Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие постоянного магнитного поля на Са-зависимые процессы в нейронах виноградной улитки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Действие постоянного магнитного поля на Са-зависимые процессы в нейронах виноградной улитки"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ нм.БУНЯТЯНА Г.Х. HAH РА

^ О /I На правах рукописи

' , АВЕТИСЯН ТОРОС ОГАНЕСОВИЧ

УДК 577.352.5+577.354

ДЕЙСТВИЕ ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ НА Са-ЗАВИСИМЫЕ ПРОЦЕССЫ В НЕЙРОНАХ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

( Q 00.04 -Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискапис ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1996

сщи ^.Pril"bhUß3Ubh шйЦшй l<bbUUßhlJhU3h bbUShSflhS

pt/u/qpft fipiu({m.Ijgni|

u<4bShU3uii ranpnu ^пачиьььиь

ittSO 577.352.5+577.354

^uususnui iruQbhuimub nucsh иапьзт-гэзт-ьс tuuanah

hJlufl^ah ЬЬЗРПЬЬЬРПШ ШИШ Ca-hg MUlu^UÖ TlPnabUbbPh

4PU

(Q.00.04 - IjbGuujpfiiJfiuj) USbbUfununi-ß3Ub UblUUQhP

IjbGuujpujGuiljujG qfiuinipjniGChpti рЬЦйшдлф с^шшЦшй штгфбшй huujgbiru Ьшйшр

bPb4Ub -1996

Работа выполнена в Центре биофизика HAH РА Научный руководитель:

доктор бнол. наук,

профессор АЙРАПЕТЯН С.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук,

профессор ХАЧАТРЯН Г.С.

канд. биол. наук,

ГЕВОРКЯН Г.

Ведущая организация: Институт тонкой органической химии

им. Мнджояна HAH РА

Защита диссертации состоится " " UAVHA 1996г. в часов на заседании специализированного Совета 042

при Институте биохимии им. Бунатяна HAH РА по адресу: Ереван, ул. П.Севака 5/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института. Автореферат разослан " ¡Л^СЬ-У 1996г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, профессор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время накопилось очень много экспериментальных данных относительно действия магнитного толя (МП) на биологические объекты различного уровня организации -от молекул до популяций. Интерес исследователей в этой области связан с тем обстоятельством, что, с одной стороны, биологические объекты находятся под постоянным воздействием естественных магнитных полей, с другой стороны, все больше увеличивается фон, созданный искусственными магнитными полями. Следует также отметить, что магнитные поля широко используются в биомедицинской практике, поэтому становится очевидным актуальность выбранной темы. Однако, несмотря на интенсивные исследования в этой области, до сих пор не существует общепринятого механизма действия МП на биологические объекты. Чрезвычайная сложность биологического объекта привела к появлению множеств гипотез относительно механизма действия МП, из которых наиболее популярными являются действие МП через биомагнетики и действие МП ка неспа-ренные электроны в структуре магниторецептора.

Однако с помощью этих гипотез удается объяснить узкий круг экспериментальных результатов. Наиболее естественным является объяснение действия МП на биологический объект через действие Ш1 на водный раствор, который, как известно, составляет 70-60,» от объема клетки и организма.

Имеются отдельные данные о том, что изменение физико-химических свойств раствора воды, содержащей ионы Са2+ под действием МП может играть существенную роль "в реализации биологического эффекта МП. Для проверки данной гипотезы представляло большой интерес комплексное исследование влияния МП на физико-химические свойства воды и водных растворов и действие омагни-ченного раствора на функциональную активность мембраны и клетки в целом.

Цель и задача исследования. Целью настоящей работы являлось исследование влияния МП на водные растворы, а также на зависимые метаболичнские процессы и функции клеточных мембран. В связи о этим, были решены следующие задачи.

I) Исследовать действие МП на электропроводимость водных

' растворов и их зависимость от типа п концентрации растворенных неорганических солей,

2) Изучить действие оыагниченного физиологического раствора

на:

. г-

а) поглощение ионов клетками ганглий улитки,

б) содержание циклических нуклеотндов в клетках ганглий,

в) хемочувствительность мембраны внутриклеточно-перфуэиро-ванного нейрона улитки.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые показ аг-но, что уменьшение электропроводимости вода и водных растворов под действием ПШ1 может реверсировать с понижением концентрации .ионов Са.1+ в среде, в то время как аналогичная зависимость эффекта ПМП от содержания ионов К+ , Ь)а и С1~ в среде, отсутствует. Впервые показано, что омагниченный физиологический раствор подавлял захват ^5Са2+ клеткой, уменьшал содержание внутриклеточного уровня цАШ, вызывал кальций-зависимый входящий ток через мембрану и повышал чувствительность мембраны к ацетилхолину (АХ).

Практическая ценность работы. Полученные данные позволяют глубже понять клеточные механизмы, ледащие в основе биологического действия МП и определить эффективность биологического дело ^ вия МП, сделав тем самым возможным более целенаправленное использование МП в биотехнологии и магнитотерапии.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международном конгрессе по электричеству и магнетизму в биомедицине (США, Флорида, 1992).

