Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энергетическая эффективность различных путей анаэробного образования сукцината в митохондриях животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Энергетическая эффективность различных путей анаэробного образования сукцината в митохондриях животных"

На правах рукописи УДК 577.3

Гришина Елена Владимировна

ЭНЕРГЕТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ПУТЕЙ АНАЭРОБНОГО ОБРАЗОВАНИЯ СУКЦИНАТА В МИТОХОНДРИЯХ ЖИВОТНЫХ

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 1997

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: ведущий научный сотрудник,

кандидат медицинских наук Е.И. Маевский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник, профессор Ю. В. Евтодиенко;

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник A.A. Шарышев

Ведущая организация: НИИ Фармакологии РАМН г. Москва

Защита состоится ^/-¿-¿-^/Ср 1997 г. ь/-^"час^ мин. на заседании диссертационного совета Д 200.22.01. в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино, Московской обл., ИТЗБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан " "_1996 г.

Ученый секретарь диссертационно горсовета,

кандидат биологических наук У 7 ,1 П. А. Нелипович

//. / 1

/ ^¡/'[(Ссссиис*! ^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬННОСТЬ ТЕМЫ. Известно, что у человека и высших животных многие заболевания сердечно-сосудистой системы, легких и крови, геморрагический, травматический и ожоговый шок, некоторые токсические состояния и многие функциональные нагрузки сопровождаются развитием гипоксии или ишемии. Развитие реконструктивной хирургии и транспланталогии остро ставит вопрос о расширении возможностей сохранения функциональной активности органов и тканей после временного прекращения кровотока. Именно поэтому поиск и создание эффективных антигипоксических средств имеют большое значение для биологии и медицины. Анализ литературного материала и наш собственный опыт дают основание полагать, что эффективная защита от кислородного голодания должна основываться на выработанных в процессе эволюции физиологических и биохимических механизмах [Хочачка П., Сомеро Дж., 1977]. В исследованиях последних лет было показано, что у аэробных организмов полноценное восстановление в постги-поксический период обеспечивается в большой степени сохранностью митохондрий как основной системы энергообеспечения [Regitz V. et al., 1984; Jones D.P., 1995]. В связи с этим мы полагали целесообразным сосредоточить наши усилия на изучении механизмов и поиске путей, способствующих поддержанию природных реакций, направленных на сохранение митохондрий в условиях гипоксии и ишемии. К таким реакциям, протекающим в митохондриях тканей животных без доступа кислорода, можно отнести реакции окислительного и субстратного фосфо-рилирования, поддерживаемые за счет анаэробных редокс превращений субстратов цикла трикарбоновых кислот (ЦГК) и аминокислот. Конечным продуктом таких превращений в митохондриях является сукцинат [Кондрашова М.Н. и др., 1973; Taegtmeyer H., 1978.; Pisarenko O.I. et al., 1983]. При этом ключевое значение приобретает изучение энергетической эффективности различных путей анаэробного образования сукцината и зависимости их от энергетического состояния митохондрий, а также поддержка анаэробного образования сукцината с помощью экзогенных субстратов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ заключалась в изучении интенсивности и энергетической эффективности различных путей анаэробного образования сукцината в митохондриях различных тканей животных и возможность их поддержания экзогенными субстратами.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ формулировались следующим образом:

1 .Выявить и проанализировать наиболее интенсивные пути анаэробного образования сукцината в митохондриях, выделенных из различных тканей животных.

2.Определить условия, при которых происходит активация и торможение путей анаэробного образования сукцината в митохондриях.

3.Сопоставить интенсивность различных путей анаэробного образования сукцината в митохондриях с их энергетической эффективностью.

4.Исследовать возможность поддержания энергетического состояния изолированных клеток животных в условиях анаэробиоза при использовании субстратов - источников сукцината.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Методом Н-ЯМР-спектроскопии показано, что образование сукцината в митохондриях печени, сердца, коркового слоя почек крыс и других животных при исчерпании кислорода или при остановке дыхательной цепи ингибиторами идет в основном тремя путями. В порядке убывания интенсивности это: одновременное восстановление оксалоацетата и окисление а-кетоглутарата, дисмутация а-кетоглутарата до глутамата и сукцината и, наконец, восстановительное обращение ЦТК.

Обнаружено явление энергетического контроля скорости анаэробного образования сукцината в митохондриях: стимуляция в присутствии акцепторов макроэргиче-ского фосфата и торможение при наличии альтернативного источника АТФ.

В отличие от сложившихся теоретических представлений экспериментально установлено, что исследованные пути анаэробного образования сукцината имеют разную энергетическую эффективность. Скорость анаэробного образования сукцината далеко не всегда соответствует энергетическому выходу, измеряемому по поддержанию концентрации АТФ или величине трансмембранного потенциала митохондрий.

Дисмутация а-кетоглутарата - весьма мощный путь анаэробного образования сукцината - в митохондриях печени энергетически не эффективна.

Впервые выявлено спонтанное чередование путей анаэробного образования сукцината в митохондриях печени, сердца и коркового слоя почек, связанное с изменением метаболического состояния митохондрий после остановки дыхательной цепи.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Определены условия, позволяющие надежно регистрировать превращения интермёдиатов энергетического обмена в изолированных митохондриях животных с помощью метода Н-ЯМР-спектроскопии.

Показано, что экзогенные ЫАО-зависимые субстраты и дикарбоновые аминокислоты, способные превращаться в сукцинат в анаэробных условиях, поддерживают энергетику митохондрий и целых клеток.

