устойчивость к действию АФК, в частности Н202, сравнительно с СДГ из организмов разных таксономических групп. Обнаружены некоторые особенности функционирования данного фермента в шмелях, обеспечивающие, на наш взгляд, ряд адаптационных преимуществ насекомым.

ВЫВОДЫ

1. Обнаруженное повышение скорости дыхания в присутствии сукцината больше, чем в два раза во время нагрузки, позволяет предположить, что сукцинат является резервным субстратом дыхания при адаптации к стрессовым факторам, которым может являться продолжительный полет.

2. Значение продукции пероксида водорода при дыхании на сукцнпате составило 1,72 нмоль Н202 / (мин • мг белка), что соответствует 0,23% потребленного кислорода, который идет на выработку Н202.

3. Проанализирован уровень повреждения ядерной и митохопдриалыюй ДНК, который позволяет сделать вывод, что обработка Н202 в течение 30 мин вызывает повреждения в обоих геномах, но в митохопдриалыюй ДНК повреждения в 14 раз сильнее.

4. Выявлено закономерное повышение активности СДГ в процессе индивидуального развития шмелей В. 1еггех1г1х, связанное с увеличением энергетических затрат на последующих стадиях развития. Динамика же содержания восстановленного глутатиона в летательных мышцах показывает обратную тенденцию.

5. Выявлена динамика активности СДГ и АГ во время полета. Активность СДГ увеличивается в 2 раза и осталось неизменным на протяжении 3 и 6 часов. Активность же АГ после первого часа полёта уменьшилась почти в 3 раза, не изменяясь после 3 и б часов. Это, возможно, свидетельствует о том, что происходит ингибирование активности митохопдриалыюй АГ.

6. В митохондриях самцов шмелей обнаружена одна изоформа СДГ, тогда как в митохондриях самок - наличие дополнительной изоформы. Вероятно, первая изоформа СДГ участвует в работе ЦТК, в то время как вторая обеспечивает, возможно, утилизацию жирового тела в абдомене.

7. В результате четырехстадийной очистки был получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ с удельной активностью 7,14 Е/мг белка, степень очистки составила 81,55 раз и выход 21,24 %. Определены молекулярная масса нативной молекулы СДГ (-115 кДа) и субъедипиц А и В (-75 и -39 кДа, соответсвенно); оптимум pH составляет 7,8; фермент подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен (К„,=0,33 мМ). Ряд солей, таких как СаСЬ, MgS04, (CH1COO)2Mg, Na2S04, NaN03, оказывает активирующее влияние на активность СДГ, тогда как ZnS04 и NH4N03 - ингибирующее действие; СДГ, выделенная из летательных мышц шмелей, отличается большей устойчивостью в сравнении с СДГ организмов других таксономических групп.

8. На основе полученных данных представлена гипотетическая схема организации и регуляции окисления сукцината в насекомых как резервного субстрата в стрессовых условиях, которым может выступать продолжительный полет.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Горбачева Т. М. Влияние пероксида водорода на сукцинатдегидрогеназу из летательных мышц шмеля (Bambus terrestris L.) / Горбачева Т. М., Сыромятников М. Ю., Попов В. Н. // Биология наука XXI века: 13-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009г., сборник тезисов, с. 65-66).

2. Препаративное получение сукцииатдегидрогеназы из летательных мышц шмелей (Bombus terrestris L.) / Горбачева Т. М. [и др.] // 3-я международная научно-технической конференция инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (Воронеж, 22 - 24 сентября 2009г., стендовые сообщения, с. 36-42).

3. Горбачева Т. М. Особенности процесса окисления сукцината в полетных мышцах шмелей (Bambus terrestris L.) / Горбачева Т. М., Сыромятников М. Ю., Попов В. Н. // Биология наука XXI века: 14-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 19-23 апреля 2010г, сборник тезисов, с. 18-19).

4. Сыромятников М. Ю. Очистка и физико-химические свойства сукцннатдегидрогеназы из летательных мышц шмелей (Bombus terrestris L.) /

Сыромятников М. Ю.. Горбачева Т. М.. Попов В. Г1. // Труды молодых ученых. Воронеж. Выпуск № I -2. 2009. - С.44-50.

5. Влияние различных концентраций направленного митохондриатыюго антиоксиданта SKQ1 на физиолого-биохимические показатели Bombus terrestris / Сыромятников М. 10. [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. 2009. С. 229—233.