Работа апробирована на заседании Ученого совета Центра биофизики НАЛ РА 23 февраля 1995.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 5 научных работ в республиканской и международной печати.

Структура и объем работы. Работа изложена на 77 страницах машинописного текста и включает II рисунков, 5 таблиц. Библиографический указатель включает III ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

Диссертация состоит из введения (общей характеристики работы) , обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛВДОВАНИК

Ошты проводились на нейронах окологлоточного нервного кольца ганглий виноградной улитки Halls Poaatla . Ганглии из тела улитки, вместе о соединяющими их коннективами выделялись и помещались в нормальный физиологический раствор Рингера.

1. Методика измерения электрической проводимости растворов. После омагничивания воды и водных растворов в течение 1-3 минут проводили измерения их электрической проводимости. Все исследуемые контрольные растворы были приготовлены из бидистиллирован-ной и деионизированной воды, имеющей начальную электропроводимость (Х=4х10~® Сименс). Деионизиругощий аппарат типа aquapub, VKB. ЬАВОНТВЗГОШ (Производство ГДР), контрольные и испытываемые растворы находились в одной и той же пробирке. Измерялась электропроводимость до и после экспозиции в ИМИ. Измеряемые растворы были изолированы от окружающего воздуха стеклянной крышкой с применением вакуумной смазки. Для приготовления солевых растворов были использованы химически чистые соли марки ХЧ. Электропроводимости растворов измерялись кондуктометром типа 0K-I04 (Венгерского производства), в котором применяются платиновые электроды с поверхностью I см2*, разделенный щелью, шириной I см. Применяемый ток, пускаемый через раствор, го своей силе был меньше I НА. Электропроводимость была рассчитана по кривой вольт-амперной характеристики.

2. Метод определения' фосфолипидов ганглий с помощью одномерной восходящей хроматографии в тонком слое силикогеля.Эк-стракцию фосфолипидов производили из ацетоновых порошков ганглий виноградной улитки с помощью хлороформ-метаноловой смеси (2:1) по методу Фолча в модификации Карагезяна (Карагезян К.Г., 1972), лх фракционирование проводили хроматографически ( Зу-бер В.Л.,1982) в тонком слое силикогеля (ЧССР). Фракционирование М производили в системе растворителей: хлороформ-метанол-вода (65:25:4). Количественное определение лишщного фосфора осуществляли спектрофотометрически (СФ-46) при длине волны

815 ЕЛ.

3. Метод Фиксации концентрации на мембране перфузируемого нейрона и внутриклеточная перфузия гиганских нейронов улитки. Применение метода фиксации концентрации (Кискин Н.И. ,1987) позволило производить быструю смену исследуемых наружных растворов и соответственно, быструю аппликацию нейромедиаторов на мембране перфузируемых нейронов. В этих опытах для перфузии нейронов применяли пластиковые капилляры с диаметром 3 мм. Ввделенный из обработанного проназой ганглия нейрон с помощью стеклянной пипетки подносился к отверстии 8-10 мкм, проделанному в пластиковом капиляре. Нейрон, поднесенный к отверстию засасывался в него с помощью отрицательного гидростатического давления. С помощью же отрицательного гидростатического давления прорывалась мембрана нейрона и таким образом обеспечивалось ее слипание со стенками капилляра. Капилляр с исследуемым нейроном при помощи микроманипулятора помещали в Г - образную трубку, заполненную внеклеточным раствором. Быстрая аппликация этого раствора осуществлялась с помощью перистальтического насоса, подключенного к концу трубки. Время полной смены внеклеточного раствора у поверхности нейрона составляло 15-20 мс. При деполяризационном скачке"мембранного потенциала наблюдались входящий и выходящий токи через потенциал-зависимые каналы мембраны. При данном способе внутриклеточной перфузии нейронов флуктуации тока были относительно малы, что позволяло непосредственно определять потенциал реверсии для медиатор-визванных ответов путем их тестирования при изменении мембранного потенциала из области отрицательных значений в область положительных.

Однако, несмотря на большие преимущества, - возможности быстрой аппликации нейромедиаторов и прямого определения потенциала реверсии, - этот метод позволял осуществлять перфузию только тех нейронов, которые были подвергнуты предварительной длительной обработке проназой, что затрудняло ряд исследований по выяснению функциональной взаимосвязи между рядом метаболити-ческих реакций нервной клетки и ее хеморецепторов,

4. Метод обработки воды и водных растворов ПМП. Раотворы с . различшаас концентрация" солей в 20 мл плекоигдасовых каморах зкспознровалксь в статическом магнхтном тале. Время экспозиции било подобрано в гавясюкстн от цели эксперимента. Для измерения индукции ПМП был использован теслометр типа BI-8, раз-

работайный Институтом Радиофизики НАН РА. Этот прибор измерял шдукцию ШП в диапазонах 1,0-Тл 0,5%). Магнитная ин-духция преобразовалась кристаллом 1-511-11, 1.5x0,2 мм', который был укреплен на нонамагничпвающемся материале (РхГЗ-1). Температура измерялась игольчатым термометром, связанным с электронным мостом, имеющим чувствительность I ыВ на 0,05°С. Этот термометр позволяет измерять температуру с точностью +0,05°С.