Выявлены ограничения по использованию экзогенного сукцината непосредственно в анаэробных условиях, связанные с тем, что он может тормозить процесс образования эндогенного сукцината, необходимый для сохранения митохондрий при остановленной дыхательной цепи.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипок-сических состояний" в Москве в 1989 г.; VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц в Тбилиси в 1989 г.; Всесоюзном симпозиуме "Физиология и биоэнергетика гипоксии" в Минске в 1990 г.; на Международном рабочем совещании по межклеточным взаимодействиям в г. Пущино в 1994 г.; научных конференциях ИТЭБ РАН в 1993 г. и 1994 г; на 2-й Международной конференции "Гипоксия в медицине" в Москве в 1996 г.; Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" в г. Пущино в 1996 г.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения получен-

ных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на /^"страницах, включая^ таблиц и 22 рисунков. ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 220 белых крысах самцах линии "Wistar" весом 180250г, 15 морских свинках весом 300-350г и культивируемых клетках почки эмбриона свиньи С-ПС.

Митохондрии (MX) из печени крыс и морских свинок выделяли по модифицированной методике Schneider (1948) в среде, содержащей 0,3 М сахарозы (либо 0,15 М KCl при ЯМР-спектроскопии), 10 мМ трис-HCl (pH 7,4). MX сердца крысы выделяли по модифицированному методу Хогебума Д. и Шнейдера В. (1957) в среде, содержащей 0,3 М сахарозы (либо 0,15 М KCl при ЯМР-спектроскопии), 10 viM трис-HCl (pH 7,4), 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ АТФ. MX из коркового слоя почек крысы выделяли по методике для получения MX печени в среде, содержащей 250 viM маннита, 70 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES. Белок во всех случаях эпределяли методом Lowry О.Н. [1966].

Кардиомиоциты крыс выделяли после обработки перфузируемого сердца кол-тагеназой в растворе, содержащем 120 мМ NaCl, 5,8 мМ KCl, 1,5 мМ MgS04, 1,4 чМ КН2Р04, 14,1 мМ глюкозы, 4,3 мМ NaHCO,, 0,3 мМ СаС12, 10 мМ HEPES, pH 7,25, при 37° С методом Powell T,ét al. [1980]. Полученная суспензия клеток содержала 85-90 % жизнеспособных кардиомиоцитов.

Суспензионный штамм клеток почки эмбриона свиньи С-ПС опоронезависимый вариант клеток нормальной почечной ткани) выращивали в условиях перемешиваемого суспензионного культивирования в питательной среде м основе препарата ФГМ-С на солевом растворе Эрла с добавлением витаминов и >-10% сыворотки крупного рогатого скота. Для исследования использовали клетки точки эмбриона свиньи, культивируемые 112-2200 часов при заданных величинах )02 и pH и систематическом обновлении среды в культиваторе. Суспензию клеток i объеме 400 мл при концентрации клеток 600-1300 тыс. в мл концентрировали пу--ем осаждения при 600 g в течение 10 мин при 20-25° С, затем ресуспендировали в .50 мл среды, содержащей 130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 10 мМ HEPES (pH 7,4), 1 мМ ]аС12, 1 мМ КН2Р04, 5 мМ глюкозы и вновь осаждали в тех же условиях. Окончательный осадок ресуспендировали в 5 мл среды. Параметры дыхания и содержание дениловых нуклео'тидов при аэробной и анаэробной инкубации в присутствии >азличных экзогенных субстратов исследовали в процессе инкубации концентри-юванной суспензии клеток (5-10 мг белка в мл).

Дыхание MX и изолированных клеток регистрировали полярографически полярограф LP-7) в закрытой ячейке объемом 2 мл с закрытым кислородным лектродом Кларка при постоянном перемешивании. Среда инкубации: для MX ючени содержала 0.25 М сахарозы, 20 мМ KCl, 3 мМ КН2РО4,10 мМ трис-HCl (pH ,4), 1 мМ MgS04, (t 26° С); для MX сердца - 100 мМ KCl, 5 мМ КН2Р04, 20 мМ рис-HCl (pH 7,4), 3 мМ MgS04, 0,5 мМ ЭГТА, (t 29° С); для MX коркового слоя очек - 0,21 М сахарозы, 10 мМ KCl, 3 мМ КН2Р04, 0,5 мМ ЭДТА, 20 мМ HEPES pH 7,4, t 26° С); для кардиомиоцитов - 120 мМ NaCl, 5,8 мМ КС!, 10 мМ HEPES pH 7,25), 1 мМ СаС12, 1,4 мМ KH2POi, 14,1 мМ глюкозы, 1,5 мМ MgS04, 4,3 мМ ГаНСОз, (t 37 С), для культивируемых клеток почек эмбриона свиньи - 10 мМ

НЕРЕБ (рН 7,4), 130 мМ КаС1, 5 мМ КС1, 1,-5 мМ СаС12, 5мМ глюкозы, 1 мМ КН2Р04, (I 37° С). Субстраты добавляли в концентрации 5 мМ, АДФ - 150-200 мкМ, С1ССР - 2-5 мкМ.

Полученные препараты МХ были прочно сопряженными. Величина дыхательного контроля (ДК) по Чансу и Вильямсу на МХ печени крысы варьировала от 7,2 до 4,2, отношение АДФ/О от 1,97 до 1,56; на МХ сердца 2 ДК от 2,5 до 2,9; АДФ/О 1,4-1,5;наМХ почек ДКвсреднем был равенЗ,7и АДФ/О- 1,5).

