Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очищение, особенности и регуляция H+-АТФазы плазматических мембран клеток корней кукурузы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Очищение, особенности и регуляция H+-АТФазы плазматических мембран клеток корней кукурузы"

Ив 0&

АКАДЕМIЯ НАУК УКРА1НИ 1Н0ТИТУТ БЮХ1М11 1М.0.В.ПАЛЛАД1НА

На правах рукопису

ПЕДЧЕНКО Вадим Костянтинович

ОЧИЩЕНИЯ, ВЛАСТИВОСТI ТА РЕГУЛЯЦ1Я Н^-АТФази ПЛАЗМАТИЧНИХ МЕМБРАН КЛIТИН КОРЕН IВ КУКУРУДЗИ

03.00.04 - 61ОХ1М1Я

Автореферат дисертацП на эдобуття наукового ступеня кандидата б1олог1чних наук

КИ1В - 1993

Роботу виконано у в1дд!л1 ф1зшлогп живлення рослин Институту фазхологП рослин та генетики АН Укра1ни

Науковий кер1вник:

доктор б1олог1чних наук Г. О.ПАЛЛАДША

Оф1ц1йн1 опоненти:

Пронина установа:

доктор б1олог!чних наук В.А.Тугай

кандидат б!олог1чних наук А.Ф.Терещенко

1нститут кл1тинн01 610л0ги

та генетично! 1нкенерП АН Укра1ни

Захист в1дбудеться " №" ^О^И^ 1993 р. в 14 годин на вашдашп спец1ал1зовано1 вчено! ради Д 016.07.01 в 1нститут1 бшх1мП 1м.0.В.Паллад1на АН Укранш за адре-сою: 252601, Кшв-30, вул.Леонтовича, 9.

3 дисертагдею можна ознайомитися в б!бл1отец1 1нституту 61ох1м11 1м.0.В.Паллад1на АН Укра'ши.

Автореферат роз1слано

_1993 р.

Вчений секретар спец1ал1зовано'1 ради кандидат б1олог!чних наук

О.В.Кирсенко

3 АГ АЛЫ ¡A ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальность пробдеми.

У плазматичних мембранах рослинних клотин метиться електрогенний насос, що використовус енергою г1дрол!зу АТФ для транспорту протонiв з цитоплазми у позакл1тинне середовище, дояльность якого зумовлена Н+-АТФазою (ЕС 3.6.1.35) (Serrano,

1989). Створюваний Н+-АТФаяою трансмембранний електрох!м1чний г рад i внт протонов використовуеться системами вторично активно го - транспорту для надходження до рослинноо кл1тини íohíb або транспорту метабол1чних продуктов шляхом симпорту а протонами (Bush, 1990; Lew, 1991). Завдяки poôoTi протонного насосу в1д-буваеться подкислення середовища в клотинних стонках, що спри-яе росту кл1тин розтягненням (Rayle, Cleland, 1977) та п1дтри-муеться стаб1льне значения рН цитоплазми, яке забезпечуе певну спрямован1сть та онтенсивн!сть гаптинного метабол!зму. На píb-hi оцлоо рослини Н+-АТФаза плазматичних мембран бере участь у процесах м1нераяьного живлешш, росту та морфогенезу, заванта-жування проводник тканин метаболитами, регуляцП транопорацП та прорастания наспшя (Полевой, Саламатова, 1991; Serrano,

1990). Важлив1сть фоз0олог1чних фунгацй зумовлюе великий iHTe-рес до всебочного дослодження властивостей Н+-АТФази.

За останне десятир1ччя були з'ясовано ochobhí характеристики Н+-АТФази препаратов плазматичних мембран, 1зольованих is piBHHX рослинних об'ercriB (Brlskin, 1990). Було в ^значено по-д1бн1сть цього фермента до Н+-АТФази плазматичних мембран кло-тин грибов (Serrano, 1985). Встановлено, що Н+-АТФаза плазматичних мембран належить до Р-типу транспортних АТФаз, предс-тавниками якого e Na+,K+-, Са2+- и Н+,К+-АТФази тваринних тканин, а також К+-АТФаза бактер1альних мембран (Болдырев, 1990). Характерними ознаками цих фермент1в б утворення в ход1 катало-зованоо ними реакцП аспартолфосфатного 1нтермедоата та чутли-BicTb до орто-ванадату. ' Значки» досягненням в доавдженно Н+-АТФази було визначення И ам1нокислотно1 послодовност1 (Pardo, Serrano, 1989) та створення модел1 ï'i орган1зацП (Serrano, 1990).

Проте, гад acneKTiB, в тому числ1 молекулярний механ1зм функц1онуЬан i ферменту та способи регуляцП його активност! в кл1тинах вип' { рослин, залишаються нез'ясованими. Це'значною мiрою зумов: но тим, що до останнього часу для вивчення ката-

- г -

л1тично1 i транспортно! фунюдй Н+-АТФази користувалися препаратами плазматичних мембран, основними недол1ками яких с низь-кий BMicT ферменту, а також присутн1сть кислих фосфатаз, яга можуть в певн!й Mipl маскувати активн!сть АТФази (Gallagher, Leonard, 1982). 0кр1м того, використання таких препарат!в для вивчення рол1 лиид1в в регуляцп активност1 Н+-АТФази обмеже-не високим вм!стом л1п1д1в плазмалеми. Вир1шення цих питань зумовило необх1дн1сть одержання очщених препарат!в ферменту та IX детально! характеристики. >

Мета i завдання досл!дження. Метою дано! роботи було вивчення катагйтичних та регуляторних властивостей солюбШзова-Ho'i Н+~АТФази плазматичних мембран корен1в кукурудзи та пор1в-няння IX з властивостями мембранозв'язаного фермейту. Для до-сягнення зазначено! мети необх1дно було виршити ряд завдань: . 1. Розробити методи вщилення i очищения солюб1л1зованих пре-napaTiB Н+-АТФази, проанал1зувйти ix пол!пептидний склад та провести 1мунох1м1чну 1дентиф1кац1ю ферменту.

