Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Субстратная регуляция цианидрезистентность и ультраструктура митохондрий озимой пшеницы при действии низких температур и картолина

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Субстратная регуляция цианидрезистентность и ультраструктура митохондрий озимой пшеницы при действии низких температур и картолина"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

-т-М-—-:-

На правах рукописи УДК 581.12: 581.1. 036

АБДРАХИМОВА Йолдыз Раисовна

СУБСТРАТНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ, ЦИАНИДРЕЗИСТЕНТНОСТЬ И УЛЬТРАСТРУКТУРА МИТОХОНДРИЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР И КАРТОЛИНА

03.00. 12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1995

Работа выполнена на кафедре физиологии растений Казанского государственного университета

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки

Республики Татарстан, доктор биологических наук, профессор Л.П.Хохлова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.И.Чиков

кандидат биологически); наук А.С.Муравьева

Ведущая организация:

Ботанический институт им.В.Л.Комарова РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится " 1995 г. в " СО" часов на

заседании специализированного Совета К.002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биологии КНЦ РАН (420503,г.Казань, а/я 30).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского института биологии КНЦ РАН.

Автореферат разослан " " 1995 г.

Ученый секретарь

специализированного Совета, . ~

кандидат биологических наук Н.Л.Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из наиболее разрабатываемых проблем в современной физиологии растений является изучение механизмов устойчивости сельскохозяйственных растений к неблагоприятным факторам, в том числе низким температурам. Более.глубокого понимания сущности адаптивных реакций можио достичь путем направленного изменения структурно-функционального состояния клеток с помощью высокоэффективных регуляторов роста, к которым относится антистрессовый препарат картолин (Баскаков,1988).

Несмотря на то, что дыхание принято рассматривать как интегральный показатель состояния растений, сведения о митохонд-риальных механизмах его регуляции,в частности, субстратной зависимости функционирования электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) и вкладе цианидрезистентного пути при низкотемпературной адаптации озимых культур, недостаточны и противоречивы (Хохлова,1976, 1987; Войников, 1 987 ; 1=)уЫ<а,1989; Кравец И др.,1990).

Относительно слабоизученной является также динамика ультратонкой организации митохондрий и других субклеточных структур при продолжительном закаливании озимой пшеницы в естественных условиях (Аветисова, Чельцова,1981; Полыгалова и др., 1982; Мишустина,1984). Ультраструктурные данные по влиянию картолина ограничиваются лишь анализом фотосинтетического аппарата клеток листьев проростков (Астахова и др.,1288).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выяснение механизмов субстратной регуляции дыхания и его циа-нидрезистентности, а также характера ультраструктурной организации митохондрий и клеток при адаптации растений к низким температурам и действии картолина.

Были поставлены следующие задачи:

1) исследовать динамику конкурентных взаимоотношений ма-лат- и сукцинатдегкдрогеназ (МДГ и СДГ) митохондрий узлов кущения и проростков озимой пшеницы;

2) изучить субстратную зависимость цианидрезистентного дыхания (ЦРД) и соотношение активностей терминальных путей ЭТЦ и их вклад в общее дыхание;

3) определить' микровязкость митохондриальных мембран при

прямом и опосредованном действии гипотермии и картолина;

4) проследить за динамикой ультраструктурных перестроек митохондрий и клеток узлов кущения в осенне-зимний период.

Научная новизна работы. Впервые для митохондрий проростков и узлов кущения озимой пшеницы установлено,что соотношение активностей СДГ и МДГ регулируется механизмом взаимного ингибиро-вания конкурирующих дегидрогеназ. Выявлена зависимость ЦРД от природы окисляемого субстрата,более выраженная в случае полевых растений,при- этом картолин способствовал увеличению потенциальной активности альтернативного пути. Отмечено снижение активности альтернативного пути ЭТЦ после холодового закаливания проростков,более всего при совместном окислении субстратов.Применение модифицированного нами метода полярографического анализа тканевого дыхания позволило обнаружить трехфазную динамику тесно взаимосвязанных изменений общего и альтернативного дыхания сегментов проростков в процессе их "адаптивного старения"(в течение-24 ч), а также низкотемпературной адаптации растений.

Впервые обнаружено появление сложноорганизованных ассоциаций митохондрий вплоть до формирования ретикулума.а также крайнее морфологическое разнообразие данных органелл (овальные,тороидальные, чашевидные, гантелевидные формы) при длительном закаливании расте~ний низкими положительными температурами.Адаптация к отрицательным температурам сопровождалась снижением межмито-хондриальной гетерогенности и интенсивности окислительных процессов. Одновременно отмечено увеличение поверхности плазмалем-мы за счет складчатости, инвагинированности и индукции процессов эндоцитоза. Выдвинуто представление о проявлении в клетках компенсаторных' структурно-функциональных механизмов разных типов в зависимости от дозы альтерирующего фактора.

Установлено, что предпосевное замачивание семян в растворе картолина (3»10-5 М) не изменяло характера субклеточных перестроек в осенне-зимний период, но положительно повлияло на их количественную сторону и темпы. Усложнение организации митохонд-риома, "сукцинатный" тип дыхания и увеличение потенциальной активности ЦРД свидетельствовали о повышенной напряженности энергетического обмена,способствующей эффективному протеканию процессов метаболической адаптации и формированию более высоко!

