Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние некоторых эндогенных и синтетических биологически активных веществ на нейроны виноградной улитки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние некоторых эндогенных и синтетических биологически активных веществ на нейроны виноградной улитки"

М 0 Н 4

Министерство науки, высшей шкоды и технической политики Российской Федерации РОСГОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ 1Ш1 ДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

Специализированный совет К 063.52.09 по биологическим наукам

На правах рукописи

АРОЯН Елена Вигеновна

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ЭНДОГЕННЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА НЕЙРОНЫ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

03.00.13 - Физиология человека и киватпих

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Ростов-на-Дону

1992

Ребота шполнйш о

НИЯ Кэйрокябершзтеки Ростовского ордена Трудазого Красного Знамена государствэнайго ушпйреттота

Научшэ руководители:

доктор Сиолопгсесгях нале, прсфзооор А.Б.КОГДН, доктор шднвднсзшх наук, профоссор Г.А.ЕШШОЗ.

Социальные ошюнэнты:

доктор биопогииеских наук, профессор Ю.Г.АНТШОНОВ доктор ыедттинских наук Е.В. НИКУШКИН

Еадуцап органкзоцЕя:

1ЙСКОВСКНЙ Госудгрствэнша Увавэрсатет.

SEEjrra дассортЕцил состоится " * 1932 г.

в " " «асов на заседании (йюцзагаззршзаинохх) Ученого Сотата К CS3.52.09 пр бгоЕогнчэскЕа наукам в Ростовском утазорептето ( 344711, Росзов-нв-Дсву, уя.3яга.шза, ICS, рГУ, Сашого-дочБвнша факультэт, оуд. 304' ).

О дзссартацнай шшю ознакомиться в научной б2б£20?31И> ГКГ ( 344СС6, г. Ростов-на-Дону, ул.?Пупкаская 143 ).

ftSTopOsiopaT разослан г.

Ученый сокротарь СгоцнахизжюЕшшого Совета, кавяидаг биологических паук

В.Н. Кнро2

РОССИЙСКАЯ

ГОСУДАК:'. БЕ-.'.:НДЯ а

БИБЛИОТЕКА

С!"'.»! ¡i

,,Z , : , ! ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Физиологическое к клиническое значение медиатерев и рэгуляторных пептидов чрезвычайно велико ( Ашмарин W.U., Каменская М.А., 1988; Замятин A.A., 1990 ). Многие формы патологий нервной системы сопровождаются изменениями встесстввшого баланса этих соединений ( Цоздеев В.К., 1981 ). В связи о этим считается, что существует возможность коррекции состояния больных неврологическими заболеваниями с помощью биологически активных веществ эндогенного происхождения.

Одним из наиболее распространенных заболеваний нервной системы является эпилепсия, при развитии которой происходят изменения не только в электроэнцефалографической активности мозга, но и в деятельности медиаторных систем ( эпилепсия может возникать при активации возбувдапцих систем, при слабости и ингибировании тормозных систем и при снижении уровня обмана модулятора нейронной активности - таурина ) ( Поздеев В.К., 1981 ), а также в составе жидких сред организма ( Цветанова Е.М., IS86 ).

Для терапии эпилепсии используют препараты, способствующие повышению уровня серотонина в крови и мозга пациентов ( Свиридова Е.И. и соавт., 1987 ). Этот подход к лечении эпилепсии основывается на представлении о серотонине как о тормозном медиаторе, способствующем подавлению эпи-припадков ( Свиридова Е.И. и соавт., 1987, Hi.ramtsu Ii. et. al., 1987 >, хотя по данным Yakel J.L. et. al. ( 1988 ) серотонин вызывает не только тормозные, но и возбудительные ответы в нейронах гшшокампа - одной из наиболее предрасположенных к эпилептической активности структур мезга ( Shen J.M. &-Krieg3tein A.R., 1986 ). Рядом авторов показано, что дельга-сон-индуцируадий пептид обладает способностью подавлять эпилептиформяые разряды ( Крыкановсюий Г.н! и соавт., ТЭ87;° Адрианов o.e. и'"соавт., 1988; Доведова Е.Л., 1990; Шандра A.A.' и соавт., 1989). Крыжановским Г.Н. и Соавт. ( Г988 ) были описаны противосудорожные свойства дикворв животных, перенесших эпилептический припадок, которые га® мнению авторов обусловлены эффектом эндогенных веществ. Вместе с тем клеточные механизмы указанных

явлений на изучены.

Внутриклеточными коррелятами этшптиформной активное являются ггароксизмальные деполяризационные сдвиги ( ГЩО ), кот рые создаю'^' в экспериментальных Моделях эпилепсии, либо воздейс вием химических агентов ( пенициллин, пентилентетразол, оуба и др. ), либо электрическим током (электрошок, алектростимуляц в режиме раскачки ) ( Dichter М.А. and Ayala G.P., 1987 ). Paö тами ряда авторов бою показано, что апалептиформную активное можно также вызвать устранением ионов магния из внеклеточно раствора ( Walter H. et.al., 1986; Stanton P.K., 1987; Mody et.al., 198T ). Тест-системами в этих экспериментах служат только млекопитающие, но и беспозвоночные ( Эзрохи В.Л., 198 Altrup U. and Spectanan E-J., 1988 ). Доказано, что механиз действия ко:шульсантов на нейроны позвоночных и беспозвоночн аналогичны ( Ulbricht И. and Warner Н-Н., 1976; Hermann А. а Gonnan А.Ь.Р., 1981 ).