6. Особенности дыхания митохондрий летательными мышцами шмелей Bombus terrestris L. / Горбачева Т. М. [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. 2010. С. 229-234.

7. Горбачева Т. М. Получение гомогенного препарата сукцинатдегидрогеназы из летательных мышц шмелей. Bombus terrestris (L). с помощью ионообменной хроматографии и изучение некоторых его свойств / Горбачева Т. М.. Сыромятников М. К).. Лопатин Л. В. // МЭСК-2010 «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск. 2010г.. с. 252-253).

8. Горбачева Г. \1. Закономерности и биохимические особенности индивидуального развития Bombus terrestris / Горбачева Т. М. [и др.] // Материалы всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации растений и животных» (Махачкала. 2010г.. с.277-279).

9. Получение с помощью ионообменной хроматографии ферментативного препарата сукцинатдегидрогеназы из летательных мышц шмелей Bombus terrestris ! Горбачева Т. М. [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. 2011. том 9. № 5. с. 13-16.

10. Некоторые особенности ингибирования электрон-траснортной цепи митохондрий летательных мышц Bombus terrestris / Горбачева Т. М. [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. 2011. С. 53-56.

11. Горбачева Т. М. Влияние продолжительности полета на некоторые биохимические показатели в летальных мышцах шмеля Bombus terrestris / Горбачева Т. М.. Сыромятников М. Ю.. Лопатин А. В. // МЭСК-2010 «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск. 2010г.. с. 206).

12. Горбачева Т. М. Устойчивость к воздействию пероксида водорода ферментативного препарата сукцинатдегидрогеназы из летательных мышц шмелей Bombus terrestris / Горбачева Т. М.. Попов В. Н.. Лопатин А. В. // Симбиоз России 2011 (Воронеж . 23-27 мая 2011г.. сборник тезисов, с. 12-14).

13. Определение уровня повреждения геномной и митохондриальной ДНК самцов шмелей Bombus terrestris / Горбачева Т. М. [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Воронеж. 2012. С. 64-68.

14. Исследование аминокислотного состава кормовой пыльцы для шмелей с использованием сверхпроизводительной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ) / Сыромятников М. Ю. [и др.] // Сорбционпые и хроматографические процессы. 2012. Том 12, №4. С. 592-597.

15. Горбачева Т. М. Применение метода ПЦР длинных фрагментов для измерения уровней повреждения геномной и мигохондриальной ДНК ВотЬш /етг«7га // Биология наука XXI века: 16-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино. 16-21 апреля 2012г, сборник тезисов, с. 99-100).

16. Особенности функционирования сукцинатдегидрогеназы из летательных мышц шмелей ВотЬш / Горбачева Т. М. [и др.] // Известия РАН. Серия биологическая. 2013. №5. С. 520-537.

17. Роль пероксида водорода в регуляции активности сукцинатдегидрогеназы из организмов разных таксономических групп / Горбачева Т. М. [и др.] // Биологические мембраны. 2013. №4. С. 230-237.

Статьи №9. 14. 16 и 17 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 29.05.13. Формат 60 84 '.'„.■ Усл. иеч. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 499.

Отпечатано с готовою оригинал-макета в пиюфафни Издательско-полшрафичсского центра Воронежскою государственною университета. 394000. Воронеж, ул. Пушкинская. 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горбачева, Татьяна Михайловна, Воронеж

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет»

04235і і

Горбачева Татьяна Михайловна

ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОКИСЛЕНИЯ СУКЦИНАТА МИТОХОНДРИЯМИ ЛЕТАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ ВОМВШ

ТЕКЯЕЗтШ (Ь.)

Специальность: 03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Попов В.Н.

На правах рукописи

ВОРОНЕЖ 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................13

1.1. Особенности функционирования летательных мышц насекомых ...13

1.1.1. Строение летательных мышц..............................................................13

1.1.2. Отличительные черты сократительного механизма летательных мышц насекомых...........................................................................................17

1.1.3. Футильный цикл...................................................................................19

1.2.Особенности энергетического метаболизма насекомых.......................21

1.2.1. Метаболизм углеводов.........................................................................24

1.2.2. Окисление жиров..................................................................................27

1.2.3. Окисление аминокислот......................................................................29

1.3. Сукцинат - основной субстрат дыхания при адаптации к

стрессовым факторам..................................................................................29

1.3.1. Метаболические пути окисления сукцината.....................................29

1.3.2. Структура молекулы сукцинатдегидрогеназы..................................33