морозоустойчивости обработанных картолином растений по сравнению с необработанными.

Практическая значимость работы.Результаты исследований углубляют представления о субклеточных механизмах регуляции активности дегидрогеназных систем и путей ЭТЦ дыхания, а также об ультраструктурной организации митохондрий и клеток в условиях направленного изменения морозоустойчивости растений под влиянием холодового закаливания и антистрессовых регуляторов роста. Полученные доказательства полифункционалоного действия картоли-на могут быть полезными для поиска практических путей оптимизации процессов закаливания сельскохозяйственных растений.

Выявленная нами возможность образования сложных форм митохондрий, в том числе ретикулярных, поднимает вопрос о проблематичности выделения высокоинтактных органелл из уалов кущения в определенные периоды онтогенеза растений.

Арробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на VI Всесоюзном симпозиуме- "Ультраструктура растений" (Чернигов,1988>, зональной конференции молодых ученых-бислогов (Казань,1989), Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений" (Иркутск, 1991), Всесоюзном совещании "Применение янтарной кислоты в медицине и сельском хозяйстве" (Казань,1993), 3 съезде ВОФР (Санкт-Петербург,1993), отчетных научных конференциях Казанского госуниверситета (1989-1995гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, включая 5 статей. Одна работа находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 170 страницах, содержит 26 рисунков,11 таблиц и одну схему. Список цитированной литературы включает 220 наименований, в том числе 102 на иностранном языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали побеги этиолированных проростков и узлы кущения полевых растений озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Мироновская 808. Проростки, выращенные на водопроводной воде (контроль) и растворе картолина-2 (3«10"5М) (опыт) при 23±1°С, подвергали холодовому закаливанию при 2¿1°C в течение

3.5 суток. В полевых экспериментах проводили предпосевное замачивание семян (8 ч) в растворе кзртолина той же концентрации. Пробы брали с раскустившихся растений в периоды осенней, вегетации, закаливания и вынужденного покоя (.конец сентября-декабрь).

Методика выделения митохондрий. Митохондриальную фракцию иг тканей узлов кущения и этиолированных проростков выделяли согласно методике Войникова (1980) с модификациями (Хохлова и др.,1993). Общее время выделения митохондрий составляло 30-40 минут, все операции проводили при температуре не выше 4°С. Содержание митохондриального белка оценивали по Лоури (Lowry et al.,1951).

Определение окислительной и ФосФорилисуюшей активности митохондрий проводили на полярографе 0Н-105 (Венгрия) с помощью закрытого электрода типа Кларка (Трушанов,1973) в условиях постоянного термостатирования при 25°С. Среда инкубации митохондрий рН 7.4 содержала 18 мМ КНгРО*, 125 MM КС1, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ МдС1г.субстрат окисления (10 мМ мапат и/или сукцинат,2 мМ НАДН) 90 мкМ АДФ. Рассчитывали скорости дыхания з 3 и 4 состояниях, величины отношения АДФ/0 и коэффициента дыхательного контроля (КДХ) (Chanse,Wi11iams,1956).

Поглощение кислорода тканями измеряли полярографически согласно (Azcon-Bieto et al.,1983). Среднюю часть побегов нарезали на 1 —1.5—мм сегменты, навеску в 0.1 г отмывали, инфильтрировали 0.2 мМ СаСЪ рН 7.0 с добавлением 0.1 X БСА и переносили в ячейку, которая содержала среду того же состава.

Для ингибигорного анализа дыхания митохондрий и тканей использовали цианид калия (KCN) и бензгидроксамовую кислоту в конечной концентрации 1-2 мМ.

Микровязкость митохондриальных мембран определяли на ЭПР-спектромзтре "Thomson"(Франция) с помощью спин-меченых производных кетопальмитиновой кислоты MeFASL(10,3) (Sentjure et al., 1985), как описано нами ранее (Гарифуллина и др.,1992).

При электронно-микроскопическом анализе ультраструктуры клеток кусочки тканей узлов кущенил или средней части побега проростков фиксировали 2.5Х глутаральдегидом на 0.1 М фосфатном буфере рН 7.2 в течение 6-12 ч.•Постфиксацию проводили 1ж четы-рехокисью осмия на том же буфере с добавлением сахарозы (34

мг/мл) в течение 2 ч.Образцы,дегидратированные в этиловом спирте восходящей концентации (30-100Х) и ацетоне,заключали в эпоксидную смолу Эпон-812. После полимеризации смолы срезы получали на ультрамикротоме LKB-Ш (Швеция), контрастировали последовательно 1* водным раствором уранилацетата при 60°С (30 мин) и цитратом свинца при комнатном температуре (10 мин) ( Reynolds, 1969). Препараты просматривали на электронном микроскопе JЕМ-6 (Япония).

Тестирование морозоустойчивости растений проводили методом прямого, промораживания, в случае полевых опытов - путем подсчета выживших после перезимовки растений.

Биологическая повторность опытов 2-5-кратная, каждая из которых была проведена в 2-4 аналитических повторностях. Основной экспериментальный материал обработан статистически.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Дыхательная активность митохондрий при отдельном

и совместном окислении малата и сукцината Согласно результатам полевых опытов, митохондрии, выделенные из тканей узлов кущения озимой пшеницы, окисляли янтарную кислоту с большей скоростью, чем яблочную, (рис.1). В связи с этим можно привести известное положение о способности янтарной кислоты "монополизировать" ЭТЦ дыхания митохондрий как животных (Ленинджер,1966; Кондрашова,1972; Gutman,1S80), так и растений (Шугаев,Выскребенцева,1988,1994).

