Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пластичность хемо- и электровозбудимых мембран нейрона: регуляция опиоидами и вторичными посредниками

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Пластичность хемо- и электровозбудимых мембран нейрона: регуляция опиоидами и вторичными посредниками"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА _БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ_,

п р л На правах рукописи

ОД

М%ШШАРОВ Аркадий Саулович

ПЛАСТИЧНОСТЬ ХЕМО - И ЭЛЕКТРОВОЗБУДИМЫХ МЕМБРАН НЕЙРОНА: РЕГУЛЯЦИЯ ОПИОИДАМИ И ВТОРИЧНЫМИ ПОСРЕДНИКАМИ

03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выложена на кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Официальные оппоненты: академик Российской Академии Образования,

доктор биологических наук, профессор Соколов E.H.

доктор биологических наук Балабан П.11.

доктор биологических наук, профессор Чедурне® С.А.

Ведущая организация: ИНСТИТУТ ИОЗГД Российской Академия иедццивскнх Наук

Защита диссертации состоится " 2% и И1995 г. в 15■•!><> часов на заседании Специализированного ученого совета Д.053.05.35 при Биологическом факультете МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: II9899, Москва ,• В-234, Воробьевы горы; МГУ; Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МРУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 23 " ä о JA 1995 г.

Ученый секретарь

/И

специализированного совета, , I

кандидат биологических наук

О

Уызровя Б.А.

- ОЕЩЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пробдзш. В основе разных еидов обучения и памяти лзхит. пластичность нервных клеток [Котляр, 1989], которую определяет, как способность к временному изменению реактивности под влиянием последовательных, постоянных по силе раздражений [Конорски, 1970], или при их ассоциировании с другая: стимулами [Котляр, 1389]. Пластические изменения приводят к юдификациям клеточной и синоптической функции, которые позволяв? объяснить простые изменения поведенческих реакций [Кэндел, 1980; • Bawitíüs et al., 1993]-. Изучение пластичности нейронов в моделях, иштирушщх поведенческие явления, необходимо для понимания их кеханизмов на клеточном уровне [Кзндел, 1980; HawfcLns et al., 19931-

При решении вопроса о локализации пластических сдвигов мнения исследователей разделились. Согласно результатам одних авторов местом активных пластических перестроек является пресинаптическая терминаль [Kandel et al., 1970; Zucker, 1972; Krasne, Bryan, 1973; Farel, Ihompson, 1976; Shiaahara, Tauc, 1978; Воронин, 1982]. Результаты публикаций других авторов свидетельствует о локализации механизмов пластичности • на уровне постсинаптическах структур [Соколов, 1969, 1981; Stephens, 1973; tfoody, BlacK-Cleworth, 1973; Штоловский» Пивоваров, 1975; lynah et al., 1976; Alton, 1984]. Активные механизмы пластичности модифицирует ' электрогенез плазмалемш постсшаптического нейрона. Возбудимость хемо- и эдегсгровозбудимых мембран определяет их реактивность. Поэтому анализ параметров возбудимости мембран при пластических перестройках реактивности может выявить нейрофизиологический механизм пластичности на постсиваптическом уровне.

Эндогенные опиоида влияют на формирование, фиксацию и воспроизведение временных связей, т.е. контролирует все операции функции памяти [Ашмарин, 1977; Steia, Beluzzi, 1978; Izquierdo, 1979; Izquierdo et al., 1980; Кругликов и др., 1980; Rigter et al., 1980; Кругликов, 1981; Hartinez, Rigter, 1982; Ашмарин, Кругликов, 1983; Olson et al., 1984; Sohiadler at al., 1936; Martínez et al., -1988]. Пластичность нейрона в экспериментальных моделях о'бучения должна находиться под модуляторнш контролем опиоидов. Модулятфхша эффекты опиоидов могут иметь определенные особенности, связанные с типом активированных опиатных рецепторов.

Пластичность нейрона в экспериментальных моделях обучения находится под контролем внутриклеточных регуляторов - вторичных

посредников. Исследования в данной области начались с неудачной попытки связать простые формы обучения ашшзии с синтезом белка в ее нейронах [Бс^тахЧа et а1., 1971]. Это обстоятельство позволило Э. Кэнделу [1980] предположить, что механизмы кратковременных пластически перестроек состоят из ряда реакций, при которых происходит' синтез низкомолекулярных веществ, а на образование новых структурных, рецепторных или ферментных белков. К этому временя ухз была сформулирована концепция "вторичного посредника" [Би1Ь.ег1ап1 а!., 1962], что и полонило начало исследованиям роли вторичных посредников в пластичности нейрона. • Целесообразно провести сравнительной исследование роля разных вторичных посредников в пластичности хемовозбудамой макбрани на одной модели и выяснить схему внутриклеточных регуляторных путей с их участием.

Опиатные рецептора, через которые опиоида контролируют активность нейронов, сопряжены через сьбелки . с вторичными посредниками: сайр, сайр, внутриклеточным Са2+ и его рецептором кзльмодулшш [Азке;?, СЬага1ашр,оив, 1976; Шипетап, Хуегвеп, 1976; ВагаеНо, 1983; Гейтов а!., 1983; ЯехЧг, ЫаойоваЛД,

1983, 1984; БсМсаЬага, 1сагй-Ыерка1пз, 1937; Йшэ1тге1аз еЪ а1., 19В8; ШЛ.11«аа, ЫсКепг19, 1983; АПа11 ей., 1989; РеаупуаМп, Ьео, 1989]. Ыоаю предполагать, что эндогенные опиоиды регулирует функции нейрона (в тон числе и его пластичность) через система вторичных посредников, сопряженных с опиатнаыи рецепторами.

Цзяь работа. Изучение закономерностей пластичности хеко- и электровозбудашх камбрая нейрона в экспериментальных моделях, обучения и кеханнзыов ее регуляции ошоидаш и вторичными посредниками.

Задачи иссявдопадая.

1. Анализ параметров возбудимости хеш- я элактровозбудиыых ыекбрав нейрона в экспериментальных моделях обучения.

2. Особенности модуляции агонпстгыз разных опиатннх рецепторов пластичности хешвозбудашх кеыбран нейрона.

3. Роль взаимовлияний разных ошатных рецепторов прп модуляции опшндаыи пластичности хеыовозбудкыых мембран нэЕрона.

4. Вторичные посредники в регуляция ' пластичности холинорецептшшз: иембрав нейрона.

5. Участие вторичных посредников в молекулярном механизме модуляции тшолдакп пластичности холинороцеигивных кекбран нейрона.

Новизна результатов. • ■

1) Универсальный механизм пластичности хемо- и элэктровозбудимых мембран нейрона в экспериметальных моделях обучения включает изменение их возбудимости (чувствительности хемовозбудимых ■ мембран к ляганду и порога спайкгенерируюших • мембран), распространяющееся но всей плазмалеша.

2) Степень пластичности холанорецептивных мембран коррелирует с соотношением холиноредапторов (ХР), управлящих проводимостью разных ионов. ' • •

3) Направление- а' степень модуляции пластичности хемовозбудимых мембран нейрона опиоидами определяется типами активированных ощатных рецепторов и характером их взаимовлияний.

4) Многозвенные регуляторные молекулярные механизмы: пластичности ХР нейронов виноградной улитки (сниеэния их чувствительности при ритмической активации ацетшшшшш (АХ) (i); разнонаправленной регуляции пластичности ХР нёйронов виноградной улитки ациклическим эйкозаноидом 15-гидроксиэйкозатетраеновой кислотой (И), ослабления пластичности ХР нейронов виноградной улитки опиатным каяпа-агонистом бремззощшом (iii) ж отрицательной регуляции активности ХР нейронов садовой улитки эндогенным пептидом моллюсков 2КРТНК?акидом (iiii), реализуются через влияния на уровень нескольких "вторичных посредников, объединенных способностью повышать концентрацию свободного Са2+ в цитоплазме.

Теоретическое значение работы. Результаты работы вносят вклад в исследование закономерностей мембранной пластичности центрального нейрона в экспериментальных моделях обучения и раскрывают механизмы вне- и внутриклеточной регуляции пластичности нейрона ошоидами и вторичными посредниками.

Практическое значение работы состоит в возможности применения полученных результатов в молекулярной медицинской фармакологии для целенаправленного синтеза соединений - вероятных лекарственных средств, с цельв фармакологической коррекции пластичности нейронов и мзхнейронной синаптической передачи, определяющих характер и степень обучения на системном уровне; а таквз модуляции активности холинергической системы мозга, 'расстройства которой наблюдаются при ряде патологий. v4

Результаты работк включены в курс лекций "Пластичность нервной ' системы" для студентов Биологического факультета Московского государственного университа им. М.В.Ломоносова.

Основша положения, выносимые на зацхгу.

(1) Обратимые изменения возбудимости хемо- и электровозбудЕгз. мембран нейрона - универсальный механизм пластичности Езрвной клетки в экспериментальных моделях обучения.

(2) Изменения возбудимости хемо- и электровозбудашх. мембран охватывают вех мембрану нейрона (генерализация пластических изменений возбудимости), хотя стимул ее вызывающий активирует только локальную область пяазмалешш.

(3) Эндогенные опиоиды контролируют пластичность хеморецепторав нейронов зрительной. коры черепахи - через сшатнне рецепторы шь, дельта-, каша- и сигма-типов. Направление и степень модуляции зависит от типа активируемых олиатных рецепторов и характера их взаимовлияний. ^

(4) Пластичность ХР нейронов виноградной улитки, сопровоЕдахцаяся снижением их чувствительности к ¿X, регулируется несколькими, вторичными посредниками, объединенными способностью . увеличивать концентрацию свободного са2+ в цитоплазма путем стимуляции мобилизации депонированного Са2+ и хемоуправляемого входа са2+ из внеклеточной среда.

(5) Вторетный посредник 15-гидроксиэйкозатетраеновая кислота регулирует , пяастичность ,. ХЕ нейронов виноградной улитки _ в противоположных направлениях, действуя разнонаправленно на уровень Саг+-шбилизувдих вторичных посредников.

(6) Агонист ошатннх каппа-рецепторов бремазоцин ослабляет пластичность ХР нейрона ППаЗ виноградной улитки, снигая уровень Са2+-мобшщзущих вторичных посредников.

(7) Новый эндогенный 1Ш?амид-подобный гептапептид моллюсков БКРУМКРамид участвует в отрицательной авторегуляции активности нейронов гч, гг, у а и р5/6 садовой улитки - тормозит их возбуадавдие ХР, повышая базальный уровень Са2+-мо0илиз;пцих вторичных посредников в цитоплазме.

Адробащя работа. Материалы диссертации долохены на П Ыевдународной конференции стран-членов СЭВ по основным проблемам бионики "Бионика-78" (Ленинград, 1978); П Всесоюзной межуниверситетской конференции -молодых ' • ученых "Современные проблемы биологии" (Тбилиси, 1980); У1 и УП Международных нейробиологичесшга симпозиумах по обучению и памяти (Магдебург, ГДР, 1980, 1935); П Всесоазном съезде эндокринологов (Ленинград, 1981); УШ и X Совещаниях по эволюционной фщяалопеа (Ленинград,

1982, 1990); IX Всесовзной конференции по Снохе,ян цершой системы (Ереван," 1933); I конференции по нейронаукгм (Бакурзани, 1934); Всесоюзном симпозиума "Нейрохимические механизмы регуляции, памяти" Шущипо, 1934); 'опшоэнумэ "Система мозговых и внемозговых пептидов" (Ленинград, 1984); Всесоюзной конференции, посвященной 100-летив со дал решения академика И.С.Берагшввши "Современные проблемы фенологии нервной и глшетаой систем" (Тбилиси, 1985); I и П Всесоюзных конференциях "Простые нервные системы и иг значение для теории и практики" (Казань, 1985, I9S8); 1У -Всесовзной конференции "Физиология И'Скохтшя кодиаторных процессов" (Москва, 1985); I Всесоюзной конференции "Нейропеятиды: их роль в физиологии и патологии" (Томск, 1935); Всесовзной конференции "Современные проблемы нейробиологии", посвященной 50-летих> Института физиологии ем. И.С.БериташБИлн (Тбилиси., 1985); ХУ съезде Всесоюзного физиологического общества да. И.П.Павлова (Кишинев, 1987); Всесоюзной конференции, посещенной 80-лети» со дня роздения члена-корр. АН и АПН СССР Л.Г.Воронина "Сравнительная физиология высшей нервной деятельности человека и животных" (Москва, 1988); У1 Всэ сошном симпозиуме "Роль циклических вуклеотидов и зтсржчных посредников, в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988); П и Ш Всесоюзных конференциях по нейронаукгм (Киев, 1988, 1990); 12 а X Всесоюзных гопференциях по нейрокибернзтгке (Ростов-на-Дону, 1839, 1992); ХХУШ Совещании по проблемам высаэЯ нервной деятельности (Ленинград, 1989); Международном сшпозпуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции" (Тбилиси, 1989); Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторшых систем" (Таллинн, 1990); Региональных конференциях йездузародного общества нейробюлогиа беспозвоночных (ISIN) "Простые норЕЕые систзш" (Минск, 1991; Пушво, 1994); Всесоюзном свшозиуме "Нейрофизиологические механизмы обучения" (Киев, 1991); Российской научной конференции "Создание лекарственных средств" (Купавна, 1992); симпозиуме стран СНГ Нута передача внеклеточного сигнала" (Звенигород, J993); ХХХП конгрессе Иеадународного союза ЗкзиологЕческих наук (OTPS) (Глазго, Шотландия, 1993); Х1У конгрессе Международного' общества нейрохкшш' (XSH) (Монпелье, Фронния, 1993); е негодной инициативной рабочей конференции по вэйробиологии беспозвоночных Совета по научным и техническим исследованиям (SERC) БзликоСриташш (НейроСнологичеошй центр в Сэссексе, Великобритания, 1993); XI конференции Ассоциации

- б -

исследования мозга (bra) (Саутхемптон, Великобритания, 1994); а также йа заседаниях кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ.

