Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Светоиндуцированный структурный переход в мембранах тилакоидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Светоиндуцированный структурный переход в мембранах тилакоидов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Р £ 0 д ИМ. М.ВЛОМОНОСОВА

1 3 МАЙ Шо

на правах рукописи

Туган-Барановская Айша Джучиевна

СВЕТОИНДУЦИРОВАННЫЙ СТРУКТУРНЫЙ ПЕРЕХОД В МЕМБРАНАХ ТИЛАКОИДОВ

(03.00.04-биохимия)

автореферат диссертащш на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ Физико-Химической Биологии имени А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова и в Лаборатории Нейтрошюй Физики им. И.М.Франка Объединенного Института Ядерных Исследований (гДубна).

Наун1ше руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник, профессор Ягужинский Л.С., кандидат физико-матсматичсских наук, старший научный сотрудник Горделий В.И.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Василенко И.А., доктор физико-математических наук, профессор Тихонов А.Н.

Ведущая организация: Институт Теоретической и Экспериментальной биофизики РАН.

Защита диссертации состоится "" У/СМЯ_ 1996 г. в _часов на

заседании специализированного совета Д.053.05.032 по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

МГУ.

Автореферат разослан "_"_ 1996 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, кандидат биологических наук

М.В.Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В растительных мембранах помимо огромного количества разнообразных процессов, протекающих в них, особое место занимают процессы фотосинтеза. Фотосинтез является одним из самых фундаментальных биохимических процессов, в силу того, что свет - это основной первичный источник энергии для всех биологических систем.

Процессы фотосинтеза изучаются очень давно, однако, существует много нерешенных вопросов, связанных с функционированием и строением крупных, полиферментных комплексов. Относительно недавно обнаружено явление функционального полиморфизма митохондрий и хлоропластов. Рядом авторов показано, что под влиянием внешних воздействий можно качественно изменять работу полиферментных систем. Получены указания на то, что функциональные изменения сопровождаются конкретными структурными перестройками в мембранах митохондрий и тилакоидов. В этой связи с особой остротой ставится вопрос о возможных изменениях структуры мембран митохондрий и хлоропластов. Вопрос о природе структурных перестроек сопрягающих мембран, в частности мембран хлоропластов, пока остается открытым. Электронная микроскопия, ядерный магнитный резонанс обладают ограниченными возможностями.

Наиболее прямым методом изучения структуры отдельных молекул и относительно крупных макромолекулярных комплексов является дифракция рентгеновских лучей и нейтронов [1]. Дня исследования структуры некристаллических мембранных систем в водных суспензиях удобно использовать метод малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН), который начал применяться для этих целей примерно с 1976.

Волновые свойства нейтронов особенно удобны для изучения таких объектов как мембраны тилакоидов и митохондрий. Важнейшей особенностью малоуглового рассеяния является возможность анализа внутренней структуры разупорядоченных систем. Его применение часто оказывается единственным способом получения прямой информации о структуре систем с хаотическим расположением неоднородностей

порядка ДО"7-КГ4 см. Количество и качество подобной информации резко возрастает при направленном дейтерировании образцов.

Цель настоящей работы состоит в том, чтобы

1) показать возможности использования МУРН для определения структурных параметров мембран тилакоидов;

2) исследовать влияние освещения на структуру мембран отдельных тилакоидов.

Кроме того, целью исследования является изучение влияния освещения на структуру мембран тилакоидов в гранах.

Научная новизна. Впервые проведено структурное исследование одиночной мембраны тилакоида при освещении методом малоуглового рассеяния нейтронов. Впервые зафиксирована долгоживущая перестройка темповой мембраны при освещении, которая проанализирована в соответствии с двумя моделями.

Практическая важность работы. Выполненная работа имеет важное практическое значение. Разработаны новые экспериментальные подходы для структурных исследований фотосинтезируюших мембранных систем. Разработан метод получения стандартных образцов тилакоидных мембран, которые дают хорошо воспроизводимую картину рассеяния

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на семинарах института Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, на семинарах Лаборатории Нейтронной Физики им. И.М.Франка (Дубна, Россия), на международной конференции "Вюепег§ейс" (Москва, Россия, декабрь 1995 год). Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 работы. Объем работы. Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, выводов, заключения и списка используемой литературы. Она содержит 118 страниц текста, включающего 19 рисунков, 15 таблиц и список литературы из 151 наименования. По теме работы выполнено три публикации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обосновывается актуальность работы, сформулированы основные задачи исследования и дается краткое описание работы по главам.