5. Определение входа А5Саг* . Предварительно взвешенные изолированные ганглии улитка,группами по 10 штук в кавдой, после обогащения ионами натрия в бескалиевой среде (2-3°С), з течение 3-х часов помещали в тестируемые среды, содержащие А5Саг+ (удельная радиоактивность 2,5 мкКЮ\;лл) е инкубировали в течение I часа при комнатной температуре (18-20°С).

После ганглии трижды промывали 10 мл холодной инкубационной средой для удаления межклеточного 45Са1+ . Затем к каж-

дому ганглию добавляли 100 мкл 2 М КОН, после чего определяли радиактивность в сцинтилляторе Брея на счетчике ДС-4221. Среды с повышенной или пониженной концентрацией С а14 готовили путем повышения пли понижения содержания Саг+ в соответствующих растворах.

6. Определение концентрации внутриклеточного содержания цАМФ и ыДЛу'Ф проводили с помощью коммерческих наборов фирмы АногвЬел . Отпрепарированные ганглия взвешивались и инкубировались в соответствующих растворах в теченяо врзиопл, предусгмтрзн-псм эксперянентон. После этого в инкубационные среды вводилось

5 Ш ЭДТА. Затем ганглии гемогенизировались в 300 мкл 50 (¿Л раствора трис - НС?. . содержащего 5 Ш ЭДТА ( рН 7,4). К гоюгенату добавляли 2 мл этанола, пробы выдерживали при температуре 4°С в течение 5 минут, после чего их центрифигурировали. К полученному осадку добавляли 2 мл 70% этанола, размешивали и вновь центрифугировали. Нздосадочную жидкость, образовавшуюся в результате двухразового центрифугирования, высушивали при температуре 55°С в вакууме. Количество циклических нуклеотидов определяли радиоиммунным методом Стейнера.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ДЕЙСТВИЕ ПМП НА ЭЛЕКТРОПРОВОДИМОСТЬ РАСТВОРОВ

Как показано в литературе, в результате транспорта воды через клеточную мембрану (регулируемого работой электрогенного натриевого насоса) существенным образом меняется структурная активность мембраны как путем изменения поверхности мембраны (Холодов Ю.А.,1979), так и непосредственной активацией и инактивацией ионных каналов, ответственных за генерацию потенциалов действия в возбудимых клетках. Отсщда следует, что исследование механизма дейотвия МП на физико-химические свойства воды, с одной стороны, и влияние омагниченной воды на осмотические свойства клетки, с другой стороны, может приблизить к пониманию механизмов, лежащих в основе магниторецепцш: живых организмов. Известно, что под действием МП возрастает вязкость, плотность и поверхностное Еатяквяие и понижается электропроводимость води (Классен В.И., 1982). В основе многочисленных приемов практического использования магнитной обработки водных систем лежат естественно определенные изменения физических и физико-химических свойств. С целью выяснения изменения физико-химических свойств воды и водных растворов при обработке магнитным полем мы исследовали изменение их электрической проводимости. Известно, что электропроводимость.воды зависит от концентрации и подвижности содержащихся там ионов. Чистая вода также характеризуется слабой электропроводимостью, обусловленной диссоциацией молекул воды на ионы гвдроксила.ОН)" и гвдроксония •(НдО)+. Так как электропроводимость воды находится в прямой зависимости от диссоциации ионов, то исследование действия МП на электропроводимость воды может дать определенную информацию о прямом действии ЫП на' структуру воды. Поскольку, наиболее чувствительным к действию МП является 1\1л' Ca _ обмен клеточных мембран (Oase Й.Ы., 1930, Blaokmaa С.F. et &1., 1982), то мы исследовали электропроводимость водных растворов СаС12 различной концентрации.

Эти измерении были проведены в условиях комнатной температуры (22°С).

Концентрация ОаО^ (М)

мла /мкра

Электропроводимость

Контроль

Опыт

10 10 10' 10' 10'

-I

2 г3 ,-4

Г,

мла 10,00+0,05 9,80+0,05

мла 1,160+0,005 1,140+0,005

мкра 140,0+0,5 137,0+0,5

мкра 15,00+0,05 14,50+0,05

мкра 2,60+0,005 2,850+0,005

ТаблД. Изменение электропроводимости растворов хлорида кальция при экспозиции в постоянном магнитном поле (27 мТл). Каждый результат соответствует среднему значению 10 проб.

Данные, представленные на таблице I показывают, что одноминутная экспозиция МП растворов изменяла их электропроводимость, однако степень л направленность действия МП зависела от концентрации OaGlg . При концентрации CaCl^ IO^-IO-^M электропроводимость при экспозиции падает, тогда как при более низкях концентрациях (ниже 10~®М) она увеличивается. Электропроводимость ОаОЗ^ растворов также изменяется в зависимости от величины магнитной индукции. Хотя эти изменения незначительные, они легко воспроизводимы. Все измерения электропроводимости растворов были осуществлены непосредственно после выключения МП. Изменения электропроводимости СаОЗ^ раствора под действием МП сохраняются з течение 2-х часов после магнитной экспозиции без существенного уменьшения. Поскольку эти растворы содержали воду и OaClg, изменения электропроводимости можно рассматривать как результат изменения подвижности ионов Са^+ и CI". Однако, поскольку электропроводимости растворов NaCl и soi оказались нечувствительными к действию МП, это указывает на то, что изменение электропроводимости раствора. OaOlg под действием Ш являются результатом изменения подвижности ионов. Учитывая, что под воздействием Ш происходит подавление электропроводимости дистиллированной воды (Классен В.И., 1982), гда исследовали зависимость этого эф^та от времени или длительности экспозиции.