2. Досл1дити к1нетичн1 характеристики та чутлив!сть до 1нг1б1-тор1в АТФазно! aKTHBHocTi мембранного та солюбШвованого npenapaTiB.

3. Вивчити вплив екзогенних фосфолШШв та стершпв на актив-HicTb Н+-АТФази.

4. 3 використанням групоспецифгчних 1нг1б1тор1в адентифжувати функцшнально важлив! ам1нокислотн1 залишки солюб1л!зовано-го ферменту.

5. За допомогою 1мунофлуоресцентного методу вивчити розподм Н+-АТФази в коренях паростк!в кукурудзи.

Наукова новизна роботи. В робот! вперше проведено nopiB-няльне вивчення властивостей Н+-АТФази плазматичних мембран корен!в паростк1в кукурудзи у мембранзв'язаному i солюбШзо-ваному стан1. Показано, що п!сля селективно! солюбШзацП цьо-го фермента двома цвiтерiониими детергентами не змгнюються його основн! катал1тичН1 характеристики - Км для MgAKD 1 сти-муляц!я К+. На основ! експеримент!в з группоспециф!чними iHri -' ■б!торами зроблено припущення про суттеву роль сульфггдрильних," ам!нних та 1м!дазольних груп у функц1оннуванн! Н+-АТФази.

Одержано.очищений препарат ферменту з високою АТФазною активн1стю i показано, що Н+-АТФаза представлена двома пол1-пептидами з молекулярного масою близько 94 кДа.

Встановлено залелипсть реактивуючо! дП екзогенних фосфо-лйпд1в Б1Д сп1вв!дношення детергент:б!Лок та продемокстровано к1льк1сне встроювання солюбШзсваного ферменту в лгпосоми, що св1дчить про високу спорхдненхсть Н+- АТФаэи до. лШд1в мембран. Вперше показано, що л13офосфатнд1лхолгн в специф1чним стимулятором Н+- АТФази як у мембранозв'язаюй, так 1 у солкШ-л1эованш форм!.

За допомогою 1мупо4вдоресцентного методу встаковлеао, шо гпдвищений вмгст Н+-АТФази спостерхгаеться у саме тих тканинах кореня, що характеризуются високсю активтстю Энного транспорту.

Практична ц!нн1сть роботи. Одержан! результати розширюють уявлення про властивост!, функц!оналъну роль та особливост1 регуляцП Н+-АТФази плазматичних мембран у клтшах вищих рос-лин та в1дкривають нов! можливост1 у вивченн! цього фермента.

Встановлен1 законом!рност1 можуть виксристсвуватися при розробщ теоретично обгрунтсваних систем м!нерального живлення та в селекцП високопродуктивних сортов рослин.

Результати роботи Еикористовувалися в курсах легадй з бшенергетики та морального живлення на кафедр1 ф1з1ологп та екологп рослин Ки1вського ун1верситету 1м.Тараса Шевченка.

Апробащя роботи. 0сновн1 результати роботи допов1дались на IV и V Всесоюзнйх м1жун1верситетських конференщях "Б1оло-г1я кл1тини" (ТбШс1, 1985; Тб1л1с1, 1987); 8-мш м1жнародч1й нарадх "Мембранний транспорт у рослин" (Венец1я, 1989); 19-1Й конференцП Ф6БС (Рим, 1989); IV Всесоюзн1й конференцП моло-дих вчених з ф1з1ологи рослинно} клгтини (Москва, 1990); 12-ому М1«народному симпоз1ум! "Транспортн! та рецепторн! 61л-ки рослинних мембран" (Бр1столь, 1991).

Публ1кацП. За матер1алами дисертацП опубл1ковано 16 друкованих робгт.

Об'ем 1 структура дисертацП. Дисертащйну роботу виклад»-но на 170 стор1н'ках друкарського тексту. Бона складаеться з вступу, огляду л1тератури та експериментально! частини. яка мхстить опис матер1ал1в та метод1в досл!джень, викладення одержаних результат!в з '1х обговоренням, заключения, висновк1в та списку цитовано! л1тератури, що включав 882 найменування. Робота вюпочае 15 таблиць та 1люстрована £б рисунками.'

- 4 -

МАТЕР IАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕННЯ.

Об'ектом досл!дження були корен! 8-денних етиольованих napocTKiB кукурудзи сорто-лШйного г!бриду Дн!провський 247МВ, як! вирощувалися при 26°С на 0.5 мМ розчин! CaS04..

Фракц!ю, збагачену плазматичними мембранами вид!ляли шляхом центрифугувалня míkpocom у град!ент! нЦлъност! сахарози (Leonard, Van Der Woude,1976) за власною модиф!кац!ею (Pedchenko et al.,1990).