Глава I "Полиморфизм биологических мембран" носит вводный характер. В ней приводится обзор литературных данных, посвященных поиску связи между структурой и функцией в биологических мембранах. Кроме того, настоящий обзор литературных данных ставит своей целью дать перечень основных направлений изучения структуры крупных белковых комплексов и сложных мембранных биологических систем в первую очередь рентген- и нейтроноструктурными методами [2 ,3 ,4].

В Главе П "Материалы и методы", разделе 1 изложены основные принципы малоуглового рассеяния нейтронов [5] и его приложение к исследованию мембранных систем. Описаны подходы к определению структурных параметров мембран.

В разделе 2 приведена методика приготовления биологических мембран. Отмечены особенности определения концентрации белка и липида для нейтронных исследований, а также приготовление дейтерированных образцов тилакоидных мембран. Описан процесс освещения мембран тилакоидов, а также процесс выделения гран тилакоидных мембран.

В Главе III "Изменения толщины мембран тилакоидов, зависящие от условий выделения" разработан метод выделения стандартных образцов мембран темповых тилакоидов. Прежде чем приступить к изучению зависимости структуры тилакоидных мембран от их функционального состояния необходимо было разработать методические подходы к решению поставленной задачи. Анализируя литературные данные, было показано большое различие в значении толщины тилакоидной мембраны (толщина варьировалась в пределах от 50-100 А) [6, 7, 8]. Мы предположили, что одной из возможных причин такого расхождения может быть различие в методиках приготовления образцов мембран тилакоидов.

В данной главе мы попытались установить причину разброса данных по значению толщины мембраны тилакоида в работах разных авторов. Для этого мы направленно изменяли толщину тилахоидных мембран: исследования проводились на обычных образцах, а также на образцах, которые подвергались нескольким дополнительным отмывкам средой выделения. При этом было показано, что толщина стандартных образцов составляет 75 А, а после дополнительных промывок снижается до 50 А.

В данной главе измерены экспериментальные зависимости рассеяния тепловых нейтронов на тилакоидных мембранах в растворе с концентрацией 2% белка в растворе БгО от вектора рассеяния ((2=4тшп(0/>.), где 0-половина угла рассеяния, а Х-длина волны нейтронов).

Интенсивность малоуглового рассеяния на таких структурах, как мембраны, может быть описана аппроксимацией Гинье [9]:

нв)=а* (1)

где 2"2-Лорентц-фактор. Для мембран, у которых Т намного меньше двух других измерений. 1т на интервале 2гс/5ш<(2<1/К,, описывается формулой [10] :

ЫЯ)=1тоехр1-Я,2^1 (2)

где 5-площадь мембраны, йградиус инерции толщины мембраны, интенсивность рассеяния в нулевой угол равна ¡то [5]:

Ы^йп-р,)2 Г^, (3)

где пш-количсство рассеивающих центров, рш-средпяя плотность амплитуды рассеяния мембраны, р^плотность рассеяния растворителя (буфера). Радиус инерции толщины мембраны & равен [5]:

2 _ |(р.

^ ~ ' И)

где х-координата в направлении нормали плоскости мембраны. Следуя работе [10], можно показать, что (4) преобразуется в

„, Р. Т*

Л,--(5)

1- —

где Ии -радиус инерции толщины мембраны в "нулевом" растворителе (р8=0).

Все параметры в уравнении (5), кроме р£, являются константами и зависят только от мембраны. Мы предполагаем здесь также, что все параметры мембраны, например, рга, не зависят (или слабо зависят) от изотопного замещения НгО на БгО. Параметр р5 полностью зависит от буфера и изменяется в широких пределах при замене 1ЬО на ОгО.