' Оказалось, что да мере увеличения времени экспозиции падает эффективность действия МП на электропроводимость воды. Как видно из рис, I, зависимость действия МП на электропроводимость раствора от времени носит характер насыщения. После 30-и минут экспозиции эффект МП остается неизменным ( электропроводимость больше не понижается).

О 5 10 20 ВО 40 150

ВРЕМЯ(МИН)

Рис. I. Временная зависимость действия ПМП на

электропроводимость дистиллированной воды

Представлял интерес провести эти исследования при различных температурах. Рис, 2 показывает, что эффект МП на электропроводимость также зависит от температуры и имеет форму кривой насыщения. Интересно, что при температурах выше 15-20°С эффект МП не

10 15 20 25 30 ТЕМПЕ РАТУРАД°С)

Рис. 2. Температурная зависимость электропроводимости дистиллированной вода: 0 - обычная вода; 0 - омагниченная вода

завистл от температуры. Аналогичные закономерности мы наблюдали при исследовании раствора Рингера (рис. 3). Поскольку ионы Са2+ играют ключевую роль во многих метаболических процессах, то предполагается, что незначительное изменение термодинамической активности ионов Са2+ может существенным образом влиять на внутриклеточные процессы. По этой причине в следующей серии наших экспериментов било исследовано действие смагничен-ного физиологического раствора на различные Са2+_ зависимые процессы, такие как содержание циклических нуклеотидов, фосфоли-пидный состав и хемочувствительность мембраны.

1-1--и__I

о 5 10 20 30 ТЕМПЕРАТУРА,(°С)

Рис. >алшвратурная зависимость электропроводимос

физиологического раствора: 0 - обычный физиологический раствор; в - омагниченный физиологический раствор.

2. ДЕЙСТВИЕ ОМАГНИЧЕННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА ПОГЛОЩЕНИЕ Саг+ ГАНГЛИЯМИ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

Поскольку под действием МП происходит изменение термодинамической активности ионов Са2+ в растворе, то предполагалось, что на это соответственным образом будет реагировать Са -- обмен в клетке. Известно, что вход Са2+ в клетку осуществляется через потенциал-зависимые кальциевые мембранные каналы и другие ионные каналы, а также через Иа: Са обмен. Ионы Саг+

а таете фиксируются на поверхности клеточной мембраны

отрицательно заряженными группами (В1ьокиаа С.?. &1., 1982, Айву ».Н.,1981,0ага-Ьо11 В.,1988).В настоящей серии экспериментов мы исследовали действие омагниченного физиологического раствора на поглощение меченого изотопа Са,г+ ганглиями виноградной улитки. Для этой цели контрольные (без экспозиции в магнитном поле) и опытные группы ганглий после их изоляции помещали в физиологический раствор, содержащий А5 Са2+ , инкубировали их в течение 30 минут при 25сС. Затем, после трехкратной промывки физиологическим раствором при 5°С кавдая группа помещалась в специальные пробирки для измерения радиоактивности, Ко всем пробам добавляли 2 N КОН и измеряли радиоактивность на счетчике 51- - 4221. Каждая точка на графике соответствует 10 пробам.

Табл. 2.

Магнитное поле Вход 45Са (в ,1)

0 100,0

Постоянное 4,6 УЕд 70,21 + 8,45

Постоянное 38,0 мТл 61,58 + 10,00

Изменение входа ^5Са2+ в ганглии виноградной улитки Helix poir.aUa ^ инкубированные в физиологическом растворе после экспозиции в магнитном поле.

Из представленных на таблице 2 данных видно, что поглощение Саг+ значительным образом подавляется в ганглиях, которые предварительно инкубировались в физиологическом растворе, омагниченном МП. Сравнивая экспериментальные группы ганглий с контрольными можно било заметить, что статическое поле с интенсивностью 4.6 или 38 мТл значительным образом подавляет вход свободного кальция на 30 и 39$ соответственно. Интересно отметить, что при десятикратном изменении индукции магнитного поля, действие НМЛ на вход кальция меняется незначительно. Здесь не наблюдается линейной зависимости.

3. ВЛИЯНИЕ НМЛ НА Ма:Са ОШЕН

Гомеостаз внутриклеточного Са2+ является одним из

показателей нормального функционирования клеточных мембран. В Са _ обмен клетки вовлечены три механизма: Са - каналы; Са -ЛТфаза и N<3: Са обмен (Сагиян А.А., 1991). Са - каналы обеспечивают вход Са?'*' в клетку во время ВД, они потенциал-зависимые , .Са. - АТфаза осуществляет выброс Саг+ из клетки, ^а: Са обмен, работает в электрогенном режиме, т.к. осуществляет сопряженный перенос трех ионов К1а+ к I иона С а7* в противоположных направлениях. При этом Ма*. Со обмен может работать в прямом (вход Иа4" и выход Са2+ ) и обратном ( вход Слг+ и выход ) режимах. Направление переноса ионов зависит от

концентрационных градиентов для N0 и на мембране, а

также от уровня цАМР в клетке.