АТФаэну активн!сть вим!рювали при 30°С в середовищ!, яке мгстило 50 мМ МЕС-трис (рН 6.5), 5 мМ аз1д натрш, 0.2 мМ мо-л!бдат аммошю, 50 мМ КС1, 3 мМ MgS0,j, ЗмМ АТФ за модиф1кова-ним методом Ратбуна (Rathbun, Bettlach, 1969¡Pedchenko et al., 1990) та виражали у мкмоль Фп/мг б1лкутод. К!нетичн! констан-ти визначали за методом нелШйно! perpecil (Page, 1987) з по-передн1М" обрахунком концентрацГ! комплексу MgATÍ> (Serrano, 1985). Актившсть кисло! фосфатази вим1рювали у середовищ!, що мгстило 50 мМ МЕС-трис (рН 5.0) та 2.5 мМ лНФФ як субстрат ре-акцН. К1льк!сть утворюваного п-н!трофенолу визначали спектро-фотометрично при-400 нм.

Концентрад!ю б!лку визначали за методом Bradford (1976), а в npncyTHocTi детергент!в - за модиф!кованим методом Jioypi (Markwell et al., 1978).

АТФ-залежну генерац!ю мембранного п'отенц!алу у везикулах плазматичних мембран реестрували за зм!намм флуоресценцП зон-д!в АНС та aypaMiHa О (Педченко, Паллад!на, 1985).

Солюб!л!зац!ю Н+-АТФази цв!тергентом 3-14 проводили за модиф!кованим методом Вара i Серрано (Vara, Serrano, 1982). Плазматичн! мембрани осаджували Центрифугуванням 30 хв при lOOOOOg. Осад мембран суспендували у глЩериновому буфер! (20Z гл!церин,, 1мМ ЕДТО» 1мМ д1тштрейтолу (ДТТ), 1мМ фен!лметил-сульфон!лфториду (ФМСФ), ЮмМ МЕС-трис, рН 6.5) при концентра-Ui'i б1лку 2 мг/мл, додавали Тритон Х-100 i КС1 до концентрац1й О.ЗХ i 0.5 М в1дпов!дно та центрифугували 45 хв при 115000g. Осад суспендували при 20°С у глШериновому буфер! при концент-paqi'i б1лку 1 мг/мл, додавали цв!тергент 3-14 до 4 мг/мл та холат натр!ю до 9 мг/мл i центрифугували 30 хв при 115000g.

Для солюбШаацП Н+-АТФази л!зофосфатид!лход!ном (лФХ) за модиф!кованим методом Серрано (Serrano,'1984) фракц1ю плаз--матичних мембран, щом!стила 0.25 М KI, центрифугували 30 хв

при 100000^. Осад ресуспендували у глхцериновому буфер! (20X глщерин, ОЛмМ ЕДТО, 1мМ ДТТ, 1мМ ФМОФ, ЮмМ ГЕПЕС-трис, рН 7.2) при концентраци б1лку 2 мг/мл, додавали Тритон Х-100 до 0.4% 1 центрифугували 45 хв при ИБОООд. Осад ресуспендували в тому ж буфер! до концентрацП б1лку 1 мг/мл та !нкубували з 5 мг/мл лФХ 10 хв при 20°С з наступним центрифугуванням 30 хв при 116000^.

В обох методах супернатанти, що м!стили солюбглхэовану Н+-АТФазу 8бер1гали при -18°С.

Для очищения Н+-АТФази, 3 мл препарату, содюбШзованого лФХ, наносили на л1н1йний градиент гл1церину (34 мл, 25-65%)> що м1стив 1 мМ трио-МЭС (рН 6.Б), 2 мМ ДТТ, 0.1 мМ ЕДТО, центрифугували при тооог протягом 16 год при 4°С та збирали фракцП об'емом по 1.5 мл.-

Пол1пептидний склад фракп1й анализували методом електро-форезу в присутност1 додецклсульфату натрш (ДСН) у град1ент-ному пол1акрилам1дному гел1 (10-20%) за Леммл1 (ЬаеттН,1970).

1мунодетекЩю проводили п1сля нап1всухого горизонтального переносу б1лкхв з пол!акрилам!дного гелю на н1троцелюлозну мембрану в 0уфер1, що м1стив 48 мМ трис, 39 мМ глщин, 0.05% ДСН и 20% метанол, при сил! струму 0.8 мА/см2 протягом 2 год при 20°С. Для локал 13ад11 ферменту були використан! кроляч1 пол1клональн1 антипла до очищено! Н+-АТФази АгаЫс1орз15 ¿ЬаЛапа у розведенн! 1:250 та вторинн! антит!ла до !муногло-бул1и1в кроля, кон'югован! э пероксидазою хр!ну у розведенн1 1:200. В1зуал1зац1ю 1ммуноблот1в проводили за допомогою 1-хло-ро-4-нафтолу.

Гель-ф1льтрац1ю препарат1в Н+-АТФази проводили на колонц! 1.6x30 см, . заповнен1й Берйагозе-бВ <Х, яку вр1вноважувпли трьома об'емами буфера, що м1стив 10 мМ МЕС-трис, 50 мМ ацетат кал!ю 1 Б мМ азид натр!ю (рН 6.6). Елюц!ю проводили в тому ж буфер! при 20°С та швидкост! потоку 0.5 мл/хв.