Разница между скоростями окисления малата и сукцината была особенно существенна в период осеннего роста и в начале закаливания низкими положительными температурами (конец сентября октябрь). В дальнейшем (в конце октября-ноябре) наблюдали сближение кривых окисления вследствие, с одной стороны, снижения активности СДГ и,с другой стороны, поддержания относительно высокой МДГ-ной активности.После длительного действия отрицательных температур (26.XI1.90) активность СДГ резко повышалась,тогда как активность МДГ существенно Hesизменялась (рис.1). Сходная динамика активности малат- и сукцинатокисляющих систем митохондрий в осенне-зимний период была выявлена нами и у растений разных по морозостойкости сортов Альбидум 397 и Безостая 1

(Абдрахимо^а и др., 1991). . ,

Совместное окисление яблочной и янтарной кислот органелла-ми выявила, что скорость дыхания на двух субстратах не только не суммируется (рис.1,кривая 3), но даже не превышает интенсивности отдельного окисления сукцината. ' Поскольку отсутствие аддитивности при совместном окислении субстратов является основным признаком, характеризующим механизм "взаимного ингибирова-ния" конкурирующих дегидрогеназ (вШтап,1980;3вягильская,1983; Шугаев,Выскрзоенцева,1988,1994), можно констатировать о его функционировании и в наших объектах - митохондриях узлов кущения озимой пшеницы. При этом внесение сукцината к митохондриям, инкубируемым с малатом, максимально стимулировало поглощение кислорода именно в тот период, когда имело место существенное превышение скорости отдельного его окисления над таковой малата (4.X, 17.X,рис.2). В пробах с середины ноября эффект второго субстрата был выражен слабо (рис.2), что согласуется с положением о выравнивании активностей МДГ и СДГ в данный период.

70-

« ч

&а> о

о

3 £

11 § I а !'■

2&1Х 9.Х 13.Х 28.Х ЛЯ

2ЯМ

3&Х11

аф

о ||

1 *

II

В

л ж**-—-

• } 3

~&3 105 3.2 2.3 2.7 г г • -6.1

Рис.1.Динамика окисления сукцината (1), малата (2) и малат+ сукцината (3) митохондриями узлов кущения необработанных (А) и обработанных картолином (Б) растений (1990 г.).На оси абцисс отмечены дата отбора проб и среднесуточная температурь воздуха

28, X!

- э -

Рис.2.Эффект второго субстрата на дыхание митохондрий узлов кущения необработанных (1) и обработанных карто-лином (2) растений (1989 г. ).

4.Z I7JC 24-Х 2JQ 16JU 21X1 14.ХП

Обработка семян картолином (5*10"5 М) существенно не пов-~ лияла на окисление используемых субстратов (рис.1Б,2). Вместе с тем для данного варианта выявлена высокая корреляционная зависимость функциональных показателей митохондрий (V3,V4,KflK) при совместном окислении субстратов от параметров окисления янтарной кислоты (в среднем г=+0.65 против 0.52 у контроля).

Обнаруженные нами в условиях многофакторного (полевого) эксперимента закономерности взаимоотношения СДГ м МДГ нашли определенное подтверждение и в лабораторных опытах. На рис.3 и 4 приведены характерные полярографические кривые цыхания митохондрий этиолированных проростков. В норме (рост при 23¿1°C) окисление митохондриями янтарной кислоты происходило интенсивнее по сравнению с яблочной. После холодового закаливания проростков (2-1° С, 3.5 сут) скорости данных процессов почти выравнивались Ш цикл фосфорилирования). При этом скорость окисления смеси субстратов, как и в случае узлов кущения, была приблизительно равна скорости окисления одного сукцината. Способность сукцината стимулировать дыхание окисляющих малат митохондрий была максимальной в норме (до 40 3£) и менее выраженной

у адаптирующихся к холоду проростков (рис.ЗА, 4А). В обоих случаях внесение малата в качестве второго субстрата существенно не изменяло наклона полярографических кривых (рис.ЗБ,4Б).

Рис.3. Полярографические Кривые при совместном окислении . субстратов митохондриями проростков (23£1°С,3 сут): А-малат+сукцинат, Б-сукцинат+малаг.Цифры над кривыми-скорость поглощения кислорода, натомы/(мин-мг белка)

Рис.4.Полярографические кривые окислекия субстратов митохондриями проростков после холодового закаливания (2*1°С;3.5 сут): А-малат+сукцинат, Б-сукцинат+малат

2. Цианидрезистентность дыхания митохондрий при окислении разных субстратов: влияние картолина

Рассмотренные выше конкурентные взаимоотношения между начальными участками ЭТЦ реализуются на уровне убихинонового пула (СШгтап, 1 980;Шугаев,Выскребенцева, 1 988,1994;Мооге,31ес1о\«, 1991 ),

который, как известно,является также точкой ответвления цито-хромного и КСЫ-реэнстентного путей дыхательной цепи.