На активность На ' Са обмена влияют разные факторы, такие как вне- и внутриклеточные концентрации ионов и Саг+сос-

тояние Мс?, К* - АТфазы ( натриевого насоса), уровень фосфо-рилирования мембранных белков, изменение лисидного состава и текучести мембраны, температура и т.д.

В литературе имеются также данные, что изменение рН среды влияет на активность Ыа:СА обмена. На культивированных сердечных клетках цыпленка показано, что увеличение рй среды от 7,0 до 7,6 вызывает увеличэние входа Са2+ (МигрЬу В. et а!., 1986 ). Исследование на аксонах кальмара показано, что алка-линизация среды с помощью (нн^)* значительно увеличивает вход ионов Са2+ через на«Са обмон (М11пв ЬЛ. вt а1., 1993). Аналогичные данные получены и на красных кровяных клерках собаки (^агке^. СГ.О., ЗЭ7в)*

Известно, что под действием Ш изменяется термодинамическая активность ионов СаЛ+ в водных средах (Классен Ю.И., 1968). Подвергается изменению также лшшдный состав "плазыата-" ческой мембраны. Исходя из этих данных, можно предположить,что МП будет влиять на На:С« обмен через изменение указанных факторов. Не исключается возможность непосредственного влияния МП на белковую структуру, обеспечивающую N0; Са обмен. Однако, необходимо отметить, что в литературе практически отсутствуют данные или сведения относительно влияния МП на Ма: С а обмен.

С целью выявления возможного влияния ПМП на На; Са обмен, нами был исследован вход ионов ^Са в ганглии в условиях

II + и*

подавления N а, К - насоса в присутствии фармакологического блокатора Са - каналов. Ранее было показано, что в этих условиях вход ионов Са2+ отражает активность электрогенного No : Са обмена, работающего в обратном режиме, а именно, ■ од Саг+ и выход

рН 8.8 рН 7.7 рН 6.0

Рис. 4. Зависимость входа тонов в нейроны улит-

ки от величины рН во внеклеточной среде без обработки (заштрихованные столбики) и с обработкой внеклеточной среды в НМЛ (пустые столбики).

Из литературы также известно, что под действием МП изменяется рН водных растворов. Известно, что изменение внеклеточного рИ вызывает изменение внутриклеточного рН в том же направлении (Ноаз А. et а1>, 1981, СЬва1ег Ы., 1990)»

Учитывая эта факты, нами было исследовано влияние низкого рН (6,0), нормального (7,7) и высокого (8,3) значения рН среды на вход ионов Со в условиях подавления N<3- насоса без влияния и с влиянием МП. На рис. 4 представлены полученные результаты, показывающие, что влияние МП на вход ионов Сильно зависит от рН среды. Оказывается, что изменение значения рН раствора до 9 стимулирует, а в обратном направлении - до 6 подавляет вход ионов ^Са по сравнении с его входом при рН 7,7. Механизм такого влияния в рамках имеющихся данных трудно объясним; Возможно, что изменение рН непосредственно влияет на активность переносчика. Из рисунка видно, что вход А5Са в клетку зависит от рН , но это еще не говорит об изменении входа с изменением рН в обычных условиях и при воздействии МП. Это говорит скорее о том, что наблюдаемый эффект обусловлен не только изменением величины рН , но и действием самого магнитного поля.

4; ДЕЙСТВИЕ ОМАГНИЧЕННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ цАМФ и цГШ.

Внутриклеточный уровень цАМФ и цШ$ в нейронах регулируются различными способами, включая действие нейротрансмиттеров и гормонов, в рецепции которых участвуют ионы (ОЬоо1ог ы., £990,Новиизаод Ы.Д970)' Для того, чтобы выявить действие омаг-ниченного физиологического раствора исследовали действие МП на внутриклеточный уровень цАМФ и цШФ в контрольных и экспериментальных ганглиях, которые перфузировались .физиологическим раствором, предварительно омагниченноы МП интенсивностью 25 ыТл в течение 10 мин.

Из представленных на таблице 3 данных видно, что дажо при относительно кратковременной инкубации происходили значительные изменения в содержании внутриклеточного уровня ц(Ш п цШФ по сравнению с контролем. Содержание внутриклеточного цШФ увеличивается, товда как цАМФ уменьшается в отношении контроля. Какие механизмы ответственны за эти изменения пока остается неясным. Эти данные отчетливо показывают, что омагниченный физиологический раствор, меняя содержание внутриклеточных мес-сендаеров, может существенным образом менять метаболитический

статус клетки.

Табл. 3.

Раствор Содержание циклических нуклео-тидов

цАМФ цШФ

Контроль 100,0 100,0

Опыт 76,2 + 8,6 170,2 + 35,5

(р < 0,02) (р < 0,05)

Изменение содержания циклических нуклеотддов в ганглиях виноградной улитки МеЬ* ротсИло щ)И инкубации в физиологическом растворе, подвергнутом экспозиции в постоянном магнитном толе (25 мТл).

