Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональные особенности эритроцитов у лиц различных возрастных групп

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные особенности эритроцитов у лиц различных возрастных групп"

На правах рукописи

005019025

ГОРИС АННА ПЯТРАС

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ У ЛИЦ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 ДПР 2012

Ульяновск-2012

005019025

Работа выполнена на кафедре медико-биологических дисциплин в негосударственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Зарубина Елена Григорьевна

доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой адаптивной физической культуры Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования

«Ульяновский государственный университет» Балыкин Михаил Васильевич доктор медицинских наук, профессор кафедры теоретической и прикладной психологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тольятгинский государственный

университет»

Якунин Валерий Ефимович

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пензенский государственный университет», г. Пенза

Защита состоится «17» мая 2012 г. в_:_на заседании диссертационного

совета Д 212.278.07 при ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, ул. Набережная реки Свияги, д. 106, корпус 1, ауд. 703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом - на сайте ВУЗа http://wwvv.uni.ulsu.ru и на сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации http://vak.ed.gov.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432017, г.Ульяновск, ул. Л. Толстого, д. 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.

Ведущая организация:

Автореферат разослан « /у »

А_УІ2012 Г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

С.В. Пантелеев

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одним из важнейших свойств эритроцита является его способность к деформируемости. Эритроциты способны значительно деформироваться при прохождении через капилляры, не меняя своего объема и площади поверхности. Эта особенность эритроцитов имеет важное значение для поддержания оптимальных процессов диффузии газов на протяжении всего микроциркуляторного русла различных органов. Огромное значение для деформируемости эритроцитов имеют вязко-эластичные свойства мембраны, которые определяются состоянием спектрино-актинового комплекса и его взаимодействием с другими структурными элементами мембраны (Зинчук В.В., 2001, Бобынцева О.В., 2006, Байбеков И.М., Москвин C.B., 2008, Сторожок С.А. и др., 2009). Прочность мембраны обеспечивается подмембранной сеткой из длинных и относительно гибких нитей белков спектрина и актина, тогда как содержимое цитоплазмы (раствор гемоглобина) ведет себя подобно жидкости, не препятствуя деформациям (Лисовская И.И., 2004, Свербиль В.П., Захаров С.Д., 2008).

В нормальных физиологических условиях с возрастом деформируемость эритроцитов уменьшается, увеличивается их агрегируемость и снижается кислородтранспортная функция, что по данным ряда авторов (Саркисов К.Г., 1998, Журавлева Т.Д. и др., 2003, Муравьев A.A., 2009) отражается на состоянии системы микроциркуляции. В литературе подробно обсуждаются механизмы изменений и нарушений деформируемости эритроцитов, многообразие которых указывает на то, что этот показатель является достаточно лабильной характеристикой крови, которая чувствительно реагирует на изменение любого метаболического процесса в организме (Новицкий В.В., 2001, БархинаТ.Г., 2006, Муравьев A.A., 2010).

При многих ситуациях, когда на организм человека начинают воздействовать неблагоприятные факторы внешней и внутренней среды (Козинец Г.И., 2001, Кленова Е.А., 2003, Кравец Е.Б., 2006, Лесникова Л.Н., 2006), эритроциты первыми реагируют нарушением деформируемости своей мембраны. Это связано с эндогенными (изменение структуры и концентрации гемоглобина, уровня содержания 2,3-дифосфоглицериновой кислоты, АТФ, ионов Mg 2+ и Ca 2+ в клетке и т.д.) и экзогенными (изменение концентрации гормонов, глюкозы, повышения вязкости плазмы) факторами (Зинчук В.В., 2001, Коркушко О.В., 2002).

Все эти обстоятельства объясняют повышенный интерес биофизиков и физиологов к деталям молекулярной динамики, обеспечивающим гибкость эритроцитов, и методам оперативного контроля их деформируемости, особенно в условиях клиники.

Цель исследования:

Изучить морфофункционалыюе состояние мембран эритроцитов и их способность к деформации в зависимости от возрастных особенностей человека.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить способность мембран эритроцитов к деформации у лиц разных возрастных групп.

2. Определить характер изменений липидного и белкового компонентов мембраны эритроцитов, влияющих на её деформируемость у лиц разных возрастных групп.

3. Установить влияние деформируемости мембраны эритроцитов на состояние регионарного кровотока и кислородное обеспечение тканей у лиц разных возрастных групп.

4. Оценить влияние гипоксии и температуры на деформируемость эритроцитов и регионарный кровоток у лиц разных возрастных групп.

Научная новизна. Получены новые данные о состоянии мембран эритроцитов и их способности к деформации у лиц разных возрастных групп. Исследованы показатели, характеризующие состояние как липидной, так и белковой компонент мембран эритроцитов у лиц разных возрастных групп.

Выявлены качественные и количественные различия в белковой части мембран эритроцитов у лиц разных возрастных групп. Установлено, что у лиц старше 50 лет в мембранах эритроцитов возрастает содержание спектрина, увеличивающего естественную «жесткость» красных клеток крови.

Получены новые данные о взаимосвязи между состоянием мембран эритроцитов и параметрами регионарного кровотока.

Установлено, что гипоксия и изменение температуры влияют на состояние мембран эритроцитов и характеристики регионарного кровотока в зависимости от возраста.

Практическая значимость работы. Изучение фракционной структуры эритроцитов может использоваться при оценке качества эритроцитарной массы и донорской крови, для проверки ее годности на фоне хранения и оценки состояния мембран красных клеток крови.

Возрастные структурно-функциональные особенности эритроцитов следует учитывать при коррекции состояний на фоне гипоксии и гипертермии.

Методика определения деформируемости эритроцитарных мембран, метод отмывки и хранения эритроцитов используются в работе клинико-диагностической лаборатории многопрофильного лечебно-диагностического комплекса «МедГард».

Выявленные тенденции в изменении деформируемости мембран эритроцитов на фоне старения человека используются в курсе преподавания нормальной физиологии в разделе «Кровь» у студентов лечебного, стоматологического факультетов Самарского медицинского института «РЕАВИЗ».

Положения, выносимые на защиту:

1. В периферической крови людей содержатся эритроциты с различной способностью к деформации, которая зависит от возраста и оказывает влияние на характер регионарного кровотока.

2, Возрастные особенности мембран эритроцитов связаны с изменением вязкости липидного бислоя, содержанием скелетных белков, которые определяют степень деформируемости эритроцитов.

3. Гипоксия, снижение рН и изменение температуры влияют на деформируемость мембран эритроцитов и характеристики регионарного кровотока в зависимости от возраста.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XXXV международной научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии» (Харьков, 2011), на научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в лазерной медицине» (Москва, 2011), ежегодной Российской научно-практической конференции «Наука. Образование. Медицина» (Самара, 2011), на международной научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии» (Судак, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, 3 из них по списку ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследований, главы данных собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 рисунками, содержит 15 таблиц. В работе использовано 211 литературных источника, из них 144 отечественных и 67 зарубежных.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Для решения поставленных задач были сформированы четыре возрастные группы, в которые вошли практически здоровые люди обоего пола от 20 до 59 лет, п=111:1 группа в возрасте 20-29 лет (средний возраст 25,7±3,5, среди них женщин п=11, мужчин п=20); II группа в возрасте 30-39 лет (средний возраст 36,3±2,1, среди них женщин п=10, мужчин п=19); III группа в возрасте 40-49 лет (средний возраст 45,6±3,3, среди них женщин п=15, мужчин п=13); IV группа в возрасте 50-59 лет (средний возраст 56 ±2,8, среди них женщин п=9 , мужчин п=14).