Для !муноцитолокал!зацП Н+-АТФази сегменти корен!в 4-денних паросткхв кукурудзи 1нку0ували 2 год при £0°С у ф1кса-тор! Чемберлена (формал!н: 70% етанол:оцтова кислота, Б:90:б). Промивку, ' зневоднювания та заливку у параф!н проводили за стандартними цитолоПчними методиками (Паушева, 1988). Зр1зи завтовшки 16 мкм посл!довно 1нкубували г год при ¿0°С в кроля-чими антит!лами до очищенно'! Н+-АТЗаэи плаэматичних мембран

(роэведення 1:200) та 1 год в вторинними антит!лами кози до 1муноглобул1н1в кроля, кон'югованими а Ф1ТЦ (1:100). Шсля промивок зр1зи продивлялися п1д флуоресцентним м1кросколом "Лепатес!" (Герман1я) у 50% гл1церин1.

Л1зофосфатид1лхол1н одержували з обробленого фосфол1пазою Аг фосфатид!лхол1ну шляхом адсорбц1йно"1 хроматограф!3 на ко-лонц! з сил!кагелем.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ.

При досл1дженн! субстратно! специф1чност! та 1нг101торному анал1з! було встановлено, що АТФазна активн!сть препарату плазматичних мембран корен1в кукурудзи зумовлена в основному Н+-АТФазою, характерними ознаками якш е оптимум при рН 6.5, значне 1нг1б1рування орто-ванадатом, д!циклогекс1лкарбод11м1-дом (ДЦКД) та д1етилст1льбестролом (ЛЕС) 1 стимуляц1я 1онами кал!ю (01ля 30%). В1дсутн1сть гальмування при дП ол1гом1цину, азиду, мол1бдату, н1трату та уаба!ну св!дчила про невначний р1вень забруднень 1ншими кл1тинними мембранами. Залежн1сть АТФазноЗ активност! в1д концентрат 1 комплексу МгАТФ маяа Г1-пербол1чний вигляд з Км 0.2 мМ, яка не 8М1нювалася в присут-ност! 50 мМ К+.

- 0ск1льки активний центр Н+-АТФази локаШзований на цитоп-лазматичному боц1 мембрани, АТФазна активн1сть препарату виз-начаеться ферментом, локал!зованим в 1нвертованих везикулах. Э використанням трьох незалежних метод1в - активацП в присут-ност1 каналоутворюючого 1онофору аламет1цину, _ ав'язування мембран на 1моб1л1зованому лектнн1 та вм1н АТФазно! активност! при вар1пванн1 осмолярност1 реакц1йного середовища, . нами було показано, що доля таких веаикул складае б1ля 60% в1д 1х га-гально! к1лькост1. Додавання до мембранного препарату MgATФ призводило до характерних зм1н флуоресценц1I потенц1ал-чутли-вих зонд1в, що св1дчило про генерац1ю внасл1док транспорту протон1в АТФазою позитивного всередин! везикул мембранного по-тенц1алу . Цей потенц1ал швидко ро8С1ювавоя в присутност! про-тонофору карбон1лциан1д-м-хлорфен1лг1дразону 1 энижувався Шсля обробки плазматичних мембран 1нг1б1 тором Н+-АТФази ДЦКД.

Очищения Н+-АТФази неможливе без руйнування . С1лок-л1п1д-ного комплексу мембран, тому важливим етапом досл!длення було вивчення впливу р1зних детергенПв на АТФазну активн!сть плаз-

матичних мембран. При цьому було встановлено, ¡до концентраций н1 залежност1 для íohhhx, не!онних та цв1тер!онних детергент^ мали двофазиу форму: при низьких коицентрац!ях спостер1галася активашя, а при Шдвищених - шгШрування. Активац1я АТФази при концентрац!ях нижче критично! концентрацН мiцелоутворения (ККМ) мабуть пов'яаана 1з зб1льшенням проникностх мембран до MgAT®, оск1льки най01лыва стимуляц1я фермента не перевгацувала значения, розрахованого нами ран1ие за сп1вв1дношенням везикул з резною ор!ентац1ею плазматично! мембрани.

Значн1 в!дм1нк у вплив1 на АТФазну активн1сть були вияв-лен1 при використанн1 л1зофосфатид1лхол1ну (лФХ): активац1я в1дбувалася при концентрац1ях, нижчих за ККМ 1 значно перевищувала ефект 1нших детергент1в, а гальмування при п1двищен1 концентратí було в1дсутне (рис.1). ОскШки в!домо, що лФХ входить до складу плазматичних мембран рослинних кл!?ин (Sandstrom, Cleland, 1639), одержат ревультати аумовили необ-х1дн1сть детального вивчення стимулюючо! дi'i лФХ у зв'язку в можливо» участю uie'í сполуки в регуляцп активноот! Н+-АТФази in vivo.

Проведен! з використанням препарату плазматичних мембран досл!дження показали, щр максимальна стимуляц!я П1Д д1ею лФХ спостер!гаеться при рН 6.6 (рН-оптимум Н+-АТФази), 1 супровод-жуеться значним 8б1лыяенням Чтах, в той час як Км ферменту для М&АТФ, 1нг1б1рування ванадатом та стул!нь активацП К+ досто-

50

Рис.1. Вплив лФХ на актив-н!сть Н'-АТФааи препарату плазматичних мембран корен 1 в ку курудай.