Публикавди. По теме диссертации опубликованы 55 статей и, 55 тезисов докладов.

Структура к объем работа. Диссертация включавг:' введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, экспериментальную часть (3 раздела, 12 глав) с изложением результатов исследований и их обсуждения, заключение, вывода, список цитируемой литературы.

Объем диссертации 561 стр., в том числе: текст (283 стр.), 140 рисунков (147 стр.), 30 таблиц (40 стр.), 6 схем (8 стр.); список литературы (78 стр. ) содержит 646 источников, из которых 152 на русском язнке и 494 на иностранных.

штнгаш и метода исследовании

Объекты ассладований. В экспериментах использовала идентифицированные найроны брюхоногих моллюсков - виноградной (Helix lucorum taurtca Eryn) и садовой (Helix азрегза I.) улиток, а также нервные клетки перивентрикулярного слоя зрительной коры переднего мозга'и "нейроны Ill-rv слоев tectum opticum (зрительного центра) среднего мозга болотной черепахи (Eimjs orbicularis L. ).

Применен препарат изолированных ганглиев моллюсков. На черепахах проводили острые опыты после обездвиживания 0,2-0,3 мл 0,7-2,OS раствора дшиацина.

В работе на виноградной улитки исследования проведены на нейронах ЛПаЗ (из левого), ППаЗ и ППа4 (из правого) париетальных ганглиев. В отдельных сериях использованы нейроны: ЛПа2, ЛПл1, Iïïlal, Ша5, BI, В2, ВЗ, В4, В5, В6, (идентификация по Сахаров, 1974). По функция. ЖаЗ и ППаЗ - командные нейроны оборонительного поведения, участвуют в сокращении мантийного валика и дахгльцз еивотного [Машкова, Балабан, 1983; Иерусалимский и др. 1992].

В работе на садовой улитке исследования выполнены на Еейронах Р1, У2, Р4 и Ï5/6 из правого париетального ганглия (идентификация по Kerlrut et al.. 1975; Balker et al., 1993).

Регистрация, регистрировали трансмембранныз ионные токи нейронов виноградной и садовой улиток методом двухалектродной фиксации потенциала на мембрана пра nouons высоковольтного усилителя для из^гршдш тока обратной cmmi по падении нзттрл^аяия

на сопротивлении.1,5 ÎSJ или усилителя Axoolamp 21 (рогим ТЕ7С). В ряда экспериментов использовали однозлектроднув фиксацию потенциала с помощь® усилителей SEVC (БЙМКР, Нянек), 8100 (bagАН) и Axocianp 21 (рехам SSVс). Токи записывали на самописцах КСП-4 (МЗМ), 7402А (Hewlett Paooard, США.) и BD40 (KIPP & ZONES).

Для регистрации внутриклеточных потенциалов использовали шпфоэлектродные цредусижтеди: I) конструкции Сергеева, Неверовского [1970], 2) ЫЫ-8101 (ШЪоп Kohden, Япония), 3) MEZ-8201 (Nihon Kohden, Япония), 4) однозлектроднув систему 8100 (DAGAN, США), 5) Aioolarap 2А (Axon Instruments, ЙШ В режиме "BRIDGE4. Потенциалы записывала на бумагу чернильными самописцами ÏÏI-641G (Nihoa Kohden, ЯПОНИЯ), Н338-6П.

Внутриклеточные микроэлектроды вытягивали из стекла ГОСТ 1224-41, пирекса, боросиликатного стекла (ЯР1, (Ж; Clark Electromedical Instruments, Великобритания) и заполняли цитратом К+ (2 М; 2,5 М), ацетатом к+ (2 М) или хлоридом к+ (2,5 М).

Вызванные потенциалы (ВП) регистрировали монополярно с поверхности зрительной коры черепахи электродом из серебряной проволока диаметром 50 рм и записывали на кинопленку фоторегистратором ФОР-2 (ЭЖЖ).

Химическое раздражение. В опытах на нейронах улиток системное химическое воздействие при постояннном протоке .через камеру раствора Рингера состояло в замене нормального раствора на модифицированный. При методе остановленного протока добавляли микрошприцем (Hamilton, Швейцария) или дозатором (ïiimplpette, Фшпяндия) аликвоты растворов веществ (1-100 цл), что обеспечивало расчетную концентрацию соединений в проточной камере и гомогенность окружающего препарат раствора.

Локальная Енаклеточная микроионофоретическая аппликация. Инъецировали AI-хлорид (Sarva, ФРГ; Sigma, США.); ДХ-бромид (Sirria, (Ж); езротонш-крэатишгн сульфат (Реанал, Венгрия; sigma, США) и Leu-эзкефалин (Serva, ФИ"). Использовали две схемы ионофоретической аппликации: с источником тока изолированным (1 ) и неизолированным (2) от земли (ионофоретичвекза модули системы S7000 /WPI, США/ и c&N). Форетическив гоки катионного направления варьировали в разных опытах по величине (I-I300 НА) и длительности (0,1-10 с).

В опытах на нейронах мозга черепахи для форетической внеклеточной ■ аппликации и одновременной внутриклеточной

регистрации потенциалов использовали блок из трех микроэлектродов: центральный слухшл для регистрации, два боковых для микроионофэреза [Пивоваров, Трепаков, 1982]. При изготовлении блока микрозлектродов применяли оригинальный микроыаяшулятор [Пивоваров, Трепаков, 1982; Трепаков, Пивоваров, 1982].

Внеклеточную' локальную аппликацию под давлением применяли на нейронах улитки. Вещества выводили в количестве4 0,2-2500 пмоль в объемах 0,2-1200 нл из инъекционных пипеток, подведенных к соме нейрона на расстояние 10-30 рд. Для инъекции использовали нанолитровый насос-1400 (w?I, США), поршневой шгьёктор Ю,!-2 (НТО АН СССР, Черноголовка) и Pioocpritser II (CY General Value Corporation).

Локальную аппликацию вевдств на поверхность коры черепахи проводили микроацрицем в объеме 1-2 цл раствора непосредственно на поверхность шзга.

Внутриклзточно инъецировали соединения в опытах на нейронах виноградной уягтки через отдельную внутриклеточную пипетку (cGSff) или из регистрирующего внутриклеточного микрозлектрода (активаторы о-белков, полгфасфознозитиди).

В работе исследованы эффекты 82 соединений: агоннстов и антагонистов • ацетлхолиновых, серотониновых, дофаминовых и опиатных рецепторов; нейропептида моллюсков SKPYME?амида ; активаторов и блокаторов ионных каналов; модуляторов систем вторичных посредников.

Поларизгагд) нейронов улитки проводок через второй внутриклеточный ыикроэлактрод. На нейронах черепахп для поляризации использовали мостовую. степу с питанием от сети (конструкции В.И.Сергеева). По изменению амплитуда разбаланса мостовой схеш при пропускании через регистрирувдай михроэлзктрод деполяризующих токов оценивали изменение входного сопротивления (R^) нейронов черепахи .

Зрительная стаыуляцая. Ортодромная электрическая: биполярное электрическое, раздражение контралатерального зрительного нэрва и нпсилатеральшй поверхности teotua optimal среднего мозга чэропаш прямоугольными Ешульсами (0.1-0,2 ыс). Адекватная: включение (on) и выклотеше (oii) освавдния, а таксе вспышки света от импульсной лампы кмоо в экспериментальной кагоре, где находилась черепаха.

Объаы эгсЕгргпззстзльщзго патера ana. Резу;^та,ты получены при анализе реакцй 1225 нейронов: Usltz lucortzr. - 795 (ЛПаЗ - Zi",

ШаЗ - 299, ППа4 - 196, остальные клетки - 51); Hellx азрегза -110 (Р1 - 38, F2 - 46, ?4 - V, Ï5/6 - 19); Emys orblcularls - 320 (зрительная кора - 293, teotum optiouni - 27). Поставлено 358 опытов с регистрацией ВП зрительной коры черепахи.

Обработка результатов. Нулевую гипотезу оценивали по критериям Стьдеята, Фишера, и-крнтерию Вилкоксона, парному t-критерия Вилкоксона (Манна-Уитни) и знаков. Применен корреляционный и регрессионный анализы. Часть статистическеской обработки проведена на персональном компьютере 1ш pc/xt -используя специализированные программы "ДИАСТА" и "СТАДИА" (автор А.П.Кулаичев).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ЫЕКБРАННШ НЕШШЗШ ПЛАСТИЧНОСТИ НЕЙРОНА

1.1. Холинорецепторы нейронов виноградной улитка

Идентификация холинорецепторов_на нейронах виноградной

улитки. Локальное подведение АХ к соме нейронов ППа4, ШаЗ "и ЛПаЗ вызывало деполяризацию, которая . у нейрона Ша4 сменялась гиперцоляризацией. АХ монет вызывать эти реакции связнваясь либо со специфическими ХР, либо с какими-то неспецифаческими якзкоаффинныш .мембранными центрами. ..Поэтому . проведена идентификация участков связывания АХ на соматической мембране нейронов.

Нейрон ППа4. Сома нейрона Ша4 чувствительна не только к АХ, но также к агонистам никотиновых ХР (нХР) - никотину, цитизину и мускариновых ХР (мХР) - мускарину, ареколину, которые вызывали доза-зависимую деполяризацию клетки при их локальной аппликации на мембрану. Чувствительность нейронов к АХ выше, чем к селективным холиномаметикам. среди которых никотин и мускарин были эффективнее цитизина и ареколина.

На фоне десенситазяшт рецепторов к никотину и мускарину, и в условиях насыщенного связывания рецепторов цитизином и ареколином реакция, вызванная. АХ (АХ-реакция) уменьиалась, вероятно, вследствие того, что агонисты нХР и МХР связывались с теми рецепторами на мембране, которые активирует АХ.

Никотиновый холаноблокатор й-тубокурарин (20-80 рЫ) в большей степени ингибировал центры связывания первого типа (для никотина и цитизина), а мускариновый холиноблокатор атропин (20-80 цМ) -

второго (для мускарина и ареколина). Эти результаты дают основания предполагать, что ХР первого типа - никотиновые, а второго -мускариноше. АХ является смешанным агонистом нХР и ыХР сомы нейрона ППа4, поскольку не обнаружено преобладающего подавления АХ-реакции й-тубокураршом и атропином.

Нейрош ППаЗ и Л1аЗ. Идентификация ХР "на соме нейронов ППаЗ п ЛПаЗ проведена с помощью большего количества холшюмиметиков и холинолитиков. Способность никотиновых (никотин, цитизин) и мускариновых (мускарии, ареколин, пилокарпин, оксотреморин и карбамилхолвн) холшоыиметиков вызывать доза-зависимым образом входящий ток нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки дает возможность идентифицировать связываемые ими мембранные центр! на соме как никотиновые и мускариновые. Большая чувствительность исследованных нейронов к никотиновым холиномиметикам может быть результатом превалирующего сродства нХР к использованным селективным агонистам, либо преобладания нХР над мХР.

По ингибированкю АХ-тока никотиновыми агонисташ и антагонистами (а-тубокурарин: 10-60 (Л!, а-бунгаротоксии: 0,2-1 цЫ) можно заключить, что на соме нейронов ППаЗ и ЛПаЗ существует ХР никотинового типа, отличавдиеся фармакологически от нХР нейронов позвоночных меньшей. чувствительностью . к использованным соединениям.