Объектом исследования служила кровь и эритроциты людей разных возрастных групп. Взятие крови осуществлялось путем пункции локтевой вены (спустя 10-12 часов после последнего приема пищи) при минимальной физической активности непосредственно перед взятием. В качестве антикоагулянта использовали К2ЭДТА 7,2 п^. Рабочую суспензию эритроцитов получали с помощью трехкратной отмывки раствором низкой ионной силы (производитель ООО "Гематолог») с режимом

центрифугирования при 2700 об/мин в течение 8 минут. Готовую суспензию эритроцитов разводили в соотношении 1:200.

Определение деформируемости эритроцитарной мембраны проводилось с помощью методики «лазерный пинцет» (Коробцов А.В. и др., 2009) путем измерения относительного удлинения эритроцитов под воздействием лазерного пучка с длиной волны излучения 1,08 мкм и максимальной выходной мощностью около 200 мВт. Выбранная длина волны позволяла попасть в полосу прозрачности эритроцитов и минимизировать

негативное воздействие излучения на объект. Скорость перемещения пятна оптической ловушки составляла около 15-20 мкм/сек. Пучок от лазера проходил через коллиматор и направлялся в ЮОх объектив микроскопа МИН-8. Результаты экспериментов записывались на ПЗС камеру, подключенную к компьютеру. Размер эритроцитов определялся по его теневому контуру. Деформируемость эритроцитов определялась при помощи программы контурного анализа клеток.

Определения микровязкости мембран по флуоресценции зонда пирена проводили по методу Г.Е.Добрецова (1990), измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре «СМ-22» (Беларусь). Индекс микровязкости мембран определяли как отношение флуоресценции пирена при 480 и 390 нм.

Осмотическую резистентность эритроцитов определяли с помощью модифицированного метода В.К.Петрова (1985) с применением антибиотика амфотерицина Б (АМТБ). Пробы инкубировали в течение 15 минут при температуре +37°С, затем центрифугировали при 3000 об/мин 5 минут и в супернатанте определяли концентрацию гемоглобина на спектрофотометре «СФ-26» (Россия) при длине волны 540 нм. В заключении проводился расчет процента гемолизированных эритроцитов и строилась графически концентрационная зависимость.

Для проведения исследований белков мембраны эритроцитов отмывку теней красных клеток крови проводили по методу 1.Таппе1Ч (1981). Электрофорез белков мембран проводили в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Ыа) в ступенчатом градиенте плотности геля от 13,5 до 5% в течение 5,5 часов. Гели окрашивали Кумасси в 250 бриллиантовым голубым, вымачивая в растворе красителя-фиксатора, содержащего 45% метанола и 25% уксусной кислоты в течение 12 часов, дифференцировали 10 % уксусной кислотой и денситометрировали на денситометре «ОМ 2120» (Беларусь). Количественную оценку содержания отдельных белковых фракций проводили методом взвешивания пиков.

Для изучения влияния деформируемости эритроцитов на регионарный кровоток использовался метод лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) (Крупаткин А.И., 2005) со спектральным анализом колебаний кровотока на многофункциональном лазерном диагностическом комплексе «ЛАКК-М» («ЛАЗМА», РФ).

Исследования проводили в первой половине дня при температуре воздуха в помещении 18-22°С. За три часа до исследования исключали курение. В течение 15 мин перед исследованием обследуемый находился в спокойном расслабленном состоянии в положении лежа на спине. Перед ЛДФ-мониторированием измеряли артериальное давление для исключения искажения получаемых результатов за счет гипо- и гипертонии. Световодный зонд закрепляли на исследуемой области испытуемого (на подушечке второго пальца правой руки), пальцевой датчик пульсоксиметра фиксировали на левом втором пальце испытуемого.

Определялись такие параметры как среднее значение перфузии (М, перф. ед.) насыщение кислорода в артериальной крови (ЭрОг, %) и венозной

крови (S02,%), относительный объем фракции эритроцитов (Vr, %), индекс перфузионного насыщения кислорода в микрокровотоке (SOm= S02/M, усл.ед.), индекс удельного потребления кислорода в ткани (U= Sp02/S02, усл.е.), показатель шунтирования (ПШ). Методом лазерной флуоресцентной диагностики в режиме «Флуоресценция» осуществлялись измерения спектра вторичного излучения ткани при ее зондировании лазерным излучением на длине волны, соответствующей длине волны максимального поглощения излучения определенным ферментом (>»=630 нм - порфирины; >=560 нм -липофусцин).

Влияния гипоксии на деформируемость эритроцитов и регионарный кровоток в зависимости от возраста людей оценивалась на примере гипоксии респираторного генеза. Обследовались люди в возрасте 40-49 лет (подгруппа IIIA, п=30) и 50-59 лет (подгруппа IVA, п=25) в состоянии дыхательной гипоксии. В контрольные группы были включены практически здоровые люди тех же возрастов: 40-49 лет (III группа, п=28) и 50-59 лет (IV группа, п=23). Газовый состав и КОС в артериализированной крови определяли с использованием автоматического газового анализатора «ABL-50» (Дания). В обследуемых группах людей изучалась деформируемость эритроцитов методом «лазерный пинцет» и параметры регионарного кровотока методом ЛДФ.

Для изучения состояния мембран эритроцитов лиц различных возрастных групп к изменению рН проводилось исследование in vitro. Для этого была использована лактатная модель ацидоза (с концентрациями молочной кислоты 7,5 ммоль/л, 10 ммоль/л и 20 ммоль/л) (Boning D. et. al., 1989). В качестве контроля в каждой группе использовались эритроциты, не подвергавшиеся воздействию молочной кислоты.

Для изучения состояния мембран эритроцитов лиц различных возрастных групп к изменению температуры проводилось исследование in vitro. Для этого рабочую суспензию эритроцитов помещали в термостат марки ШСВЛ-80 «Касимов» (Россия), где выдерживали экспозицию 60 минут при температуре 38°С (подгруппы А) и 40°С (подгруппы Б). В качестве контроля в каждой группе использовались эритроциты, не подвергавшиеся термостатированию. Для подтверждения влияния изменения температуры на деформируемость эритроцитов и состояние регионарного кровотока проводилось исследование in vivo у людей разных возрастных групп на фоне повышения температуры тела до 38°С и до 40°С.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ Statistica for Windows 6.0 с использованием t-критерия Стьюдента и корреляционного анализа. Все данные представлены как средние значения ± стандартные ошибки. Статистические результаты считались достоверными при р<0,05.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Особенности деформируемости эритроцитов у людей разных возрастных групп

Результаты исследования показали, что в крови обследованных из всех четырех групп наблюдения содержатся разные по способности к деформации эритроциты. Согласно исследованиям других авторов (8рос1агук К., 2001, ^уауапШ 8., 2002), эритроциты, способные к деформации более 40% от исходного диаметра, значительно эффективнее участвуют в газообмене и не ухудшают реологические свойства крови (текучесть, вязкость), что позволило нам считать эритроциты, увеличивающие свой диаметр свыше 40% при их деформации в лазерной ловушке «эластичными», а не дающие подобного эффекта — «ригидными».