о

т

Кат1они в середовищ! iHKy6a-

ui'i: о - 3 JAI MgS04; • - 3 мМ MgS04, БОмМ KG1.

10 е.

О 500 1000 -1500 2000 лФХ, мкМ

BipHq не ам1нювалися. Тому можна припустити, що цей ефект пов'язаний насамперед з Пдрофобною взаемод!вю лФХ з молекулою Н+-АТФази, що зумовлюе nepexifl ферменту до активованого стану. Сл1д також зазначити, що при эамШ АТФ 1ншими н1чними субстратами стимуляц!я г!дролазно! активное^ не спостер1галася, що переконливо св!дчить про специф!чн1сть лФХ щодо Н+-АТФази.

НеобХ1дною умовою для вивчення катал!тичного механ1зму та особливостей регуляц!'! Н+-АТФази е одержання очищенного ферменту. Враховуючи низький bmíct Н+-АТФази у плазматйчних мембранах рослин, важливим етапом, що передув П солюбШзацП, було вилуч'ення з мембран б!льшо1 частини б!лкових дом!ток. Нами було встановлено, що обробка мембранних препарат!в Тритоном Х-100 (детергент: б!лок-2:1) при п!двшцен!й 1онн1й сил1 призво--дить до видалення 2/3 загального б!лку з1 збереженням б1ля 80% АТФазно'1 активност! 1 супроводжуеться значним зниженням актив-hoctí кисло! фосфатазй. Одержаний збагачений препарат ферменту був використаний для солюбШзацП Н+-АТФази is застосуванням двох цв i тер i онних детергент1в - синтетичного (цв!тергент 3-14) та природнього (лФХ), ефективн1сть яких було виявлено при очи-щенн1 ферменту з корен1в в!вса (Yara, Serrano, 1982; Serrano, 1983). При пор1внянн1 солюбШзуючо! дП цих двох детергент!в з'ясувалося, що в препаратах, солюбШзованих лФХ, вих1д за-гально! АТФазно'1 активност! та коеф!ц!Бнт очищения Н+-АТФази вид!, nopiBHHHO з одержаними при застосуванн! цв!тергенту 3-14 (табл.1). АТФазна активнЮТь препарат!в, солюб!л!зованих

Таблиця 1

Очищения Н+-АТФази плазматичних мембран корен1в кукурудзи при солюб!л!зац!Ч цв!тергентом 3-14 та лФХ.

Препарат Б!лок, мг АТФазна активиста , мкмоль Фн Вих!д, % Очищения, pasiB

мг 01лкутод Б1лку АТФази

Плазматичн! мембрани Пв!тергент 3-14 (супернатант) 28.29 12.94 ± 0.43 - - -

2.53 56.17 ±2.38 8.9 23.3 4.3

Плазматичн! ■ мембрани лФХ (супернатант) 52.00 6.32 7.81 ± 0.32 79.68 ± 3.75 12.2 74.4 10.2

цв!тергентом 3-14 п!двищувалася в 2-3 рази при доданш екзо-генних фосфол1п!д1В со! (азолектину) (табл.2), досягаючи наси-чення при сшвв1дношенн! б!лок:лШд-1:15. Нами було вперше продемонстровано, що при зростанн! сп1вв!дноиетга цв!тер-гент:б1лок вхдбуваеться як зниження АТФаэно'1 активности солю-бШзованого препарату, так 1- зростання реактивуючо! д!1 екзо-генних фосфол1п!д!в. Це св!дчить, що солюб!л!аац!я цв!терген-' том 3-14 супроводжуеться частковою оберненою !н&ктивадгею Н+-АТФази внасл!Док 11 дел!п1дуваняя.

Сл1д також в1дзначити, що активуюча д!я лФХ збер1галася в солюб1л1зованих препаратах (табл.2). Оск!льки в останн1х в!д-сутн! латентн! молекули АГФази, одержан1 результати п1дтверд-жують ран!ше висунуте припущення про те, що активац!я Н+-АТФ-ази лФХ е специф1чною 1 не може пояснюватися виключно мембра-нотропним ефектом п,1е'1 сполуки.

Додаткове МдвиЩення АТФазно! активност! препарату, солю-б!л!зованого цв!тергентом 3-14, було зареестроваио при вико-ристанн1 сумш! азолектину з! стеринами, значний вм1ст яких е характерним для плазматичних мембран рослин (Кеепал еЬ а1., 1973). Активуюча д1я ситостерину була вищою, н!ж холестерину, 1 спостер!галася при ваговому сп1вв1дношенн! 3:1, тод1 як п!д-вшцення дол! стерин!в викликало зменшення активност!. Актива-ц!я Н+-АТФази стеринами може пояснюватися 1х впорядковуючою д!ею на фосфол!п1дний матрикс мембрани.

Таблиця 2

Активащя солюбШзованих препарат1в Н+-АТФази плазматичних мембран азолектином та лФХ.