Очевидную теоретическую и практическую значимость приобр тает перспектива использования простых нервных систем для иссл дования клеточных механизмов действия биологически активных в ществ на эпилептиформную активность, а также для поиска и апроС ции эффективности препаратов, обладающих противосудорожным дейс вием.

Цель исследования. - Целью данной работы явилось изучен влияния препаратов, обладающих антиэпилептическими свойствами, также ликвора больных различными неврологическими заболевания на нормальную и судорожную активность нейронов виноградной улит Helix luoorum X.

Задачи исследования. I. Выявить нейроны винограда

улитки, реагирующие на удаление магния из физиологического рас вора развитием ■ эпилегггиформной активности. 2. Изучить влияв ликвора больных эпилепсией и шизофренией на нервные клетки вине радной улитки. 3. Сопоставите аффекты беэмагниевого раствора ликаора больных эпилепсией на идентифицированные нейроны вине радной улитки. 4. Охарактеризовать еффекты пептида дельта-сна серотонина на судорожную активность нейронов моллюска.

Научная новизна. В работе впервые использован npenaj

рвной системы виноградной улитки для создания модели епилепти-рмной активности с помощью удаления ионов магния из внеклеточ-й среда. Впервые сопоставлено влияние лннгоров больных эпилеп-ей и шизофренией на спонтанную и вызванную активность нервных еток виноградной улитки и на спонтанный синвптичэ екий приток ентифицироввншх нейронов этого моллюска. Впервые описано влия-е пептида дельта-сна на синаптическую передачу в нервной систе-моллюска и на судорожную активность, вызванную удалением ионов гния. Показано, что пептид дельта-сна в концентрации Ю-8 М еныпает чаототу и продолжительность парокоизмалыш деполяри-ционных сдвигов, вызванных аппликацией безмагниевого раствора, в концентрациях Ю-7 - Ю-4 М полностью устраняет пароксизмаль-е разряды в нейронах виноградной улитки. Обнаружено, что серо-нин подавляет эпилептиформную активность в клетках, которые рмозятся а растворах Б-НТ и усиливает в нейронах, которые збуадаютсч под влиянием этого медиатора.

Научно-теоретическое и практическое значение работы, зультаты проведенной работы имеют как теоретическое, так и штическоэ значение. Они вносят определенный вклад в понимание ханизмов противосудорокного действия пептида дельта-сна и в но-|Торых случаях - серотонина, раскрывают клэтлчные механизмы ияния ликвора больных егмепсией и шизофренией. Полученные дан-:е позволяют применять использованную экспериментальную модель в пастве тест системы для изучения механизмов действия и апроба-и эффективности противосудорожных препаратов, как применяемых в стоящее время в клинике, так и вновь синтезируемых.

Внедрение результатов исследования. Материалы диссертации ¡пользоваш в .отчете по теме P0CTH-I9 и в курсе практических яятий студентов кафедры ©гаиологии человека и зг<шотяых 'У г

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуи-ны на конференции молодых ученых РТУ в 1988 г.; на Всесоюзной сференции " Простые нервннч системы " ( Казань, 1Э88 ), на 2-й «союзной конференции по нейронаукам ( Киев, 1988 ), па коь?>-|нции по нейрокибернетике ( Ростов-нв-Донт, 1989), конференции 1Лодых ученых ( Ставропол:, 1989 ), на 28 совещании по ВНД ( М-

нинград, 1989.-), на региональной конференции международной общества нейробиологии беспозвоночных " Простые нервные системы.1 ( Минск, 1991 ). По материалам диссертации' опубликовано 1С научных работ. Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры физиологии человека и животных РТУ ( Ростов-на-Дону, 1930 ;

Обьем и структура диссертации. Диссертационная работа содержит 155 страниц машинописного текста? включая 27 рисунков, С таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 'методики исследований, Б глав собственных результатов, обсувдения, заключения и выводов. Список литературы включает 80 отечественных и 183 иностранные работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 150 виноградных улитках Helix lucorur L., массой 25 - 30 г. Для экспериментов использовался полуинтакт-ный препарат ЦНС - мантия ( Шехтер Е.Д., Аракелов Г.Г., 1985 ). Электрическое раздражение нервов и пневмостомы моллюсков производилось от стимулятора " Multlstim Тактильные раздраженш дыхальца и других внутренних органов наносили вручную, касалкой, Биоэлектрическую активность нейроноч регистрировали внутрикле-точно с помощью стеклянных капиллярных микроэлектродов, заполненных 2,5 - 3 М KCl, сопротивлением 10 - 20 МоМ. Электроды черег хлорсеребряную проволоку подсоединялись к усилителям для внутриклеточных исследований. Внутриклеточную поляризация проводили через регистрирующий электрод с помощью мостиковой схемы.. Импульсную активность нейронов записывали на кинопленку РФ - 3 с помощы фоторегистрирующегс устройства ФОР - 2 с экрана осциллографа CI -69; для непрерывной регистрации и ведения протокола опытов использовался самописец Н338 - 6П. Биологически активные вещества, лекарство и лшсвор растворяли е растворах Рингера непосредственнс перед опытом и агпшщировали кэ всему препарату с омывающим раствором либо с помощью шприца, либо используя водоструйный насос марюг "Zalimp". Вещества ашшщировали в течение Б - 30 мин. Пептид дельта-сна - в концентрациях от 2 х Ю-4 до 2 х Ю-8 М, оеро-тонин - в концентрации I х Ю-5 М, диметияеульфоксид - в концент-