Анализ полученных результатов показал (рис.1.), что с возрастом снижается деформируемость мембран эритроцитов. Так у лиц НУ групп на величину до 90% от своего исходного диаметра при деформации изменяли свой диаметр 88,0%; 84,5%; 65,7% и 50,2% клеток соответственно. В то же время, параллельно с увеличением возраста обследованных в пробах крови увеличивалось количество более «ригидных» эритроцитов. Так, например, количество клеток, дающих прирост диаметра до 40% от исходного, увеличивалось в ряду 1-1V группы и составляло 12,0%- 15,5%-34,3%-49,8% (в среднем в 4,2 раза, р<0,05), а дающих увеличение до 50% - с 5,2% до 19,6% (в среднем в 3,8 раз, р<0,05).

Таким образом, в периферической крови людей содержатся эритроциты с различной способностью к деформации. С увеличением возраста происходит снижение деформируемости мембран эритроцитов.

5.0 10,0 15.0 20.0 25,0 30,0 35,0 40:0 45:0 Доля эритроцитов,% Щ груша 20-29 лет ШП группа 30-39 лет

0111 группа 40-49 лет 0IV грушш50-59 лет

Рис. 1. Распределение эритроцитов в зависимости от степени растяжимости эритроцитарных мембран в различных возрастных группах

3.2. Влияние деформируемости эритроцитов на регионарный кровоток у людей разных возрастных групп

Результаты исследования показали (табл.1), что у обследованных людей из I группы отмечались наиболее низкие значения индекса перфузионного насыщения кислорода в микрокровотоке - 4,8 усл. ед., что свидетельствовало об активном усвоении кислорода из перфузируемой крови. Это подтверждалось высоким значением индекса удельного потребления кислорода тканями - 1,28 усл.ед. и высокими значениями перфузии (М) и относительного объема фракции эритроцитов, проходящих через микрососуды (Уг).

Таблица 1

Показатели периферической микроциркуляции у пациентов разных

возрастных групп (М±т)

Показатель I группа, п=31 II группа, п=29 III группа, п=28 IV группа, п=23

М, перф. ед. 16,1±0,5 16,0±0,6 13,2±0,4* 11,2±0,4**

802, % 77,6±1,1 78,3±1,2 80,2±1,3 80,6±1,4

8р02 % 99,9±0,1 99,8±0,2 98,3±0,1 97,1±0,1

Уг, % 19,6±0,3 19,3±0,4 14,3±0,3** 12,3±0,3**

80т= 802/М, усл.ед. 4,8±0,1 4,9±0,3 6,1±0,1* 7,2±0,1**

и= 8р02/ 802, усл.е. 1,28±0,01 1,27±0,02 1,23±0,02* 1,20±0,01*

ПШ, усл.ед 1,3±0,1 1,5±0,1 1,9±0,2 2,3±0,2

Примечание: *- различия достоверны по сравнению с данными предыдущей группы (р<0,05), ** - различия достоверны по сравнению с данными предыдущей группы (р<0,001)

Аналогичные показатели отмечались и у лиц из Н-ой группы. В отличие от них у людей из Ш-ей группы отмечалось значительное (на 21,2%, р<0,001) снижение среднего значения перфузии. При этом достоверно уменьшался объем фракции эритроцитов, проходящих через микрососуды (на 35,0%, р<0,001). Эти изменения сопровождались снижением эффективности газообмена у данной группы людей: на 24,5% (р<0,001) возрастал индекс перфузионного насыщения кислорода в микрокровотоке и на 3,3% (р<0,05) снижался индекс удельного потребления кислорода в тканях. У лиц 1У-ой группы объем перфузии уменьшался по сравнению с показателями 1-ой и П-ой групп на 43,8% (р<0,001), объем фракции эритроцитов, проходящих через микрососуды, на 59,3% (р<0,001), а индекс удельного потребления кислорода в тканях на 6,6%, (р<0,05). При этом, так же как и у людей из Ш-ей группы, у них возрастал индекс перфузионного насыщения кислорода в микрокровотоке на 50,0% (р<0,001).

Методом ЛФД было установлено, что у людей, по мере их старения, особенно из IV-ой группы была значительно повышена (на 21,9%, р<0,001) по сравнению с 1-ой группой «красная» эндогенная флуоресценция в диапазоне длин волн А,=600-800нм (Х=630 нм), соответствующая эндогенным порфиринам и/или их комплексам с белками, которые, видимо, накапливаются в области исследования в более высоких концентрациях, особенно в возрастном интервале от 40 до 49 лет, который соответствует началу структурно-функциональных перестроек в мембранах эритроцитов. Некоторый вклад в суммарный сигнал эндогенной флоуресценции могут вносить здесь также и липофусцины, имеющие в этой области длинный «шлейф» спектра люминесценции. Липофусцин часто считают индикатором старения клеток организма человека, кроме этого как порфирины, так и липофусцин являются маркерами наличия хронической гипоксии (Татарюнас А.Б., 1999, Горенков Р.В. и др., 2007).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что изменения структурно-функциональных свойств эритроцитов могут иметь важное значение в транспорте газов и являются одним из факторов, влияющих на газообмен на уровне микрогемоциркуляции в зависимости от возраста.

3.3. Морфофункциональные изменения мембран и деформируемость эритроцитов в зависимости от возраста

Сложность строения эритроцитов обусловливает зависимость их деформируемости от вязкости внутреннего содержимого и структурно-функционального состояния мембраны. О состоянии вязкости липидного бислоя судигш по изменению индекса микровязкости (табл.2), определяемому с помощью липотропного зонда пирена. Было зарегистрировано достоверное (р<0,001) уменьшение индекса микровязкости мембран эритроцитов, коррелирующее с возрастом обследуемых людей и динамикой снижения деформируемости красных клеток крови, полученной ранее (г=0,97) в ряду I-II-III-IV группы. Обращает на себя внимание и тот факт, что статистически значимое снижение микровязкости липидов мембран эритроцитов происходило именно после 40 лет - на 35,5% (р<0,001), после 50 лет это снижение не превышало 19,2% (р<0,05).

Таблица 2

Значение индекса микровязкости мембран эритроцитов у людей разных возрастных групп (М±т)

Показатель I группа, п=31 II группа, п=29 III груша, п=28 IV группа, п=23

Индекс микровязкости мембран эритроцитов, усл.ед 0,88 ± 0,02 0,84 ± 0,03 0,62 ±0,01* 0,52 ± 0,02*

11римечание: *- различия достоверны по сравнению с данными 1 группы (р<0,001)

В качестве дополнительного критерия состояния липидного бислоя учитывалась степень гипотонического гемолиза эритроцитов в присутствии антибиотика АМТБ. Установлено, что все три используемые концентрации (0,006%; 0,008%; 0,01%) АМТБ вызывали достоверно (р<0,001) большую степень гемолиза в пробах эритроцитов у людей старших возрастных групп по сравнению с показателями I группы (табл.3). Между чувствительностью эритроцитов обследованных групп людей к АМГБ и индексом микровязкости имеется отрицательная корреляционная связь (г=-0,94), то есть чем больше возрастает микровязкость их липидного бислоя, тем ниже их осмотическая резистентность.