Для всех образцов по экспериментальным данным в соответствующем интервале О, строилась зависимость 1п(1(32) от О2. По наклону прямой,

экстраполирующей эту зависимость, определяли радиус инерции толщины мембраны,

той прямой с ось 1) на интервале (3-10"4 А"2до 10"3 А"2).

а по пересечению этой прямой с осью ординат 1п(Щ2) определяли значение 1то (Рис

0 0000 0 0002 0 00(14 0 ОООв 0 0009 0 0010

Рис. 1. Экспериментальные зависимости 1п(1С)2) от О2 "неотмытых" мембран тилакоидов (р-

дейтерированные (полученные путем инкубации в темноте в среде на БгО в течение 14 часов при 0°С)), -I-протонированные (полученные путем инкубации в темноте в среде на НгО в течение 14 часов при 0°С)).

Измерения с образцами без отмывки в НгО и ОгО дали следующие результаты: НгО: {{,=24.6*6 А; 1(ОМ5.08±1.1Н05 см"1 020: Е,=21.7±0.5 А; 1(0)=[2.8б±0.04]-10"4 см"1 Видно, что радиусы инерции толщины мембраны в НгО и ОгО в пределах ошибок измерений совпадают. Из формул (4) и (5) следует, что такое совпадение

радиусов инерции толщины мембраны в столь разных растворителях (в ШО р5=-0.0042-10"12см/А3, а в 020 р5=0.063-10"12см/А3 ) возможно только в случае достаточно однородного распределения плотности амплитуды рассеяния по мембране.

Необходимо отметить, что плотности рассеяния растворителя (р*) в НгО и ОгО получены с учетом вклада сахарозы, триса и трицина, входящих в состав буфера.

В это^л случае для определения толщины мембраны можно пользоваться формулой, приведенной в работе [5]:

Г = Д,-Л2 (б)

Таким образом, подставляя в (б) значение II, для тилакоидной мембраны без "отмывок" в ОгО, ато наиболее точно измеренное значение, получаем Т»75£2 А.

Далее из (2) получаем:

Рд ~Р«.рго _ I ^торю

Рт~ Рямго ^^Тонго

что позволяет определить среднюю плотность амплитуды рассеяния мембраны рш. Подставляя в (7) экспериментальное значение 1(0) и вычисленное значение р8 (состав буфера известен), получаем рш=0.0157'10"12см/А3.

То, что рт <р!,ою, является еще одним аргументом в пользу того, что (6) дает хорошую оценку толщины мембраны [10].

Вычисленное выше значение рт позволяет оценить объемные соотношения белков и липидов в тилакоидных мембранах. Из формулы

Рт =А ^ =А(1-Уг)+рЛГг (8)

где ^.-средняя плотность рассеяния нейтронов для липидов, /^-средняя плотность рассеяния нейтронов для белков, ^-парциальный объем липида в мембране, Уг-парциальный объем белка в мембране, N^+N^,=1, легко получить:

у = Р.~Ре ^ (9)

Подставляя значения ръ=0.00710'12см/А3, рр=0.02-10"12см/А3 [5, 10], получаем Уь=0.3, Ур=0.7. Полученные значения парциальных объемов, близки к тому, что было ранее определено У[.=0.4, Уг=0.6 в работе [11].

Малоугловые нейтронные измерения с "отмытыми" образцами тилакоидных мембран проводились в разных контрастах: ЮО%НгО, 509Ш20, 607сТ>гО, 15%Т>20,

юо%т>2о.

Затем по графику зависимости (ДО))1'2 от р8, определяли значение рт=0.011ЫО-12см/А3 и по формуле (б) находили толщину мембраны Т=50 А (рисунок 2). Проделав те же самые вычисления для соотношения белков и липидов (9), получим, что У^О.7, У,=0.3.

р, 1013 сг^'А5

Рис 2.

Определение рассеивающей плотности мембраны рт для протонированных "отмытых" мембран тилакоидов ( (ДО))1'2 от р5).

Таким образом, так как парциальные объемы белков и липидов в процессе отмывки уменьшаются, то можно предположить, что в процессе "отмывки" от мембраны отрывается слой нелипидиых мембранных компонентов, по-видимому, прежде всего, периферических белков [12 ,13].