Изучение зависимости ЦРД от природы окисляемого субстрата показало, что активность альтернативного пути дыхания в целом снижается при окислении ряда:малат^НАДН^малат+сукцинат^сукцинат (табл.1). Это согласуется с концепцией Р.А.Звягильской (1983), согласно которой низкая скорость окисления субстрата одновременно с его высокой доступностью для ЦРД является механизмом "увода" менее активной оксидазы от конкуренции с более сильным энергизатором дыхательной цепи.

Таблица 1

ЦРД при окислении разных субстратов митохондриями узлов кущения озимой пшеницы

Субстрат малат сукцинат малат+сукцинат НАДН

Варианты

Уксм %, _от V

Укс

3-

Кснтроль (вода)

1989 г. 3.2 13.1 2.0

1990 Г. 3.2 20.9 1.0 Опыт (картолин,3*10"5М)

1989 г. 4.5 21.7 2.3

1990 Г. 4.5 31.1 3.6

_ОТ У3

7.3 3.9

6.3 12.0

Укс

1 .8 1.9

4.0

3.6

X,

-от У3

7.1

5.7

16.1 11.9

Уксм 56, _от v

3-

2.2

3.7

5.8

8.4

14.1 18.8

Примечание: Уз и Уксм- скорости дыхания в 3 состоянии соответственно до и после внесений цианида, натомы [0]/(мин-мг белка)

Предпосевное замачивание семян картолином,не изменяя субстратную зависимость ЦРД, вызывало повышение альтернативного дыхания органелл, выделенных из узлов кущения (табл.1), что подтверждает ранее полученные данные на уровне целых тканей (Абдра-химова.Султангалеева,1989).

В отличие от митохондрий узлов кущения органеллы этиолированных проростков характеризовались большей потенциальной активностью ЦРД (рис.5). Более высокая относительная доля альтернативного дыхания для интенсивно растущих растений по сравнению

с закончившими рост отмечена О.А.Семихатовой (1950,с.33).

Холодовое закаливание проростков приводило к существенному снижению КСЧ-резистентного поглощения кислорода особенно при совместном окислении субстратов (рис.5)., когда часто наблюдали полное отсутствие альтернативного дыхания.

Рис.5. ЦРД при окислении малата (м), сукцината (с) и малат+сукцината (м+с) митохондриями проростков до (1) и после (2) холодового закаливания. Цифры над столбцами - относительные доли, в % от общего дыхания

3. Исследование динамики тканевого дыхания проростков

При полярографическом анализе дыхания тканей предварительно были подобраны оптимальные условия проведения экспериментов, а именно, концентрация ингибиторов с максимальным эффектом, время инкубации сегментов до и после внесения дыхательных ядов и т.д. Так, изучение временной динамики дыхания сегментов при инкубации от 5 мин до 24 ч в . среде.содержащей 0.2мМ СаСЬ и 0.1% БСА (Агкоп-В1е^ е1 а1.,1983), позволило обнаружить трох-фазность взаимосвязанных (г= +0.88) изменений общего и альтернативного дыхания: их снижение к 1.5 ч инкубации (25 % от исходных значений) и выход на стационарный уровень к 3 ч (рис.6). Сходная динамика общего дыхания была описана у отсеченных корней проростков яровой пшеницы в процессе их "адаптивного старения": фазы физиологической депрессии, репарации и стабилизации,

С3| ■]

последняя из которых наступала после 4 часов инкубации (Пахомо-ва,Гордон,1991).

Изучение временной динамики дыхания при действии и последействии гипотермии (от 1.5 ч до 3.5 сут) показало, что основные его изменения приходятся на начальные 6-8 часов смены температурного режима (25°~*2°С),в дальнейшем (к 1 сут) происходил выход кривых дыхания на стационарный уровень. При этом более высокий холодоиндуцированный подъем дыхания отмечен для обработанных картолином- проростков (рис.7). Судя по данным морфомет-

500 г—

я

« ^

о со

о. о

§ &

Рис.6. Динамика дыхания при "старении" срезов: 1 - общее,

2 - цитохромное,

3 - цианидрезис-тентное, 4 - остаточное дыхание

5" 46' 1.6«

6« 24*

Время инкубации срезов при Е5"С

6 94

Ере «я холсдовой экспозиции при 2°С, ч

Рис.7. Влияние картолина на дыхание срезов проростков до и после холодового закаливания. 1-растения, выращенные на воде и 2 - на картолине

рического анализа, у опытных растений площадь митохондрии на срезе in situ к 3.5 сут гипотермии возрастала с 0.31 до 0.43

мкм2, тогда как у контроля существенно не изменялась (с 0.31 до 0.28 мкм2). Явление стимуляции дыхания связано,по-видимому, с увеличением количества и/ или размеров митохондрий в клетках , испытавших охлаждение (Мирославов и др.,1984;Кислюк и др.,1993),и свидетельствует об активизации процессов митохонд-риогенеаа, что относится к компенсаторным механизмам адаптивной реакции клеток,направленным на поддержание оптимального уровня энергообмена в ответ на резкое снижение интенсивности метаболических процессов (Хохлова,1987).

Следует отметить, что выращивание проростков на растворе регулятора роста давало дополнительный прирост устойчивости • на 20* (табл.2).