Таблица 3

Изменение осмотической резистентности эритроцитов в присутствии АМТБ у

Группы наблюдения Количество гемолизированных эршроцитов в присутствии разных концентраций АМТБ, %

0,006 0,008 0,01

1 группа, п=31 13,5 ±0,1 16,9 ±0,2 21,9 ±0,2

II группа, п=29 14,8 ±0,2 24,3 ±0,1 34,3 ± ОД

III группа, п=28 28,4 ± 0,2 49,9 ± 0,3 76,3 ± 0,6

IV группа, п=23 38,9 ± 0,4* 62,2 ± 0,7* 97,4 ± 0,6*

Примечание.' *- различия достоверны по сравнению с данными 1 группы (р<0,001)

Помимо липидной часта, нами были изучены и возрастные количественные изменения в структуре белковой части мембран эритроцитов. Результаты исследования приведены в табл.4.

Таблица 4

Изменение содержания белков в мембранах эритроцитов у людей разных

Группы наблюдения Содержание фракций белков в мембранах Э, %

1 4 5 13

I группа, п=31 4,26 ±0,1 4,36 ±0,2 8,45 ± 0,2 24,61±0,5

II группа, п=29 4,11± 0,3 3,81 ±0,2 8,43±0,3 25,35±0,4

III группа, п=28 2,32±0,1** 2,75±0,5** 8,3б±0,б 29,65±0,8*

IV группа, п=23 1,32±0,3** 2,37±0,2** 6,34±0,6** 38,13±0,6**

**- различия достоверны по сравнению с данными I группы ф<0,001);

Примечание 2: названия фракции: 1 - Глугатион - Б - трансфераза; 4 - Глицеральдегид-

3 -фосфатдегидрогеназа; 5 - Актин; 13 - Спектрин.

Относительное содержание высокомолекулярных скелетных белков спектринов (фракция 13) в первых двух группах статистически не отличалось друг от друга. Достоверное повышение содержания - на 20,5% (р<0,001) по сравнению с людьми из 1-ой группы было отмечено у лиц старше 40 лет, у лиц старше 50 лет по сравнению с лицами 1-ой и П-ой групп это увеличение составило в среднем 52,7% (р<0,001). Однако нами было зарегистрировано наряду с ростом фракции 13 снижение относительного содержания белковых фракций с молекулярным весом менее 50 кДа (1 и 4 фракции), причем также наиболее выражено у лиц Ш-ей и IV-ой групп наблюдения. Так, снижение содержания белка 4 полосы (с молекулярным весом 35 кДа - глицеральдегад-3-фосфатдегидрогеназа, важнейший фермент энергетического обмена эритроцитов) в 1,6 и 1,8 раза (р<0,001) у лиц Ш-ей и 1У-ой групп по сравнению с показателями I группы может приводить к нарушениям энергетического обмена эритроцитов. Динамика количественного снижения фермента глуташон-в-трансферазы (в ряду 1-Н-Ш-1У групп) была аналогична динамике снижения 4 фракции: в 1,8 и 3,2 раза (р<0,001) у лиц Ш-ей и IV-ой групп по сравнению с показателями 1 группы, что сопряжено, по-видимому, с увеличением активности процессов перекисного окисления липидов и изменением качественного состояния липидов мембран эритроцитов с возрастом. Косвенным подтверждением этого являлось увеличение процента гемолизированных эритроцитов в присутствии АМТБ. Содержание полосы с молекулярным весом 43 кДа, идентифицируемых как актин, было достоверно снижено (р<0,05) только у больных из IV группы. Одновременное снижение содержания фактически всех белковых фракций с относительно низким молекулярным весом и локализованных на внутренней стороне мембраны эритроцитов отчасти может быть объяснено структурно-функциональными изменениям! мембран красных клеток крови с возрастом.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в процессе старения происходит уменьшение деформируемости мембран эритроцитов, что выражается в увеличении вязкости их мембран, снижении осмотической резистентности на фоне увеличения количества белков спектринов и уменьшении низкомолекулярных белков цитоскелета и нарушении белково-липидных взаимодействий.

3.4. Влияние гипоксии и рН на деформируемость эритроцитов и регионарный кровоток в зависимости от возраста

В результате исследования были получены данные, которые позволяют говорить о том, что возрастные изменения мембран эритроцитов приводят к различной устойчивости красных клеток крови к воздействию гипоксии. Так, если у здоровых людей в возрасте 40-49 лет из 111 группы «эластичными» могли считаться до 65,7% клеток, то на фоне гипоксии в ША группе количество «эластичных» эритроцитов снижалось на 10,8% (р<0,05). В возрастной группе 50-59 лет на фоне гипоксии (1УА группа) деформируемость эритроцитов еще больше снижалась и в структуре эритроцитов отмечалось уменьшите количества «эластичных» клеток на 39,4% (р<0,001).

С этими изменениями коррелировали и показатели регионарного кровотока у людей описанных групп (табл. 5).

Таблица 5

Показатели периферического регионарного кровотока у обследованных с

Показатель Практически здоровые люди Обследованные с гипоксией

Шгруппа, п=28 IVrpyraia, п=23 IIIArpyima, п=30 IVArpyima, п=25

М, перф. ед. 13,2±0,3 11,2±0,4 12,1±0,3 10,0±0,4*

S02, % 80,2±1,3 80,б±1,4 80,9±0,4 83,9±0,9*

Sp02i% 98,3±0,1 97,1 ±0,1 92,3±0,1 92,1±0,3

Vr, % 14,3±0,3 12,3±0,3 13,6±0,1* 10,3±0,2*

SOm= SOj/M, усл.ед. 6,1±0,1 7,2±0,1 6,7±0,3 8,4±0,3

U= Sp02/ S02, усл.е. 1,23±0,02 1,20±0,02 1,14±0,01 1,09±0,01**

Примечание:*-различия достоверны по сравнению с данными IV группы (р<0,05).

различия достоверны по сравнению

данными ША

группы (р<0,05)

У лиц IVA группы среднее значение перфузии тканей было меньше, чем у обследуемых из IV группы, на 12,0% (р<0,05). При этом объем фракции эритроцитов (Vr,%) снижался на 19,4% (р<0,05), что может быть связано частично с увеличения количества «ригидных» клеток, увеличением периферического сопротивления и открытием в связи с этим шунтов и увеличением сброса крови в венозное русло. Косвенным подтверждением этого было повышение у этих лиц насыщения кислорода в венозной крови (на 4,1%, р<0,05). Ухудшение кислородной обеспеченности тканей на фоне гипоксии с возрастом подтверждалось снижением у них индекса удельного потребления кислорода в ткани (U, усл.е.) по сравнению с людьми 40^19 лет (IIIA группа) на 4,6% (р<0,05), а по сравнению с IV-ой группой - на 10,1% (Р<0,05).