1.3.4. Молекулярные аспекты регуляции сукцинатдегидрогеназы...........37

1.4. Активные формы кислорода, их образование и биологическое

действие............................................................................................................38

1.4.1. Механизмы генерации активных форм кислорода...........................38

1.4.2. Кальций и его связь с образованием АФК в митохондриях............40

1.4.3. Влияние АФК на некоторые структурные компоненты клетки......42

1.4.4. Нейтрализация АФК............................................................................46

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...............................................................51

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................51

2.1 Объекты исследования.............................................................................51

2.2. Выделение митохондрий из летательных мышц самцов шмелей......51

2.3. Определение концентрации белка по методу Лоури...........................52

2.4. Полярографический метод определения уровня поглощения кислорода........................................................................................................52

2.5. Определение уровня образования АФК с использованием сукцината в качестве субстрата дыхания....................................................53

2.6. Метод выделения тотальной ДНК.........................................................54

2.7. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы.. 54

2.8. Метод полимеразной цепной реакции..................................................55

2.9. Определения уровня повреждения митохондриальной и ядерной ДНК.................................................................................................................56

2.10. Спектрофотометрическое определение активности СДГ и АГ........56

2.11. Определение концентрации восстановленного глутатиона..............57

2.12. Выделение и получение гомогенного препарата СДГ......................58

2.13. Электрофоретические исследования белков......................................59

2.13.1. Определение гомогенности ферментного препарата.............59

2.13.2. Специфическое проявление сукцинатдегидрогеназы............60

■ 2.14. Определение молекулярной массы нативной молекулы фермента.........................................................................................................60

2.15. Определение субъединичного строения фермента............................60

2.16. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента.....................................................................................61

2.17. Исследование влияния пероксида водорода на сукцинатдегидрогеназу организмов разных таксономических групп.....61

2.18. Статистическая обработка данных......................................................62

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................................63

3.1. Особенности окисления сукцината митохондриями летательных мышц В. terres tris в покое и при нагрузке...................................................63

3.2. Продукция пероксида водорода митохондриями летательных мышц в присутствии сукцината...................................................................65

3.3. Оценка уровня повреждения митохондриальной и ядерной ДНК.....67

3.4. Закономерности и биохимические особенности на разных этапах индивидуального развития В. terrestris.......................................................74

3.5. Влияние продолжительности полёта В. terrestris на некоторые биохимические показатели...........................................................................77

3.6. Изоферментный состав сукцинатдегидрогеназы в митохондриях самцов и самок Bombus terrestris.................................................................80

3.7. Получение гомогенного препарата сукцинатдегидрогеназы из митохондрий мышц самцов шмелей...........................................................83

3.8. Физико-химические свойства сукцинатдегидрогеназы......................87

3.8.1. Определение молекулярной массы нативной молекулы.........87

3.8.2. Определение молекулярной массы субъединиц фермента.....88

3.9. Кинетические и регуляторные характеристики сукцинатдегидрогеназы................................................................................89

3.9.1. Определение константы Михаэлиса сукцинатдегидрогеназы.........................................................................89

3.9.2. Определение рН-оптимума.........................................................90

3.9.3. Влияние ионов различной природы на активность сукцинатдегидрогеназы.........................................................................90

3.10. Влияние пероксида водорода на активность сукцинатдегидрогеназы из летательных мышц В. ¿еггау/га и сравнение с СДГ из организмов других таксономических групп............92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................98

ВЫВОДЫ..........................

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

102 .104

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Шмели - эффективные опылители ряда важных сельскохозяйственных культур, таких как томаты, болгарский перец, огурец [115, 124, 216, 222]. Экономическая важность насекомых-опылителей обусловила особое внимание к исследованиям физиолого-биохимических процессов, протекающих в них.

Насекомые, в частности земляные шмели Bombus terrestris (L.), используются в качестве модельного объекта для изучения окислительного стресса, так как они отличаются интенсивным дыхательным метаболизмом, обусловленным высокими затратами энергии во время полета [42, 208]. Интенсификация энергетического метаболизма насекомых, повышение скорости работы ЭТЦ и, как следствие, высокий уровень образования АФК обусловливают важность изучения биохимических процессов, протекающих в митохондриях летательных мышц. Как известно, 2-5% потребляемого кислорода идет на образование АФК [110]. При усиленном поступлении кислорода в клетки или нарушении работы ЭТЦ митохондрий образование АФК может значительно возрастать [163]. Высокая интенсивность дыхания насекомых обусловлена не большим количеством ферментов, а их высокой удельной активностью [203]. Интересно, что в летательных мышцах насекомых цикл Кребса характеризуется большей интенсивностью в сравнении с другими животными, что достигается высокой активностью ряда катаболических ферментов [5].