Фармакологические отличия ХР мускаринового типа исследованных нейронов от мХР позвоночных выражены значительнее. Из четырех антагонистов мХР (атропин, скополамин, платифиллин и пнрензелин) эффективными оказались только дза. (атропин: 30-70 цЫ, шрензепин: 100-500 цМ). Действие агониста м.,ХР пилокарпина в сравнительно высоких дозах и очень низкая эффективность антагониста »^ХР пирензепина не позволяют .отнести мХР нейронов ППаЗ и ЛПаЗ к м1 подтипу. Сочетание высокой эффективности агониста м^ карбамилхолина, действие которого блокировали атропин и антагонист м1ХР пирензепин, с крайне низкой (вплоть до полного отсутствия у рада нейронов) эффективностью другого ^-агониста оксотреморнаа затрудняют отнести мХР нейронов улитки к ы2 подтипу. Поэтому мХР нейронов ППаЗ и ЛПаЗ мохно отнести ,к особому 'виду мХР отличному от известных ьц - и «2 подтипов.

Сопряжение холинорецепторов, нейрона ППа4 с ионшата каналами. Амплитуда АХ-деполяризации, потенциал реверсии которой составлял -21,9+1,7 нВ (п=10), уменьшалась под влиянием Слокатора

У

хемоуправляемой На+ проводимости гехсамэтония (5 Ш), и посла воздействий, снижавших Са2+ токи, - уменьшения концентрации Са2+ во внеклеточном растворе с 10 мМ до 2 ыЫ и Олокаторов электро- и хемоуправляемой Са2+ проводимости - верапамш (100 цИ) и ионов са2+ (I мМ).

Фенилтриметиламмонжй и тетраэтилашовий (50-500 рМ), блокирующие хемоуправляемую к+ проводимость, не влияли на амплитуду АХ-потенциала.

Холиномиметик декаметоний, селективно индуцирующий и~ проводимость,- вызывал в нейроне ППа4 гипершляризацяю,- ■ которую подавлял блокатор хешуправляемых и" каналов фуросемад (5 х Ю-5 г/мл). Однако фуросемид не изменял амплитуду АХ-деполяризации. Возможно, это происходило вследствие незначительной по сравнению с деполяризующим компонентом величиной «"-зависимого гиперполяризующего компонента АХ-реакции из-за близости м~ равновесного потенциала к мембранному потенциалу (Ш) клетки ППа4.

Гексаметоний блокировал никотиновую деполяризацию и не влиял на мускаршовую,. а снижение концентрации Са24 в омывающем препарат растворе уменьшало, в основном, мускариновую деполяризацию, мало влияя на никотиновую.

Можно заключить, что АХ приводит к возрастанию проницаемости для На4, . Са2+. и С1~. . Однако, поскольвд- С1~ компонент, .мал. вследствие близости МП к равновесному потенциалу С1~, доминирующая реакция на АХ связана с хемоуправяяемым входом в клетку и Саг+. Взаимодействие никотина с нХР вызывает входящий ток Ка+, а связывание мускарином мХР - входящий ток Са2+.

1.2. Пластичность хеыовозбудаыых ыеабран

Пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки в экспериментальной модели привыкания. Ритмическая локальная ионофоретическая аппликация АХ на сому нейронов ЛПаЗ, ШаЗ и ППа4 с интервалом 50-180 с (ЛПаЗ, ППаЗ) и 20-80 с (ППа4) вызывала снижение величины исходной возбуждающей АХ-реакции (деполяризация, входящий ток). Скорость депрессии ответа выше у нейронов ЛПаЗ.и ППаЗ по сравнению с клеткой Ш1а4. ■ Скорость развития и степень выраженности декремента АХ-ре акция нейрона находшшсь в прямой зависимости от частоты повторной стимуляции. Декремент АХ-реакции сопровождался уменьшением ответов на другие стимулы: аппликации АХ или серотонина к соседним зонам мембраны, внутриклеточную инъекцию

сверхпорогового деполяризующего тока (генерализация угашения). После прекращения ритмической симуляции ответ постепенно восстанавливался. Время спонтанного восстановления составляло 5-15 мин (ППа4) и 10-30 мин ШПаЗ, ЛПаЗ).

Использование в данной модели "искусственного синапса" (форетической пипепш, подведенной к мембране), выделение медиатора из которого строго постоянно, позволяет исключить вклад пресинаптического звена в пластичность холинорецептивной мембраны. Поэтому можно утверждать, что в использованной модели уменьшение возбудимости холинорецептивной мембраны (чувствительности к АХ) -мембранный механизм развившейся пластичности.

Различная пластичность никотиновых и мускариновых холинорецепторов сомы нейрона Ша4. Наносили ритмические аппликации АХ после предварительной фармакологической блокада мХР атропином, платифшишном, или нХР - ¿-тубокурарином. Атропин и платвфшшш (20-100 цМ) обратимо ослабляли, а й-тубокурарин (20-100 цМ) углублял уташение АХ-реакции. Угашеше после воздействия ыускаринового холиноблокатора более глубокое, чем после никотинового холиноблокатора. Вероятно, эти различия обеспечиваются разной динамикой десенситизации нХР и мХР. При ритмической аппликации АХ десенситизапия нХР менее ■-глубокая-по-сравнению с десенситизацией мХР.

С Пластичность холинорецепторов в разных зонах сомы нейрона ППа4. При близких величинах АХ-реакций нейронов ППа4 на аппликацию АХ кривые угашения ответа часто не совпадали при одинаковых параметрах ритмической стимуляции. Локализация кончика форетической пипетки с АХ на соме разных нейронов, скорее всего, различна. Близкая степень уменьшения АХ-реакций у нейронов в разных препаратах достигалась неодинаковыми. концентрациями блокаторов ХР одного типа. Пороговые концентрации блокаторов нХР и мХР на одаш нейрона также часто не совпадали. Возможно, неодинаковое соотношение числа нХР и мХР, отличалшхся по степени пластичности, в разных пунктах их мембраны - причина вариабельности кривых угашения АХ-реакций при ритмической аппликации АХ. ■ • •

К нейрону подводили две форетические пипетки, заполненные АХ. Уравняв величины АХ-реакций на форез АХ из первой и второй форетических шшеток, проводили последовательные серии угашения АХ.,- и АХ-реакций. Сравнив кривые угашения АХЦ— и АХ^-реакетй,.

выделили две группы нейронов. Кривые угажения реакций у нейронов первой группы (п=8) отличались, а у нейронов второй группы (п=3) -нет.

Блокаторы нХР (1-тубокурарзн, 50-100 цМ) и мХР (атропин, платифшшин, 50-100 рМ) уменьшали в разной степени АХ-реакции нейронов первой группы на выведение'¿X из разных пипеток. Реакция угашаемая быстрее и глубже, подавлялась в больпей степени блокаторами ¡ЯР, а угашаемая медленнее и слабее - блокаторами нХР. Никотиновый и мускариновый хожноблокаторы уменьшали .в равной степени АХ1- и АХ^реакции-нейронов второй группы.

Неодинаковое подавление блокаторами нХР и мХР АХ-ре акций одного и того из нейрона первой группы при апшшкаши АХ на разные зоны сомы свидетельствует о разном соотношении в них мХР и нХР. Близкую степень подавления АХ-ре акций нейронов второй группы можно трактовать как следствие равного соотношения нХР и мХР в зонах мембраны, активируемых АХ из двух форетических пипеток. Поскольку все опыты проведены на нейронах одного типа - ШаА, маловероятно, что в одних нейронах распределение разных ХР гетероганно по всей мембране,, а в других - гомогенно. Мояно предполагать, что в ряде зон соматической мембраны нейрона Ша4 соотношение разных типов ХР неодинаковое.

Ритмическая активация АХ холинорецептивной мембраны приводит к более быстрой и глубокой депрессии"АХ-отвёта в том случае,'если" в популяции активируемых X? преобладают мХР. Вели же в холинорецептивной зоне мембраны больше доля нХР, депрессия развивается медленнее и слабее. Следовательно, одной из вероятных причин разной пластичности холинорецептивных мембран нейрона ППа4 может быть вариабельность соотношения в них нХР и «ХР. управлягаих проводимостью разных ионов.

Неодинаковая пластичность холинорецепторов, управляющих проводимостью разных ионов. Сравнивали вольт-ампёрныа

характеристики (ВАХ) АХ-тока нейронов ППаЗ и ЛПаЗ до утешения, на фоне развившегося в результате подачи серии повторных аппликаций АХ угашения (вышедшего на плато - обычно, начиная с ответа на пятый стимул) и после восстановления угашенного ответа.

Цри угашении АХ-тока нейронов (п=10) наблюдали негативное смещение его потенциала реверсии (-19,913,3 мВ) на 7-18 'мВ (10,1*1,1 мВ). Величина сдвига потенциала реверсии голояительно коррелировала с глубиной угашения ЛХ-тока в этом же нейрона.

Восстановление АХ-тока сопровождалось смещением его потенциала реверсии в половите льном направлении.

Отрицательный сдвиг потенциала реверсии АХ-тока свидетельствует о неодинаковой степени угашения АХ-токов, обусловленных движением разных ионов. В большей степени, судя по полученным результатам, уменьшается ток ионов с более положительным, чем потенциал реверсии, равновесным потенциалом. Учитывая известную ионную природу АХ-тока этих клеток [Дятлов, 1988], это могет быть ток ионов Са2+ и/или Еа+.

Разная степень ■ депрессии отдельных ионных токов в. экспериментальной модели привыкания мокет быть следствием неодинаковая пластичности ХР соматической мембраны, управлящпх проводимостью разных ионов.

1.3. Пластичность электровозбудаосгх меьЗран Привыкание

Привыкание коркового нейрона черепахи к ортодромному раздражителю сопровождается обратимым уменьшением амплитуды ПД [Цитоловсквй, Пивоваров, 1975, 1976], которое могет быть следствием изменения возбудимости тритгерных зон.

Изменение _ КУД и ПГО. Уменьшение амплитуды. ДД, вызванного монотонным стимулом - вспышкой света, в процессе ритмической (интервал 4-5 с) стимуляции сопровождалось сдвигом критического уровня деполяризации (КУД) ПД в положительном направлении и возрастанием порогового потенциала (ПРП) ПД. А увеличение амплитуды ПД в ответ на экстрастимул - включение-выключение света, происходило параллельно со смещением КУД в негативном направлении и уменьшением ПРП. Во время привыкания происходило неспецифзческоз понихение возбудимости тритгерных зон спонтанного ЦЦ.

Езиазвв2а1 порота раздраханая триггарЕах зон. По кзре выработки привыкания к прямоугольным толчкам деполяризующего тока (интервал 2-4 с) и вспышкам света (интервал 4-5 с) порог раздражения электровозбудимой мембраны дзполярцзувдкм токон (измеренный по амплитуде порогового тока или латентности и количеству пшсов спайкового разряда, вызванного надгороговым деполяризующим током постоянной силы) возрастал в момент действия монотонного стимула и уменьшался при действии экстрастимула. Зкстрастшул и перерыв в ритмической стимуляции восстаняк-ашали сшгЕенЕый порог рзздрагзния.

Изиеневиеи Е^ нейрона. Р^ корковых нейронов черепахи обратило' уменьшалось по мере выработки привыкания к внутриклеточным раздражениям и вспышкам света в момент действия монотонного стимула и возрастало в момент действия экстрасгимула. н^, при действии монотонного стимула восстанавливалось после экстрастимула и перерыва.

Изменение форш вызванных ПД. При привыкании электровозбудимой мембраны тектэльных нейронов к деполяризующим толчкам тока (интервал 0,5 с) менялись параметра вызванного пика: амплитуда, длительность, скорости нарастания и спада. Суммарная длительность вызванного монотонным стимулом пика я его фазы подъема уменьшались, а вызванного экстрастимулом (деполяризующим током меньшей силы) - увеличивались.

Возбудимость мембраны корковых и тектальных нейронов обратимо меняется - уменьшается при действии монотонного стимула и растет в момент действия экстрасгимула. Зкстрастамул и перерыв в ритмической стимуляции восстанавливают возбудимость.

Фотогвшов генерализованное тормоазние

Рит?,плеская стимуляция вспышками света (0,4-0,6 /с) черепахи вызывала в ЗЭГ эшиептаформную активность, сменявшуюся обратимым генерализованным торможением реактивности и возбудимости электровозбудимой мембраны корковых нейронов черепахи.