Таблица 2

Выживаемость растений после промораживания (-10°С, 4 ч)

Число выживших растений, % от общего

Варианты _

незакаленные закаленные

Контроль (вода) 38.5^1.6 50.7^4.1

Опыт (картолин,3»10~5М) 41.4±1.4 ,71.8*3.1

4. Влияние гипотермии и картолина на микровяэкость митохондриальных мембран

Согласно широко распространенной точке зрения функциональная активность клетки и ее органелл,в частности,митохондрий определяется состоянием мембранных систем. Одним из прямых методов, применяемых для изучения свойств мембран, является, метод ЭПР-спектроскопии. В качестве спиновой метки использовали молекулы метилового производного кетопальмитиноаой кислоты МеРАБЬ (10,3).эффективно встраивающиеся в биологические мембраны (Бег^-;игс ег а11985).Были рассчитаны времена корреляции вращательной диффузии X , которые соответствовали времени, необходимому для поворота сегментов жирнокислотных хвостов по С-С-связям на угол в 1 радиан (Шуберт,1990).

- 15 -

Установлено, что холодовое закаливание растений приводит к уменьшению значений параметра вращательной диффузии X меток, и, значит, микровязкости митохондриальных мембран (рис.8). Вызываемое холодом увеличение текучести мембран хорошо согласуется с многочисленными литературными данными и объясняется целым рядом причин - повышением степени ненасыщенности жирных кислот, отношения фосфолипиды/белки, фосфолипиды/стерины и т.д.

Рис.8.Температурная зависимость времени X (не) корреляции вращательной диффузии МеРАвЬ (10,3) в мембранах митохондрий проростков до (А) и после (Б)холо-дового закаливания: 1-растения выращены на воде и 2-на кар-толине (3*10"5М)

Выращивание растений на растворе картолина (3*10_!М) при оптимальных условиях почти не повлияло на изучаемые показатели, при холодовом же закаливании оно способствовало повышению микровязкости мембран особенно при измерении в области температур ниже 20°С (рис.8) и уменьшению тем самым степени холодоиндуци-рованных изменений микровязкости митохондриальных мембран.

Для вычленения мембранотропного действия регулятора роста проводили ?0-минутную прединкубацию выделенных митохондрий в его растворе. Из данных табл. 3 видно, что увеличение времен X, а, следовательно, микровязкости митохондриальных мембран происходило при инкубации с картолином органелл, выделеннных как из незакаленных, так и закаленных проростков.

Несмотря на одинаковый результат - увеличение микровязкости, механизмы прямого и опосредованного действия картолина на

мембраны,возможно,были разными. Причиной быстрого эффекта могли быть адсорбция картолина мембранными белками и липидами и обра--зование прочного липопротеидного каркаса (Белогуб и др.,1993). По мнению Д.М.Гродзинсксго с сотр.(1987), чем надежнее система, тем меньше диапазон изменений текучести и тем быстрее она стабилизируется после прекращения стрессового воздействия. Наряду с этим продолжительное действие картолина связано, по-видимому, с активацией белоксинтезмрующей системы клетки и ее органоидоп (Шевелуха и др.,1983; Кузнецов и др.,1992), что может приводить к увеличению площади внутренних мембран митохондрий,которые,как известно,имеют высокое отношение белок/липиды (Твердислов и др., 1987), обратно влияющее на текучесть биомембра.н (Yoshida,Uemurа, 1984).

Таблица 3

Изменение времен X спиновых меток в мембранах при инкубации митохондрий с картолином (КА, 3*10"! М),нс

Рост при Закаливание

23*1°С (2±1°С,3.5 сут.)

Темпе- Инкубация органелл в среде ресуспендирования

ратура '_.____

измере- без КА с КА без КА с КА ний,°С ___

12, .5 7.5*0, .8 10, . 9*0.7 6.1*0.3 7 . .7*1. , 1

15, ,0 ' 6.8*0, ,8 ' 10, .2*0.8 5.0*0-6 6. .1*0. ,3

17, .5 5.9-0. ,7 8. .9*0.6 4.4*0.2 5. .4*0. ,3

20, .0 5.4*0, .6 8, .7*0,5 4.3-0.1 5, .1*0. .2

22, .5 4.9*0, ,6 7 , .0*0.4 3.7*0.2 4, .2*0. .3

25, .0 4.6*0, . 6 6, .5*0.1 3.2*0.1 3, .9*0. .2

5. Ультраструктурная организация клеток узлов кущения е осенне-зимний период и при действии картолина

Электронно-микроскопический анализ клеток узлов кущения растений, адаптирующихся к низким положительным температурам

(2.XI,+2.1°C),показал высокую насыщенность цитоплазмы полирибосомами, осмиофильными липидными каплями и включениями, параллельными цистернами шероховатого ЭПР, диктиосомами и др., что указывает на высокую биосинтетическую активность клеток в данный период. При этом выявлены морфологические типы клеток, различа-, ющиеся по электронной плотности гиалоплазмы."Пестрая" меристема была зафиксирована также для тканей проростков озимой пшеницы, причем разнокачественность клеток усиливалась в условиях низких температур (Авэтйсова,Кадыков,1985).