Результаты этих исследований показывают сильную зависимость радиуса инерции от контраста от (р5). Это также подтверждает наше предположение о том, что в результате различных приготовлений образцов мембран тилакоидов состав мембраны изменяется

Проведенное выше изучение изменения толщины мембраны в зависимости от условий выделения позволяет сделать заключение о необходимости стандартизации образцов для малоуглового рассеяния нейтронов.

Мы определяем стандартный образец, как образец для изучения структуры мембраны методом малоуглового рассеяния нейтронов, долгоживущую мембрану

тилаконда, приготовленную по описанному выше методу. Эта мембрана имеет минимальную толщину, и включает в себя липидный бислой с прочно связанными белками и с минимальным количеством поверхностных белков. Таким стандартным образцом мы будем называть и использовать далее в исслсдованиях-"отмытую" мембрану тилакоида, имеющую толщину Т=50 А и рт=О.ОПМО"12 см/ А3. Дальнейшие исследования структуры и свойств тилакоидной мембраны в различных функциональных состояниях сделаны на этом образце.

В Главе IV "Интерпретация экспериментальных данных, полученных методом малоуглового рассеяния нейтронов, для темповых и освещенных мембран тилакоидов" проведено исследование влияния освещения на структуру мембран отдельных тилакоидов. Исследования структуры фотосинтезирующих мембран и характера сс фотоиндуцированных изменений весьма актуальны для понимания темповой и световой стадий фотосинтеза. Литературных данных по исследованию эффекта освещения на структуру темповой мембраны тилакоида ранее не было. Однако, подобное исследование на фоторецепторных дисках мембран лягушки методом малоугловой рентгеновской дифракции было проведено в институте Кристаллографии в 1981 [14]. Было показано, что ламеллярная структура фоторецепторного диска изменяется только при световом повреждении. Интенсивности рефлексов светоповрежденной сетчатки указывают на иной профиль электронной плотности и соответственно на другую структуру фоторецепторного диска. Световое повреждение приводило к существенным изменениям фоторецепторного диска, которое прогрессировало с увеличением степени светового воздействия. Профиль электронной плотности световой мембраны становился шире и асимметричнее. Предполагается, что эти нарушения связаны с выдвижением родопсина в цитоплазматическую часть диска фоторсцепторной мембраны [14].

Нами была поставлена задача установить влияние освещения на структуру тилакоидных мембран. Для решения этой задачи проведено сравнительное нейтроносгруктурное исследование фотосинтезирующих мембран тилакоидов в трех состояниях:

1. в темновом состоянии (нротонированные и дейтерированные мембраны выдерживались в темноте окаю 14 часов соответственно в НгО или ЭгО соответственно).

2. в освещенном состоянии (нротонированные и дейтерированные мембраны освещались в течение 25 минут при температуре 0° С соответственно в НгО или 020).

3. при освещении в присутствии субстратов фосфорилирования (протонированные и дейтерированные мембраны были освещены в течение 25 минут при 0° С в среде инкубации (НгО ДОгО)) в присутствии АДФ 2 мМ и ИагНАзСи 3 мМ).

Предварительный анализ данных по малоугловому рассеянию нейтронов на мембранах темновых тилакоидов, а также на мембранах тилахоидов после освещения был проведен стандартным образом. Результаты экспериментов показали, что освещение индуцировало качественные изменения в структуре мембраны тилакоида. Для выявления характера этих изменений результаты (кривые малоуглового рассеяния нейтронов) обрабатывались, предполагая следующие изменения в структуре мембраны тилакоида:

Структурная топологическая перестройка. Эффект освещения рассматривается как структурная перестройка темповой мембраны тилакоида, в результате которой экспериментальные данные не могут быть описаны в рамках ламеллярной мембраны, но достоверно могут быть описаны в рамках модели длинных цилиндров.

Изменения структуры ламеллярной мембраны в результате перераспределения ее компонентов. Эта модель предполагает, что под действием света происходит перераспределение плотности рассеяния по толщине ламеллярной мембраны (вероятно за счет перераспределения белка). На поверхности плотность рассеяния становится выше чем у центральной части мембраны. Обсуждаются две модели структуры мембраны качественно соответствующие экспериментальным данным.