При глубоком' генерализованном торможении не Генерировались спонтанные и вызванные сенсорным стимулом Щ. Фоновые я вызванные колебания Ш не выражены. Постоянный уровень Ш испытывал двухфазное изменение. Сначала происходила деполяризация на 25-30% по сравнению с контролем, затем Ш сдвигался в отрицательном направлении и превышал контрольный уровень на 13%. Возбудимость электровозбудимой мембраны в этот период снижена: достоверно возрастали величины порогового деполяризущего тока и ПРП ПД, вызванного этим током; уменьшалось нейрона; угнеталась

генерация ВД, вызванного деполяризующим током.

Снижение возбудимости электровозбудамой мембраны нейронов черепахи при депрессии спайсового ответа в эксперниентальаой модели' привыкания и фотогенном генерализованном тормояении имеют одинаковый механизм - I) сдвиг в положительном направлении критического уровня деполяризации вызванных ПД, 2) увеличение порогового потенциала.. вызванных ОД, 3) уменьшение входного сопротивления нейронов.

Посттетаничвская пластичность

Параметры возбудимости электровозбудимой мембраны проанализированы' в период посттетаничесхой пластичности корковых нейронов черепахи с целью оценки степени универсальности изменений возбудимости, выявленных при привыкании - и фотогенном генерализованном тормокенш.

Ортодромия тетавнззгия - электрическое раздражение поверхности tectum optioum среднего мозга (9-10 /с, 10-12 с) вызывало два типа посттетаничвских пластических изменений ответа у разных хявотннх: облегчение (ЕГО) и депрессию (ПТД).

При ЕГО амплитуда коротколотентного негативного компонента ортодромного ВП обратимо возрастала (на 25,0±3,0£). В период ПТД амплитуда компонента f^ ВП обратимо уменьшалась (на 26,6±1,0Ж).

Постгетаютеские изиашная ПСП. ВПСП и ТПСП испытывали при одной и той жз форме посттетааической пластичности однонаправленные изменения. Амплитуда БПСП к ТПСП обратимо возрастала при ЕГО (на 162,0±44,6%; 75,0±20,2") и снижалась при ПТД (на 25,0±5,5S; 17,5±6.0й).

Посттеташгчасшш изиенаная ортодроиного пикового ответа. Во время ЕГО амплитуда ортодромного Щ обратимо возрастала (на 6,3±2,IS), КУД увеличивался по абсолютной величине (на 6,3±1,93), ПШ уменьшался (на 10,4*2,8%).' Во время ПТД амплитуда ортодромного ПД снижалась (на 7,5+2,4%), КУД уменьшался по абсолютной величине (на Э,5±2,4%), ПШ возрастал (на 2Q,S±4,8%).

Посггетаниче ские изменения вызванного внутриклеточной деполяризацией пикового ответа. "При ЕГО обратимо возрастали амплитуда вызванного коротколатентного ПД^ (на 8,8tl,2%), частота разряда (на 47,5±П,Э%), уменьшались латентности Iffij и (на 32,5*4.0%; 15,0*2,9%). При ПТД ашлитуда вызванного коротколатентного ПД^- свивалась (на Ю,0±1Д35), частота разряда падала (на 20,0±2,4%), латентности ПД^ и Пд, увеличивались (на 57,5±II,IS; на 29,8±4,0%).

Постетанячесвиа изиананая R^. Посттетаническая пластичность корковых нейронов сопровождалась закономерными и ойратимына изменениями их' R^. Исследованные в этой серии нейроны (п=64) разделены на 2 группы по направлению изменения Н^, которое менялось в противоположных направлениях как при ЕГО , так и при ПТД. В нейровах I группы (п=25) Рт росло при НТО и ЕГД. В нейронах П группы (n=39) R^. унэньоалось при ЕГО и ЕГД. Динамика

изменений ям нейронов обета групп носила сходный характер.

Вяутрнклеточвзя твтапизадяя палпороговюя деполяризующими толчками тока (0,3-2,0 НА, 10 не, 5-10 /с, 5-10 с) вызывала, как и после ортодромвой тетанизацпи, ПТО и ИТД.

При ПТО обратило возрастали амплитуда хоротколатентнаго вызванного Щ .(на 10,0±1,Э5), частота разряда (на 62,514,3&), снижались латентности первого (на 30,2±6,7£) и второго (на 16,3±1,9%) вызванных пиков. При ПТД указанные параметр! менялись в противоположном направлении: уменьшались амплитуда. ПД (на 8,1±1,1%) и частота разряда (на 25,0±3,8г), возрастала латентность первого (на 50,0112,9«) И второго (на 25,4±5,33) пиков.

Постоташгческпа изьденешя Изменение Е^, протекало

параллельно с динамикой спайкового разряда. Все исследованные нейроны (п=79) разделены на две группы по направлению изменения Е^. В нейронах первой группы (п=30) возрастало щи ПТО (п=17) и ПТД (п=13). В нейронах второй группы (п=49) в^ снижалось при ИГО (п=25) и ПТД (п=24).

Внутриклеточная тетавизация гиперполяризухщими толчка-ж тока (0,2-2,0 нА; 10 мс; 5 /с; 5 с) также вызывала ПТО и ПТД, сопровождавшиеся обратимыми изменениями возбудимости элактровозбудимой мембраны.

Разные по форме тетанические воздействия (ортодромная и внутриклеточная) вызывают" изменение возбудаости электровозбудамой мембраны, сопровождающие изменение ее реактивности.

1.4, Генерализация пластичности нейрона Генерализованная пластичность при привыкании

Нейроны ППаЗ я ЛПаЗ виноградной улитки. Проведены 4 серии экспериментов. В первой вырабатывали угашэние АХ-реакции, тест-стимулом служила аппликация серотонина. Во второй серии вырабатывала угаиензе реакции на серотонш, а тестирующим стимулом была аппликация АХ. В третьей серии вырабатывала угашение АХ-реакцаи при ритмической аппликации АХ из одной пипетки, а тестирунщет раздрагением служило подведение к ■ соме этого ей медиатора, но из второй фэретической пипетки, кончик которой локализован у другой зоны соматической мембраны. В четвертой серии монотонным стимулом служила аппликация АХ, тестирующим сверхпороговая внутриклеточная инъекция деполяризующего тока.

Угаиенне реакции на монотонный стимул • сопровождалось

снижением реакции на тест-стимул во всех четырех сериях экспериментов.

Вероятно, ритмическая аппликация медиатора вызывает в нейронах виноградной улитки вторичные процессы, приводящие к генерализованному отрицательному влиянию как на активируемые в серии рецепторы экзогенным химическим стимулом, так и на хеморзценторы, не активируемые повторным стимулом, а также на электровозбудимую мембрану.

Корковые нейроны черепаха. В первой серии уменьшение амплитуда ВПСИ в ответ на повторные (интервал 4-5 с) электрические раздражения контралатерального зрительного нерва (подоороговые для генерации ЦД) сопровождалось возрастанием реакции на тестирующий стимул (внутриклеточная сверхпороговая инъекция деполяризующего тока - 0,1-1,5 нА, 100 мс). Во второй серии снижение спайковой реакции на повторные .(интервал 2-4. с) внутриклеточные раздражения сопровождалось возрастанием ортодрошого ВПСП.

Следовательно, повторное раздражение хемовозбудамой мембраны ортодромным стимулом, вызывавшее привыкание синаптического входа (депрессия ВПСП), индуцирует возрастание возбудимости электровозбудамой мембраны. - Повторное прямое электрическое раздражение нейрона, вызавахдее привыкание электровозбудамой, мембраны (депрессий спайковой реакции), индуцирует возрастание ВПСП за счет повышения чувствительности хеморецептороной мембраны.

Посттетаническая генерализованная -пластичность

Нейроны ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улаткп. Внутриклеточная тетанизация нейронов ШаЗ и ЛПаЗ прямоугольными толчками деполяризующего тока (50-100 нА, 700 мс; интервал ые»ду стимулами - 1с, длительность пачки - 30 с, количество пачек в серии - 5) приводила через 1,5-2 мин к обратимым облегчению (на 27,5*8,2$), либо депрессии (на 24,8±8,3£) АХ-тока, что свидетельствует о генерализовавши изменении чувствительности ХР к экзогенному АХ после тетанического раздракения злектровозбудимой мембраны.

Корковые неСропы черепахи. Внутриклеточная тетанизация нейрона деполяризующими толчками тока (0,3-2,0 НА; 10 мс; 5-10 /с, 5-10 с) приводила к обратимым изменениям амплитуда ортодромных ВПСП и ТПСП.

При постоянных параметрах ортодрошого раздражения, в период ПТО обратимо возрастали амплитуда ВПСП (на 42,5±Ю,55) и ТПСП (на 78,8tI6,0S). При ПГД наблюдались обратимые уменьшение ВПСП на

25,0±4,5% и ТПСП на 26,3±2,Э%.

Предполагаем, что тетанизация толчками деполяризувдего тока вызывает обратимые изменения чувствительности хемовозбудимой постсинаптической мембраны: возрастание при облегчении, и снижение при депрессии реактивности. Генерализованная гостетаническая пластичность хемовозбудимых мембран и локальная шастичность злектровозбудимых мембран имеет однонаправленный характер. Генерализованная пластичность охватывает всю мембрану нейрона хотя иэдуцирувдий ее стимул активирует только локальную область.

II. ИОДУЛЯЦИЯ ПЛАСТИЧНОСТИ НЕЙРОНА ОШОВДДЩ

II. 1. Чувствительность нейронов виноградной улитки к опаоидаы

Наличие в нервной системе моллюсков эндогенных ошюидов и опиатных рецепторов [Кгваа et äl., 1980; Leung, Stefano, 1983; Takayanagi, Takeda, 1988; Dalton, fflddowson, 1989; Leung et al., 1990; Gutierrez, Azai, 1991; Kemenes et al., 1992], позволяет предполагать существование в нервной ткани беспозвоночных эндогенной энкефалинэргической системы, сходной с опиоидной системой высших кивотных [Stefano, leung, 1984). Исходя из этого проведена идентификация опиатных рецепторов на нейронах виноградной улитки.

Электрогенные опиатнне рецепторы. Планируя идентификацию ' рецепторов'первого типа, полагали зарегистрировать' прямйе реакции нейронов - изменение МП, вводя в окружавдий препарат ганглиев или апшшцируя локально на сому (год давлением) агонистн опиатных рецепторов: р-агонист морфин, е-агонист [1>-АЛ.аг,1)-1еи?-энкефалин] (DAHL), смешанные ц-, 5-агониста Met- и Leu-энкефалинн, эг-агонист бремазоцин, е-агонист ß-эндорфин.

Ни один их перечисленных опиоидов в диапазоне концентраций 0,01-100 pü не изменял МБ нейронов. В то же время антагонист, опиатных . рецепторов налонсон Модифицировал электрическую активность ряда нейронов: реакции клеток возбуздагагие иди тормозялдаа, коротко- зли длиннолатентные. Норотколатеншые реакции начинались в тот момент, когда концентрация налоксона в камере достигала максимума и продолжались 1-5 ш до .его полного вымывания. Длиннолатентные реакции начинались' после полного выведения налоксона из смывающего раствора, их длительность достигала 30 мин. Реакции на налоксон зависели от дозы, пороговая •концентрация составляла 10-50 рМ. У-некоторых клеток (ЛПа2, ЛПаЗ,

BI, B2, ППаЗ, Ша5) прямые реакции на налоксон ев з арегистрированы.

Налоксон, подведенный к нейронам локально, под давлением, таюке вызывал возбуждение, в ряде случаев сменявшееся торможением, ила только торможение. Реакции зависели от дозы антагониста. Следует отметить, что при локальной аппликации налоксона или при его введении'в проток у чувствительных к нему клеток развивались реакции одного и того же знака.

Эффекты, вызванные налоксоном, могли быть обусловлены тем, что, связываясь с опиатными рецепторами, он предотвращал действие эндогенных ошюидов, которые, по всей видимости, тонически контролировали возбудимость исследованных нейронов. Реакции на опиатный антагонист уменьшались, примерно, в одинаковой степени, когда посла налоксона (с интервалом меньшим- латентного пергода вызываемой им реакции) в проток вводили опиатнке агоннсты: бремазоцин, dadi, морфин и ß-эндорфин.

Полученные результаты позволяют предположить, что действие налоксона на ряд нейронов надглоточных ганглиев виноградной улитки осуществляется через специфические кенотронные ошатныэ рецепторы (сходные с р.-, в-, ж-, и е-опиатнкш рецепторами мозга млекоштаюрсих), находящиеся под тоническим возбуждающим, или тормозящим контролем эндогенных ошоидов.