Основные субстраты дыхания у насекомых - пролин, пируват, а-глицерофосфат, характерной чертой летательных мышц является то, что митохондриальная и цитоплазматическая формы фермента а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) образуют мощный каталитический цикл, передающий электроны на ЭТЦ [66, 210]. Функционирование а-ГФДГ хорошо изучено в организмах разных

таксономических групп, в том числе насекомых [36, 40, 66, 96, 159, 232]. Известно, что сукцинат является субстратом дыхания в стрессовых условиях [15]. Более того, сукцинат - компонент множества метаболических реакций, что позволяет ему осуществлять гибкий контроль соотношения метаболических потоков, т.е. играть роль регуляторного фактора [13, 61]. Изучение роли окисления сукцината заслуживает более пристального внимания. Реакция превращения сукцината в фумарат с образованием энергетического эквивалента в виде восстановленного флавинадениндинуклеотида (ФАДН2) катализируется сукцинатдегидрогеназой (СДГ).

Выделение и изучение свойств СДГ сопряжено с рядом трудностей, так как в процессе очистки, отделяясь от мембранных компонентов, фермент становится крайне лабильной структурой. Впервые очищенный препарат растворимой СДГ был получен из животных тканей Сингером [194]. В литературе описано несколько методов выделения комплекса II из митохондрий животных тканей, микроорганизмов [156, 233] и растений [12]. Однако работ по экстракции данного фермента из летательных мышц насекомых, в частности В. ґеггезґга, не проводилось.

Структурная организация молекулы сукцинатдегидрогеназы устроена таким образом, что данный белок расположен вблизи источников генерации АФК - компонентов ЭТЦ. В связи с этим представляется чрезвычайно важным изучить и охарактеризовать особенности организации окисления сукцината в митохондриях летательных мышц В. /еггея/ад и функционирования сукцинатдегидрогеназы, ее регуляторные свойства и молекулярную структуру, возможно, в силу адаптационных механизмов. Для полноценного извлечения энергии в цикле Кребса работа СДГ абсолютно необходима, кроме того, потеря активности СДГ приведет к накоплению в матриксе сукцината и реципрокному ингибированию

сукцинаттиокиназы, которая отвечает за субстратное фосфорилирование и дает одну АТФ на каждый оборот цикла. Также данные исследования имеют научный и практический интерес, в связи с тем, что нарушения в структуре фермента и работе генов, кодирующих отдельные субъединицы белковой молекулы, сопряжены, в частности, с развитием канцерогенеза [52, 149, 226].

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение молекулярной организации и регуляции окисления сукцината как основного субстрата дыхания при адаптации к стрессовым факторам шмелей В. terres tris.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. измерить максимальную скорость поглощения кислорода в летательных мышцах В. terrestris при использовании сукцината в качестве субстрата дыхания в состоянии покоя и при нагрузке;

2. определить интенсивность образования АФК при утилизации сукцината в качестве единственного субстрата дыхания;

3. оценить степень повреждения митохондриальной и ядерной ДНК из летательных мышц В. terrestris в модельном эксперименте;

4. выявить динамику активности СДГ и восстановленного глутатиона на разных этапах в процессе индивидуального развития В. terrestris;

5. выявить корреляцию активности ключевых ферментов энергетического метаболизма - СДГ и АГ - и динамику концентрации глутатиона в митохондриях в зависимости от продолжительности полета;

6. исследовать изоферментный состав СДГ в митохондриях самок и самцов шмелей В. terrestris с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;

7. получить гомогенный препарат СДГ из летательных мышц самцов шмелей и изучить физико-химические, кинетические и некоторые регуляторные свойства СДГ.

Научная новизна. Установлено, что сукцинат может выступать в качестве основного субстрата дыхания при адаптации к стрессовым факторам. Возможно, это обусловлено тем, что сукцинат является компонентом множества метаболических реакций. Это позволяет осуществлять гибкий контроль соотношения метаболических потоков, т.е. играть роль регуляторного фактора. Определен уровень продукции пероксида водорода при дыхании на сукцинате, произведена оценка % потребленного кислорода, который идет на выработку Н2Ог при использовании сукцината в качестве субстрата дыхания. Полученные данные о степени повреждения митохондриальной и геномной ДНК из летательных мышц В. terrestris в модельном эксперименте показали возможность использования метода long range ПЦР для интегрального определения уровня повреждений, и вполне вероятно, для мониторинга репараций этих повреждений.