рации 0.01%. Для того, чтобы в ходе аппликации сохранить состав Рингера, характерный для нормального физиологического раствора моллюсков, ионная сила растворов, которыми разбавлял! вещества и ликвор была" изменена. Для веществ применяли разбавление типа 1:4. Динвор разбавляли 1:1 раствором, который приближал его ионный состав к раствору Рингера для виноградной улитки. За основу Орали среднестатистические данные о составе ликвора человека, приведенные Цветановой Е.М. ( 1986 ). Статистическая обработка данных производилась на ПЭВМ "Искра-1030" и на "IBM PC AT" с помощью пакетов программ "STATGRAPH" и "MICROSrAT". Для предварительного анализа данных строились гистограммы частот значений выборок екс-териментальных данных и графики динамики средних в фоне, в раст-зорах пептидов, серотонина, ликвора, диметилсульфоксида, и на отлитом препарате. С помощью критерия х2 ( хи квадрат ) осуществляли проверку распределения' данных на нормальность. Достоверность различий выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна -Гинти - Уилкоксона ( Владимирский Б.М., 1983; Лакин Г.Ф., 1990 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Пароксизыальные деполяризвционные сдвига в активности нейронов виноградной улитки

Исследовано 33 нервные клетки. 9 из них было идентифициро-шно ( клетки ППа2, ППаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ, ЛПаб, BI, ППаб, В4, В6 ). [роизведено 120 отведений внутриклеточной активности. Нами уста-ювлено, что устранение учгния из раствора, омыващего нервные •летки, приводит к эпилептизации некоторых нейронов, к появлению одержанной деполяризации в их ПД. Часть нервных клегог в безмаг-иевом растворе сохраняла паттерн активности неизменным. По . на-югии с классификацией, предложенной Matsumoto H. and Marsan .. ( 1964 ), среди нейронов, рэагирущих на отсутствие ионов магия можно было выделить активные и пассивные.

Активные Нейроны ( клетки В4, В6 и неидентифицированные фо-овоактивнне клетки ) реагировали на .удаление ионов магния либо тойкой деполяризацией мембраны, либо генерацией типичных парок-

сизмальных деголяризационных сдвигов, состоящих из восходящей фазы, в ходе которой клетка деполяризовалась на 15 - 30 мВ, фазь плато, и фазы реполяризации, в течение которой восстанавливала« способность клетки генерировать ПД и МП возвращался к исходному уровню. Общая продолжительность ЦЦС варьировала от 0.4 до 20 се» и в среднем составляла 2.7 сек. Спонтанные эпилептиформные разряды появлялись с частотой в среднем составляющей I - 5 / мин.

Пароксизмальныэ деполяризационные сдвиги в активных нейронах появлялись также в ответ на раздражение магистральных нервов и рецептивного поля исследованных нейронов. Латентный период их появления варьировал от 3 до 21 сек, и в среднем составлял 12.1 сек. Структура вызванных пароксизмальных сдвигов была аналогична структуре спонтанных ЦЦС.

Пассивные нейроны ( Ш1а2, ППаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ, ЛПаб и нв-идентифицированные клетки ) реагировали на отсутствие магния несколько иначе, чем активные. Так же, как и у активных нейронов в их ДЦ появлялась задержанная деполяризация, а в активности - деполяризационные сдвиги, в результате которых молчащие клетки генерировали одиночные, или залпы ЦЦ, а фоновоактивные нейроны повышали частоту импульсной активности, но амплитуда этих сдвигов не достигала уровня инактивации спайк - генерирующего механизма. Аналогичные деполяризационные сдвиги наблюдались в ответах пассивных нейронов на стимуляцию рецептивного поля и магистральных нервов. Амплитуда ПДС варьировала от 15 до 30 мВ и в среднем составляла 13 мВ. Продолжительность ЦЦС варьировала от 0.8 до 11.6 сек, и в среднем составляла 5.6 сек.

Как спонтанные, так и вызванные ПДС возникали синхронно в различных нервных клетках, не связанных друг с другом синаптичес-шз 'связями. Таким сйразом, удаление магния из среды, омывающей нервные клетки виноградной улитки, приводило к синхронизированному возбуждению синаптически ье связанных нервных клеток, что является характерной особенностью эпйлептиформной активности (Окуджава В.М., 1965) .

Влияние безмагниевого раствора на параметры спонтанных ВПСП идентифицированных неАронов виноградной улитки

Изменение активности специфических синапсов может индуцировать, иди предупреждать эпилептические приступы ( Н. Дж. Лега, 1982 ). Для выяснения вклада возбувдвщих синаптических вводов в развитие эпилептифэрмной активности в идентифицированных клетках было исследовано влияние безмагниевого раствора на спонтанный си-наптический приток нейронов ППа2, ППаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ. Проанализированы следующие параметры ВПСП: амплитуда, длительность, время достижения максимума и интервал между отдельными ВПСП. Было установлено, что распределения амплитуд ВПСП в фоне, в безмагниевом растворе и на отмытом препарате достоверно отличались друг от друга ( а « 0.01 ). Среднее значение амплитуда ВПСП увеличивалось на 160% по сравнению с фоном. Изменялся также интервал мэаду отдельными ВПСП. Распределения интервалов меаду возбуждающими си-нвптическими потенциалами в фоне и в Сэзмагнивом раствора достоверно различались ( а < 0.01 ). Среднее арифметическое этого параметра уменьшалось на 81. %.' Сопоставление продолжительности ВПСП и величин времени достижения максимума ВПСП в фоне, в безмагниевом растворе и на отмытом препарате не выявило существенных изменений в распределении этих параметров в указанных условиях. Таким образом, отсутствие ионов магния приводило к усилению эффективности возбудительной .синаптической передачи. Это позволяет предполагать, что эпилептяформные разряды в этих нейронах имеют синаптическую природу.