Метаботропные модуляторные опиатшэ рецепторы. На нейронах ППаЗ и ЛПаЗ отсутствуют злэктрогенные оплатные рецепторы, т.к. опиоиды и антагонист ошатных рецепторов налоксон (0,01-100 цМ) нэ вызывают сшщания Щ, однако' на исключена вероятность существования рецепторов модуляторного типа.

С целью изучения вероятной модуляции ошюидама активности нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки исследовала влашпе опиатных агонистов морфина, DADL, list- и Хеи-энкофжЕов, бремазоцина и антагониста ошатных рецепторов нзлокссзэ на активность ХР этих нейронов по их влияния на амплитуду АХ-тока. Только морфзн и бремазоцин влияли на амплитуду АХ-тока при системном воздействии: ц- и ж- агонисты (50-100 цМ) уменьшала АХ-ток. Наблщалось равное подавление АХ-тока морфином Еа нейронах ЛПаЗ (на' 29,4+3,2") и ППаЗ (на 29,It3,85C);" глубина подавления АХ-тока Сревазоцином выше на нейроне ППаЗ (на о5,2±4,12) по сравнению с ЛПаЗ (на 23,0+4,6%). Налоксон пра системном лрплжшии (до 100 цУ) ев изменял амплитуда АХ-тока.

Локальные инъекции морфина и бремазоцина на сому клеток также обратило уменьшали амплитуду АХ-тока. Локальная аппликация налокссна не влияла на величину АХ-тока. Предварительная локальная аппликация налоксона на сому ослабляла модуляторные эффекты, вызванные локальными воздействиями мю- и каппа- агонистов.

Снижение 'АХ-тока нейронов ППаЗ и ЛПаЗ морфином и бремазоцином, которое предотвращает опиатный антагонист налоксон, свидетельствует о существовании на соме нейронов ППаЗ и ЛПаЗ опиатных кто- и каша-рецепторов. Выявленные рецепторы не являются электрогенными, т.к. их активация лигандами не индуцирует ионной проводимости. Они относятся к модуляторным метаботропным рецепторам, которые влияет на реактивность клетки через сопряженные с ними системы с-белков и вторичных посредников [В1г1са11, 1939]. Активация модуляторвых опиатных рецепторов ц- и эе-типов соответствушшми агонистами тормозит активность электрогенных соматических ХР нейронов ППаЗ и ЛПаЗ.

Связывая глубину модуляторных аффектов опиоидов с количеством соответствувдих рецепторов можно предположить одинаковое количество опиатных ц-рецепторов. на соме нейронов ППаЗ и ЛПаЗ и неодинаковое - ае-рецепторов, которых, вероятно, больше на соме нейрона ППаЗ.

¿1.2. Кодуляция опиатами ш>- и каппа-аговиетаыг пластичности холинорецепторов нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки

С цель» изучения роли опиоидов в регуляции пластичности хемовозбудамых мембран нейронов исследовали влияние опиатных ц-агониста морфина и г-агониста бремазоцина на пластичность ХР нейропоз ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки. Обнаружено, что оба опиоида (50-100 иМ) обратимо влияли на глубину угашения АХ-тока, причем, в противополозяых направлениях. Морфин углублял угашениа АХ-тока меток ЛПаЗ (на 12,311,1%) и ППаЗ (на 12,6±1,0Х), а бремгзоцин ослаблял угааенге АХ-тока нейрона ППзЗ (на 15,6±1,0Ж) не влияя на пластичность ХР нейрона ЛПаЗ. Следовательно, направление модуляции пластичности ХР исследованных нейронов виноградной ' улитки" зависит ' от тала активируемых опиатных рецепторов.

Можно предоояохзяь, что разнонаправленное действие морфина и бремазоцина на глубину угаиения входящего АХ-тока реализуется за счет противоположного влияния р- и ае-рецепторов на уровень тех

вторичных посредников, гсоторие регулируют пластичность ХР.

II-3. Иодуляцая опиоадаьга пластЕчности нейронов зрительной коры черепахи: роль 1шдааторшх састеы

Сшоидезыэ v пептщщ: энкефалиш, эндорфшы и их аналоги активируют более одного типа опиатных рецепторов [Lord et al., 1977; Chang et al., 1979; Snyder, CMldera, 1979]. В связи с этим представляет интерес выяснить способность разных ошатшх рецепторов к модуляции пластичности нейрона в экспердаантальной . модели обучения.

Чувствительность нейронов зрительной коры черепахи' к зготастам ошатшх рецепторов. Агониста охшатзых рецепторов: морфзш, DADL, бремазоцин, SKF 10,047,. ilet- ж Lau-эЕкефалзны (1,0 pj), а так® белковые экстракты зрительной коры черепахи (0,3-5,0 (лг) через 1-5 кнн подавляли амплитуду 8П (на 44,5-65% и 30-90%, соответственно). Торможение продолжалось 10-40 кин с последующие медленным (10-20 мин) спонтанным восстановлением ВП. Тормозное действие SXF ю,047 через 10-15 мия после его аппликации сменялось обратимым облегчением.

Налоксоз препятствовал ингибированив морфином ВП зрительной коры черепахи, и ослаблял на 70-9Ш тормозящие эффекты ее белковых экстрактов. -

Ионофоретическая аппликация beu-энкефалша в область дендрнтов и сомы регистрируемых нейронов зрительной коры (п=21) вызывала торотение спайховой активности клеток (п=15).

Полученные результаты можно интерпретировать в пользу существования на нейронах, зрительной коры черепахи ошатшх рецепторов ц, 0, эг и о типов. Влияние налоксона, в основном, только на эффекты морфина обусловлено высоким сродством опиатного антагониста к рецепторам ц.-типа. Опнты с острой десенсизнзацией. позволяют предполагать, что эффекты морфина, Dili и бремазоцияа реализуются через разные рецептор!.

Модуляция агонистами опиатных рецепторов привыкания нейронов зрительной кода черепахи. Влияние агонистов опиатных рецепторов оценивали да их действию на разшо фазы депрессии ВП зрительной коры в процессе повторных (интерззл 4-5 с) электрических раздражений хонтралатерального зрительного нерва.

Бесмотра на одинаковую степвЕь активааги опаоидаа разных опиатных рецепторов, они модифицировали привыкание по-разному.

Модуляция привыкания опиатными рецепторами включала, как правило, влияние не на все фазы привыкания (6-рецепторы) и разную степень влияния на эти фазы (р.-, ге- и о-рецепторы) (табл. I).

Таблица I.

Характер модуляции агонистами оциатных рецепторов привыкания в зрительной корэ черепахи Рецептор акти- ; Фаза привыкания

й Соединения внруемый или Привы- Генера- Расторма- Сенсити-п/п блокируемый Ссание лизания кивание зация

I. Морфин И 3+ 2+ 1+ 0

2. DADL Ô 1+ 0 1+ 0

3. Бремазоцин ге 3+ 2+ 1+ 0

4. SXF 10,047 0 I+, 2- 2+, 0 0, 3+ 3+, 1+

5. МорфШ! + DADL Ц, ô 1+ 2+- 6+ 0

6. Морфин + бремазоцин ц, ж 4+ 3+ 1+ 0

7. DADI + бремазоцин е, ге 3+ 7+ 0 0

8. SKF 10,047 +

бремазоцин а, ае 2+ 1+ 0 0

"9. Морфин + DADb +

бремазоцин ц , Ô, ге 2+ 1+ 1+ 0

10.'Met-энкефалин В, ц "2- 0 0 0

II. Налоксон Ц. s 0 3+ 0 0

12. Этанол (15%) - 1+ 0 0 2+

13. Раствор Рангера — 0 0 0 0

Пркнечания: + - усялеггие, О — отсутствие влияние, — ослабление, 1 - на 5-1ОУ., 2 - 11-20«, 3 - 21-30>:, 4 - 31-*05г, 3 - И-50Х. 6 -31-605*, 7 - 61-70Х.

Одновременная аппликация разных агонистов выявила взаимодействие опиатных рецепторов, в результате которого модуляторный яф£вкт при совместной аппликации нескольких агонистов отличался от суммы эффектов кахдого из агонистов в отдельности (табл. I). Следовательно, разные типы опиатных рецепторов взаимодействуют друг с другом, в результате их совместная активация приводит4 как к торможению, так и к облегчению эффектов отдельннх гтсшстов на разные фазы привыкания.

Роль кадиаторных систем в модтлящм аговистами опиатных рецепторов дгавнкавия нейронов зрительной кода черепахи. Проанализирована роль дофаминовых, серотониновых и мускариношх рецепторов, используя их специфические антагонисты (гзлопарвдол, ЛСД и атропин) в .модифицирующем влиянии агонистов разных опиатных рецепторов (морфина, БАШ,, бремазоцина и зк?:,10,047) на привыкание нейронов зрительной коры черепахи.

Блокада дофаминовых, серотокшовых и мХР эффективно изменяла способность агонистов опиатных ц-, 5-, х- и о-рецептороз модифицировать динамику привыкания.

Галоперидол блокировал способность опиатных агонистов углублять привыкание и изменял направление их влияния на противоположное - олноида на фоне галоперидола снижала глубину депрессии Ш при повторном раздражении • контралатерального зрительного нерва. Галоперидол предотвращал усиление морфином и бремазоцином генерализации привыкания. Он блокировал усиление растормахивания привыкания, вызванное морфином, и усиливал его при активации опиатных 8-, ае- и а-рецензоров.

ЛСД нарушал способность опиатных агонистов углублять привыкание, а направление действия бремазоцина, кроме того, менял на противоположное - на его фоне _ ж-агонист, ослаблял привыкание. ЛСД ослаблял усиление генерализации привыкания под действием морфина и бремазоцина. Он такие ослаблял растормаюшанне привыкания, вызванное р.- и б-агонистами, и усиливал его при действии зе- и а-агонистов.

Атропин предотвращал способность морфина и бремазоцина углублять привыкание. Мускаршовый холиноблокатор ослаблял генерализации привыкания, вызываемую ц- и ге-агонистамн. Кроме того, атропин изменял расторлаташание привыкания, вызванное морфином и бремазоданом.

Вероятно, модифицирующие эффекты ошоидов на привыкание нейронов зависят от. взаимодействия опиатных и медааторных (серотониновых, дофаминовых и ыускариновых) рецепторов. Поэтому изменение степени такого взаимодействия иохвт быть механизмом, регулирующим пластичность нейронов зрительной коре черепахи.

11.4. Модуляция БКРИШУаиидоц холиворецапторов нейронов садовой улитки

Сравяениа структуры эндогенных пептидов моллесков:

Met-энкефалина, !iet-3HKe$ajnraa-Arg6~l>he7 и РМКРамида позволяет установить совпадение аминокислотных остатков в С~конце молекул. Известные эккефалиноподобные пептиды ме^энкефалин-ц^ и Ket-aHKeiaJMH-Arg-Phe-N^ с амидной группой на С-конце обладают опиоидной активностью [Huneoka, Uatauura, 1985]. Можно предположить, что эндогенные Met-энкефашш и мтвамид произошли от общего прэдаествэнника, а их функции и клеточные механизмы могут иметь общие черты. с

Новый представитель семейства ШФамид-подобных пептидов моллюсков - гептапептид Sei^byB-Pro-Tyr-liet-Arg-Phe-NHg (ЗКР'ЯСКРамид) с молекулярной массой 927,2 Да недавно выделен из экстрактов ЦНС нресЕозодного моллюска прудовика Lymaea 3tagnali3 [Be With, Уап der Sohors, 1992].

БКРУКйРамид обратимо уменьшал АХ-деполяризацию и ДХ-ток нейронов F1, F2, 14 и F5/6 садовой улитки (пороговая концентрация 0,5-1,0 jiM). Торшггениэ было доза- и время-зависгм^м.

ЗЕРУ)Ж?2!Шд, ' апшицированный прямо в проточную камеру в пороговых концентрациях, снижал крутизну и максимум кривой доза-ответ. После длительной экспозиции (30-40 мин) пептида в пороговой концентрации (I рЩ или короткой экспозиции (20 мин) при сверхпороговой концентрации (5„ цМ) наблюдали сдвиг вправо, кривой., доза-ответ, снижение ее максимума и возрастание пороговой амплитуды иоЕофоретдческого тока через пипетку с АХ.