В модели структурной топологической перестройки экспериментальные данные были проанализированы дополнительно, кроме модели ламеллярной структуры в модели вытянутых плоских цилиндров [5] и в модели сферической симметрии [9]. Для достоверности, такой же процедуре обработки подвергались данные по темповым мембранам тилакоидов.

Согласно выше приведенным данным, для темновых мембран экспериментальные данные обрабатываются как [5] :

Ш = /,(0)ехр(--?Х) => Т=К,4\2 (10)

Иградиус инерции толщины мембраны тилакоида, получаемый из графика 1п|д21^)] от я2, (рис. За), Т-толщина мембраны тилакоида. Темновыс мембраны были также обработаны в моделях длинных цилиндров и шаров (рисунок ЗЬ и Зс).

При исследовании освсшснных мембран оказалось, что ламеллярная модель не работает. Экспериментальные данные были обработаны в предположении, что освещение вызывает топологическую перестройку, при которой ламеллярная структура мембраны исчезает. Обработка экспериментальных данных проведена в соответствии с уравнениями, которые применимы для описания цилиндрических объектов.

Цд^Ц'1 Ш (11)

где ¿-длина цилиндра, а /сС^-интенсивность рассеяния, обусловленная структурой частицы в поперечном сечении. Цц) определяется как:

Ш = Ш™Р(-?Ч2/2) => </ = 2Д,Л (12)

радиус инерции поперечного сечения цилиндра, из рафика 1п[ц1(ч)] от q2, (рис. 4а), с1-диаметр поперечного сечения цилиндра [5].

Согласно [5], в модели шаров, данные обрабатываются как

',(<?)= /,(0)ехР(-^ /3) => г = (5.1.4)

радиус инерции шара, определяется из графика от q , (рис. 5) г-радиус шара.

Рис. 3. Данные, обработанные в модели тарной структуры, а) темновые мембраны, рированпые (мембраны, полученные путем лыгой инкубации в течении 14 часов в 100 % Г^О), отонированные (мембраны, полученные путем льной инкубации в течении 14 часов в ЩО); Ь) ценные мембраны, ■-дейтерировашше (свеже 1енные тилахоиды помещались в среду интубации на и освешались в течении 25 минут при 0е С), жированные (свеже выделенные тнлакоиды шались в среду инкубации на НгО и освещались в гин 25 минут при 0" С); с) освещенные в присутствии -ратов фосфорнлирования. А-дейтергтрованные :е выделенные тилахоиды помещались в среду бации на Е>гО плюс АДФ 2 мМ и На2НМО< 3 мМ, а I освещались в течении 25 минут при 0° С), Д-оиированные (свеже выделенные тилахоиды щались в среду инкубации на НгО плюс АДФ 2 мМ и с [АбОд 3 мМ, а затем освещались в течении 25 минут Г С). _ "

Рис. 4. Данные, обработанные в модели длинных ов. а) темновые мембраны, •-дейтерироваиные, нировшшые; Ь) освещенные мембраны, »ванные, □-протоиированные; с) освещенные в ■вии субстратов фосфоршшровани*. А-ю ванные, Д-протонировапные. Подробные см. рис. 1 и главу П- Приготовление образцов.

4*0« Ш А** *т» им и*м

• Ш.|дМ

• ртм*

. ... - - -1 ■ -

£ -41 -414 . я а А вьл и и ■ а ■ о " 1- ■ ■ Ч- ■■ " к

Рис. 5. Данные, обработанные в модели шаров, а) темповые мембраны, •-дейтерироваиные, О-протонированные; Ь) освещенные мембраны, Ш-дейтерированные, □-протоиировашше; с) освещенные в присутствии субстратов фосфоршшрованга. А-дейтерировавные, Д-протонироваяные.

Мм 1ИН ыга

11

А МиСфОи

* «««.ЦЧш

им мем

«ЛвЖ им

ч".А*

Выбор адекватной модели для освещенных мембран тилакоидов проводился по критерию х2, кроме того, нами были выбраны те модели строения тилакоида, при которых значение Кг2 было положительно.