Скорость потребления кислорода составляла в среднем 15 + 2 нг-ат 02 в мин на мг белка для кардиомиоцитов и 85 ± 4 нг-ат 02 в мин на мг белка для культивируемых клеток почки эмбриона свиньи. Добавление в инкубационную среду 5-10 мМ сукцината не влияло на скорость потребления кислорода, что свидетельствует, по крайней мере о сохранности наружной мембраны большей части клеток. Внесение в ячейку 5 мкМ С1ССР - разобщителя окислительного фосфорилирования повышало скорость дыхания клеток в среднем в 3,5 раза. Добавление жирных кислот и активация К7Ыа+-АТР-азы сопровождались активацией дыхания клеток.

Анаэробное образование сукцината, изменение концентраций исходных субстратов и их метаболических продуктов в изолированных МХ регистрировали с помощью ЯМР-спектрометра (Вгикег ШМ-400) [Писаренко О.И. и др., 1986]. Метод 'Н-ЯМР-спектроскопии позволяет проследить кинетику анаэробных превращений субстратов в изолированных МХ. Среда инкубации содержала 100 мМ КС1, 5 мМ КН2Р04, 20 мМ трис-НС1 (рН 7,4), 3 мМ М£С12, 0,5мМ ЭГТА, 0,4 мМ АДФ, 2,5% ДгО, а также различные субстраты (по 5 мМ) и антимицин А (0,3-0,4 мкг на мг МХ белка). Фосфоенолпируват и пируват вносили в виде натриевых солей, остальные субстраты - калиевые соли. Концентрация МХ в кювете спектрометра составляла 14-20 мг белка в мл для печени, 8-10 мг для сердца и 10-12 мг для почки. 'Н-ЯМР-спектры записывали в автоматическом режиме при температуре 300°К с интервалом 90 сек, в режиме 50 накоплений в минуту. Спектры регистрировали в области от 2,3 до 3,2 р.р.м. при использовании в качестве реперной линии спектра ЛО.

При анаэробной инкубации МХ представляют собой закрытую систему, в которой общий пул субстратов практически не меняется вследствие невозможности их полного окисления до С02 и Н20, что позволяет легко рассчитать концентрации убывающих и синтезируемых соединений.

Энергетическое состояние МХ определяли по содержанию адениловых нуклеотидов и величине трансмембранного потенциала на внутренней мембране МХ после инкубации в таких же условиях, как при регистрации 'Н-ЯМР-спектров Адениловые нуклеотиды определяли энзиматически в безбелковом экстракте. Для получения безбелкового экстракта пробы отбирали через 1 мин аэробной инкубации, а затем через 1 и 10 мин анаэробной инкубации.

Схема эксперимента по определению энергетического состояния кардиомиоцитов и культивируемых клеток эмбриона почки свиньи была такая же, как и дай МХ, за исключением состава инкубационной среды, описанного для клеток выше I содержащего 5 мМ глюкозы. Клеточную суспензию (1-2 мг белка в мл) сначал; инкубировали в аэробных условиях 3 мин, затем отбирали часть суспензии для по лучения безбелкового экстракта, добавляли в среду антимицин А и затем через : мин "анаэробной" инкубации вновь отбирали образец.

Энзиматическое определение концентрации адениловых нуклеотидов в безбелковых экстрактах выполняли флуорометрически по регистрации изменения степени восстановленное™ пиридиннуклеотидов в сопряженных реакциях [модифицированная методика Williamson and Corkey, 1969] в среде, содержащей 100 мМ КС1, 10 мМ MgCl2, 20 мМ трис-HCl (рН 7,3). В суспензии изолированных кардиомиоцитов, после определения АТФ в тех же пробах определяли содержание креатинфосфата.

Величину трансмембранного потенциала (Аф) в MX определяли по распределению липофильного проникающего катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) между матриксом MX и инкубационной средой. Концентрацию ТФФ+ измеряли при помощи электрода, чувствительного к ТФФ+ [Като N. ct al.,1979] в открытой термо-статируемой ячейке объемом 2 мл, с постоянным перемешиванием, при температуре 27®С в среде инкубации, содержащей 0.25 М сахарозы, 20мМ KCI, 3 мМ КН2Р04, 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 1 мМ MgS04, 2 мкМ ТФФ+. В каждой пробе повторяли калибровку электрода, используя в качестве стандарта 0,2 мМ раствор ТФФ+.

Полученные данные обрабатывали с помощью параметрических критериев статистики [Кокунин В.А., 1975].

I. Сопоставление путей анаэробного образования сукцината в митохондриях печени, коркового слоя почек и сердца крыс.

Ранее возможные пути образования сукцината при увеличении степени восстановленное™ пиридиннуклеотидов (ПН) схематически описывались М.Н.Кондрашовой (1969-1973), Taegtmeyer Н.(1984) и ИХочачкой и Дж.Сомера (1977, 1988). Отдельные пути анаэробного образования сукцината исследованы Писаренко О.И. и др.(1986); Penney D.G., Cascarano J.(1970); Pisarenko O.I. et al.(1983); Hohl С. et"al.(1987). В настоящей работе пути анаэробного образования сукцината в MX печени, сердца и коркового слоя почек изучались методом Н1-ЯМР-спектроскопии [Писаренко О.И. и др.,1986]. Промерив практически все возможные пути анаэробного образования сукцината в MX (табл. 1), мы пришли к выводу, что наиболее значимыми по интенсивности являются следующие.