Чувствительность разных идентифицированных нейронов к SKPYifRFамиду оценивали посла введения пзптйда в проточный раствор в постоянной сверхлорогозой концентрации (5 рМ). Пептид уменьшал АХ-ток нейронов ?1, Т2, F4 и F5/6 почти одинаково - степень его тормохения (й), соответственно, составила:. 39,2±3,0, п=32; 37,6±2,0, п=46; 38,5±9,3, u=4: 33,0±3,5, п=17. Эффекты пептида на разных идентифицированных нейронах достоверно не отличались. _

Тормозящее действие зкгапфамида (5 |Ш) на АХ-ток развивалось во времени градуально, достигая максимального стабильного уровня и было обратимым после отшва. Кривые время-ответ для одного типа нейронов из разных препаратов при одинаковой концентрации БКРИШУамкда (5 цМ) варьировали: эффект начинался' ^ерез 3-7 мин, максимальное действие - спустя 7-II мин, а восстановление - после 8-40 мин отмыва.

уннкамид-подобные эндогенные пептиды обнаружены в подглоточных ганглиях садовой улитки [Cottrell et al., 1982;

Lehaan, Price, 1987; Price et al., 1990; Cottrell et al., 1992]. Причем, кластеры в правом .париетальном ганглии содержа? преимущественно гепта-УЫКРамид-подоОные эндогенные пептиды по сравнение с тетра-рмнрамид-подобными эндогенными пептидами [Cottrell et al., 1992]. В исследованиях с молекулярной гибридизацией при использовании зондов клонированной' ДНК было показано, что нейроны кластеров правого париетального ганглия садовой улитки экспрессируют, преимущественно, матричную РНК, кодирующую гепта-рмнгамвд-подобные -эндогенные пептида. Полагаем, что БКРЖКРамяд или структурно тесно связанный с ним гептапеятид, например такой как БитаВРамид, выделенный в 1990 г. из нервной ткани Bellx aspersa [Price et- al., 1990], является эндогенным агонистом специфических участков связывания да»ащд-лодобных пептидов на мембране F1, Г2,' F4 и F5/6 нейронов из правого париетального ганглия Helix aspersa.

Поскольку все исследованные нами нейроны имеют приблизительно одинаковую чувствительность к зкпашгамвду, мохно допустить, что пептид активировал рецепторы одного типа. Однако не исключено, что количество функционирующих рецепторов ва мембране нейронов одного типа из разных препаратов может варьировать.

Вероятно, БКРУМКРамид действует как нейромодулятор, тормозящий холинергическую передачу на постсинаптическом уровне в каудальном нейронном кластере правого париетального ' ганглия садовой улитки по механизму отрицательной обратной связи.

III. РЕГУЛЯЦИЯ ВТОРИЧЕН® ПОСРЕДНИКАМИ ШАСИЯНОСТИ

ХОЛИНОРЕЦЕИГОРОВ НЕЙРОНА III. 1. Роль вторичных посредников в пластичности

холинорецеггтороз нейронов виноградной улитки Применяя модуляторы систем вторичных посредников,, исследовали роль G-белков и известных вторичных посредников: оАЫР; НО; cQHP; Са2+ (проникающего извне и мобилизованного через канальи управляемые - рианодиновыми рецепторами и рецептора:,а инозитол-1,4,5-трифосфата - 1(1,4,5)Р3); внутриклеточного рецептора са2+ кальмодулина; 1(1,4,5)?э; фосфатцдной кислоты; протеишшназы С (мишени 1,2-диацилглицерола); арахидоновой кислоты' (АА), ее циклических, а такке 8 ациклических производных, образующихся под влиянием разных липоксигеназ (L0) (5-Ю, 12-Ю и 15-1Д) - 5-, 12- 15-гидроксиэйкозатетраеиовых кислот1 (5-НЕГЕ,

12-НЕТЕ, 15-НЕТЕ), лейкогриенов в4, (1Л!В4, 1ТС4), гепоксилшюв А3 (ífflLj) И В3 /трео к эритро эпсмеров/ (нхв^-трео, Н2В3-эритро) в пластичности ХР нейронов виноградной улитки, которую оценивали по глубине депрессии' реакции холинорецептавной мембраны (входящий тек, деполяризация) нейронов ЛПаЗ, ШаЗ и ППа4 во время серии ритютеских. локальных гонофэретических аппликаций АХ на сому.

Пластичность ХР усиливали: негидролизуемые ' активаторы G-белков - . 5'-гуашлилиьшдодгфосфат (GppNHp), гуанозин 5'-0-(3-тиотрифзсфат) (GTP-7-S); доноры ко, активаторы v гуанилатпиклазы . -. s-Еитрозо-н-ацетилпенщилламин (зиар ), нитропруссид Ка+, азид Иа+; о gup; ингибитор растворимой гуашлатциклазы LY-83,583; повышение Са2+ во внеклеточной среде, ингибитор специфического транспорта са2+ митохондриями рутений красный; агонаст рианодиновнх рецепторов кофеин; 1(1,А,5)Р3; стимулятор синтеза фосфатвдной кислоты - фосфолипаза- D (PLD); арахидоновая кислота; ациклические эйкозаноиды из 5-липоксигеназного пути (5-НН?Е, ЬТВ^, Iffic^) (табл. 2).

Таблица 2. Влияние модуляторов вторичных посредников на депрессию АХ-реакция нейронов вызванную ритмическим подведением АХ к соме

& Соединения Концентрация Изменение глубины

п/п рМ депрессии АХ-реакции (%)

Ослабление Усиление

I. Gpp (ИН)р (in)2 _ 18,7±2,61

2. GEP-7-S (In) - 14,7±2,3

3. Форсколшн 20-60 -

4. Имидазол 5000 - -

5. ъ-njsu. 100-500 - -

6. ьчшш 200-300 - -

7. SNAP 50-500 - 18,6±2,8

8. Витропруссид Na+ 500-1000 - 22,6±1,5

9. АЗИД Na 500-1000 - 15,5±1,5

10. oGMP (in) I8,í±3,3

II. 8-Вг-сСИР 60-500 - -

12. LY-83,583 20-40 - 19,8±3,7

13. Ca2+ 0 . I5,5tl,0 -

14. Верапамнл 100-150 II,8i0,5 -

- 28 -

15. Сй2+ 2000 14,441,8 -

16. Са 27000 - 16,741,4

17. Рутений красный 5-10 - 13,1*0,6

18. Кофеин 1000-4000 - 21,841,3

19. Тетракаин 50-500 Л,8±1,0 -

20. ТМВ-8 50-300 14,7±0,8 -

21. К24571 20-50 19,8±0,8 -

22. Трифлуошразин 50-200 20,1*0,6 -

23. Хлорпроыазин 20-60 19,9±1,6 -

24. Пренилашна лактат 30-400 12,0*0,5 -

25. 1(1,4,5>Р3 (Ы - .17,9*0,6

26. ТМВ-8 30:70 - -

, + 1(1,4.5№3 (1п>

27. РР6 (1п) -

28. 1Рб (оиЮ 50-200 - -

29. РШ) 1,0-1,5 (мг/мл) - 14,6*0,8

30. РИА 0,2-7 - -

31. Полимикснн В 100-500 - -

32. АА 50-60 - 11,6*0,6

33. Хннакрин 200-600 - -

34. Ш5А 3-10 9,6*0,6 -

35. Индометацш 20-50 - -

36. ЕМА 1-100 "

37. ЕГУА 30-60 16Д±0,7 -

38. ЕРУА 5-30 12,4±0,5 -

39. 5-НЕЕЕ 22,8-57 - 17,1*1,1

40. 1ЯВ4 1,0-3,3 - 14,1*0,8

41. ЫГС4 10,4-28,9 - 10,6*0,5

42. ТНВ-8 20-60

+ ьтс4 20-25 15,9*1,0 -

43.

44.

45.

46.

47.

12-НЕГЕ ШСА^

трео-НХВ3

эритро-вхв3

15-ЕЕТЕ

0,7-21.9 40-100 40-100 40-100 '4-16

12,0*0,73 13Д*0,64

Примечания: статистическая значимость э?фэктов

2

Ср<0,01> по парному тесту Еилкоксоиа; внутриклеточная инъекция

3 4

соединенийэкспозиция 15-НЕТЕ: <70 кин, >70 хин.

Пластичность ХР ослабляли: удаление Са2+ из' внеклеточной средн. блокатори са2-|"-тока - верапамил и С12+; ингибиторы мобилизации депонированного Са2+ через каналы управляемые рианодиновыми рецепторами - тетракаип и 1(1,4,5)Р3-рецепторами - ' 8-(диэтиламино) октидовый эфир 3,4,5-триметоксибензойной кислоты (тнв-а); ингибиторы кальмодулина - П24571, трифлуоперазин, хлорпромазин, прениламин лактат; Олокаторы липоксигеназ норднгидрогваяретовая кислота (шйа); 5,8,11,14-эйкозатетраиновая кислота (ЕИГА), 5,8,11,14,17-эйкозагонтаиновая кислота (ЕРЫ); ЫГС4 на фоне ткв-8 (табл. 2).

15-НЕТЕ влияла на пластичность двухфазно: ослабляла при экспозиции <70 мин и усиливала при экспозиции >70 мин (табл.2).

На пластичность ХР го влияли: активатор аденилатшклазы . форсколин; активатор с-ШР-зависимой фосфодиэстеразы имидазол; ингибиторы гго-синтазы . - 1Гш~метил-1>-аргзшш сыушд), Мш-НЕтро-1г-арпшш (Ъ-ШЫЕ); проникающий аналог сСЫР - 8-бром-сйя? (8-Вг-сОМР); 1(1,4,5)Р3 на фоне гнв-з; инозитолгексафосфат ЦРд); активатор и ингибитор протеинкиназн С, (форбол 12-миркстат 13-ацетат - риа., полимаксин в); ингибитор фосфолипазы к^ хинакрин; ингибитор циклооксигеназы индометацин; ингибитор 12-ьо и 15-ьо ' 5,3,11-эйкозатрииновая кислота (ЕГгУа); "ациклические эйкозаноидд из 12-липоксигеназного цуга - 12-НЕС2, нха^, ехв^ (табл. 2).

Таким образом, пластичность ХР регулируется не одам, а не сколькими вторичными посредниками, синтез которых опосредован активацией с-бэлков после лиганд-рецзптороного взаимодействия. В ряд внутриклеточных регуляторов пластичности ХР вовлечены: сас, внутриклеточный свободный Са2+, поступающий в цитоплазму по хемоуправляекым ионным каналам плазмалеммы и мобилизованный из внутриклеточных Са2+-депо двумя путями: чзрзз Са2+-каналы эндоплазматического ретикулугга, управляешь рианодиновыми рецепторами (I) и 1(1,4,5)Р3 рецептора;.я (2); Енутриклеточшй рецептор са2+ кальмодулин; продукты фосфоинозитидного обмена: 1(1,4,5)РЭ, фосфатидная кислота; а также арахпдоновая кислота л ее ациклические производные,, из 5- . з 15-лшюкскгеназного путей. Усиленный синтез этих соединений во время серзз ритмической активации ХР повторны;,я аппликациями АХ на сомагачесхув мембрану является одной из причин обратимого снижения альтитуды АХ-реакции. Последующая активация вторичными' посредниками

Са2+/кальыодулин-зашстаоа протеинкиназн п. возгхетго, киназц с

- зо -

модифицирует ХР или управляемые ими ионные каналы путем их фоофорилирования, что трансформируется в пластичность ХР.

Не обнаружено участия сМР, 1,2-диацилглицерола, v 1Р6, ациклических эйкозаноидов из 12-липоксигеназного пути и циклических эйкозаноидов в регуляции кратковременной пластичности ХР. Роль N0 в этом механизме, вероятно, незначительная. Пратеинкиназы А и С не вовлечены, видимо, в фосфэрилировгние белков, ХР и их ионных каналов при развитии кратковременной пластичности.