При проведении эксперимента in vitro было установлено, что на фоне воздействия трех концентраций молочной кислоты деформируемость эритроцитов изменялась по-разному у лиц разных возрастных групп. Так, эритроциты людей из 1-ой группы практически не реагировали на воздействие первых двух концентраций молочной кислоты и только концентрация в 20 ммоль/л приводила к незначительному увеличению количества «ригидных» клеток - с 12,0% до 17,3 % (р<0,05). У людей из И-ой группы была отмечена аналогичная устойчивость эритроцитов к воздействию молочной кислоты. При этом количество «ригидных» клеток, дающих прирост диаметра эритроцитов до 40%, увеличивался с 15,5% до 24,0% (р<0,05). У людей из П1 группы наблюдения динамика изменения деформируемости была более значительной и отмечалась уже при концентрации молочной кислоты в 10 ммоль/л:

количество «ригидных» клеток при этом увеличилось на 18,4% (р<0,05), а при концентрации молочной кислоты 20,0 ммоль/л - на 21,6% (р<0,001). У людей из IV-ой возрастной группы динамика изменений в деформируемости эритроцитов, выявленная в Ш-ей группе, сохранялась. Однако степень этих изменений была в среднем на 17,6% (р<0,05) больше, чем в предыдущей группе и возникала уже при инкубации с концентрацией молочной кислоты в 7,5 ммоль/л, что свидетельствует о неблагоприятном влиянии лактоацидоза на деформируемость эритроцитов.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют, что с возрастом на фоне гипоксии и изменении pH снижается деформируемость мембран эритроцитов и ухудшаются параметры регионарного кровотока.

3.5. Влияние изменения температуры на деформируемость эритроцитов в зависимости от возраста человека

В результате исследования, проведенного in vitro (рис.2,3) было установлено, что в группе людей в возрасте 20-29 лет повышение температуры инкубационной среды до 38°С практически не влияет на деформируемость эритроцитов и очень незначительно (статистически не достоверно) увеличивается количество «ригидных» клеток при увеличении температуры до 40°С.

У лиц 30-39 лет инкубация эритроцитов в термостате при температуре 38°С приводила к ухудшению деформируемости эритроцитов и увеличению количества «ригидных» клеток в среднем на 15,5% (р<0,05), при гипертермии 40°С эти показатели ухудшались на 30,9% (р<0,001) по сравнению с показателями контрольной группы.

У обследованных людей в возрасте 40-49 лет (IIIA группа) влияние изменения температуры было более значимым: при этом после инкубации при температуре 38°С максимальная деформируемость эритроцитов уменьшалась до 60% от исходного диаметра у 17,8% клеток. При гипертермии 40°С (ШБ группа) только 16,6% клеток деформировались до 50% от исходного диаметра, количество «эластичных» клеток уменьшилось на 34,9% (р<0,001) по сравнению с группой контроля.

Эта же динамика прослеживалась и у лиц старшей возрастной группы 50-59 лет. При инкубации эритроцитов при 38°С (IVA группа) количество «ригидных» клеток возросло на 20,9% (р<0,05), а при гипертермии 40°С (IVB группа) количество «ригидных» клеток увеличилось на 38,3% (р<0,001) по сравнению с IV-ой группой.

Для изучения влияния температуры на свойства эритроцитов in vivo мы провели исследование деформируемости эритроцитов у людей разных возрастных групп с повышением температуры тела до 38°С и 40°С (в подмышечной впадине). В эксперименте in vivo были получены аналогичные данные, подтверждающие результаты эксперимента in vitro. Так, например, также как при эксперименте in vitro в возрасте 30-39 лет при повышении температуры деформируемость эритроцитов ухудшалась в среднем на 7,7% (р<0,05) и 18,7% (р<0,05) соответственно по сравнению с показателями

контрольной группы. У обследованных людей в возрасте 40-49 лет и 50-59 лет повышение температуры до 38°С приводило к значительному изменению деформируемости мембран эритроцитов: количество «ригидных» клеток возрастало на 12,8% (р<0,05) и 14,0% (р<0,05), а при гипертермии 40°С — на 32,6% (р<0,001) и 34,3% (р<0,001) по сравнению с группой контроля.

Доля эритроцитов,%

□ IA группа Н IIA группа ЕЗ IIIA груша Ш IVA группа

Рис.2. Эластичность эритроцитов в различных возрастных группах при температуре 38°С.

Изучение регионарного кровотока у людей разных возрастных групп выявило изменения показателей регионарного кровотока в условиях гипертермии. Результаты изучения параметров регионарного кровотока представлены в табл.6.

Таблица 6

Показатели периферического регионарного кровотока при воздействии температурного фактора у людей разных возрастных групп (М±ш)

Показатель М, перф. ед. S02, % Sp02,% Vr, % SOm= S02/M, усл.ед. U=Sp02/ S02, усл.е.

I группа, п=31 16,1 ±0,5 77,6±1,1 99,9±0,1 19,6±0,3 4,8±0,1 1,28±0,01

IA группа, п=18 17,5±0,4 77,3±1,0 99,8±0,1 20,3±0,3 4,4±0,1 * 1,29±0,01

ІБ группа, п=21 19,0±0,3* 76,2±0,9 98,1±0,1 24,1±0,2 4,0±0,1 * 1,29±0,01

II группа, п=29 16,0±0,6 78,3±1,2 99,8±0,2 19,3±0,4 4,9±0,1 1,27±0,02

IIA группа, п=19 17,1 ±0,3 78,2±0,7 98,1±0,2 20,3±0,3 4,6±0,2 1,25±0,01

ІІБ группа, п=22 19,0±0,3* 78,2±0,9 95,2±0,3 22,1±0,3* 4,1 ±0,1 1,21±0,01*

III группа, п=28 13,2±0,4 80,2±1,3 98,3±0,1 14,3 ±0,3 6,1±0,1 1,22±0,02

IIIA группа, п=18 14,1 ±0,4 81,1±0,8 96,2±0,7 14,8±0,4 5,8±0,2 1,18±0,01*

ІІІБ группа, п=19 14,9±0,3* 82,2±0,5 93,2±0,7 14,9±0,3* 5,5±0,1 1,13±0,01*

IV группа, п=23 11,2±0,4 80,6±1,4 97,1±0,1 12,3±0,3 7,2±0,1 1,20±0,01

IVA группа, п=21 10,1 ±0,3* 81,6±1,0 95,3±0,2 11,4±0,1 * 8,1±0,2 1,16±0,01*

IVB группа, п=23 9,7±0,4* 83,6±1,1 94,2±0,1 10,4±0,2* 8,6±0,2 1,12±0,01*

Примечание: *р<0,05 по сравнению с контрольными группами (1,11,III,IV)

При повышении температуры тела у лиц молодого возраста были зафиксированы незначительные изменения параметров регионарного кровотока. С увеличением возраста наблюдались значительные изменения параметров регионарного кровотока, так у лиц III и IV групп при повышении температуры наблюдалось снижение индекса удельного потребления

кислорода в ткани (U, усл.е.) в среднем на 5,6% (р<0,05) и 5,3% (р<0,05), что свидетельствует об ухудшении регионарного кровотока с возрастом.