1) Восстановительное обращение ЦТК от оксалоацетата (ОАА), малата или фу-марата до сукцината, которое приводит к окислению флавопротеидов дыхательной цепи и обеспечивает поддержание NÄDH-флавин-оксидоредуктазной реакции, сопряженной с генерацией А цН* на внутренней мембране митохондрий [Sanadi D.R., "Fluharty A.L., 1963].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

NADH2 NAD+ ОАА^—*МАЛАТ—>

ГМиП 2 «-AU

ФУМАРАТ^-^СУКЦИНАТ

2) Образование сукцината из субстратов, превращающихся в ОАА, с последующим восстановительным обращением ЦТК, в том числе из пирувата (Пир): Пир + С02+ АТФ ОАА + АДФ;

фосфоенолпирувата (ФЕП): ФЕП + С02+ ГДФ (AD®) -> ОАА + ГТФ (АТФ); аспартата (АСП). АСП + а-КГ ОАА + Глутамат.

3) Обычные окислительные реакции ЦТК, осуществляемые за счет сопряжения с восстановительным обращением ЦТК [Писаренко О.И. и др., 1986; Penney D.G., Cascarano J., 1970].

4) Анаэробная дисмутация а-КГ по Кребсу и Коэну в присутствии аммония [Krebs H.A., Cohen P.P., 1939].

а-КГ + NH^ Глутамат

NADH2 NAD+ Сукцинат ^ а-КГ

В этом случае одна молекула а-КГ вовлекается в восстановительное аминирова-ние, в результате которого образуется глутамат с одновременным окислением NAD((p)H до NAD(<t>)+. Восстановленность последнего в митохондриях поддерживается либо за счет окисления изоцитрата ЫАОФ-зависимой изоцитратдегидроге-назой [Tager & Slater, 1963], либо энергозависимой трансгидрогеназой [Скулачев В.В., 1975]. При работе трансгидрогеназы появляется окисленный NAD+, необходимый для окисления другой молекулы а-КГ до сукцината в а-кетоглутаратдегидрогеназной реакции.

Таблица 1. Образование сукцината (нМ на мг белка МХ) в МХ печени, сердца и корково го слоя почек за 8 минут анаэробной инкубации в присутствии различных субстратов.

СУБСТ{^ТЬ1-ИСТ0ЧНИК{1СУ1СЩШАТА. ПЕЧЕНЬ СЕРДЦЕ ПОЧКА

а-кетоглутарат (промытые МХ) 7,0±1,7 2,0±0,5 —

а-кетоглутарат + NH4C1 96,0±10,6 84,0+10,5 75,3±8,2

малат 33,0±3,0 40,0±5,8 36,+5,0

оксалоацетат1 6,7±1,4 — —

оксалоацетат2 78,0±3,2 — —

фумарат 19,0±4,0 — —

оксалоацетат + глутамат 13 6,+10,2 — —

оксалоацетат2 + изоцитрат 15 5, ±20,0 — —

аспартаг + а-кетоглутарат 169,±7,0 323±28,5 170,±20,4

малат + а-кетоглутарат 85,0+8,1 222+16,8 145,+17,4

В присутствии взятых по отдельности: изоцитрата + N14,01, пирувата, фосфоенолпирувата + 1 мМ КНСОЗ, аспартата, аланина, глутамата, а также при сочетании аланина с а-кетоглутаратом и эндогенных субстратах накопление сукцината не превышало 8 нМ на мг белка МХ. Начальна концентрация каждого добавленного субстрата - 5 мМ, ЫН.,С1 - 2,5 - 3 мМ, антимицина А - 0,3-0 мкг/мг белка МХ.

1.1. Анаэробное образование сукцината из пары'субстратов: а-КГ и АСП при участии аспартатаминотрансферазы.

При сопоставлении интенсивности различных путей анаэробного образования сукцината в исследованных МХ (табл. 1, рис. 1, 2, 3) оказалось, что самым мощным источником образования сукцината в МХ является сопряжение двух потоков -восстановительного обращения ЦТК и окисления а-КГ в обычной последовательности ЦТК, особенно когда исходными субстратами служит смесь а-КГ с АСП. В этом случае а-КГ равномерно утилизируется практически до полного исчерпания (рис. 1). Максимальная скорость накопления сукцината достигала 20 нМ в минуту на мг белка МХ.

Рис. 1.

АСП

Динамика изменения ■лугамат концентрации субстратов укцииат в суспензии митохондрий печени крысы при инкубации с антиыицином Л (0,4 мкг/мг белка МХ), к-КГ «¿-КГ (5 мМ) и АСП (5 ыМ).

0183456789 мяв

(Ошибка средних ± 12 % от абсолютной величины).

тМ

Рис. 2.

Динамика изменения концентации субстратов в суспензии митохондрий печени крысы в присутствии антимицина А (0,4 мкг/мг белка МХ) , об-КГ (5 мМ) и аммония (2,5 - 3 мМ). 23458789 ШСХ

(Ошибка средних ± 12 % от абсолютной величины).

оС-КГ

сукцинат

глутамат

1.2. Анаэробная дисмутация а-КГ по Кребсу и Козну.

Следующий по активности путь анаэробного образования сукцината - дисмутация а-КГ по Кребсу-Коэну [Krebs H.A., Cohen P.P., 1939] до сукцината и глутама-та. Для анаэробной дисмутации а-КГ в MX печени достаточно 0,5 мМ аммония. Такое и значительно большое количество аммония образуется в условиях гипоксии, аноксии и ишемии как из аминокислот [Watanabe Т. et al., 1969], так и в результате деградации адениловых нуклеотидов [Деркачев Э.Ф. и др., 1976]. В присутствии 2,5 - 3 мМ NH4C1 наблюдается равномерное накопление сукцината и глу-тамата в суспензии MX печени (рис. 2). Максимальная скорость накопления сукцината достигала 14 н М в минуту на мг белка MX.

1.3. Восстановительное обращение UTK.