Предложим гипотетическую схему участия внутриклеточного Са2+ и Са2+-мобилизувдих вторичных посредников в развитии кратковременной пластичности ХР. Снижение АХ-деполяризации (входящего АХ-тока) развивается после нескольких аппликаций АХ. Периодическое вхокдеше Са2+ черех ионный канал ХР приводит к локальному возрастанию концентрации этого катиона вблизи внутренней поверхности рецептора. Возрастание уровня внутриклеточного Са2+, входящего в цитоплазму извне по управляемым ХР ионным каналам, активирует са2+-зависимую мобилизацию депонированного Са2+ управляемую рианодиновыми рецепторами. Связывание АХ с ХР повышает уровень cGMP [Beiridge, 1984; Северина, 1987], которая активирует рианодивовые рецепторы и вызывает мобилизацию депонированного Саг+ iBerridge, 1993]. Кроме того', cGitP, вероятно,' активирует соответствупцую протеинкиназу G. " Активация ХР стимулирует гидролиз фосфатидилинозитола [Briggs et al., 1985; Швец И др., 1987; Hicoletti et al., 1989; White, 1988; Yamamoto, Kanaide, 1990; Berrldge," 1991], В . результате которого возрастает внутриклеточный уровень 1(1,4.5)Р3 и фосфатидной кислота. 1(1,4,5)?2 стимулирует мобилизацию депонированного Са2+ через каналы зависимые от 1(1,4,5)Р3 и приводит к возрастанию уровня внутриклеточного Са2+. Накапливашшйся в клетке са2+-ионофор фосфатидаая кислота [Селшцева и др., 1985; Швец и др., 1987] будет такте увеличивать концентрацию внутриклеточного Са2+. Взаимодействие АХ с ХР активирует фосфолипазу к^, что повышает уровень АА и ее ациклических эйкозаноидов. Последние стимулируют мобилизацию депонированного са2+ и повышают его концентрацию в цитоплазме. Таким образом, разные звенья регуляторного каскадного механизма: хемоуправляемый вход Са2+ в цитоплазму, 1(1,4,5)Р3-зависимая и рианодин-зависимая мобилизации депонированного са2+ и вход са2+ извне под действием фосфатидной

кислоты конвергируют на общее звено регуляторного каскада повышают уровень свободного внутриклеточного Са2+. Достигнув определенной концентрации, Са2+ запускает молекулярный механизм, обеспечивающий депрессию АХ-ответа, который может включать: уменьшение сродства ХР к лиганду, снижение мест связывания за счет их-частичной интернализации, инактивацию входящего тока.

Повышение концентрации внутриклеточного Са2+" путем длительной активации потенцпалзависимых са2+ каналов и вхождения са2+ в цитоплазму при тетанлзации сверхпороговыми (для генерации ПД) внутриклеточными толчками' деполяризующего тока нейронов ППаЗ . и ЛПаЗ в режиме фиксации тока (длительность толчка - 700 мс, амплитуда толчка 50-100 нА, мекимпульсный интервал - I с, длительность пачки - 30-60 с) приводила к обратимому подавлению на 22,1+5,9% (п=6) амплитуды АХ-деполяризации и входящего АХ-тока (в рекиме, фиксации потенциала) в ответ на аппликацию АХ после окончания тетанизации. Эти результаты подтверждают реальность изложенного выше механизма депрессии АХ-реакции внутриклеточным Са2+ при ритмической активации ХР.

Поскольку Са2+, в конечном итоге, через внутриклеточный рецептор кальмодулин активирует соответствующую

с а2+/ка ль? «о ду лин-з ависимую киназу, .мощо предполагать, что. эта киназа является мишенью нескольких регулирующих пластичность путей, в которые вовлечены вторичные посредники. Она приводит к кратковременной химической модификации (фосфорилированию) белков ХР, что, вероятно, и является причиной их пластичности.

После прекращения ритмической аппликации АХ избыток свободного внутриклеточного са2+ ликвидируется системами связывания его внутри нейрона: митохондриями, эндоплазматическш рэтикулумом, са^-связывавщими белками (Кудивов, 1Э83] и системами активного транспорта Са2+ из клена: са2+-насосом. на+,са2+-обменником [Котик, Яначек, 1930; Кудинов, 1983]. Соответственно, прекращается модификация ХР и наступает восстановление АХ-реакции.

III.2. Вторичные посредники вовлскншз в рзгуякцзв

пластичности холшюрецептороз нейронов кшоградЕой улитки 15-гпдроксазакозатзтраеновсЯ пхсяотсЗ

Для исследования механизмов двухфазного влияния ациклического зйкозаноида 15-НЕЕЕ (2-20 ц-М) на пластичность ХР исследовали ее

эффекты на фоне предварительного действия ингибиторов синтеза вторичных посредников. Обе фазы модуляторного действия 15-нете нарушали ингибиторы лшюксигеназ (!.тса), ио-синтазы (х^кша) и растворимой гуанилатциклазы (ьу-вэ,583 и метиленовый синий). Ингибиторы рианодин-зависимой (тетракаин) и 1(1,4,5)Р,-зависимой (ТМВ-8) мобилизации са препятствовали длиннолатентному эффекту 15-нете и не влияли на коротколатентный. Удаление Са2+ из внеклеточной среды не влияло на обе фазы модуляторного действия 15-нете (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние ингибиторов вторичных посредников на модуляцию 15-нете глубины депрессии АХ-тока нейронов ППаЗ и ЛПаЗ при ритмическом подведением ¿X к соме

*

п/п

Соединения

Изменение глубины депрессии АХ-реакции {%) Ослабление Усиление

1. 15-НЕТЕ

2. NDGA (2-20 pii) + 15-НЕТЕ

3. Са2+, 0 Mf,! + 15-НЕГЕ

4. Тетракаин: (50-90 цМ) + 15-НЕТЕ

5. ТЫВ-8 (10-60 |ДЫ) + 15-НЕТЕ

6. L-iyßiA (300-400 рЫ) + 15-НЕГЕ

7. ЪУ-83.583 (20-40 рМ) + 15-ННЕВ

8. Метиленовый синий + 15-НЕТЕ (30-50 цМ)

K.oto.T1 тз.ьо.б2

I5,7±5,I 9,'9±2,4 9,6±I,8

II,5±I,6

Примечания: Min, статистическая значимость эфЭектов Ср<0,01> по

__4 2

парному t—тесту Вилкоксоыа; экспозиция 13-НЕТЕ: <70 мин, >70 мин.

Полученные результаты позволили предположить, что коротколатентное действие 15-НЕЕЕ обусловлено торможением синтеза iiö, ссмр и 5-липоксигеназных цроизводных арахидоновой кислот. • В этот период 15-НЕГЕ может ингибировать фосформирование мембранных белков через снижение уровня оСКР и активации киназы с.

Длиннолатентный эффект 15-НЕТЕ связан, по-видимому, с активацией синтеза N0, cSMP, 5-липоксигеназных производных

арахидоновой кислота и потеягшацией (мобилизации Са24* через каналы управляемые рианодиновыми и 1(1,4,5)р3 рецепторами. Участие N0 и cGîîp во вторую фазу действия 15-негв монет реализовываться путем их включения "в путь мобилизации Са2+ через каналы управляемые рианодиновыми рецепторами, а та mes активации cGMP-зависимой протеинкиназы. Участие 5-липоксигеназных ациклических эйкозаноидов в модуляторном действии 15-неге может заключаться в мобилизации ими депонированного Са2+ через активацию гуанилатциклазы. Не исключен и более короткий путь (без участия других эйкозаноидов) мобилизации Са2+ непосредственно 15-нете через каналы, управляемые 1(1,4,5)РЭ рецепторами.

Объяснить разнонаправленные влияния 15-НЕГЕ на одни и те хе регуляториые системы могут разноаффинные мембранные центры 15-НЕТЕ на внешней и внутренней сторонах плазмалеммы, активация которых одним и тем хе лигандом вызывает противоположные эффекты.

Длиннолатэнтный эффект 15-НЕТЕ может маскироваться в начальный период более сильным коротколатентным действием и проявляться поэтому после его окончания.

В пользу предлозеевного механизма свидетельствуют данные биохимических исследований о разнонаправленных влияниях 15-НЕТЕ на уровень внутриклеточного Са2+ [Gukovskaya et al., 1990; Tacher et al., 1992], '5-iO и образованиё соответствующих' эйкозаноидов' [Vanderhoek et al., 1980; Haviv et-al., 1987; Temowitz et al., 1938; Tonakis, Yanderhoek, 1992], . фосфэрилярование белков [Bectanan, Jeter, 1990; Setty et al., 1992].

III.3. Вторичные посредники вовлеченные в регуляцию пластичности холянорецепторов нейрона ШаЗ виноградной улитки опиатшы каппа-ггоЕистом бреиазоцинои

Системы Са2+-мобилизуищих вторичных посредников, сопряженных с опиатнымя рецептора:.® в мембранах нейрона ППаЗ, принимают участие в модуляции опиатннм каша-агсвистом бремазоцином пластичности ХР.

ТМВ-8, R24571 и NDGA достоверно нарушали модуляторный эффект аг-агониста на угашение АХ-тока нейрона ШаЗ. Удаление Са2+ из внеклеточного раствора или добавление в нормальную внеклеточную среду тетракаина не предотвращало ослабления депрессии бремазоцином.

Внутриклеточный механизм ослабления бремазоцином плгспгчности

ХР нейрона ШаЗ виноградной улитки при их ритмической активации АХ, реализуемый через вторичные посредники, включает I) ингибирование 1(1,4,5)?3-зависшой мобилизации депонированного Са2+, действующего через внутриклеточный рецептор кальмодулин и 2) торможение синтеза ациклических эйкозаноидов.- -В результате снижается активация Са2+/калькодулин-зависмой протеинкиназы, фосфоршшроваше белков ХР и/или их ионных каналов, что, в конечном итоге, приведет к снижению пластичности ХР.

Т а' 0 л и ц а 4.

Влияние ингибиторов вторичных посредников на модуляцию бремазоцином глубины депрессии АХ-тока нейронов ШаЗ при ритмическом подведением АХ к соме

» Соединения Изменение глубзны

п/п .депрессии АХ-реакции {%)

Ослабление Усиление

I. Бремазоцян 15,6±1,0

2. Са2+, 0 мМ, + Еремазоцин 12,7±1,5

3. Тетракаш (50-500 + Еремазоцин 15,6*1,5

4. иге-а (50-300 цМ) + Еремазоцин -

5. К24571 (20-50-ЦЫ) + Еремазоцин -

6. ШЮА (5-30 цМ) + Еремазоцин -

Примечания: Мш, статистическая значимость эффектов Ср<0,01> по парному 4—тесту Вилкоксона.

Свободный внутриклеточный Са2+, поступавдий по хемоуправляемым ионным каналам плазмалеммы и Са2+-каналам внутриклеточного депо, управляемым рианодиновыми рецепторами, не опосредуют модуляторного действия бремазоциза на пластичность ХР нейрона ШаЗ.

111.4. Вторичные посредники вовлеченные в шдуляцив

холинорецепторов нейронов садовой улитки БКРХЫНРамидоы Тормозящее действие БКРИССРамида уменьшали №-метил-1-аргиниЕ (Ь-Н^ЫМА) И Ь-НАЫЕ - ингибиторы Ш-СШТазЫ; ЬУ-83,583 - ингибитор растворимой формы гуашлатциклазы, мобилизации внутриклеточного са2+, антагонист эффектов N0; тыв-8 - антагонист внутриклеточного

Са2+, тормозящий мобилизацию депонированного Са2+ через каналы, управляемые рецепторами 1(1,4,5)Р3; я-7 - антагонист кальмодулина и блокатор Са2+/калъмодулин-заЕисимой протеишшназы II; и-73122 -ингибитор фосфолипазы о и гидролиза фосфатидилинозитола до 1(1,4,5)Р3; 4-(октадецил-фенил)-4-оксобут-2-еновая кислота (ООЕА) - ингибитор фосфолипазы а^ (табл. 5). Наиболее значительно уменьшали тормозящее действие зкР'ЯШ'амида 1г-н°1ША (на 36,0*7,6:6), и-73122 (на 26,9+6,7$) и ИШ-8 (на 26.It3.8JS) (табл. 5).

Не предотвращали торлозящее действие БКРУНКРамида- па АХ-ток Ир-аденозин 3' ,5*-монофосфотиоат триэтиламин (Ир-сАЯРв) - блокатор оАМР-зависимых протеинкиназ I и II; тетракаин - локальный, анестетик, способный тормозить. мобилизацию Са2+ через каналы управляемые рианодиновыми рецепторами; РМА и полимиксин в (активатор и блокатор протешсошазы с); индометацин - блокатор циклооксигеназы (табл. 5).

Таблица 5.

Ослабление модуляторами вторичных посредников депрессии -входящего АХ-тока зкруывгамидом

Л - Соединения Концентрация Ослабление эффекта-БКРтангамида (,%) ■

тип (цМ) модуляторами вторичных посредников

1. L-NG!MA 50; 100 36,0*7,6**

2. Ir-NAME 50; 100 16,5*3,6**

3. LY-83,583 20 18,4*3,9**

4. Rp-cAHPS I; 5 <10

5. ТШ-8 I; 5 26,1*3,8**

.6. Тетракаин 4; 5 <10

7. РЯА 0,1 <10

8. Полимиксаш В I; 5 <10

9- W-7 0,3-2 22,3*5,6*

10. И-73122 0.3-1 26,9*6,7*

11. 1ÍDGA 3; 5 21,6*5,1*

12. Индометацин 4; 5 ' <10

13. ООЕА 0.3; 0.4 14,3*0,5***

Примечания: Utm, *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001.