ВШШНИВ ЛИКВОРА БОЛЬНЫХ НЕВРОПОГИЧЕСКИШ!

ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ' НА НЕЙРОНЫ ВШШГРАДНОИ УЛИТКИ

Влияние ииквора больных шизофренией на активность нервных;клеток виноградной улитка

Проведено исследование влияния ликвора больных шизофренией на активность нервных клеток виноградной улитки. Использовано 25 улиток. Опыты проводились- на идентифицированных ,( клетки ППа2,

ППаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ, ЛПаБ, ППаб. В4 ) и неидентифицированных нейронах виноградной улитки. Под влиянием ликЕора в молчащих клетках увеличивались пороги генерации ДЦ, уменьшалось количество потенциалов действия в ответах на внутриклеточную стимуляцию деполяризующим током, кроме того, увеличивался латентный периодответа клеток на раздражение точек их рецептивного поля, уменьшалось количество ДД в ответах. Среди фоновоактивных нейронов были клетки как с тормозными, так.и с возбудительными ответами на апшп кацию ликвора больных шизофренией.

Влияние ликвора Сольных шизофренией я дийетилсульфоксида на параметры спонтанных ВЛСП идентифицированных нейронов

Исследовано влияние ликвора больных шизофренией на спонтанный синаптический приток нейронов ППа2, ППаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ. Проанализированы следующие параметры ВПСП:> амплитуда, длительность, время достижения максимума и интервал между отдельными ВПСП.

Было установлено, что распределения амплитуд ВПСП в фоне, в растворе ликвора больного шизофренией и на отмытом препарате достоверно отличались друг от друга ( а ^ 0.01 ). Ликвор больных шизофренией увеличивал среднее значение амплитуды ВПСП на 43% , при этом средние значения амплитуда ВПСП были выше, чем в фоне на протяжении всего периода аппликации ликвора. Отмывание не возвращало полностью характер распределения ВПСП к фоновому, но устраняло наиболее высокоамшштудные ВПСП. Распределение амплитуд ВПСП возвращалось, к фоновому под влиянием раствора днметилсульфоксида ( 0.01% ) ( а € 0.7 ).

Сравнение распределений длительности ВПСП показало, что во время аппликации р^стйорв ликвора больных шизофренией преобладают более короткие ВПСП. Отмывание не возвращало распределение длительности ВПСП к фоновому. Различия выборок длительности ВПСП в фоне, в растворе ликвора, на огмытйм препарате были статистически достоверны ( а < 0.01 ). Ликвор больных шизофренией не влиял на время достижения максимума ВПСП.

Интервал мэвду отдельными ВПСП изменялся под влиянием ликвора больных шизофренией. Среднее значение интервала уменьшалось

на 2535 ( С.О- = 10 ). Распределения интервала меаду ВПСП в фоне, в растворе ликвора больного шизофренией и на отмытом препарате достоверно отличались друг от друга ( а * 0.01 ). Дшгетилсульфок-сид возвращ'ал распределение интервалов между ВПСП к фоновому.

Влияние ликвора больных эпилепсией на активность нейронов виноградной улитки

В этой серии опытов использовано 20 улиток. Было установлю но, что ликвор больных эпилепсией изменял параметры биоэлектрической активности нервных клеток виноградной улитки. В клетках ППа2, ППаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ, ЛПа5, ВЗ, ППаб ликвор повышал пороги к деполяризующим токам более чем в 2 раза, угнетал ответы клеток на афферентные стимулы. Указанные изменения развивались в клетках через 5-10 мин после начала аппликации ликвора. Отмывание не возвращало нейроны в исходное состояние. Фоновоактивнне нейроны под влиянием ликвора больных эпилепсией реагировали либо тонической деполяризацией мембраны, либо двухфазно: вначале клетки гиперполяризовались ( I - 1Б мин ), затем - деполяризовались.

Влияние ликвора больных эпилепсией и диыетилсульфоксида на параметры спонтанных ВПСП идентифицированных нейронов

Исследовано влияние ликвора больных эпилепсией на спонтанный синаптическпй приток нейронов ППа2, ППаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ. Установлено, что в растворе ликвора больных эпилепсией через 0.5-1 мин после начала аппликации параметры ВПСП изменялись. Расправления амплитуд ВПСП в фоне, в растворе ликвора больного шизофренией и на отмытом препарате достоверно отличались дру: о* друга ( а < 0.01 ). Под влиянием ликвора среднее значение амплитуда ВПСП возрастало па 40% ( С.О. = 5 ). Средние значения амплитуда ВПСП в растворе" ликвора были выше, че>м в фоне на протяжении всего периода аппликации ликвора. Отмывание не возвращало полностью характер распределения ВПСП к фоновому. Характер распределения амплитуд ВПСП возвращался к фоновому под влиянием раствора диматил-сульфэксида ( 0.01 % ).