Наиболее полно описано в литературе восстановительное обращение ЦТК (от ОАА, малата или фумарата до сукцината) [Penney D.G., Cascarano J., 1970; Писа-ренко О.И. и др., 1984; Grivennikova V.G. et al., 1993]. Наши эксперименты показали, что в исследованных MX этот процесс происходит в 5-7 раз медленнее, чем анаэробное образование сукцината из пары а-КГ - АСП и примерно в 2-3 раза медленнее анаэробной дисмутации а-КГ (табл. 1, рис. 3). Максимальная скорость накопления сукцината при этом не превышала 4,5 цМ в минуту на мг белка MX.

Рис. 3.

Динамика изменения концентации субстратов в суспензии митохондрий печени крысы в присутст вии антимицинаА (0,4 мкг на мг белка MX)

и малата (5 мМ).

(Ошибка средних ± 12 % от абсолютной величины).

1.4. Другие источники анаэробного образования сукцината

Значительно ниже скорости превращения в сукцинат добавленных по отдельности фумарата, а-КГ. Практически не образуется сукцинат из глутамина, глута-мата, аланина, аспартата, изоцитрата, пирувата, а также в промытых MX из а-КГ. Существенный разброс данных по синтезу сукцината из ОАА (табл.1), по видимому, объясняется различиями в энергетическом состоянии выделенных MX, поскольку транспорт ОАА в MX носит энергозависимый характер [Haslam J.M., Griffiths D.E., 1968].

II. Анаэробное образование сукцината и энергетическое состояние митохондрий.

2.1. Зависимость анаэробного образования сукцината от энергетического состояния митохондрий.

На МХ печени крысы исследовали влияние исходного энергетического состояния на анаэробное образование сукцината. Различные энергетические состояния задавались изменением исходной величины отношения АТФ/АДФ при суммарной концентрация АТФ и АДФ в инкубационной среде на уровне 4 мМ, что близко к уровню адениловых нуклеотидов в ткани печени [Ныосхолм Э., Старт К., 1977]. Анаэробное образование сукцината регистрировали в "высокоэнергетическом" и "низкоэнергетическом" состояниях.

"Высокоэнергетическое" состояние задавали двумя способами: высоким начальным отношением АТФ/АДФ, равным 3, или внесением в среду альтернативного источника АТФ - избытка креатинфосфата с креатинкиназой. "Низкоэнергетическое" состояние создавали либо низким начальным отношением АТФ/АДФ - 0,3, либо внесением в среду фосфат—акцепторной глюкозо-гексокиназной системы, либо разобщением окислительного' фосфорилирования внесением 5 мкМ С1ССР.

сукцинат

, (нМ/мг бетпса за 2,5 мин) эо

Условия инкубации температура 27°С, концентрации 40 субстратов - 5ыМ, аммония - 2,5 ыМ, КрФ - 15 мМ, 30

АТФ + АДФ - 4ыМ, антииицина А' - 1мкМ, С03СР - 5 мкМ, 20 активность КК-0,Зед. ^ АТФ/АДФ 0.3 10 рн КК+КрФ ^ сесср

о

об-КГ+АСП об-КГ+аммоний МАЛАТ Условные обозначения КК— креатинаиназа. КрФ— креатинфосфат

Рис. 4. Влияние исходного энергетического состояния на анаэробное образование сукцината из различных субстратов МХ печени крысы.

Как показано на рис. 4, скорость анализируемых путей анаэробного образования сукцината максимальна в низкоэнергетическом состоянии, создаваемом низким отношением АТФ/АДФ, и резко снижена в высокоэнергетическом состоянии в присутствии альтернативного источника АТФ - креатинфосфата и креатинкиназы.

Разобщение окислительного фосфорилирования незначительно тормозит анаэробное образование сукцината при использовании пары а-КГ + АСП или при дисму-тации а-КГ в присутствии аммония, и практически полностью останавливает - из маната. Торможение восстановительного обращения из малата наблюдали и при истощении пула адениловых нуклеотидов в присутствии глюкозо-гексокиназной фосфат-акцепторной системы. По-видимому, для протекания восстановительного обращения из малата необходимо как прочное сопряжение окислительного фосфорилирования, так и сохранение пула адениловых нуклеотидов, чтобы избыток АДФ мог служить дополнительной движущей силой процесса. Таким образом, анаэробное образование сукцината в МХ подвержено энергетическому контролю.

2.2. Изменение пула адениловых нуклеотидов при анаэробном образовании сукцината в МХ.

Данные различных исследователей по энергетической эффективности анаэробного образования сукцината весьма противоречивы: от явно оптимистических оценок [Taegtmeyer Н., 1978; Sogabe Н., 1983; Писаренко О.И. и др.,1984], до полного отрицания связи между образованием сукцината и синтезом АТФ [Hohl С. et al., 1987]. Следует однако отметить, что в последних случаях как правило энергетические параметры клеток или органов определяли после длительной (до 1 часа) анаэробной инкубации на фоне уже накопившегося сукцината. В таких условиях вклад процесса анаэробного образования сукцината в поддержание энергетики клеток измерить невозможно. Мы попытались оценить состояние пула адениловых нуклеотидов при анаэробном образовании сукцината в МХ с различными источниками сукцината на ранних сроках анаэробиоза (от 1 мин до 10 мин). Выбор субстратов был продиктован вышеописанными результатами исследований.

0

[АТФ! (нМ/мг МХ белка)

АТФ/АДФ

инкубации □ вз Ю мин

Рис. 5. Энергетическое состояние МХ печени крысы при инкубации с антимицином А в присутствии субстратов: 1 - а-КГ, 2 - а-КГ с аммонием, 3 - а-КГ с АСП, 4 - малата, 5 - а-КГ с малатом. Начальные концентрации субстратов - 5 мМ; аммония (NN4 С1) - 2,5 мМ; антимицина А - 0,4 мкг на мг белка МХ.