Результаты исследования, полученные в эксперименте in vitro, показывают, что повышение температуры, особенно до 40°С влияет на изменение деформируемости мембран эритроцитов, что выражается в увеличении количества «ригидных» клеток. В эксперименте in vivo были получены аналогичные данные, подтверждающие, что повышение температуры тела приводит к изменению морфофункциональных свойств красных клеток крови, а именно к уменьшению их деформируемости, а также наблюдается ухудшение характеристик регионарного кровотока, особенно у лиц старше 40-50 лет.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в зависимости от возраста человека изменяется деформируемость эритроцитов: в группе молодых людей зафиксирована максимальная способность к деформации эритроцитов (40,3%), в группе пожилых людей - минимальная способность к деформации эритроцитов (19,6%).

2. Возрастные изменения мембран эритроцитов заключаются в увеличении вязкости липидного бислоя (индекс микровязкости снижается за период с 20-29 лет до 50-59 лет на 69,2%) и повышении процентного содержания скелетных белков (спектрина на 52,7%), что определяет снижение деформируемости эритроцитов.

3. Установлена взаимосвязь между возрастными изменениями деформируемости мембран эритроцитов и состоянием регионарного кровотока, что выражается в изменении параметров тканевой микроциркуляции: у лиц старших возрастных групп по сравнению с более молодыми людьми снижается объем перфузии (на 43,8%), объем фракции эритроцитов, проходящих в единицу времени через микрососуды (на 59,3%), индекс удельного потребления кислорода в тканях (на 6,6%), а индекс перфузионного насыщения кислорода и показатель шунтирования в микрокровотоке возрастают (на 50,0% и 76,9% соответственно).

4. Выявлено, что на фоне гипоксии и изменения рН у лиц старших возрастных групп отмечается уменьшение деформируемости мембран эритроцитов, что выражается в увеличении количества «ригидных» красных клеток крови: у лиц старше 40 лет - до 41,7%, у лиц старше 50 лет - до 67,0%.

5. Установлено, что воздействие температурного фактора до 38 С у лиц старших возрастных групп приводит к увеличению числа «ригидных» клеток до 41,3% и 60,2%; при гипертермии в 40°С - до 51,3% и 68,9 % соответственно.

Список публикаций по теме диссертации

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Лысов H.A., Горис А.П., Зарубина Е.Г., Москвин C.B. Связь способности эритроцитов к деформации со структурными перестройками мембран красных клеток крови у лиц различных возрастных групп //«Морфологические ведомости»,- 2011,- №4. - С. 69-72.

2. Супильников A.A., Горис А.П., Зарубина Е.Г., Москвин C.B. Влияние деформируемости мембран эритроцитов на микроциркуляцию у лиц различных возрастных групп //«Морфологические ведомости»,- 2011.- №4 -С.76-78.

3. Горис А.П., Зарубина Е.Г., Москвин C.B. Влияние деформируемости мембран эритроцитов на микроциркуляцию в зависимости от возраста у пациентов с лихорадкой //«Вестник новых медицинских технологий».- 2012,- T.XIX, №1,- С.150-152.

Публикации в других изданиях

1. Горис А.П., Москвин C.B., Зарубина Е.Г. Деформируемость мембран эритроцитов в условиях лактоацидоза // Материалы XXXV межд. научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии». - Харьков, 2011. - С. 172.

2. Горис А.П., Москвин C.B., Зарубина Е.Г. Деформируемость мембран эритроцитов у пациентов разных возрастных групп // Материалы XXXV межд. научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии». - Харьков, 2011. - С. 173.

3. Горис А.П., Москвин C.B., Зарубина Е.Г. Исследование деформируемости мембран эритроцитов методом «лазерный пинцет» в условиях лактоацидоза // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в лазерной медицине».-М., 2011.-С. 116-117.

4. Горис А.П., Москвин C.B., Зарубина Е.Г. Исследование деформируемости мембран эритроцитов методом «лазерный пинцет» у пациентов разных возрастных групп // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в лазерной медицине». - М., 2011. — С. 117.

5. Горис А.П., Зарубина Е.Г., Москвин C.B. Влияние деформируемости эритроцитов на микроциркуляцию в зависимости от возраста// Материалы ежегодной Российской научно-практической конференции «Наука. Образование. Медицина». - Самара, 2011. - С. 116-118.

6. Горис А.П., Зарубина Е.Г., Москвин C.B. Деформируемость мембран эритроцитов у пациентов различных возрастных групп на фоне лихорадки// Материалы ежегодной Российской научно-практической конференции «Наука. Образование. Медицина». - Самара, 2011. - С. 124.

7. Горис А.П., Зарубина Е.Г. Изучение деформируемости эритроцитарных мембран методом «лазерный пинцет» для оценки влияния возраста на морфофункциональное состояние эритроцитов// Материалы

ежегодной Российской научно-практической конференции «Наука. Образование. Медицина». - Самара, 2011. - С. 187-190.

8. Горис А.П., Москвин C.B., Зарубина Е.Г. Влияние деформируемости мембран эритроцитов на микроциркуляцию в зависимости от возраста пациентов с гипоксиями различного генеза// Материалы XXXVI Международной научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии». - Судак, 2011. - С. 104-105.

9. Горис А.П., Москвин C.B., Зарубина Е.Г. Изучение деформируемости мембран эритроцитов у пациентов различных возрастных групп на фоне лихорадки// Материалы XXXVI Международной научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии». -Судак, 2011.-С. 105-106.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМТБ -антибиотик амфотерицин Б

ЛДФ -лазерная допплеровская флоуметрия

ЛФД -лазерная флуоресцентная диагностика

М, перф.ед. -среднее значение перфузии

ПШ, усл.ед. -показатель шунтирования

8р02> % -насыщение кислорода в артериальной крови

802, % -насыщение кислорода в венозной крови

80т, усл.ед. -индекс перфузионного насыщения кислорода в микрокровотоке

и, усл.ед. -индекс удельного потребления кислорода в ткани

Уг, % -объема фракции эритроцитов в области исследования

Подписано в печать 13.04.12г. Формат 60x90/16. Усл.печ.л.1,5. Цифровая печать Офсетная бумага 80 гр. М2 Тираж 100 экз. Заказ № 1

Отпечатано с цифрового насителя.