5: ДЕЙСТВИЕ ОМАГНИЧШНОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА ЛИЩНЫЙ СОСТАВ НЕРВНЫХ ГАНГЛИЙ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

Известно, что Мя: Со обмен играет валкую роль в поддержании внутриклеточного содержания кальция (Аугарв"Ь1аа 8.11. st а1., 1985 ). При низких концентрациях цАМФ Ма:Са

обмен работает в направлении выхода Саг+ и входа Ма+ , тогда как при повышении уровня цАШ происходит реверсия этого обмена, т.е. кальций транспортируется внутрь, а натрий выбрасывается наружу (ЗЕ&Ьуоа А.А. et а1., 1991. )7 Поскольку каль-> ций является модулятором ферментных систем, ответственных за липцдннй обмен, то можно ожидать, что изменения, происходящие в Мо : Са обмене под действием МП может повлечь за собой и существенное изменение липидного состава мембран.

В настоящее время с достоверностью установлено важное значение липкдов в механизмах регуляции трансмембранного переноса ионов и различных метаболитов, в структуре и функциональной активности липид-зависимых ферментов, клеточных органелл и важнейших метаболитических комплексов (0агр1по111 А.в. at а1., 19ВО, АугарвЪ1аа а* а1», 1985). Процессы гидролиза, ресин-теза от окисления липидов обеспечивают динамическое равновесие

обмена как в мембране, так и внутри клеток. Нарушения этого равновесия лежат в основе различных патологических процессов.

Фосфолшшды являются полифункциональными компонентами клеточной мембраны, играющими первостепенную роль в осуществлении ее барьерной функции в реакциях трансмембранного переноса веществ при активном участии реакций, катализируемых мембраносвя-занными ферментами. Процессы мембранной проницаемости находятся в состоянии тесной зависимости от качественного и количественного состава присутствующих в мембране фосфолшшдов.

Следовательно, задачей настоящих исследований и послужило наблюдение за изменением фосфолшшдного состава мембран иод действием оыагнгченного физиологического раствора. Представлены данные относительно фосфолигаудаого состава ганглий при 24-часовой инкубации в обычном и омагниченном физиологическом растворе и после 24-часовой инкубации в омагниченном физиологическом растворе.

Наблюдалось повышение уровня фосфотидилэтанолампна (ФЭ) на 23,5±3,8# и понижение уровня фосфатиднлинозитола (ФИ) - на 36,7+4,6^, как известно, фосфатидилинозитолы играют исключительно важную роль, как соединения, выполняющие роль поставщика диглицеридов и фосфорилированных эфиров инозита, играющих роль вторичных мессендкеров в клеточном метаболизме. Уровень Д.ФГ также понижается при инкубации ганглий в омагниченном физиологическом растворе. В уровнях других фосфолипидов (сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатвдилсерина) не удалось обнаружить достоверной разницы. Возможно, под действием МП затормаживается гидролиз фосфолипазы Д., в результата уровень ФЭ повышается, а уровень 4>К падает;'

6. ГО.ЮЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕМБРАНЫ ИЗМЕНЯЕТСЯ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ОМАГНИЧЕЕШОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА (ОФР);

Поскольку нашими исследованиями было показано, что омаг-ниченный физиологический раствор (ОФР) существенным образом влияет на вход Сй г+ в нейроны ганглий, уровень циклических нуклеотидов и фосфолипидный состав, то можно было ожидать, что в этих условиях произойдет также изменение хемочувствитель-

ности мембраны. По этой причине в следующей серии экспериментов па диализированных нейронах виноградной улитки в условиях фиксаций напряжения на мембране мы исследовали действие ОФР на хёмочувствительность мембраны.

При перфузии нейрона физиологическим раствором, предварительно обработанном МП ( 27 мТл), наблюдалось появление входящего тока до 10 нА (рис.5). При исследовании зависимости амплитуды тока от времени экспозиции физиологического раствора в МП оказалось, что минимальное время экспозиции в растворе, которое

Рис. 5. Трансыембранннй входяций ток в диализированном нейроне Helix pomatio , перфузированном физиологическим раствором, заранее подверженный действию МП в течении 4-х мин. Стрелка "вниз" показывает время действу омагниченного раствора. Стрелка "вверх" показывает время промывания нормальным физиологическим раствором.

Рис. 6. АХ - вызванные мембранные токи на внутриклеточных перфузированных нейронах И<?(.1* рстс^иэ А. и С. получены в контрольном физиологическом растворе, В - после обработки контрольного физиологического раствора в МП.