Как показано на рис. 5 А, минимальному приросту сукцината (из а-КГ без аммония, табл. 1) соответствовала наименьшая концентрация АТФ, а самый мощный путь анаэробного образования сукцината (из пары а-КГ с АСП) существенно тормозил падение [АТФ]. Но ни один из исследованных нами путей образования сукцината не обеспечил сохранения концентрации АТФ в суспензии MX печени в течение 10 минут анаэробиоза хотя бы на уровне, наблюдаемом через 1 минуту. Это может быть связано с тем, что анаэробный ресинтез АТФ в целом уступает АТФ-азлой активности MX. При одновременном торможении аденилаттранслоказы кар-боксиатрактилазилдом и ГГ-АТФ-азы олигомицином мы наблюдали такое же торможение распада АТФ, как и при анаэробном образовании сукцината из пары а-КГ с АСП. На рис. 5 Б приведены наиболее информативные параметры состояния пула адениловых нуклеотидов в MX при анаэробиозе. Как видно, с наибольшей эффективностью способствуют поддержанию отношения АТФ/АДФ в течении 8-10 минут анаэробиоза две пары субстратов: а-КГ с аспартатом и а-КГ с манатом, являющиеся самыми мощными источниками анаэробного образования сукцината. Особое место занимает анаэробная дисмутация а-КГ. Будучи значительным источником сукцината, этот процесс не способен замедлять падение или поддерживать уровень АТФ и отношение АТФ/АДФ в MX.

2.3. Сравнительная оценка энергетической эффективности различных путей анаэробного образования сукцината по изменению величины трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода на внутренней мембране MX.

Поскольку энергетический выход анаэробного образования сукцината слишком мал по сравнению с интенсивностью энергопотребляющих реакций самих MX, обнаружить и оценить его по изменению, концентрации АТФ весьма сложно. Очевидна необходимость исследования начального периода анаэробиоза, пока образование сукцината могло идти с достаточно высокой скоростью и не тормозится из-за недостатка исходных субстратов - источников сукцината или избытка накопившегося сукцината.

Наиболее адекватным для такого исследования является кинетический подход, позволяющий регистрировать сдвиги в степени энергизации MX по изменению величины трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода -Д рГТ на внутренней мембране MX. О величине А рН+ судили на основании измерения распределения между MX и средой липофильного катиона ТФФ+ и последующего расчета величины Дер. При этом добавкой ротенона в среду инкубации мы моделировали гипоксическое состояние, когда согласно исследованиям Chance et al.[1969] пиридиннуклеотиды уже целиком восстановлены, а флавины и терминальный участок дыхательной цепи еще окислены. Аноксическое состояние моделировали при помощи антимицина А.

При торможении окисления NAD-зависимого субстрата Р-оксибутирата (Р-ОМ) ротеноном (ингибитором переноса электронов на участке между пиридиннуклео-тидами и флавопротеидами) величина Дер резко падала (рис. 6 А). Последующее внесение в инкубационную среду сукцината способствовало восстановлению Дф за счет работы терминального участка дыхательной цепи. Добавление NAD-зависимых субстратов, способных превращаться в сукцинат, значительно тормозило падение Дер (рис. 6 Б). В условиях ротенонового блока образование из NAD-

зависимых субстратов и окисление образующегося сукцината обеспечивает существенное поддержание мембранного потенциала МХ.

Падение ¿ч> мх+" " субстрат + МХ

Рис. 6. Изменение величины Дер на внутренней мембране МХ печени крысы при торможении окисления ЫАО-зависимых субстратов ротеноном (А, Б) и окислении экзогенного (А) и вновь образуемого (Б) сукцината. Добавки: р-оксибутират (р-ОМ), а-кетоглутарат (а-КГ). малат (МАЛ), аспартат (АСП), сукцинат по 5 мМ, К1Н401- 2,5 мМ, ротенон - 5 мкМ, ТФФ* - по 1,5 мкМ.

Подобный, но менее выраженный эффект от субстратов - источников анаэробного образования сукцината наблюдали в случае остановки дыхательной цепи на постфлавиновом участке антимицином А. Количественная оценка энергетической эффективности различных путей анаэробного образования сукцината по степени снижения величины Дер в присутствии антимицина А приведена на рис. 7.

Д!Р гдУ

I 1-1

180 170 160 150 140 130 120 110 100 90

I

без суб.

Рис. 7.

Мембранный потенциал дУ ыитохондий печени крысы в аэробных (А) и анаэробных (Б) условиях в присутствии субстатов 1

2 -(¿-КГ+ а им о ний ,

3 - малат, 4 -с£-КГ + АСП.

Сопоставление скоростей различных путей анаэробного образования сукцината с их способностью поддерживать Дф свидетельствует о наибольшей энергетической эффективности восстановительного обращения ЦТК и наличии в целом хо-

рошей корреляции между интенсивностью анаэробного образования сукцината и степенью поддержания Д<р (коэффициент корреляции 0.8, р < 0.001).

Следует обратить внимание на то, что удельная энергетическая эффективность восстановительного обращения ЦТК от малата на единицу образующегося сукцината выше, чем при использовании пары а-КГ с АСП. Тогда как суммарный энергетический выход больше при использовании смеси а-КГ с АСП.