Распределения интервалов меаду ВПСП в фоне, в растворе лик-вора больного эпилепсией и на отмытом препарате достоверно отличались друг от друга ( а < 0.01 ). В среднем, в растворе ликвора значение интервала уменьшалось не 84%. Аппликация раствора диме-тилсульфоксидв после раствора ликвора больного эпилепсией приводила к восстановлению распределения интервалов меаду ВПСП. Сравнение распределений выборок значений интервалов между ВПСП в нормальном физиологическом растворе и в растворе даметилсульфоксйда показало их идентичность ( а ^ 0.13 ). Сопоставление длительности ВПСП и времени достижения максимума ВПСП в фоне, в растворе ликвора больных эпилепсией и на отмытом препарате не выявили отличий распределений этих параметров в указанных условиях (а ^ 0.19 ).

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ДЕЛЬТА-СНА НА НЕЙРОНЫ ВИНОГРАДНОИ УЛИТКИ

Эффекты пептида в нормальной фиэиологическоп растворе

Исследовано 12 идентифицированных и 9 нвидентифицированнш нейронов. Были идентифицированы клетки ППа2, ППаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ, ЛПа5, ЛПа9, ППаб, В1, ВЗ, В4, В6, ВН. Пептид дельта-сна изменял параметры биоэлектрической активности исследованных клеток: паттерн активности, мембранный потенциал, реакции на поляризующие токи. Уквзаннне изменения' происходили на фоне гиперполяризации мембранн идентифицированных клеток и зависели от дозы вводимого вещества. У фоновомолчащих клеток ( нейроны 1Ша2, ППаЗ, ЛПа2, ЛПпЗ, ЛПаЭ, ЛПаб ) пептид усиливал аккомодацию к деполяризующим токам. Так, например, в концентрациях 2 х Ю-8 - 2 х 10 М ДСИП уменьшал количество потенциалов действия в ответахна деполяризующий ток клеток ПГЙ2,1 а в концентрациях 2 .х Ю-5 - 2 х Ю-4 М полностью подавлял ответы молчащих клеток на внутриклеточное раздражение. Фоновоактивнне нейрины ППаб, В6, В4, ВЦ тормозились в растворах пептида. В более высокой'' концентрации пептид дельта -сна приводил к более выраженному торможению нейронов. Из 3 исследованных невдентифицированных нейронов 2 клетки не реагировали на введение пептида, Z возбуждались, б реагирввали торможением.

Влияние пептида дельта-сна на синаптичесхую передачу

Нами такта было исследовано влияние ДСИП на моносинаптичес-ки связанные нервные клетки ЛПаЗ и ЛПаЭ. В ответ на ЦЦ, вызванные вну триклэточным раздражением клетки ЛПаЭ, либо раздражением рецептивного поля данной клетки, в нейроне ЛПаЗ возникают ВПСП. Связь является мопосинаптической ( Аракелов Г.Г. и соавт., 1989). При введении ДСИП в концентрации 2 х 1СГе М в клетке ЛПаЭ увеличивались пороги генерации ПД. Мембранный потенциал нейрона возрастал с -39 —40 мВ до -46 —49 мВ.

В растворе Рингера нормального состава мэкду амплитудой ВПСП постсинаптического нейрона ( А ) и интенсивностью деполяризующего тока, стимулирующего пресинаптический нейрон ( 1з ) существовала линейная зависимость. Коэффициент корреляции между этими величинами составлял 0.69. Зависимость описывалась уравнением линейной регрессии вида: А = 1.681э + 2.15. Аналогичным,образом амплитуда ВПСП постсинаптического нейрона зависела от величины мембранного потенциала ( МП ) пресинаптического нейрона. Коэффициент корреляции между этими величинами составлял 0.69. Зависимость описывалась уравнением линейной репрессии вида А = 0.23МП + 15.2. Анализ зависимости между указанными параметрами в раствора пептида дельта-сна показал, что ДСИП устраняем корреляционные связи между амплитудой ВПСП и величиной мембранного потенциала пресинаптического нейрона и амплитудой- ВПСП и интенсивностью деполяризующего тока, стимулирующего пресинаптический нейрон.

Влияние пептида дельта-сна на эпилептифорннув активность

В концентрациях от Ю-8 М до Ю-4 М пептид дельта сна вносил изменения в патологический паттерн активности, вызванный удалением ионов магния из внеклеточной среды. В концентрации 10"® М пептид дельта-сна увеличивал интервал между отдельными ДДС,' в среднем на 68%, уменьшал, в среднем, на 3755 продолжительность ДДС и на ЗЗЖ количества ЦД в 1ЩС. ДСИП такие оказывал влияние на ДДС, вызванные электрическим раздражением нервов. В указанной концент-

рации пептид увеличивал среднее значение латентного периода между эпилептиформными разрядами на 3055, средний межишульсный интервал в ДЦС - на 63%; уменьшал продолжительность ЦЦС на 27%, количество ЦЦ в ПДС - на ЗСЖ .

ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИНА НА НЕРВНЫЕ КЛЕТКИ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

исследованы реакции 14 нейронов виноградной улитки. Два нейрона висцерального ганглия и два нейрона плеврального ганглия тормозились при аппликации серотонина ( Ю~& М ), два нейрона висцерального ганглия не реагировали и вясемь клеток возбуждались. Например, нейрон ЛНаб" в ответ на аппликацию серотонина генерировал шсокоамгаштудные потенциалы действия. Серотонин изменял также реакции этих клеток на поляризующие токи. В растворе серотонина у клеток ЛПа5 практически отсутствовало привыкание к деполяризующему току, наблюдался усиленный эффект посттормозной отдачи в ответ на действие гиперполяризующего тока. Аналогичным образом реагировали на серотонин нейроны ППа2, ППаЗ, ЛПаЗ/ ЛПа2.