Печатный салон «Green Cat», 443110 г.Самара, пр-т Ленина, 12А Тел.: 8(846) 22-00-552

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горис, Анна Пятрас, Самара

61 12-3/1115

НЕГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ САМАРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ «РЕАВИЗ»

На правах рукописи

ГОРИС АННА ПЯТРАС

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ У ЛИЦ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Зарубина Елена Григорьевна

Самара - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................4

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................9

1.1. Современные представления о структуре и функции эритроцитов, строение их мембран...................................................9

1.2. Механизм деформируемости эритроцитов.................................15

1.3. Методы определения деформируемости эритроцитов...................24

1.4. Микроциркуляторное русло и его исследование методом лазерной допплеровской флоуметрии.............................................30

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................35

2.1. Объект исследования............................................................35

2.2. Методы исследования...........................................................38

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............52

3.1. Изучение деформируемости эритроцитов у людей разных возрастных групп с помощью «лазерного пинцета»...........................52

3.2. Морфофункциональные изменения мембран и деформируемость эритроцитов в зависимости от возраста человека.............................61

3.3. Влияние деформируемости эритроцитов на состояние регионарного кровотока у людей разных возрастных

групп......................................................................................71

3.4. Влияние гипоксии и рН на деформируемость эритроцитов и регионарный кровоток в зависимости от возраста

человека..................................................................................75

3.5. Влияние изменения температуры на деформируемость эритроцитов в зависимости от возраста человека.............................................86

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................97

ВЫВОДЫ......................................................................................117

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..................................................118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМТБ антибиотик амфотерицин Б

АТФ аденозинтрифосфат

АТФ-аза аденозинтрифосфатаза

КОС кислотно-основное состояние крови

ЛДФ лазерная допплеровская флоуметрия

пол перекисное окисление липидов

цАМФ циклический аденозинмонофосфат

Э эритроцит

1 длина волны зондирующего излучения

пш показатель шунтирования

ЭрОг насыщение кислорода в артериальной крови

802, насыщение кислорода в венозной крови

БОт индекс перфузионного насыщения кислорода в микрокровотоке

р02 парциальное давление кислорода

и индекс удельного потребления кислорода в ткани

Уг объема фракции эритроцитов в области исследования

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Одним из важнейших свойств эритроцита является его способность к деформируемости. Эритроциты способны значительно деформироваться при прохождении через капилляры, не меняя своего объема и площади поверхности. Эта особенность эритроцитов имеет важное значение для поддержания оптимальных процессов диффузии газов на протяжении всего микроциркуляторного русла различных органов. Огромное значение для деформируемости эритроцитов имеют вязко-эластичные свойства мембраны, которые определяются состоянием спектрино-актинового комплекса и его взаимодействием с другими структурными элементами мембраны [9,19,50,128]. Прочность мембраны обеспечивается подмембранной сеткой из длинных и относительно гибких нитей белков спектрина и актина, тогда как содержимое цитоплазмы (раствор гемоглобина) ведет себя подобно жидкости, не препятствуя деформациям [83,121].

В нормальных физиологических условиях с возрастом деформируемость эритроцитов уменьшается, увеличивается их агрегируемость и снижается кислородтранспортная функция, что по данным ряда авторов [46,98,119] отражается на состоянии системы микроциркуляции. В литературе подробно обсуждаются механизмы изменений и нарушений деформируемости эритроцитов, многообразие которых указывает на то, что этот показатель является достаточно лабильной характеристикой крови, которая чувствительно реагирует на изменение любого метаболического процесса в организме [10,99,102].

При многих ситуациях, когда на организм человека начинают воздействовать неблагоприятные факторы внешней и внутренней среды [60,61,73,81], эритроциты первыми реагируют нарушением деформируемости своей мембраны. Это связано с эндогенными (изменение структуры и концентрации гемоглобина, уровня содержания 2,3-дифосфоглицериновой кислоты, АТФ, ионов 2+ и Са 2+ в клетке и т.д.) и экзогенными (изменение

концентрации гормонов, глюкозы, повышения вязкости плазмы) факторами [50,69].

Все эти обстоятельства объясняют повышенный интерес биофизиков и физиологов к деталям молекулярной динамики, обеспечивающим гибкость эритроцитов, и методам оперативного контроля их деформируемости, особенно в условиях клиники. Цель исследования:

Изучить морфофункциональное состояние мембран эритроцитов и их способность к деформации в зависимости от возрастных особенностей человека.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить способность мембран эритроцитов к деформации у лиц

разных возрастных групп.

2. Определить характер изменений липидного и белкового компонентов мембраны эритроцитов, влияющих на её деформируемость у лиц разных возрастных групп.

3. Установить влияние деформируемости мембраны эритроцитов на состояние регионарного кровотока и кислородное обеспечение тканей у лиц

разных возрастных групп.

4. Оценить влияние гипоксии и температуры на деформируемость эритроцитов и регионарный кровоток у лиц разных возрастных групп.

Научная новизна. Получены новые данные о состоянии мембран эритроцитов и их способности к деформации у лиц разных возрастных групп. Исследованы показатели, характеризующие состояние как липидной, так и белковой компонент мембран эритроцитов у лиц разных возрастных групп.

Выявлены качественные и количественные различия в белковой части мембран эритроцитов у лиц разных возрастных групп. Установлено, что у лиц старше 50 лет в мембранах эритроцитов возрастает процентное содержание спектрина, увеличивающего естественную «жесткость» красных клеток крови. Получены новые данные о взаимосвязи между состоянием мембран

эритроцитов и параметрами регионарного кровотока.

Установлено, что гипоксия и изменение температуры влияют на состояние мембран эритроцитов и характеристики регионарного кровотока в зависимости от возраста.

Практическая значимость работы. Изучение фракционной структуры эритроцитов может использоваться при оценке качества эритроцитарной массы и донорской крови, для проверки ее годности на фоне хранения и оценки состояния мембран красных клеток крови.

Возрастные структурно-функциональные особенности эритроцитов следует учитывать при коррекции состояний на фоне гипоксии и гипертермии.

Методика определения деформируемости эритроцитарных мембран, метод отмывки и хранения эритроцитов используются в работе клинико-диагностической лаборатории многопрофильного лечебно-диагностического комплекса «МедГард».

Выявленные тенденции в изменении деформируемости мембран эритроцитов на фоне старения человека используются в курсе преподавания нормальной физиологии в разделе «Кровь» у студентов лечебного, стоматологического факультетов Самарского медицинского института «РЕАВИЗ».

Положения, выносимые на защиту:

1. В периферической крови людей содержатся эритроциты с различной способностью к деформации, которая зависит от возраста и оказывает влияние на характер регионарного кровотока.

2. Возрастные особенности мембран эритроцитов связаны с изменением вязкости липидного бислоя, содержанием скелетных белков, которые определяют степень деформируемости эритроцитов.

3. Гипоксия, снижение рН и изменение температуры влияют на деформируемость мембран эритроцитов и характеристики регионарного кровотока в зависимости от возраста.

Личный вклад автора в проведенное исследование и результаты, полученные совместно с другими исследователями. Все экспериментальные результаты исследования были проведены лично. Постановка цели и задач исследования, а также обсуждение экспериментальных результатов проведены под руководством д.м.н., профессора Зарубиной Е.Г.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на XXXV международной научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии» (Харьков, 2011), на научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в лазерной медицине» (Москва, 2011), ежегодной Российской Научно-практической конференции «Наука. Образование. Медицина» (Самара, 2011), на международной научно-практической конференции «Применение лазеров в медицине и биологии» (Судак, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, 3 из них по

списку ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследований, главы данных собственных исследований и обсуждения результатов, выводов, списка литературы. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 рисунками, содержит 15 таблиц. В работе использовано 211 литературных источника, из них 144 отечественных и 67 зарубежных.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Современные представления о структуре и функции эритроцитов, строении их мембран

Эритроцит (Э) является самой многочисленной и наиболее дифференцированной клеткой организма человека и млекопитающих животных. В организме млекопитающих это единственная безъядерная клетка, в цитоплазме которой присутствует белок гемоглобин (95% массы Э), обеспечивающий транспорт кислорода и обратный перенос углекислого газа [9,17,80].