На основании полученных данных для темновых мембран тилакоидов единственно правильной, как и предполагалось, оказалась ламеялярная модель. Для освещенных мембран в присутствии и для мембран, освещенных в отсутствии субстратов фосфорилирования, с точки зрения значения х2> наиболее предпочтительной является модель длинных цилиндров. Модель сферической симметрии оказалась не подходящей ни в том, ни в другом случае.

Таким образом, дашгые по малоугловому рассеянию нейтронов показывают, что освещение мембраны тилакоида приводит к существенной структурной перестройке липидного комплекса. Малоугловое рассеяние нейтронов в этом случае уже не описывается в рамках модели ламеллярной структуры. Рассеяние нейтронов свидетельствует о том, что структура мембран качественно изменяется при освещении. Мембраны при этом могут быть описаны в модели цилиндров, уравнение (12). Диаметры поперечного сечения таких цилиндров, посчитанные для тилакоидов, освещенных в отсутствии и в присутствии субстратов, составляют приблизительно

<1=80-120 А.

В модели перераспределения плотности рассеяния по толщине мембраны при . освещении анализ экспериментальных, результатов проводился в рамках ламеллярной мембраны. Но при этом сделано дополнительное предположение о том, что под действием света происходит перераспределение рассеивающей плотности: по толщине мембраны (вероятно за счет перераспределения белка). В этом варианте возможны два случая перераспределения рассеивающей плотности:

a) когда рассеивающая плотность в центре мембраны выше чем на поверхности;

b) когда рассеивающая плотность на поверхности мембраны больше чем в центре мембраны.

Показано, что изменение знака угла наклона в экспериментально полученной зависимости 1п (Щ2) от ОТ при переходе от темновых к световым мембранам должно сопровождаться перераспределением рассеивающей плотности по толщине мембраны. Качественно сходная ситуация рассматривается в статье Садлера и Вустера [б], положительный наклон наблюдался там при варьировании контраста растворителя, в средах с высоким содержанием НгО появлялся отрицательный

Рассмотрим зависимость радиуса инерции от соотношения рассеивающей плотности мембраны и растворителя [5]:

Д? = % - % 4 ¿V (14)

Ар (Ар)2

где ^-измеренный радиус инерции частицы, Ис-радиус инерции области в случае

однородности плотности внутри нее, Яр-радиус инерции области в частице

недоступной проникновению растворителя (то есть радиус инерции в "нулевом"

растворителе, при р8=0), Ьш-длина когерентного рассеяния мембраны, Др=рт-р5. Ь-

расстояние между центром тяжести рассеивающей плотности частицы и ее центром

инерции. Рассмотрим случай-Ь=0 симметричная частица, но Ир.

Существует область, в которой принимает отрицательные значения. То

есть,

Я,2 <0=>ЯС2 +^-(П2-1$)<0 (15)

Ар

Ъ 1

Так как —— =-;—гг~. то можно записать:

V i_A.fl К К

'-т.'тгк-

а) Рассмотрим случай, когда рассеивающая плотность частицы

сосредоточена в центре. Тогда, если обозначить —у-5—-а, то получим, что а> 1,

К -к,

отсюда имеем: :£ 1 - а, а так как 1-а<0, то Рш

— < 1 -а<0 (17)

Рш

Эго возможно только тогда, когда либо р5<0, а рш>0. Или в случае, когда р8>0, а Рт<0.

Рассмотрим случай

р,<0, арт>0, (18)

это предположение отпадает сразу, так как в качестве растворителя использовалась среда на ОгО, с рассеивающей плотностью р2,шо=0.0б3• 10"12см"1 /А3. Очевидно, что

р8,ШЗ>0.

Рассмотрим другой случай

р,Х), а рт<0 (19)

Отсюда следует, что рассеивающая плотность мембраны должна принимать отрицательные значения. Поскольку в экспериментах использовались два типа мембран-нротонированные и дейтерироваиные, то необходимо рассмотреть оба варианта.

Протонированная мембрана. Плотность рассеяния "отмьггой" протонированной составляет Рт,ргм=0.011 М0"12см"1/А3, детальный расчет приведен в главе Ш. Видно, что для случая протонированной отмытой мембраны получается Рт.рпнХ), (19) не выполняется.