Солюб!л!зуючий детергент АТФазна активн1сть, мкмоль Фя/мг;год

контроль +азолектин +лФХ

Цв!тергент 3-14 27.47 ± 1.42 56.17 ± 1.86 46.09 ± 2.49 лФХ 56.69 ± 2.06 47.88 ± 1.23 67.64 ± 2.98

Шд час гель-ф!льтрац!1 фраку!1 плазматичних мембран' на колонц! з сефарозою вся АТФазна активн!сть виявлялася у в1ль-ному об'ем! у вигляд! единого п!ку оптично! густини при 280 нм, тобто була ц!лком зв'язана з везикулами. При хроматограф!! солюбШзованих препарат1в роапод!л активност! зм!иовався, -

а

230 0.10 0.05

0.00

20 40 60 60 20 40 60 80

а) Час, хв б) Час, хв

в) Час, хв г) Час, хв

Рис.2. Розпод1л АТФазно! активное^ (дгаграма, А750) та б!лку (крива, Агво) п!сдя гель-ф1льтрацП препарат1в Н+-АТФа-ви, солюбШвованих лФХ (а, в) та цв1тергентом 3-14 (б,г): а, б - без добавок; в, г - в присутност! азолек-ТИНОВИХ Л1ПОСОМ (10 мг/мл).

61 ль та частина актиеноет! виходила з колонки г певною аатрим-кою (рис.2 а,б). Це св1дчило про включения Н+-АТФааи в м!цели детергентХв 1 було додатковим критер1ем солюбШзацП. Додання до солюбШвованих препарат!в надлишку д1посом в аэолектину призводило до встроювания Н+-АТФази в Чхн! мембрани, що супро-воджувалося к1льк!сним виходом АТФазно! акТивност! у в1льному об'ем! (рис.2 в,г). АктивШсть АТФази, солюбШэовано! цв1-

тергентом 3-14, п1сля ц1е! процедури зб!льшувалася в 1.7 раза, що пояснюеться активуючою д!ею фосфол!п!д!в. Тагам чином, за допомогою гель-ф1льтрацП нами були одержан! переконлив1 дока-зи високо1 спор!дненост! Н+-АТФази до фосфол!п!д!в мембрани, а також оберненост1 порушення л!п1д-б!лково! вэаемод!! п1д час солюб!л!зац!1 ферменту цв!тер!онними детергентами.

Вваемод1я детергентов з Н+-АТФааою може пркзводити до Бначних зм1н конформад!! ферменту, тому необх!дно було досл!-дити катал1тичн! властивост! солюб!л!зованих препарат1в. За допомогою к!нетичного анал!зу Оуло встановлено, що залежн!сть АТФазно! активност! в!д концентрац!I комплексу М^АТФ мала г!-пербол1чний вигляд, тобто в1дпов1дала р!виянню М1хаел1са-Мен-тен (рис. . 3)', причому Кт для солюбШвованих препарат!в не в!др1знялася достов1рно в!д одержано! для плазматичних мембран (б!ля 0.65 мМ), той час як Ущдх значно зб!льшувалася. В ок-ремих досл1дах, коли варшвали концентрацИ одного з компонен-

80

О -1_

0.0 0.5

1.0

1.5 2.0 2.5

СМ^АТФ], мМ

Рис.3.

Залежн!сть АТФазно! активност! плазматичних мембран (о) та препарат!в, солюб!л!зованих цв!тергентом 3-14 (•) або лФХ 67) в!д концентрац!! комплексу МеАТФ.

■пв комплексного субстрату при сталш канцентрацП другого, виявилося, що максимальна'актившсть спостер1гаеться при екв1-молярному сшввшюшенн! та АТФ. Шдвищен! концентрацП в1льного АТФ (больше 1 мМ) в значн!й м!р! знижували АТФазну активн!сть, тод! як в!льний Мзг+ дещо п1двищував П. 0ск1льки значения Кщ та стимуляц!я АТФазно! активност1 К+ п!сля солюбо-л1зацП не зм1нювалися, можна зробити висновок про в!дсутн1сть значних конформац!йних зм!н в молекул1 ферменту п1д д1ею цв!т-терЮнних детергент1в.

Важливою характеристикою Н+-АТФази е П чутлив1сть до специф!чних 1нг1б1тор1в, насамперед до ДЦКД та ванадату. Одержан! нами результата св1дчать про те, що 1нг1б1торний ефект цих сполук значно б1льший для солюбШзованих препарат1в, н1ж для плазматичних мембран (рис. 4). Значне зниження 150 може пояснюватися очищениям Н+-АТФази п1д час солюбШзацП в1д 1н-ших фосфог1дролаз. 0кр1м того, ДЦКД може реагувати також в СООН-групами л1пШв або пол1пептид1в, загальна к!льк!сть яких вменшуеться, що посшше його ефективнЮТь п1сля солюбШзацП.

Збагачен! Н+-АТФазою солюб!л1вован1 препарати б зручним

€ о

т-1

га

ш

О 50 100 150 200 а) ДЦКД , мкМ

50 100 150 200 б) Ма3У04, мкМ

Рис.4. 1нПб1рування ДЦКД (а) та ванадатом (б) АТФазноЗ актив-ност! плазматичних мембран (о) та-препарапв, солюбШ-вованих цв!тергентом 3-14 (*) або лФХ (¡7).