необходимо для возникновения указанного физиологического эффекта, составляло 40 сек.' Выдерживание физиологического раствора в МП более 60 сек до 24 часов не приводило к существенному увеличению амплитуды указанного входящего тока. Этот ток подавлялся только после наружной перфузии нейрона в нормальном физиологическом растворе, причем происходило его полное исчезновение. Интересно отметить, что входящий ток довольно устойчиво держался и не подавлялся под действием неомагниченного фи-

зиологического раствора, когда внутриклеточно перфузированный раствор заранее был экспозирован в МП более 4-х часов. Входящий ток, обусловленный ОФР, оказался С а - зависимым. Когда содержаний Саг+ в наружном омывающем растворе уменьшался от 10 до'4 Ш у большинства нейронов не генерировался ток под действием омагниченпого раствора, а у 4 из 20 исследованных нейронов, наоборот, генерировался входяций ток (меньше 2 нА). Ранее нами (АрваповВ.Л. л др., 1985) были идентифицированы два типа ацетилхолиновых (АХ) ответов, которые имеют различные ионо-форные и фармакологические свойства. Один тип ответов, который является результатом повышения хлорной проницаемости, подавляется сердечным гликозндом - уабаином. Второй тип, обусловленный С а _ проводимостьв, является уабин- нечувствительным.

1,-пЛ

8 -б -А -2 -

Рис. 7. Мембранный ток в Анализированном нейроне [Ы1* ротаНо при перфузировании физиологическим раствором,предварительно подверженный действию МП с индукцией 27 мТл.

Под действием ОФР (МП интенсивностью 27 мТл) происходило резкое увеличение уабаин - чувствительных ответов, тогда как уабаин -нечувствительный нейрон не давал эффекта (рис.6).

Обработка в течение 30-40 сек внешнего нормального физиологического раствора в ПЫЛ, величиной 27 мТл приводит к появлении мембранного входящего тока (до 8 мА) (рис.5). При этом, зависимость величины входящего тока от времени акспозицаи в ЫП подчиняется закону "все еле ничего0: увеличение времени экспозиции в МП (т.е. более, чем 30-40 сек) не приводило к изменению величины указанного эффекта. Минимальное время экспозиции для генерации входящего тока, возникающего под действием ОФР составляло 30-40 сек; Меньше 30 сек экспозиция физиологического раствора не вызывала каких-либо изменений трансмембранного тока. Действие ОФР па нейрональную мембрану сохранялось в течение всего эксперимента, максимальная продолжительность которого составила 24 часа (рис.7).

Для того, чтобы выяснить ионную природу входящего тока, который возникает под действием ОФР, проводились эксперименты-. Как видаю на рис. 8 уменьшение концентрации калия, хлора и натрия на 50% путем замещения их на эквиосмолярные концентрации сахарозы и ацетата натрия. Замещение калия и натрия сахарозой, производимое с учетом коэффициента осмотичности 1.6, не действовало на величину вызванной МП входящего тока (уменьшение же ионов Са.2+ на 50% приводило к полному исчезновению входящего токаи

Приведенные в настоящей работе данные о том, что физиологический раствор после экспозиции в МП более 40 сек вызывает трансмембранный входяций ток, является подтверждением вышеуказанной гипотезы. Нечувствительность вышеуказанного трансмембранного тока к ионам натрия, калия и хлора и его чувствитель« ность к ионам Са2* свидетельствует о том, что транс-

портирующая система натрия, калия и хлора нечувствительна к действию ОФР, тогда как Са - транспорт при этом модифицируется. Причина Са - зависимости трансмембранного входящего тока, который возникает под действием ОФР объясняется либо изменением гидратационной оболочки ионов С'а2 + , либо Са - транспортирующей системой в мембране. Для выяснения вопроса о том, какой из втих механизмов ответственен за

и 'II °1 \

л п

1 I •[ I

<

I о

4 сек

Рис. 8. Возникновение трансмембранного ионного тока под действием ОФР: I - нормальный раствор Рннгера; 2 - р-р с содержанием Ма+ 3 - р-р с 50% содержанием К; 4 - р-р с 50% С1 ; 5 - р-р с содержанием Са.

генерацию указанного тока, необходимо дальнейшее исследование. Известно, что в мембране существует два транспортных механизма, обеспечивающих электрогенный вход Саг+ внутрь клетки: потенциал-зависимые Со - каналы и МО:Са обмен. Последний транспортирует один Са2+ внутрь и три Ма + наружу, когда уровень цАМФ повышается ( Ыи111аз а1., 199$.

На основе представленных данных также трудно судить о вкладе указанных двух Са - транспортирующих механизмов в генерации потенциалов, вызванных МП. Данный вопрос также служит предметом дальнейших исследований.

выводы

I/ Статическое МП с интенсивностью 27 мТл меняет электропроводимость раствора, СаС12.~ Степень и направленность такого воздействия зависит от концентрации ионов в растворе с

концентрат ей (10"^ - 10~%) электропроводимость раствора уменьшается, а при (Ю-5 М) - повышается.

2/ Омагниченный физиологический раствор подавляет поглощение ионов Са2+ нервными ганглиями виноградной улитки. Этот эффект не находится в строгой зависимости от интенсивности Ш.

3/ Омагняченный физиологический раствор снижает уровень внутриклеточного содержания цАМФ и увеличивает содержание цГМФ.

4/ Омагняченный физиологический раствор оказывает дестабилизирующее действие на лшщцннй состав клетки в период инкубации изолированных ганглий в условиях усЬгг».