Влияние серотонина на апилептиформную активность

Было установлено, что в нейронах, возбуждающихся под влиянием серотонина этот медиатор укорачивал интервал между отдельными эпилептиформными разрядами в среднем на 35£, т.е. повышал частоту появления НДС./ Одновременно с этим, серотонин увеличивал продолжительность ЦЦС указанных клеток. Это происходило за счет увеличения продолжи': элькости плато ПДС. Количество потенциалов действия в отдельных судорожных разрядах при этом, возрастало на 159%.

Исследования влщшия. серотонина на лароксизмальные деполя-ризационнне сдвиги в клетках, тормозящихся под влиянием 5-НГ показали, что серотонин в концентрации 10~® М устранял апилептиформную активность в вдах клетках. Таким образом, в клетках, воз-буждавдихся под влиянием серотонина, этот медиатор усиливал эпи-лептиформную активности, а в нейронах, тормозящихся под- влиянием серотонина - устранял ее.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе было показано, что некоторые нейроны виноградной улитки реагируют на удаление ионов магния из внеклеточной среды развитием пароксизмальных деполяризационннх сдвигов. Существует по меньшей мере 4 возможных механизма, которые могут приводить к возникновению ПДС в нейронах виноградной улитки, находящихся в безмагниевой среде: I) усиление входящих юков ( натриевых или кальциевых ), либо за счет устранения блокирующего действия ионов магния на кальциевые каналы ( Mayer H.L. and. Westbrook G.L., 1987 ), либо за счет уменьшения экранирующего эффекта ионов магния ( Косгюк п.Г., 1986 ); 2) усиление возбудительных синаптических токов .( Katz В. and Miledi В., 1968 ); 3) одновременная реализация обеих возможностей: усилегие•эффективности возбудительной синаптической передачи наряду с усилением'потенциал-зависимых входящих токов ( Dichter M.A..and Ayala O.F., 1987, ). Блокада, или ослабление выходящих токов, по-видимому, не реализуются ( Гелетюк В.И. и Казаченко В.Н., 1990 ). 'При аппликации раствора, не содержащего, ионов магния, мы наблюдали увеличение амплитуды ВПСП. Можно предположить, что для клгток с богатым си-наптическим притоком и не имеющих фоновой активности ( клетки ППа2, ППаЗ, ЛИа2, ЛПаЗ, ЛПа5 ) причиной возникновения ГЩЗ является усиление эффективности возбудительной синаптической передачи. Данные о синхронном возникновении пароксизмальных разрядов в не связанных синаптичес^тши контактами нервных клетках моллюска согласуются с результатами, полученными рядом авторов на других моделях эпилепсии ( Dichter M.A..anl Ayala С.F., 1987 ) и могут объясняться влиянием внеклеточного электрического поля -одного нейрона на активность другого ( Эзрохи В.Л., 1981 ).

Сопоставление эффектов ликвора Сольных неврологическими заболеваниями на идентифицированные нейроны виноградной улитки

В результате проведенного исследования было установлено, что лихворы больных шизофренией, эпилегсией вызывали как торможение, так и возбуждение нервных клеток виноградной улитки. Boa-

^ожно, знак ответа клеток на ликвор больных неврологическими заболеваниями связан с различной медиаторной специфичностью исследованных клеток. В наших экспериментах мы не обнаружили связи меаду знаком ответа нервных клеток на серотонин и характером ответа лейронов на ликвор больных неврологическими заболеваниями. По-видимому, в ответе клеток на ликвор рецепторы к этому медиатору не играют главной роли.

В ходе экспериментов по изучению влияния ликвора Сольных неврологическими заболеваниями на синаптический приток идентифицированных нейронов было установлено, что ликворы больных шизофренией и эпилепсией аналогично влияли на амплитуду и частоту ВПСП идентифицированных нейронов. Результаты об увеличении количества высокоамшштудных ВГОП при одновременном подавлении вызванных ответов идентифицированных клеток на афферентные стимулы, возможно, объясняются тем, что ликворы больных шизофренией и впилеппией вызывают неспецифическую гиперполяризацию гостсинапгической мембраны нейронов моллюска.

Полученные данные свидетельствуют о том, что характер ответа. нервных клеток виноградной улитки на аппликацию ликвора больных эпилепсией зависит от индивидуальных свойств электровозбудимой момбраны отдельных нейронов.

В серии экспериментов по изучению влияния диметилсульфоксида на активность нейронов. подвергнутых воздействию ликвора больных эпилепсией, было установлено, что диметилсульфоксид в концентрации 0.01% возвращает распределение амлитуды и интервала между отдельными ВПСП к фоновому. Результаты этих опытов являются косвенным свидетельством' того, что под воздействием ликвора больных эпилепсией в нейронах развивались процессы перикпсного окисления липидов.

Эффекты пептида дельта-сна на нейроны виноградной улитки

Нами было покааавс, что пептид дельтл-сна в концентрациях от 2 х I0"6 до 2 х Ю-4 М изменяет электрофизиологические свойства нервных плетор виноградной улитки, такие как мембранный потенциал, паттерн спонтанной активности, аккомодация к

деполяризующим импульсам тока.