Нами установлено,что высокой степенью гетерогенности характеризовался и хондриом. Так одновременно с округлыми митохондриями наблюдали тороидальные, чашевидные, гантелезидные, а также митохондриальные кластеры,представляющие собой структуры, как бы вставленные друг в друга.Митохондрии необычной конфигурации ранее были описаны в клетках закаливающихся" проростков (Аветисова,Кадыков,1985), узлов кущения озимой пшеницы с.Безостая 1 (Полыгэлова и др.,1983) и тканей многолетних трав Якутии (Кокушкина и др.,1992).

Закаливание растений умеренно отрицательными температурами (23.Х1,-3.8°С) приводило к заметным изменениям тонкой структуры клеток тканей узлов кущения. Разная электронная плотность гиалоплазмы паренхимных клеток выравнивалась. Параллельность цистерн шероховатого ЭПР нарушалась, наблюдали частичную фрагментацию элементов гранулярного ЭПР с образованием мелких элект-роннопрозрачных везикул. Митохондриом клеток паренхимы был представлен преимущественно овальными митохондриями, отмечалась тенденция к снижению электронной плотности матрикса митохондрий и редукции крист.что обусловливало закономерную депрессию дыхательных процессов при действии отрицательных температур.

В тс же время плазмалемма приобретала извилистый контур, образуя многочисленные складки, при этом процессы формирования инвагинаций, содержащих фибриллярное вещество клеточной стенки, усиливались. В литературе расширение площади плазмалеммы описано в основном для зимующих клеток древесных растений (Pomeroy, Siminovitch,1971;Niki,Sakai, 1 981 ;и др.),а также у протопластов, выделенных из закаленных листьев ржи (Steponkus,1984) и рассматривается как важное приспособление,защищающее мембрану от

механических деформаций в циклах замораживание-оттаивание. С другой стороны, увеличение складчатости плазмалеммы может служить компенсаторным ответом клетки на повышение барьерных свойств пограничной мембраны в условиях.гипотермии и сопровождаться вследствие этого изменением характера обмена между апоп-ластом и симпластом (Niki, Sakai,1981; Nishizawa,Mori,1984).

Выявлено, что обработка картолином не изменяла общие принципы структурной организации клеток, характерные для контрольных растений, но увеличивала степень как межклеточной, так и межмитохондриальной гетерогенности. Так, увеличение электронной плотности в отдельных клетках сопровождалось появлением негативного контраста мембран шероховатого ЭПР и пропластид при одновременном сохранении позитивного - диктиосом, митохондрий и плазмалеммы. Более сложная организация митохондриома в данном случае выражалась в способности органелл различных форм ассоциировать друг с другом поверхностными контактами и/или выростами мембран, а также образовывать митохондриальный ретикулум. В экспериментальных условиях появление элементов митохондриальной сети у растений зарегистрировано лишь в клетках корней тыквы при аноксии+глюкозная подкормка (72 ч)(Вартапетян, 1982).

Следуя гипотезе о митохондриальном ретикулуме как системе "внутриклеточного электрического кабеля" (Скулачев,1989; Бакес— ва,Ченцов,1989), встречаемого, как правило, в клетках с высоким уровнем энергообмена, можно заключить о максимальной напряженности энергетического режима клеток углов кущения обработанные картолином растений, что необходимо для эффективного протекания метаболической адаптации, направленной на синтез криозащитных веществ и мембранных компонентов (фосфолипиды,белки).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе были получены новые данные по динамике структурно-функционального состояния митохондрий in vitro и in situ при низкотемпературном закаливании растений озимой пшеницы и действии антистрессового регулятора роста картолина.

Известно, что интенсивность дыхательных процессов определяется энергетическими потребностями клеток, следовательно, по ней можно судить о метаболическом обмене в целом.Так,митохонд-

рии, выделенные из полевых растений в период осенней вегетации и интенсивно растущих этиолированных проростков,характеризовались высокой окислительной и фосфорилирующей активностью. При этом совместное и отдельное окисление янтарной и яблочной кислот показало, что сукцинат как кинетически эффективный субстрат (Кондрашова,1972; Хохлова,1976,1987; Шугаев,Выскребенцева,1988, 1994) пользуется преимуществом в окислении'. Последнее позволяет быстро мобилизовать пластические и энергетические ресурсы клеток для обеспечения энергоемких ростовых процессов (Семихато-ва,1990).

Закаливание растений низкими положительными температурами (2...5°С) приводило к выравнивании активностей конкурирующих дегидрогеназ (СДГ и МДГ). Поддержание относительно высокой активности МДГ, на наш взгляд, вполне оправдано из-аа большей энергетической эффективности (АДФ/О) окисления малата по сравнению с окислением сукцината в условиях значительного подавления скорости протекания биохимических процессов и может осуществляться за счет увеличения количества изоферментного набора (Хохлова,1976, 1985).

Уровень энергетических затрат при значительном подавлении линейного роста растений в период адаптации к низким положительным температурам определяется.по-видимому, значительными ультраструктурными перестройками клеток, направленными, в свою очередь, на компенсаторное усиление суммарной функциональной активности субклеточных компонентов (плаэмалеммы, ЭПР,митохондрий, полирибосом и др.), а также поддержанием этих структур в нативном состоянии. К наиболее характерным качественным изменениям следует отнести высокую межклеточную и межмитохондриальную гетерогенность, зафиксированную в тканях узлов кущения в конце первой фазы закаливания.3 связи с этим следует отметить,что избыточность и гетерогенность структур относятся к универсальным факторам надежности систем, "страхующим" их от серьезных сбоев при изменении внешней и внутренней среды (Гродзинский.1983).