о

об'ектом для досл1дження локал1зац1'1 футиЦ овально важливих ампюкислотних залишив ферменту. Зараз единим над1йно Центи-фжованим в залишок аспраПнов! кислоти, що фосфорилюеться гид час реакц!йного циклу вс1х АТФаз Р-типу (№а1с!егЬаие е1 а1., 1985). Для пошуку гнших ватаивих залиптв ми використовували Р1зн1 групоспециф!чн! реагента". Було встановлено, що Н+-АТФаза мала високу чутлив1сть до нодиф1камр1в ЗН-гр.п - пара-хлор-меркур! бензоату та етилмале1м1ду. Б1льш г1дроф1льн1 1нгЮ1-тори (1одацетам1д та моно!одоцтова кислота) мали значно слаб-ший ефект, що може вказувати на розташування чутливо! БН-групи в г!дрофобному оточенн1.

Модиф1кац1я ам!ногрул п1д д1ею флуорескам1ну га эалишк1в г1стидину д1ет'илп1рокарбонатом також призводили до значного зниження АТФазно! активност! солюб1л1зованого ферменту (рис.5), причому перший 1нг1б1гор був б!льш ефективним.' Пре1н-кубацхя АТФази з наведеними 1нг1б1торами в присутност! надлиш-ку реагент1в, що мгстили специф1чн! функц!ональн1 групи (д1-т!отрейтолу, Л1зину або г1стидииу) значно. знижувала гальмуван-ня активность що свгдчить про специф1чн1сть д11 1Нг1б1тор1В. Додавання М^АТФ також зменшувапо 1нг1бхрування, хоча й не призводило до вшговлення початкового р1вня активности

0ск1льки електрофоретичний анаглз солюб1л!зованих препа-рат!в виявив певну гетерогенн1сть 1х полхпептидного складу, нами був проведений пошук подальшого очищения Н+-АТФази. Наи-

• л

о

ж м

к

^

м

<

200 400 еоо 800 1000 1нг1б1тор, мкМ

Рис.5. Вплив флуорескам!-ну (о) 1 д1етилп1рокарбо-нату (•) на активн1сть ■ Н+-АТФази, солюбШзова-но! лФХ.

вица ефективтсть спостер1галася при центрифугу ванн i солюбШ-аованого ферменту в лШйному град!ент! глЩерину (рис.6), теля якого перевалена частина АТФазнси активное« виявлялася в единому nlui, який в!дд1лявся в!д ochobhoi маси б1лкових дом1-шок за рахунок б!льш високо! швидкост! седиментацП. При цьому було досягнуто очшцення в 23 рази по вгдношенню до початково! фракцП плазматичних мембран. Електрофоретичний анализ показав, що основну частину б!лку в очищеному npenapaTi складае пол!пептидний дублет з молекулярною масою близько 94 кЛа, який за допомогою 1муноблот1нгу був 1дентиф1кований як катал!тична субодиниця Н+-АТФази плазматичних мембран кукурудзи. 0чйщен1 препарати Н+-АТФази з корен1в томат1в та в1вса мали аналоПчн! молекулярн1 маси (Anthon, Spanswick, 1986; Serrano, 1984).

Висока чутлив1сть та специф1чн1сть 1мунолог1чних методов були використан1 нами для вивчення локал1зацП Н+-АТФази в ко-ренях napocTKiB кукурудзи in situ. За допомогою 1мунофлуорес-центного забарвлювання рад1альних зр1з!в було показано, що еп!дерм!с та перифер!йна частина осьового цшйндру значно

- «

л о

н í-,

а .-

■ы

« х

§ -3

h о

.й я

I

8

<

о ■

250

150

юр -

¿W

ь: о ч

150 м I00 50

ео {

50 1

м

40 »

ш

30 ' а

ф я

20 ц

Р-ч

N фракцП

о

Рис.6. Розподгл АТФазно'1 активност1 та'б1лку п1сля центрифугу-вання препарату, солюбШзованого лФХ, в град1ент1 гл1церину.

збагачен! Н+~АТФазою у пор^вняшп з шиими тканинами коретв. Загальна плотина цих тканин не перевищуе 5% в1д загашыго! по-верхн1 8р1з1в, що пояснюе низЬкий вмхст АТФаэт; у препаратах плазматичних мембран рослин. Одержан! результата узгоджугоються з гипотезою про 1снування в коренях рослин двох зон активного транспорту 1он1в (Лоттге, Хигинботам, 1984). Шдвщений вмзст Н+-ЛТФази у плазматичних мембранах цих тканин е ч1дтвердженням важливо! рол! цього ферменту в поглиннанн! та транспорт! еле-мент!в м!нерального живлення в рослинах.

В И С Н О В К И.

1. Охарактеризовано АТФазну активн!сть веэикульованих препарат!в плазматичних мембран, !зольованих з корен!в парост-к!в кукурудзи. За допомогою флуоресцентних зонд!в показано, що Н+-АТФазатенеруе мембранний потеши ал.

2. Проведено селективну солюб1л1зац!ю Н+-АТФази з вшсо-ристанням 2 цв1тер!онних детергент1в. Пор1Внякня властивостей фермента у мембранозв'язаному та солюбШзованому стан1 показало, що останнгй характеризуетесь большою активнгстю та ¡пдви-щеною чутлив1стю до 1нг!б1тор1в, в той час як значения Км для МгАТФ та стимулами Юнами калию не зм1нюються.

3. Препарати Н+-АТФази, солюб!л!зован! цвгтергентом 3-14, мають нижчу актив1псть, пор1нвяно з солюбШзованими лгзофос-фатид1лхол!ном, проте вона п!двищувться в присутност! екзоген-них фосфоЛ1П1Д1В.