III. Чередование путей анаэробного образования сукцианата в митохондриях животных.

В предыдущих разделах работы показано, что различные пути анаэробного образования сукцината существенно различаются как по абсолютной скорости, так и по динамике скоростей превращения отдельных субстратов в ходе анаэробной инкубации. Так, скорость утилизации аспартата падает уже через 3-4 минуты при использовании пары субстратов а-КГ + АСП (рис. 1). Напротив, анаэробная дисму-тация а-КГ может идти практически с неизменно высокой скоростью в течение длительного промежутка времени (рис. 2). Обнаруженные особенности динамики отдельных путей анаэробного образования сукцината и вышеописанная зависимость их скоростей от энергетического состояния МХ, существенно меняющегося в процессе анаэробной инкубации, позволяют ожидать изменение соотношения различных путей анаэробного образования сукцината во времени. Для проверки этого предположения мы провели расчет соотношения возможных путей образования сукцината в МХ исследуемых тканей в условиях антимицинового блока дыхательной цепи. Расчет производили по расходу субстратов и образованию продуктов в течение инкубации. В качестве источника сукцината использовали пару субстратов а-КГ + АСП. Такой выбор был обусловлен тем, что превращения, запускаемые парой а-КГ + АСП, могут обеспечить реализацию в МХ различных путей анаэробного образования сукцината и при этом сохраняется возможность балансового расчета.

Таблица 2. Изменение (в процентах) соотношения различных путей анаэробного образования сукцината в МХ печени, сердца и почек крысы.

ТКАНЬ ; - ПУТИ А11 ЛЗРОЕИдГО ^ВРЛЗОВ.ШИЯСУКШШЛТЛ ! - ВРЕМЯ мин.) :

. г 4,5'' : б - 74''

Печень Восстановительное обращение ЦТК 100 80 34 24

Окисление а-кетоглугарата, сопряженное с восстановительным обращением ЦТК - 20 36 30

Анаэробная дисмутация а-кегоглутарата - - 30 46

Сердце Восстановительное обращение ЦТК 100 39 - -

Окисление а-кетоглугарата, сопряженное с восстановительным обращением ЦТК - 51 - -

Анаэробная дисмутация а-кетоглугарата - 11 100 100

Почка Восстановительное обращение ЦТК 83 74 55 8

Окисление а-кетоглутарата, сопряженное с восстановительным обращением ЦТК 17 28 45 66

Анаэробная дисмутация а-кетоглугарата - - - 26

На основании данных приведенных в табл. 2, получается, что сначала идет обращение ЦТК, поддерживающее реакции окислительного фосфорилирования; затем идет одновременное окисление а-КГ и обращение ЦТК - энергетически самый интенсивный процесс; и, наконец, преобладает анаэробная дисмутация а-КГ до глутамата и сукцината - энергетически наименее эффективный процесс. При чередовании путей анаэробного образования сукцината энергетическая эффективность процесса падает со временем.

Полученные результаты позволяют понять большинство противоречий в данных различных исследователей о неодинаковой энергетической эффективности и интенсивности процесса анаэробного образования сукцината. Возможно, эти различия обусловлены реализацией разных путей данного процесса, изменением их соотношения и энергетической эффективности по мере переживания органов и тканей в условиях ишемии и гипоксии.

IV. Влияние субстратов - источников сукцината на энергетическое состояние изолированных клеток в аэробных и анаэробных условиях.

Результаты экспериментов, выполненных на изолированных MX различных тканей крыс показали, что анаэробное образование сукцината (кроме дисмутации а-КГ) способствует уменьшению степени деэнергизации митохондрий в короткий период анаэробиоза. По мере увеличения длительности анаэробного состояния происходит чередование путей анаэробного образования сукцината, имеющих разную энергетическую эффективность. В связи с этим были поставлены эксперименты по анализу энергетического состояния целых клеток в условиях антимициново-го блока дыхательной цепи MX при инкубации с различными субстратами - источниками сукцината. В качестве объекта были выбраны изолированные кардиомио-циты крысы и культивируемые клетки почки свиньи, любезно предоставленные H.H. Брустовецким и Э.И. Лежневым.

Рис. 8.

Энергетическое состояние „^ к ар диомиоцит о в крысы 100Г в условиях анаэробной инкубации (3 мин) с различными субстратами. 60 (за 100% приняты данные, полученные в аэробных условиях). 20

ао

40

|АТФ| |АТФ/АДФ[ |атф/АМФ| [ЗТЗГ ' fh

I

1

ira без су бет, гп 4- субстраты -

источники сукцината

Энергетическое состояние клеток оценивали по изменению концентрации

АТФ, отношения АТФ/АДФ и АТФ/АМФ и величины энергетического заряда (Э.з.). Концентрацию адениловых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ) и креатинфос-фата (в суспензии кардиомиоцитов) определяли после аэробной инкубации клеток и последующей анаэробной инкубации. В качестве потенциальных источников

сукцината использовали следующие субстраты и их сочетания: глутамат, аспартат +■ а-кетоглутарат, малат, а-кетоглутарат + МН4С1 (рис. 8).

Энергетическое состояние длительно культивируемых клеток почки эмбриона свиньи в аэробный и анаэробный периоды оценивали по отношению АТФ/АДФ (рис. 9). При анаэробной инкубации в отсутствии субстратов - источников анаэробного образования сукцината (когда отсутствуют субстраты, либо добавлен сукцинат, либо глутамин, который при кратковременной анаэробной инкубации не превращается в сукцинат) наблюдалось максимальное падение отношения АТФ/АДФ. Напротив в присутствии субстратов - источников сукцината отношение АТФ/АДФ поддерживалось на более высоком уровне.

1. Проведено сравнительное исследование интенсивности и энергетической эффективности различных путей образования сукцината при остановке дыхательной цепи в МХ печени, сердца и коркового слоя почек животных.