Дейтерирозанная мембрана. Совершенно естественно, что для дейтерированной мембраны Рт,<кш>0. Следовательно, вариант дейтерированной мембраны для случая р5>0, а рт<0 не выполняется.

Таким образом, случай то есть, когда максимум плотности рассеяния

располагается внутри мембраны и в качестве растворителя выступает ИгО, оказывается не пригодным для интерпретации экспериментальных данных для протонированной и для дейтерированной мембран.

Ь) В случае расположения максимумов рассеивающей плотности на

поверхностях мембраны: Кс2<КР2. Тогда, если ———- - а, то а<0, получим

Рт

а поскольку, а принимает отрицательные значения, условие (20) будет выполняться во всех случаях, кроме того, когда либо плотность рассеяния мембраны имеет отрицательное значение, а плотность рассеяния растворителя положительное (р8>0, а рт<0), либо когда плотность рассеяния растворителя имеет отрицательное значение (рассеяние в Н2О), а плотность рассеяния мембраны положительное (р5<0, а рт>0). То есть кроме выше рассмотренных случаев.

Таким образом, видно, что в частном случае, когда максимумы рассеивающей плотности сосредоточены на поверхностях ламеллярной мембраны, модель перераспределения плотности рассеяния по толщине мембраны, соответствует экспериментальным данным, полученным на дейтерированных и протонированных образцах тнлакоидов после их освещения. Она также как и модель цилиндров дает правильное качественное описание картины рассеяния и объясняет появление отрицательного значения радиуса инерции Л^ при переходе от темновых к световым мембранам в присутствии и в отсутствии субстратов фосфорилирования.

Ранее для объяснения экспериментально наблюдаемого рассеяния нейтронов на освещенных мембранах тнлакоидов, мы предполагали, что Ь=0. То есть предполагалась симметричность мембраны. Однако, хорошо известно, что, как правило, биологическая мембрана асимметрична, то есть Как легко

видеть из выражения (14) асимметричность мембраны не противоречит выводу, что смещение рассеивающей плотности к краям мембраны может привести к изменению знака Кг. Более того, само увеличение асимметрии может привести к такому же эффекту.

Таким образом, возможно при освещении тилакоидной мембраны происходит изменение ее структуры, в том числе увеличение асимметрии.

Выше мы также обсуждали, что топологическая перестройка ламелла-цилиндр тилакоидной мембраны при освещении могла бы также объяснить экспериментальные данные. Однако совокупность, имеющейся в литературе информации о тилакоидных мембранах скорее свидетельствует в пользу следующей модели: в тилакоидной мембране при освещении скорее происходит латеральное перераспределение (разделение) ее компонентов, имеющих высокий

рассеивающий контраст по отношению к БгО (то есть низкую рассеивающую плотность) образует квазицилиндрическую структуру в ламеллярной мембране. Низкую рассеивающую плотность обычно имеют липиды. Как известно [15], образование липидами цилиндрических структур (топологическая перестройка липидного бислоя) может происходить при различных изменениях в окружающей среде, например, повышение-понижение температуры, изменение солевого состава среды и.д. Возможно также что квазицилиндр состоит из белков с низкой рассеивающей плотностью.

Необходимо отметить, что выше приведенные модели очевидно дополняют друг друга и описывают разные стороны одной перестройки.

Таким образом, результаты нашей работы показывают, что при действии света на мембраны тилакоидов в отсутствии и в присутствии субстратов фосфорилирования происходит изменение структуры темповой мембраны. В результате чего тилакоид становиться невозможно описывать в рамках традиционной модели ламеллярной мембраны с равномерным распределением рассеивающей плотности. Для выяснения того какие именно изменения происходят при освещении мембраны тилакоида были рассмотрены различные возможные причины.

Предложены две модели для интерпретации экспериментальных данных для освещенных мембран тилакоидов: модель топологической структурной перестройки и модель перераспределения рассеивающей плотности по толщине мембраны.

Представляется вероятным, что увеличение рассеивающей плотности вблизи поверхностей мембраны тилакоидов является следствием формирования квазицилиндрических структур под действием света.