При действии умеренно отрицательных температур (-4...-е°С) отмечалось резкое снижение интенсивности окислительных процессов на фоне ослабления дыхательного контроля (низкие КДК),что свидетельствует о переходе митохондрий в низкоэнергетическое ■

состояние (Кондрашова,1972; Войников,1987). Депрессия дыхательных процессов в данный период является вполне закономерной и обусловливается,как показали наши данные, существенными изменениями ультраструктурной организации митохондрий: матрикс просветлялся, происходила редукция крист, "разборка" ретикулярных и других сложных профилей. Это согласуется с недавно выдвинутым положением (Иванова и др.,1992) о том,что при относительно длительном действии стрессоров, когда но происходит сильного нарушения сбалансированного обмена веществ и энергии,энергетическая цена адаптации может быть небольшой.Вместе с тем в конце второй фазы закаливания сохранялись и даже усиливались компенсаторные структурные перестройки других мембран в основном плазмалеммы. Происходило дальнейшее увеличение ее поверхности за счет складчатости и инвагинированности, а также индукция процессов эндо-цитоза.

Обработка растений картолином (3*10-5 М) в целом не изменяла естественной направленности физиолого-биохимических процессов, происходящих при низкотемпературной адаптации растений, но влияла на их количественную сторону.Так,прирост интенсивности дыхания срезов, вызванный понижением температуры, у опытных проростков был выше, чем у необработанных. Одновременно митохондрии первых характеризовались увеличением средней площади на срезе, £ з случае узлов кущения - более выраженной морфологической гетерогенностью и способностью к образованию ретикулярных форм. Усиление и усложнение дыхательной системы клет.ки, а также ее "сукцинатный" тип (высокая корреляционная зависимость функциональных показателей митохондрий от окисления янтарной кислоты: г=+0.85 против г=+0.52 в контроле) могли энергетически обеспечивать более глубокие ультраструктурные перестройки клеток в основном количественного характера, способствуя тем самым формированию морозоустойчивости обработанных картолином растений более быстрыми темпами.

ВЫВОДЫ

1. Установлено,что окисление янтарной кислоты митохондриями, выделенными из узлов кущения полевых растений и этиолированных проростков озимой пшеницы, происходило с большей ско-

- 21 -

ростью по сравнению с яблочной.

2. При отдельном и совместном окислении субстратов в митохондриях выявлены конкурентные отношения между сукцинат- и ма-латдегидрогеназными системами. которые регулируются механизмом взаимного ингибирования. У органелл узлов кущенил данный механизм проявлялся в преимущественном окислении сукцината перед малатом в периоды осенней вегетации и вынужденного покоя и в выравнивании интенсивности изучаемых процессов при закаливании низкими положительными и отрицательными температурами.

3.-Вклад цианидрезистентного пути дыхания в ЭТЦ митохондрий узлов кущения снижался при окислении ряда: малат"*экзогенный НАДН^малат+сукцинат^сукцинат. Альтернативное дыхание органелл проростков характеризовалось слабой субстратной зависимостью, а его потенциальная активность и относительная доля в общем дыхании были выше (соответственно в 4.8 и 1.4 раз) по сравнению с аналогичными показателями взрослых растений. При низкотемпературном закаливании у последних изменения цианидрезистентного дыхания были неоднозначными, в то время как у проростков оно снижалось,бог.ее всего при совместном окислении субстратов.

4. Применение полярографического анализа тканевого дыхания позволило выявить трехфазный характер изменений общего и цианидрезистентного дыхания в процессе "адаптивного старения" сегментов побегов и холодового закаливания проростков.Лик дыхательной способности приходился на 6-8ч смены температурного режима (норма холод) и был выше у обработанных картолином растений.

5. Судя по временам корреляции (X) вращательной диффузии ЭПР-спин-меток МЕРАЭЬ (10,3), холсдовое закаливание приводило к уменьшению микровязкости митохондриальных мембран. Опосредованное (выращивание проростков) и прямое (инкубация митохондрий) действие картолина (3*10~5М) способствовали снижению степени хо-лодоиндуцированных изменений текучести мембран,что указывало на стабилизирующее его влияние на физические свойства биомембран.

6. По мере нарастающего воздействия низких температур обнаружены существенные Изменения в ультраструктурной организации клеток узлов кущения.К характерным особенностям клеток при длительном закаливании низкими положительными температурами следует отнести четковыраженную гетерогенность митохондрий,заключаю-

щуюся в появлении наряду с округлыми органелл тороидальной, чашевидной , гантелевмдной форм,а также их ассоциаций вплоть до образования митохондриального ретикулума. Высокая напряженность энергетического режима растений в данный период, по-видимому, необходима для эффективной метаболической адаптации, направленной на синтез криозащитных веществ и пролиферацию цитоплазмати-ческих структур. Адаптация растений к отрицательным температурам сопровождалась "разборкой" сложноорганизованного митохонд-риома и преобладанием в нем органелл обычней формы, уменьшением числа крист, просветлением матрикса и снижением, интенсивности окислительных процессов. Одновременно происходило увеличение поверхности плазмалеммы за счет складчатости и инвагинирован-ности. При вхождении растений в вынужденный покой наблюдали редукцию части субклеточных структур (ЭПР,полирибосомы и др.) и стабильное состояние других (плазмалемма, микротрубочки).