Полученные данные согласуются с результатами других авторов, которые получили доказательства непосредственного влияния ДСИП на электрическую активность нейронов. ( Саргсян A.C. и соавт., 1981; Сологуб М.И и соавт., 1988 ).

Гшерло ляризукще е действие пептида дельта-сна на исследованные нами нервные клетки может быть результатом усиления хлорной проводимости, что характерно для действия ГАМК ( Schwar-tzkroln P.A. and Prince D.A., 1980 ), либо изменения активности аденилатциклазной системы, что характерно для многих рэгуляторных пептидов ( Ашмарин И.П., 1981; Кононенко H.H., Осипенко О.Н., 1988 ). Фактически это бы означало, что действие пептида дельта-сна направлено на постсинаптическую мембрану нервных клеток. Альтернативным механизмом действия пептида мокно считать ослабляющее действие ДСИП на синаптическую передачу. В экспериментах по изучению влияния ДСИП на моносинаптическук связь клеток ЛПаЗ й ЛПаЭ виноградной улитки мы установили, что пептид дельта-сна гиперполяризовал ' как пресинаптиче гадай, так и постсинаптический нейроны. Нейрон ЛПаЭ является фоновомолчащей клеткой, не получающей синап-тических вводов от других клеток в ганглии ( Арякелов Г.Г. и соавт., 1989; Тер-Маркарян А.Г. и соавт., 1990 ). Это означает, что в данном случае гиперполяризация клетки ЛПаЭ обусловлена непосредственным влиянием пептида дельта-сна на мембрану этого нейрона, Гигорполяризувдее действие пептида дельта-сна на мембрану клеток с богатым гинаптическим притоком может быть обусловлено как торможением пресинаптических по отношению к данным клеткам элементов в растворе пептида, так и непосредственным влиянием ДСИП на мембрану этих нейронов.

Угнетающий эффект пептида дельта-сна на эпилептиформную активность, возникающую в безмагниевом раствора, нельзя объяснить только гиперполяризующим действием пептида на мембрану нейронов, поскольку при гиперполяризацяи мембраны амплитуда деполяризацион-ных сдвигов увеличивается ( Rutecki P.A. et. al., 198? ). По-видимому, противосудорожный эффект пептида объясняется его влиянием на синаптическую передачу, возмож?о, именно нарушение корреляционной связи между величиной деполяризации пресинаптического

нейрона и амплитудой ВПСП в постсинаптической клетке служит фактором,. предотвращающим синхронизированное возбуждение и развитие пароксизмальных сдвигов в нервных клетках.

Отсутствие патологических изменений в активности нервных клеток при введении ДСЮ1 и обратимость его эффектов позволяют рекомендовать этот препарат для клинических испытаний в качестве противосудорокного средства.

Механизмы действия серотонина на вшлшггифорыную активность нейронов виноградной улитки

Механизмы действия серотонина на мембрану 'нейронов моллюсков относительно хорошо изучены. Известно, что.серотонин вызывает как активацию, так и ингябироваяве ц-АМФ-зависимых кальциевых ка-нвлов входящего тока ( Косткк П.Г. и соавт., 1990 ), кроме того, в нейронах ППа2, ШаЗ, ЛПа2, ЛПаЗ серотонин усиливает эффективность возбудительных вводов, увеличивает амплитуду ВПСП ( Балабан П.М. и соавт'., 1986; Чистякова М.В., 1987 ). Наши дйнные о возбуждающем влиянии серотонина на указанные клетки согласуются с результатами других авторов, которые описали деполяризущеа действие Б-НТ на командные нейроны виноградной улитки ( Чистякова U.B., 1987 ). Согласно полученным нвми результатам, в клетках, для которых серотонин является возбудительным медиатором, он усиливал судорожную активность: увеличивал частоту ЦДС, количество ПД в них, длительность плато. Эти эффекты серотонина могут объясняться как его активирующим влиянием на синаптическую передачу, так и активацией входящад кальциевых токов. Ьротивосудорожное действие серотонина на нейроны, которые тормозились при его аппликации может'Сыть связано с тем, что в этих клетках серотонин уменьшал входящие кальциевые токи. Полученные данные говорят о том, что серотонин в качестве.противосудорокного средства следует применять с осторожностью, поскольку в мозге млекопитающих, наряду с нейронами, для которых серотонин являемся тормозным медиатором, существуют клетка, возбуждащиеся под влиянием серотонина ( Yakel J. et. al., 1988; Takahashl T. and Berger A.J., -1990 ').

ПД в них, длительность плато. Эти эффекты серо тонине могут обьяс-няться как его ектнвиругарм влиянием на синаптическук передачу, гак и активацией входящих кальциевых токов. Противосудорокное действие серотонина на нейропы, которые тормозились при его аппликации мокет Сыть связано с тем, что в этих клетках серотонин умсньаал входящие кальциевые тога». Полученные данные говорят о том, что серотонин в качестве противосудсрокного средства следует применят* с осторожностью, поскольку в козго млзчсштагащх, наряду с нейронами, для к о тори серотонин шляется тормозным медиатором, существуют клетки, возбуждающиеся под влиянием серотонина I Yakel J. et. al., 1988; Takahashi T. and Berger A.J., 1990 ).