5/ Омагниченный физиологический раствор повышает чувствительность уабаин-блокируемых рецепторов к ацетилхолину, при этом не оказывая никакого действия на уабаин - нечувствительные рецепторы.

u ir » n ■!> (m ir

Чрш^шЬшррЬ ifhf rjujuib)}! шэдЬдтррЬ ijbpinpfcpjui[ 1)шЬ

ршц1Гшр|и| шшшПшифрмэдмИЬр Ii т^вцЪЬр 1]1ДвшрыЪш11шЬ opjUjmîifcpJi i]pia: щщр|ЛЬр№ hhuiajpgpnipjmlib iuji) hhuiffl^BinnipjmblitfiJ\

ЦшинГои/р шшиШшцЬа шйЦ t, j¡ml|i вр ^ишиЬ^ЛЭДш^шЬ щшайЛршдДО цтодЬршд iltosijty t; ifaiprjljinbg U iIjmb (¡ШшршЬш'^шЬ ofjb!(w!itp|> niphbnuiu¡!juiíi iImqb}uiol{aIi qmjuitpji aqr^oipjail mm!; çuli|b[m huiiJuiïuiljMÎimpjnitQ: <jnj»ti{i t; Ъшк, np iTaiq1i|iuci1{mb rjmjLntpß imjl Ijlipummpjmli U qmty ball рОДшздшЪ ишррЬр Ii

p¡inuifc)ulin[ni}}iaijmJ: liüili и>ЬцЦмр]тЬ&Ьр iiljb ¿вифЬ, йр IjuißJimiJfi }>пЫЬр щшрмЬщ^иц fpuij[i!i [màmjpltpQ (ГвцЬ^ш^шЬ m^hgntpjob ucil] iJiíJumiT

Ц fiptlij - hfflutljmpjnilrttpß . Ii ьр ifuiqtijHiBiljtnb qajmfi

]¡Uiimjpiiiliuil{iut шадЬдмр^ЬЬ fipuiljuiliBjiJmif t bttij IjiaQlmiify jmtilitpfi itJijajniJ:

Qju рЦЪшйшЦщЬ ptqmil itpl]Djmgi¡iBá U $i>pÁliml¡isb lihuiu^niriQipjnibbbpJí cp&2 lapiyrab^îitp, npalß 1|шрвц Lb [aiju вфпЬ[ i)tpBhfio¡ui[ *1РШ: Uwu^ib шЦшй jmjg t 'uipijaü, np <Л1-1»

шодЬдгаррЬ шш1| £puj(>b [Giàmjpïhp}i huirçsprjuiljiatmipjBti Цш^шЪ (црадЬа^ 1;шрц t fip mi)i)DipjaitQ . [mäoijpmil ljm[9timil|> |mlitihp¡\

Ijntijhliuipuijlimjt^: I,, ip (Га^^шш^шЪ ifyutjtfat ЬЬршрЭДшд

|j),q¡m¡n<¡}iujlii¡il( [màuijpibpti _ ilt{ àtrçijEiii t, tfmmjß

рерршцШЬрЦ, }ili¿qbu ЪшЪ Ь^шцпнГ t, ¡ibpp££aj}il j^iJit) 1ШЗ>-}| ¿шЬш^-UfuuduiifuiLffllj jmjg t; up^eià, up (/иц1фци1)шЬ i^ffljuiji mqr^nipjsj'u mini) р{£шрш1ци1р»'иГ шшнриЪаи! t; 1)ицд}ши{|1 J^MbpRij щнцГщЬвфр^шй ilnimpwjjii lmuuií¡¡> Ii op iímqlil>auiljuili qojia]! tturçtjnipjuab uimlj р££щршцшЪр1) mffljbmpjrabß Bjbu¡}\i)jiiiJillí Цши»?с if 1

- 26 -

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1.Aveti'sian Т., Madjinian S. and A.vrapetyan S. The Effect of Magnetized Physiological Solution on Meabrane Currents in Dialyzed Neurons of Helix Pomatia. The First ftorid Congress for Electricity and Magnetism in Biology and Ktedicine. Buena Vista Palace, Lake Buena Vista, Florida. USA. 1992.

2. Гарибова /1. С. , Аветисян Т. О. , Аванесян А. С. , Айрапетян С. Н.

45 +3

Влияние ПМП на трансмемОранный вход Са и фосфолипидный состав Т-лимфоцитов селезенки мыыей линии СВА. Депонированные научные раОоти РА, Ереван, 1995, N3, стр.29.

3. Аветисян Т. О. , ГариОова /1. С. , Аванесян А. С. , Айрапетян С. К. Влияние МП на вк/шчениея ^Н-тимидина в клетки селезенки крыс Депонированные научные работы РА, Ереван, 1Й95, КЗ, стр 22.

Д.Аветисян Т.О. , ГариОова /1. С. , Аванесян А. С. , Айрапепян С. Н.

Действие омагниченного физиологического раствора на вход ионов 45 +2

Са в клетки селезенки и мозговую ткань крыс. Дапонирован-нивованные научные раСоты РА, Ереван, 1995, N3, стр.24.

5. A.vrapetyan S.. Avetisian Т., Madjinian S., Avanesian A.

Physiological Effects of Magnetic Field May Be Mediated through Actions on the State of Calcium Ions in Solution. Biological Effects of Electric and Magnetic Fields. Volume 1. Academic Press. 1994