7. Действие картолина как индуктора морозоустойчивости растений может быть связано с усилением адаптивных субклеточных перестроек, которые энергетически обеспечиваются за счет более выраженных, чем в контроле,структурно-функциональных изменений дыхательного аппарата. Последние отражались в увеличении объема, усложнении организации митохондриома (повышение степени гетерогенности и способности к образованию ретикулярных форм), "сук-цинатном" типе дыхания (тесная зависимость функциональных показателей митохондрий.от окисления янтарной кислоты). Определенным подтверждением высокого уровня энергообмена служит и повышенная потенциальная активность ЦРД у обработанных картолином растений по сравнению с необработанными.

8. В адаптирующихся к низким температурам клетках узлов кущения озимой пшеницы формируются компенсаторные структурно-функциональные механизмы разных типов, обусловленные дозой (силой и продолжительностью) температурного фактора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хохлова Л.П..Елисеева Н.С.,Абдрахимова Й.Р. и др.Модификация структурно-функционального состояния мембран как фактор устойчивости растений к действию мороза//Тез.докл.VI Всесо-

- 23 -

юз.конф. "Ультраструктура растений".Киев,1988. С.18Э.

2. Абдрахимова Й.Р., Султангалеева A.A. Цианидрезистент-к.ость дыхания узлов кущения озимой г.шеницы при действии закаливающих температур и картолина.Казань,1989. 11 с. Дэп. в ВИНИТИ 05.12.89, М 7214- В С9.

3. Хохлова Л.П., Абдрахимова Й.Р., Беюгуб О.В. и др. Мембранотропное действие картолина и морозоустойчиьость растений // Гегуляторы роста и развития растений. Киев: Наукова думка. 1989. С. 308:

4.-Abdrakhimova I.R.,Khokhlova L.P.Substrate regulation and cyanide-resistance of mitochondrial respiratory chain under cold acclimation of plants // Proceed, of the Vth International Youth Symposium "Plant Metabolism Regulat ion".Sofi a.1991. P. 368-371.

5. Абдрахимова Й.P..Соколова О.В.,Хохлова Л.И.Способность к окислению малата и сукцината митохондрий разных генотипов озимой пшеницы // Тез.докл. Всесоюзн. конф."Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды". Новосибирск. 1991. С. 81.

6. Гарифуллина Р.Л., Абдрахимоса Й.Р., Хохлова Л.П. Исследование низкотемпературных воздействий на состояние мембран митохондрий проростков озимой пшеницы методом спиновой метки // Тез. докл. ХП Всесоюн. школы-симпозиума по магнитному резонансу. Кунгур. 1991. С.105-106.

7. Абдрахимова Я.Р..Гарифуллина Р.Л., Хохлова Л.П. Физическое состояние митохондриальных мембран в связи с холодовой акклимацией растений озимой пшеницы и действии картолина // Тез. докл. П Мэжд. конф. "Успехи современной криобиологии". Харьков. 1992. С.3.

8. Гарифуллина Р.Л., Абдрахимова Й.Р., Хохлова Л.П. Исследование влияния холодового закаливания и картолина на митохомд-риальные мэмбраны проростков озимой пшеницы методом спиновой метки // Биофизика. 1992. Т.37. N 5. С.963-968.

9. Абдрахимова Й.Р., Малютина Л.В., Хохлсва Л.П.,. Ермолаева Е.В. Ультраструктура митохондрий in vitro и in vivo при действии на проростки озимой пшеницы холодового закаливания и картолина// Тез. докл. XIV Всесозн. конф. по электронной мик-

роскопии (биология,медицина). Москва. 1992. .С. 188.

10. Абдрахимова Й.Р., Хохлова fl.il. Влияние холодового закаливания на.споссбность к окислению малата и сукцината митохондрий озимой пшеницы //.Водообмен и устойчивость растений. Казань: Изд-во Казанск.ун-та. 1993. С.42-50.

11. Абдрахимова Й.Р., Хохлова Л.П. Субстратная регуляция и цианидрезистентность дыхательной цепи митохондрий при солодовой адаптации растений озимой пшеницы // Тез. докл. Ш съезда ВОФР. Санкт-Петербург. 1993. Т.5. С.465.

12. Хохлсва Л.П., Кучеренкова Н.Н..Абдрахимова Й.Р. Сезонные изменения митохондрий у закаленных и незакаленных к холоду растеннй озимой пшеницы // Физиология растений. 1993. T.4U. N 4. С. 607-612.

13. Garifullina R.L., Abdrakhimova I .R.,Khokhlova L.P. Spinlabel study of the mitochondrial membranes of winter wheat seedl ings//Abstracts of the 27th Ampere Congress. Kazan,1994. P. 888-889.

14. Абдрахимова Й.Р., Хохлова Л.П., Абдрахимова Ф.А. Субстратная регуляция,цианидрезистентность дыхания и ультраструктура митохондрий в связи с осенним закаливанием растений и действием картолина (статья сдана в "Физиологию растений").

Сдано в набор 12.05.95. Подписано в печать 12.05.95. Форы.бум. 60 х 84 I/I6. Печ.л.1. Тираж 100. Заказ 202.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5