Выявлена обратная зависимость активности СДГ и концентрации глутатиона в процессе развития В. terrestris, что соответствует существующим представлениям об оксидативном статусе клетки и подтверждает роль глутатиона как маркера окислительного стресса. Показано, что во время продолжительной нагрузки наблюдается двукратное повышение удельной активности СДГ, трехкратное снижение активности АГ и 30% снижение концентрации восстановленого глутатиона в митохондриях летательных мышц В. terrestris.

Обнаружены различия в изоферментном составе СДГ между самками и самцами В. terrestris - у самок выявлена индукция дополнительной изоформы СДГ в абдомене, вызванная возможно, утилизацией жирового тела, локализованного в данном отделе. Данная черта является отличительной для самок.

Впервые получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ из летательных мышц В. terrestris, охарактеризованы некоторые кинетические (константа Михаэлиса), физико-химические (молекулярная масса нативной молекулы, субъединиц фермента) и регуляторные свойств СДГ (влияние рН и солей), чувствительность к воздействию пероксида водорода. Проведен сравнительный анализ свойств СДГ В. terrestris с организмами других таксономических групп.

Практическая значимость.

Научно-практическая значимость полученных результатов состоит в первую очередь в диверсификации с нашей стороны существующих представлений о путях превращения сукцината -использование в качестве основного источника электронов при активности и резервного субстрата в условиях стресса - у насекомых и свойствах ферментной системы - сукцинатдегидрогеназы, участвующей в превращениях сукцината, обладающей рядом адаптационных преимуществ.

Постановка и оптимизация метода long range ПЦР показала возможность его использования для интегрального определения уровня повреждений, и вполне вероятно, для мониторинга репараций этих повреждений.

Изоферментный состав, индукция дополнительной изоформы в самках поднимает спорный вопрос о функционировании глиоксилатного цикла в животных [10].

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии, молекулярной биологии, спецкурсов энзимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Сукцинат является резервным субстратом дыхания при адаптации к стрессовым факторам, которым может являться продолжительный полет у насекомых.

2. Митохондриальная ДНК насекомых наиболее склонна к повреждениям, чем ядерная. Несмотря на наличие антиоксидантной системы и ферментов систем репарации, митохондрии не обеспечивают высокого, подобного ядерному, уровня защиты генома от АФК.

3. Выявлена динамика некоторых биохимических показателей в процессе индивидуального развития и во время продолжительного полета В. terres tris.

4. Обнаружена одна изоформа СДГ в митохондриях самцов шмелей, тогда как в митохондриях самок - две изоформы фермента, выполняющих, вероятно, различные метаболические функции.

5. Получен электрофоретически гомогенный препарат СДГ из летательных мышц шмелей самцов, определены молекулярные массы нативной молекулы СДГ и двух субъединиц А и В, изучены некоторые кинетические и регуляторные характеристики фермента.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 13-ой, 14-ой международных

Пущинских школах-конференциях «Биология - наука 21 века» (Пущино-на-Оке, 2009, 2010, 2012); на 3-й международной научно-технической конференции инновационных технологий (Воронеж, 2009), XV, ХЫХ МЭСК «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010, 2011), Всероссийской конференции «Закономерности распространения, воспроизведения и адаптации растений и животных» (Махачкала, 2010), IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз России» (Воронеж, 2011).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности функционирования летательных мышц насекомых

1.1.1. Строение летательных мышц

Многие исследователи отмечают, что летательные мышцы насекомых в результате морфофункциональной специализации превратились в самую активную из всех сократительных тканей, которые когда-либо возникали у животных в процессе эволюции.

Если максимальная степень метаболической активности в мышцах ног человека составляет 50-60 кал на 1 г веса в час, то средний уровень активности в летательных мышцах саранчи, дрозофилы и пчелы достигает соответственно - 100, 650 и 2400 кал на 1 г веса в час [25]. У представителей некоторых отрядов высших насекомых, в особенности у насекомых с высокой частотой взмахов крыла (от 100 до 1000 взмахов в секунду), летательные мышцы имеют особое гистологическое строение, свойственное так называемой фибриллярной мускулатуре. Миофибриллы этих м