2. Самым мощным источником анаэробного образования сукцината в исследованных МХ является сопряженное течение восстановительного обращения ЦТК и окисления а-КГ при использовании пары субстратов а-КГ-АСП. Следующий по активности путь - дисмутация а-КГ в присутствии аммония до сукцината и глута-мата. Скорость восстановительного обращения ЦТК от малата до сукцината в МХ всех исследуемых тканей существенно ниже.

3. При сохраненном пуле адениловых нуклеотидов анаэробное образование сукцината находится под энергетическим контролем: подавляется в высокоэнергетическом состоянии и активируется в низкоэнергетическом состоянии. Обнаружены особенности энергетической регуляции отдельных путей анаэробного образования сукцината : восстановительное обращение ЦТК от малата жестко зависело от энергетического состояния МХ; сопряженное течении восстановительного и окислительного превращений из пары КГ-АСП минимально зависело от изменения энергетического состояния. Разобщение окислительного фосфорилирования тор-

1 2 3 4 5 суостратов - омм, аммония - ЗмМ. Время инкубации 3 мин. (За 100%приняты величины, полученные в аэробных условиях)

Рис. 9.

Энергетическое состояние культивируемых клеток почки свиньи в условиях анаэробной инкубации

1 — без субстратов,

в присутствии субстратов:

2 — малата,

3 - о£-КГ с аммонием,

4 - глутамата,

5 -о^КГ с АСП. Начальные концентрации субстратов - 5мМ,

ВЫВОДЫ

мозило анаэробную дисмутадию а-КГ и останавливало восстановительное обращение цикла Кребса.

4. Максимальному синтезу сукцината из пары КГ-АСП соответствует наиболее высокий уровень концентрации АТФ и отношения АТФ/АДФ в MX при анаэробиозе. Минимальному приросту сукцината из а-КГ без аммония соответствовал наименьший уровень АТФ. Анаэробная дисмутация а-КГ, будучи мощным источником сукцината, не предотвращает падение уровня АТФ и отношения АТФ/АДФ в MX печени.

5.Активация анаэробного образования сукцината при остановке дыхательной цепи MX ротеноном или антимицином А способна затормозить падение трансмембранного электрохимического потенциала на внутренней мембране MX.

6. В MX животных обнаружено неизвестное ранее спонтанное чередование путей анаэробного образования сукцината: энергетически более эффективные пути сменяются энергетически менее эффективными

7. При анаэробной инкубации изолированных кардиомиоцитов крысы и культивируемых клеток почки эмбриона свиньи экзогенные субстраты - источники сукцината способствуют лучшему сохранению энергетического статуса клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЦрТАЦИИ.

1. Маевский Е.И., Гришина Е.В., Окон М.С., Кутышенко В.П. Анаэробное образование сукцината и ресинтез АТФ в митохондриях тканей крысы. - В сб. "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний.", ред. Лукьянова Л.Д., М„ 1989, стр. 80-86.

2. Маевский Е.И., Гришина Е.В., Розенфельд A.C., Брустовецкий H.H. "Различия реакций митохондрий органов крыс на острую гипоксию и ишемию". - Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Физиология и биоэнергетика гипоксии", Минск, 1990, стр. 21-22.

3. Брустовецкий H.H., Маевский Е.И., Гришина Е.В. "Роль Ыа/К-АТФазы в активации дыхания изолированных кардиомиоцитов ненасыщенными свободными жирными кислотами." - Цитология, 32, 9, 1990, с.921- 922.

4. Брустовецкий H.H., Егорова М.В., Гришина Е.В., Маевский Е.И., Кокоз Ю.М., Зинченко В.П. "Механизм активации дыхания изолированных кардиомиоцитов крысы ненасыщенными свободными жирными кислотами. Роль ионов Na+." - Биологические мембраны, 8, 8,1991, 824-829.

5. Брустовецкий H.H., Егорова М.В., Гогвадзе В.Г., Гришина Е.В., Кокоз Ю.М., Маевский Е.И. "Ыа+-зависимый механизм стимуляции дыхания изолированных кардиомиоцитов крысы арахидоновой кислотой. Роль перекисного окисления ли-пидов и фосфолипазы А ." - Биологические мембраны, 8, 8, 1991, 907-911.

6. Maevsky E.I., Grishina E.V., Rosenfeld F.S., Okon M.S.,Kondrashova M.N. "Substrate exchange in hypoxic animal cells".in: Abstract Workshop on intercellular communication, Pushchino, 1994, p. 65.

7. Grishina E.V., Maevsky E.I., Brustovetsky N.N., Okon M.S. Energy efficiency of anaerobic substrate transformation in liver mitochondria in rats. - Hypoxia Medical J., 1996, N2, p. 30.

8. Maevsky E.I., Grishina E.V. Preservation of animal mitochondria under hypoxia by means of anaerobic redox substrate transformations. - Hypoxia Medical J., 1996, N 2, p. 43-44.

-j

9. Маевский Е.И., Гришина E.B., Окон M.C., Брустовецкий Н.Н., Кутышенко В.П. Чередование путей анаэробного образования сукцината в митохондриях сердца крысы. - Тезисы докладов Всеросийской конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц", Пущино, 1996, стр. 45-46.

10. Маевский Е.И., Гришина Е.В., Окон М.С., Брустовецкий Н.Н. Сравнительная оценка энергетического вклада анаэробного образования сукцината из различных субстратов в митохондриях печени крысы. - В сб. "Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве", Пущино, 1996, стр. 42-53.

Т7.ТГ.9Г) г. Зак.7330Р. Тир.ТОО шкз. Усл.печ.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте п СИТИ ГЩ РАН