вывода

1. В системе нейронов кодглоточного ганглия виноградной улитки выявлена клетки, реагирующие на удаление ионов магния из внеклеточного раствора пароксизмалышии дзголяризацашными сдвигами ( ВДС ) мембраны, характерными для злилептиформной активности. По характеру таких ПДС выделены 2 типа нейронов: I) активные клетки, ПДО которых, достигая критического уровня, приводят к инактивации спайк-генарирущего механизма и к образованию плато-потенциала ; 2) пассивные клетки, НДС которых не достигает критического уровня деполяризации, необходимого для инактивация механизма генерации распространяющегося потенциала действия. Поскольку нервные клетки виноградной улитки поддаются идентификация, препарат ВДС молласкя, помещенный в безмагниеэу» среду мсжэт слупить удобной моделью экспериментальной эпилепсии.

2. Влияние ликвора больных шизофренией не иденч кфицкроввп-ныв нейроны виноградной улитки сходно с эффектом ликвора больных эпилепсией, что свидетельствует об огсутсвии выракеннсй специфичности в действии ликворов больных этими формами патологии на ней-ооны виноградной улитки.

3. ЛикБоры больных шизофренией и эпилепсией различным образом влияют на различные нейроны ганглия виноградной улитки: депо-

ляризуют одни клетки и гиперполяризуют другие. При этом аналогии мэзду знаком реакции клеток на ликвор и ответом их на безмагниевую среду не обнаружено.

4. Наличие тормозни, и возбудительных ответов на ликвор оольних неврологическими заболеваниями свидетельствует о том, что знак ответа клеток зависит от -свойств електровозбудимой мембраны каждого нейрона.

Б. Показано, что диметалсул^фэксид в концентрации 0.01%, устраняет эффекты ликворов больннх этой формой патологии на электрическую активность нейронов виноградной улитки.

6. Эффекта серотонина и пептида двльм-сна на иденти£вдиро-вшшда нейроны противоположны.

7. Пептид дельта-сна в концентрациях от 2 х Ю-8 М до 2 х

И угнетает эпилептиформную активность, вызванную аппликацией

безмагниевого раотвора на нейроны виноградной улитки. Отсутствие токсических эффектов ДСИП, а также обратимость его действия позволяет считать перспективны!»! использование этого препарата для клинических испытаний в качестве противосудорокного агента.

3, Серотошш в концентрации I х 10 м уоиливает эпилептиформную активнооть яейронов, для которых он является возбудительным -медиатором. Поэтому при использовании Б-НТ ( или его предшественников ) в качестве специфического медикаментозного средства следует соблюдать значительную осторожность, в частности, вряд ли мокно его рекомендовать в случаях локализации эпилептиформной активности в структурах с сёротонинэргической иннервацией.

Спгсок научных работ, опубликованных по теие диссертации.

I. Реакции вденгифвдрованных нейронов виноградной улитки на действие ыедиаторных: веществ. Деп. в ВИНИТИ, 1988. ( Совместно с Карпенко Л.Д., Орлов«« В.И., Левченко Е.П. ).

2. Влияние пептида дельта-сна ( ДСИП ') на импульсную активность нейронов виноградной улитки. В сб. тезисов докладов конференции молодых, ученых, Ростов-на-Дону, 1988, с. 33. ( Совместно с

Левченко Е.П. )

3. Влияние серотонира на реакции идентифицированных нейронов виноградной улитки. В сб. тезисов докладов конференции " Простые нервные.системы " , 1988, о. 9 - 10. ( Совместно с Карпенко Л.Д., Орловым В.И., Левченко Е.П.).

4. Влияние двльта-сон-индуцирувдего пептида на активность нейронов виноградной улитки. Ъ сб, тезисов 2-й Всесоюзной конференции по нейронаVK3M, Киев, 1988, с. 122 - 123. ( Совместно с Карпенко Л.Д. )

6. Детекторные свойства идентифицированного нейрона виноградной улитки. В сб. Проблемы нейрокибернэтаки, Ростов-на-Дону, РТУ, 1989, с. 10. { Совместно с Карпенко Л.Д. ).

6. Детекторные, свойства идентифицированного нейрона виноградной улитки. В сб. тезисов докладов конференции молодых ученых, Ставрополь, 1989.

7. Влияние пептидов на привыкание нейронов дуги. оборонительного рефлекса виноградной улитки. В сО. тезисов докладов 28 совещания по ВЩ1, Ленинград, 1989. ( Совместно с Карпенко Л.Д. и Орловым В.И. ).

8. low extracellular magnesium induces upileptifora activity in Helix lucorum neurone. В об. тезисоз докладов конференции "Simpler nervous systems " < " Простые нэрвные системы ' ), 1991, с. 40. ( Совместно с KarpenKo b.D. & Filin N.N. ).

9. Delta sleep-Indue tag peptide effect on paroxysmal depolarization shifts in enall neurons. В сб. тезисов докладов конференции " Simpler nervous system " ( " Простые нервные системы " ), 1991, с.5. ( Совместно с XarpenKo L.D. ).

10. liquor of patients with neurological deaeases affects the exitabillty of snail neurons. В сб. тезисов докладов конференции " Sinpler nervous, systems " ( " Простые нервные системы * ), 1991, о. 26. ( Совместно с Filin N.N. & Karpenko L.D. ).

Список сокращений

ВПСЙ - возбуждающий синаптический потенциал

ДСИП - дельта-сон индуцирующий пептид

ВДО - пероксизмальный дедаляризапионный одвих'

С.О, - стандартное отклонение

5-ИГ - Б-гидрокситриптемин ( серотонин )