В Главе V "Малоугловое расссяпис нейтронов на тилакоидных гранах" проведено исследование водной суспензии неориентированных тилакоидных гран методом.малоуглового рассеяния нейтронов.

Кардинальных изменений структуры при освещении гран не зафиксировано. Это обстоятельство хорошо соотносится с литературными данными по электронной микроскопии освещенных и неосвещенных хлоропластов [16] и может быть объяснено большей структурной стабильностью гран при освещении по сравнению с отдельными тилакоидами.

Выводы

1. Впервые проведено измерение толщины мембраны очищенной фракции тилакоидов методом малоуглового рассеяния нейтронов. Разработан метод получения стандартных образцов мембран тилакоидов. Установлена причина наблюдаемых в литературе существенных различий значений толщины тилакоидной мембраны.

2. Впервые обнаружены изменения структуры темновой мембраны тилакоида, индуцированные продолжительным действием света. Данные, полученные на освещенных мембранах тилакоидов проанализированы в соответствии с моделью структурной топологической перестройки и моделью ламеллярной структуры мембраны тилакоида. Высказано предположение о том, что обе модели дополняют друг друга - они выявляют две качественно различные стороны одной структурной перестройки.

3. На основе проведенного анализа данных сделан вывод о том, что перестройка включает образование квазицилиндрических структур в мембране, в процессе формирования которых происходит увеличение рассеивающей плотности вблизи поверхностей тилакоидных мембран.

4. Проведено исследование эффекта освещения на тилакоидные граны. „ _ нет _ Показано, что принципиальных изменении при освещении^ Это хорошо

согласуется с исследованиями влияния освещения на тилакоидные граны методом

электронной микроскопии [15].

Цитируемая литература.

1. Zaccai G., Topics in Current Physics, Dachs H. ed., (1978), 6, p.243-270.

2. Sadler D.M., Lefort-Tran M. & Pourphile M., BBA, (1973), 298, p.620-629.

3. Pape E.H., Menke W., Weick D., and Hosemann R., Biophys. J., (1974), 14, p.221-232.

4. Pearson R.H. & Pasher I., Nature, (1979), 28, p.499-501.

5. Д.И.Свергун, Л.А.Фейгин "Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние".-М. 1986.

6. Sadler D., Worcester D.J., Mol.Biol., (1982) 159,485-499.

7. Lawlor D. Photosyntesis 2nd edition. (1993) 54-58.

8. Tien H.Ti., Topics in Phosynthesis. (1989) 3, 159-165.

9. Kratky O., Porod G. Acta Phys. Austriaca, (1948), 2. 133-137.

10. Gordeliy V.I., Golubchikova L.V., Kuklin A.I., Syrykh A.G., Watts A., Prog. Colloid and Polimer Sci., (1993), 93, p.1-38.

11. Worcester D.L.,Trasactions АСА, (1983), 19,p.37-46.

12. Бородин В.Б., Физиология растений, (1992), 39, p.344-352.

13. Strotmann H„ Hesse H., Edclman К., BBA (1973), 314, p.202-210.

14. Кривандин A.B., Львов Ю.М., Островский M.A. и др.-Докл. АН СССР, (1981), 260, с. 485-488.

15. Quinn P.J. and Williams W.P., BBA, (1983), 737, p.223-266.

16. Г.А.Семенова, В.К.Опанасенко, Биохимия, т. 60, вып. 12, стр. 2053.

Основные результаты работы опубликовапы в работах:

1. Горделий В.И., Туган-Барановская А.Д. Черезов В.Г. Ягужинскнй JI.C. Биол.Мембраны (in press) "Исследование структуры мембраны тилакоида (шпинат) методом малоуглового рассеяния нейтронов"

2. Gordeliy V.I., Tugan-Baranovskaya A.D., Cherezov V.G. Yagujinskiy L.S. BMBI, V. 38, N 3, (1996), p. 485-491 "Investigation of the structure thylakoid membranes by means of small-angle neutron scattering"

3. Туган-Барановская А.Д., Горделий В.И., Ягужинский Л.С., Цитология (1995), т.37, стр. 396-397; тезисы докладов и сообщений, представленных на совещание "Мембранный транспорт и функция клетки", Сакт-Петербург,

1994.