4. Шд час реконструкцп солюб1л1зованих препаратов спос-тер!гаеться к!льк1сне зв'язування фермента -з л!посомами, що св!дчить про високу спор!днен1сть Н+-АТФази до мембранних л!~ п!дхв.

5. Остановлено, що л1зофосфатщилхол1н е специф!Чним стимулятором Н+-АТФази як у мембраноэв'язан!й, так 1 у содюб1л1-зован!й форм!. Припускаеться, що ефект л!зофосфатид!лхол!ну обумовлений пдрофобною взабМод1ею з молекулою фермента, яка переводить Н+-АТФазу в активований стан. -

6. Виявлено, що ковалентна модиф1кац!я сульфг!дрильних, ам!нних та !м!дазольних груп призводить до. !нактивац!1 АТФази, що св1дчить про шда суттеву роль у функд1онуванн! ферменту.

7. Проведено очищения солюбШзовано! Н+-АТФази центрифу-гуванням в л!н!йному граШент! щ!льност! гл!церину. За допомо-

гою ДСН-электрофорезу та гмуноблстнгу очищеного препарату показано, шо Н+-АТФаза репрезентована подШептидним дублетом з молекулярном маоою близько 94 кДа.

8. 3 використанням 1мунофлуоресцентного анализу дослгдже-но локал1зац1ю Н+-АТФази в коренях паростк!в кукурудзи. Вста-новлено, що най51льшим bmIctom ферменту характеризуются кдЬ тини еп1дерми та перифер!йно"1 частини центрального цил1ндру, що в1дзначаються високою 1нтенсивн1стю активного транспорту ioHiB. Таким чином, п1дтверджено важливу роль Н+-АТФази в Mi-неральному живленн! рослин.

СПИСОК ОСНОВНИХ Р0Б1Т, 0ПУБЛ1К0ВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦП.

1. Педченко ГЗ.К., Палладхна Т.О. Електрогешпсть Н+-АТФази плазматичних мембран коренiв кукурудзи //Доп. АН УРСР. Сер. Б. - 1985. - N4. - С.73-76.

2. Педченко В.К., Палладина Т.А. Получение солюбидизированных препаратов Н+-АТФазы плазматических мембран корней кукурузы //IV Бсесоюзн. межуниверс. конф."Биология клетки".Тезисы докл.-Тбилиси, 1985.-С.545-547.

3. Палладина Т.А., Педченко В.К., Симчук Е.Е. Реактивация фосфолипидами солюбилизированной Н+-АТФазы плазматических мембран корней кукурузы // Докл! АН СССР. - 1986. - Т.287, N7. - С.1499-1502.

4. Педченко В.К., Палладина Т.А., Насырова Г.Ф. Некоторые биохимические характеристики Н+-АТФазы плазматических мембран клеток корней кукурузы // V Всесоюзн. межуниверс. конф. "Биология клетки".Тезисы докл.- Тбилиси, 1987. - С.347-348.

5. Белявская Н.А., Палладина Т.А., Педченко В.К., Подлуцкий А.Г. Действие фосфолипаз на морфологию препаратов плазматических мембран кукурузы //Докл. АН УССР.Сер.Б. - 1987. -N5. - С.51-55.

6. Palladina Т.A., Pedchenko V.K., Nasirova G.F., Simchuk Е.Е. Lipid dependence of plasma membrane H+-ATPase //14 Intern. Biochem. Congress. Reports. - Prague, 1988. - P.124.

7. Palladina T.A., Pedchenko V.K., Nasirova 0.F. Lipid dependence of solubilized H+-ATPase preparations from plant plasma membranes //19 Meet. FEBS. Abstr.- Rome, 1989,- TH 349. ' •

8. Palladina T.A., Nasirova Q.F., Pedchenko V.K. Effects of

phosphollpases on plasma membrane vesicles from corn seedling roots /Plant Membr. Transport: the current position. - Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1989. -P.115-116.

9. Педченко В.К. Активация Н+-АТФазы плазматических мембран клеток корней кукурузы лизофосфатидилхолином //IV Всесоюзн. конф. молодых ученых - по физиологии растит.клена.Тезисы докл.- М.-1990.-С.117.

10.Pedchenko V.K., Nasirova G.F., Palladina T.А. Lysophosphatidylcholine specifically stimulates plasma membrane H+-ATPase from corn roots //FEBS Lett. - 1990. -V.275, N1. - P.205-208.

11.Palladina T.A., Nasirova G.F., Simchuk E.E., Pedchenko V.K. Participation of plasma membrane lipids in the H+-ATPase regulation //12 Int. Long Ashton Symp. "Transport and receptor proteins of plant membranes".Abstr.-Bristol, 1991.- P.54.

12.Palladina T., Nasyrova Q., Simchuk E., Pedchenko V. Mechanisms involved in lipid regulation of the plasma membrane H+-ATPase //9th Intern. Workshop on Plant Membrane Biology. Abstr. - Monterey, California, 1992. - P.250.

Ili.in .10 лруку. /JW.M Формат <50. j<,/u rianip^i .

Л|>)К. офс. Умпвн лр;к. арк л 9. i Обл.-внд. арк. л го тир ./¿О Злм з-зь-fs.

/J О'/. «i

КиТвська кнмжкова лрукармя науиово! книги.

Кшв, Penina, 4.