Вследствие того, что Э не содержат ядра, они не способны к самовоспроизведению и репарации возникающих в них повреждений. Эти клетки циркулируют в крови около 120 дней. При достижении возраста 4 месяца Э становятся хрупкими, ломкими и подвергаются разрушению макрофагами в печени, селезенке и костном мозге [157]. Железо отделяется от гемоглобина и хранится как ферритин в селезенке для повторного использования в синтезе гемоглобина. Остаток гема молекулы гемоглобина связывается с альбумином и транспортируется в печень, где частично подвергается деградации, конъюгации и экскретируется через желчные протоки и желчный пузырь, как билирубин желчи [9,17].

На первой фазе развития и дифференцировки Э - ретикулоцита, несмотря на более крупные размеры этих клеток, они не несут полной нагрузки гемоглобина. Созревание завершается за 1-3 дня, в течение которых клетки выполняют безотказно функцию переноса кислорода. На второй фазе, зрелого Э, полностью выполняющего свою функцию, он переносит кислород в одном направлении, а углекислоту - в обратном. На третьей фазе, дефицитного Э с уменьшенной эффективностью, по причине сокращения процессов обмена веществ их утилизируют макрофаги, тем самым открывая путь молодым клеткам, вступающим в функциональный цикл [9].

Основную массу Э в периферической крови человека составляют

дискоциты (около 90%). Дискоциты имеют форму двояковогнутого диска [56,112]. Ранее считалось, что плоский диск лучше приспособлен к транспорту веществ из клетки и внутрь ее и к диффузии газов к центру клетки [50]. В настоящее время доказано, что двояковогнутая форма обладает незначительными диффузионными преимуществами. Но, объем, соответствующий диску, имеет в 1,7 раза большую поверхность, чем такой же объем, соответствующий сфере, и может изменяться без растяжения мембраны клетки [13,17,139].

Э имеет толщину 2,1 мкм, объем - 85-90 мкм3, площадь поверхности -145 мкм . Такое соотношение площади к объему способствует деформабильности Э при их прохождении через капилляры, не меняя своего объема и площади поверхности, что поддерживает процессы диффузии газов на высоком уровне на протяжении всего микроциркуляторного русла различных органов. При высокой деформируемости красных клеток крови происходит максимальный перенос кислорода в клетки, а при ухудшении деформируемости (повышении «жесткости») - поступление кислорода в клетки резко снижается [48,50].

Двояковогнутая форма Э, эластичность, деформируемость и сохранение структуры клетки при удалении из нее гемоглобина, когда остается так называемая тень Э, зависят от особенностей его строения, прежде всего скелета клетки. В состав оболочки Э входят 49% белков, 43% жиров и 8% углеводов [9]. Мембрана Э полупроницаемая, состоит из трех слоев. Наружный слой образован гликокаликсом, средний - липидным бислоем, внутренний слой -сетью белков, называемой цитоскелетом [6,28].

Мембрана представляет собой динамическую структуру. Наиболее подвижным компонентом в ней являются липиды. Они довольно свободно двигаются в плоскости липидного слоя (латеральное перемещение), меняя своих «соседей» в среднем 106 раз /сек. Молекулы белков также могут перемещаться латерально в плоскости мембраны. Возможно также, что белковые молекулы вращаются вокруг перпендикулярных и параллельных

плоскости бислоя осей, что может иметь большое значение при функционировании макромолекул и мембран в целом [6].

Поверхность Э отграничена оболочкой, представленной как результат сочетания и уплотнения тенсиоактивных гликопротеидных веществ и составляющей селективный барьер, в котором осуществляются обмены между клеткой и окружающей средой. Наружная мембрана Э, хотя отличается от плазматических мембран других клеток, тем не менее выполняет специфические функции, обеспечивая включение Э в функциональное единство организма. Она принимает непосредственное участие в непрерывном обмене водой, электролитами и метаболитами - с одной стороны, между Э и плазмой крови, а с другой - между интерстициальной жидкостью и остальными клетками [9].

В начале 70-х годов при исследовании механических свойств мембран Э было обнаружено, что после разрушения мембраны, вызванного экстракцией липидов неионными детергентами, остается плотная ячеистая структура, сохраняющая форму Э [17,53]. Эта структура получила название примембранного цитоскелета. Электронно-микроскопические исследования показали, что примембранный цитоскелет представляет собой правильную двумерную сеть, образованную гибкими протяженными молекулами длиной около 200 нм, которые соединены вершинами с образованием пента- или гексагональных ячеек [4,6,156,170,206].

Основой мембраны Э является липидный бислой, пронизанный интегральными белками цитоскелета. Среди липидов мембраны выделяют: фосфолипиды (глицерофосфолипиды, сфинголипиды, фосфотидил-этаноламин, фосфатидилсерин и др.); гликолипиды; холестерин [49,53,67,168].

Липидный бислой содержит примерно равные количества холестерина и фосфолипидов. Относительное содержание холестерина играет существенную роль, изменяя физико-химические и физиологически значимые свойства мембраны Э [189]. Фосфолипиды представлены, в основном, сфингомиелином (25%), фосфатидилхолином (28%), фосфатидилэтаноламином (26%) и фосфатидилсерином (13%). Кроме того, имеется около 2% фосфатидиловой

кислоты, 1% фосфатидилинозитола и 1% лизофосфатидилхолина. [4,17,83,100,189]. Фосфолипиды расположены в мембране асимметрично: в наружном слое преобладают сфингомиелин (более 85%) и фосфатидилхолин (65-75%), а во внутреннем - фосфатидилэтаноламин (80-85%) и фосфатидилсерин (более 96%) [46, 211].

Методом электрофореза в мембране Э обнаруживают около 15 основных мембранных белков с молекулярной массой от 15 до 250 кДа. В связи со способом расположения макромолекул в мембране эритроцита белки подразделяют на периферические (внутренние) и интегральные. Интегральные удерживаются в мембране. В их состав входят гликопротеины и протеолипиды. Функции интегральных белков разнообразны: они могут выступать в роли гидролитических ферментов, рецепторов клеточной поверхности, окислительно-восстановительных компонентов транспортной системы электронов и в качестве специфических белков входит в состав цитоскелета, который представляет собой двумерную сеть, соединенную непосредственно с мембраной эритроцита через взаимодействие с интегральными белками. Также к периферическим белкам относится ряд эритроцитарных ферментов [17].

Около 60% массы мембранных белков приходится на спектрин, гликофорин и белок полосы 3 (называется так по расположению этой белковой фракции на электрофореграмме относительно других белков) [148] .

Один из важнейших белков оболочки - это гликофорин. С внешней стороны к гликофорину присоединяются олигосахаридные группы (в осн