Можно предположить участие Са2+- мобилизующих систем вторичных посредников в торможении ХР соматической мембраны нейронов f1, f2, f4 и f5/6 садовой улитки skpïmr?амидом. Действие пептида достигается через активацию фосфолипаз о и Aj, ш-синазы, растворимой гуанилатциклазы, повышение уровней ко, cgjip, арахидоновой кислоты и ее ациклических эйкозанондов, а также 1(1,4,5)Р3 с последующей активацией мобилизации са2+, кальмодулияа и са2+/кальмодулин-занисимой протеинкиназы II.

сАЫР-зависимая протеинкиназа, протеинкиназа с и циклические эйкозаноида, вероятно, не участвуют в модуляторном эффекте skfymrfамида.

По причине сильной депрессии АХ-тока тетракаином в работе использованы концентраций (4; 5 рМ) меньшие тех (ic50=120 цМ) при которгх он тормозит рианодиновые рецепторы и зависимую от них мобилизацию Са2+ [Martin et al., 19931. Поэтому отсутствие влияния тетракаина на модуляторный эффект экрумкравда не исключает возможной роли мобилизации Са2+ через каналы, контролируемые рианодиновыми рецепторами, в торможении пептидом ХР.

ЗАКЛШЕШЕ

Результаты проведенных исследований позволяют сформулировать несколько принципиальных положений о механизмах пластичности хемо-и электровозбудимых мембран нейрона. • • -

I. Обратимые изменения возбудимости хемо- и электровозбудамых мембран нейрона - постсинаптический механизм пластичности нервной клетки в экспериментальных моделях обучения. При депрессии возбудимости электрогенных мембран их реактивность снижается, при повышении возбудимости реактивность растет.

II. Изменения возбудимости хемо- и электровозбудимых мембран охватывают всю мембрану нейрона (генерализация пластических изменений возбудимости), хотя стимул ее вызывакдий активирует только локальную область плазмалемш.

III. Эндогенные опиоидн контролируют пластичность хеморецепторов нейронов. Характер модуляции зависит от типа активируемых опиатных рецепторов.

IY. Пластичность ХР нейронов регулируется не одним, а несколькими вторичными посредниками, объединенными способностью изменять концентрацию свободного Са2+ в цитоплазме путем влияния на мобилизацию депонированного са2+ и хемоуправляемый вход Са2+ из

внеклеточной среды.

т. Один и тот же вторичный посредник мокет регулировать пластичность ХР в противоположных направлениях, действуя разнонаправленно на' одни и те же регуляторные внутриклеточные Са2+-мобилизующие системы. Такую способность могут обеспечивать рецептирующие посредник разноайшныё центры на внешней и внутренней сторонах плазмалемш в случае, если их активация оказывает разнонаправленные влияния на концентрацию свободного цитоплазматического Ca2f. Оба модуляторных эффекта могут накладываться друг на друга - доминировать будет более сильный: менее сильный будет маскирован и проявится либо после окончания доминирующего эффекта, либо в • случае его функционального подавления.

YI. Агонисты опиатных рецепторов модулируют пластичность ХР, влияя на базальный уровень не всех Са2+-мобилизувдих вторичных посредников. Вероятно, эффективность разных путей повышения уровня свободного внутриклеточного Са2+ (хемоуправляемый вход из внеклеточной среды, мобилизация из внутриклеточных депо по каналам управляемым рецепторам I(1,4,5)P3, мобилизация из внутриклеточных депо по каналам управляемым р!анодиновыми рецепторами) связана с их пространственной Локализацией в нейроне.

vil. Эндогенный шкрамид-подобный пептид SKPYiíRParom участвует в отрицательной авторегуляции постсинаптического нейрона тормозя его возбуждающие ХР путем повышения цитоплазматического урощи" Са^-мобилизующих вторичных посредников.

Нейроны ЛПаЗ и ППаЗ виноградной улитки входят в грушу командных нейронов (КН), запускающих безусловнорефлекторную реакцию закрытия дыхательного отверстия й сокращения тела животного [Максимова, Балабан, 1983]. Пластичность КН при привыкании оборонительной реакции виноградной улитки проанализирована детально [Соколов, 1981; Максимова, Балабан, 1983; Балабан, Захаров, 1992].

Поскольку установлена холинергическая природа синаптической передачи между сенсорными нейронами ' (ЛПа7, ЛПа9) и КН ЛПаЗ [Тер-Маркарян и др., 1990], можнб полагать, что обнаруженные в нашей работе , закономерности пластичности вне синаптиче ских соматических ХР на экспериментальной модели привыкания будут определять пластичность субсинаптических ХР КН при прикасании оборонительной реакции животного. С учетом, такого долдония

представим вероятную роль выявленных механизмов пластичности ХР и злектровозбудамой мембраны в пластичности спайковой реакции КН (определяющей величину эффекторной реакции) цри тактильной стимуляции во время привыкания оборонительной реакции закрытия дыхательного отверстия.

Привыкание. Ритмическая тактильная ■стимуляция активирует

повторно субсиналтические ХР КН, что индуцирует вход Са2+ через

управляемые ХР ионные каналы плазмалеымы, а также синтез через

о-белки ряда Са2+-мсбилизухщих вторичных посредников и мобилизацию

- депонированного Са2+ через ионные каналы, управляемые рецептором

1(1,4,5 )РЯ и рианодановыма рецепторами. Б результате концентрация

р.

свободного внутриклеточного Са повысится до определенного уровня. По механизму отрицательной обратной связи возрастание концентрации свободного Са2+ в цитоплазме по сравнению с базальной редуцирует амплитуду холшергического ВПСП до определенной' величины за счет снижения чувствительности субсинаптических ХР или ингибирования управляемого ими ионного тока через мембрану. Механизм отрицательного влияния внутриклеточного Са2+ на ХР включает активацию са2+/КМ-зависимой протеиакиназы.

Неодинаковое соотношение ХР, управляющих проводимостью разных ионов через мембрану в разных субсинаптических зонах - одна из возможных причин неодинаковой динамики- депрессии ВПСП КН, активируемых стимуляцией соседних участков тела улитки, и привыкания оборонительной реакции.

Снижение амплитуды ВПСП приведет к редукции спайковой реакции КН. За счет генерализации пластических изменений возбудимости в период привыкания снизится возбудимость электровозбудимой мембраны (КУД сместится в позитивном направлении, увеличится пороговый потенциал 1Щ, уменьшится нейрона), что дополнительно ослабит величину спайкового разряда и, соответственно, эффекторную оборонительную реакцию. Высокий порог генерации ЦД в КН -вероятная причина полного блокирования генерации ЦЦ и полного привыкания оборонительной реакции несмотря на частичную депрессию ортодромного ВПСП.

Генерализация снижения возбудимости - причина'редукции'ВПСП, вызванных раздражением соседних участков тела, активирующих другие синаптические входы и субсиналтические ХР (генерализация привыкания).

Завершение ритмической тактильной стимуляции и,

соответственно,, активации субсинаптических ХР КН прекратит вход Са2+ в цитоплазму и повышенный синтез Са2+-мобилизущих вторичных посредников, что перестанет поддерживать увеличенную концентрацию свободного цитоплазматического са2+, уровень которого постепенно снизится до базальной величины из-за его захвата Са2+-депонирухщими структурами. В результате степень ингибирования субсинаптических ХР будет ослабевать и ВПСП постепенно возрастет до контрольной величины. Последнее индуцирует повыейниз возбудимости спайкгенерируицих мембран до контрольной. В результате возрастет спайковая реакция КН и. управляемая им эффекторная реакция.

С какой целью природа создала многозвенный внутриклеточный механизм регуляции пластичности ХР с участием нескольких вторичных посредников, имеющих общую мишень - повышение концентрации свободного Са2+ в цитоплазме? Вероятно, многозвенная регуляция пластичности ХР по параллельным внутриклеточным' путал облегчает модуляции пластичности ХР внеклеточными регуляторами, рецепторы которых связаны с синтезом нескольких Са2+-мойилизугщих вторичных посредников. Кроме того, такой механизм может обеспечить тонкую регуляцию привыкания оборонительной реакции в результате баланса вероятных .разнонаправленных влияний внеклеточных регуляторов на содержанке' разных Са2+-мобилизущих вторичных посредников.

Сенситкзадая. Кратковременное возрастание спайковой реакции КН и эффекгорной реакции на 2-3-й стимулы в серии привыкания и после экстрастимула могут возникать за счет ослабления депрессии ХР эйкозаноидом 15-НЕТЕ и повышения возбудимости электровозбудамой мембраны фактором, выделяющимся из пресинапса совместно с АХ. Модуляторное4 действие этого фактора кратковеменно из-за возможно быстрой десенситизации его- метаботропных рецепторов на мембране.

Контроль прпнмкания эндогенншш знаклегочшин регуляторами. Эндогенные опиоиды и другие пептиды могут осуществлять тоническую и фазическую модуляцию привыкания оборонительного рефлекса улитки действуя на уровень свободного внутриклеточного Са2+ через иетаботропные внесинаптические рецепторы разных типов на соме КН, связанные с синтезом Са2+-мобклизугпих вторичных посредников, регулирующих пластичность субсинаптических ХР. Изменяя цитоплазматический уровень вторичных посредников в ту или другую сторону, . внеклеточные регуляторы могут разнонаправленно модулировать привыкание оборонительной реакции.

вывода

1. Холинорецепторы никотинового и мускаринового типов идентифицированы фармакологически на соме нейронов ШаЗ, Ша4 и ЛПаЗ виноградной улитки. Никотиновые рецепторы индуцируют, в основном, На+-проводимость, а мускариновые - Са2+-проводимость.

2. Пластичность хемовозбудамых мембран нейронов виноградной улитки сопровождается обратимыми изменениями их чувствительности к медиатору. Степень пластичности холинорецептивных зон связана с соотношением в них холинорецепторов, управляющих проводимостью разных ионов. .

3. Пластичность элактровозбудимнх мембран нейронов зрительной коры и teotгзm оросит болотной черепахи сопровождается изменением параметров возбудимости этих мембран: критического уровня деполяризации и порогового потенциала спайка, порога раздражения деполяризующим током, входного сопротивления.

4. Стимуляция хемо- или электровозбудимой мембраны нейрона, модифицирующая ее реактивность и возбудимость, индуцирует изменение возбудимости в соседних, неактивируемых стимулом участках мембраны.

5. Эндогенные опиоиды контролируют активность нейронов виноградной улитки через ионотропные (ыю, дельта, каппа, эпсилон) и метаботропные (мю, каппа) опиатвые рецепторы.

6. Спийтный "мю-агонист морфин углубляет, а каша-агонист бремазощн ослабляет пластичность холинорецепторов нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки в экспериментальной модели привыкания.

7. Тормозящие опиатвые мю-, дельта-, каша- и сигма-рецепторы идентифицированы фармакологически в зрительной коре черепахи. Мю-, каппа- и сигма-агонисты модулируют пластичность хемовозбудиыых мембран нейронов при привыкании. Выявлены облегчающие и тормозящие взаимодействия разных типов опиатных рецепторов. Активация дофаминовых, серотониновых и ыускариновых рецепторов ваша для проявления модулирующих эффектов опиатных агонистов. -

8. Новый эндогенный пептид моллюсков БКРУМЕРамид из семейства РМК?амидов тормозит ионотропные деполяризующие холинорецепторы нейронов 12. ?4 и Р5/6 правого • париетального ганглия садовой улитки взаимодействуя со специфическими метаботропными рецепторами плазмалеммы.

9. Пластичность деполяризующих холинорецепторов нейронов ШаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки : в экспериментальной модели привыкания

регулируется несколькими вторичными посредниками, синтез которых опосредован активацией о-белков. В ряд внутриклеточных регуляторов включены: .внутриклеточный свободный Са2+, поступающий в цитоплазму по хемоуправляемым ионным каналам плазмалемми и мобилизованный из внутриклеточных Са2+-депо через каналы, управляемые рецепторами инозитол-1,4,5-трифосфзта и ■ рианодиновыми рецепторами; внутриклеточный рецептор Са2+ кашгадудин и вторичные посредники, объединенные способностью повышать внутриклеточную концентрацию свободного Са2+: сСНР, продукты фосфознозитидного цикла (инозитол-1,4,5-трифосфат, фосфатидная телота), арахцдоновая кислота и ее ациклические производные из 5- а 15-липоксигеназных путей (5-гидроксиэйкозатетраеновая кислота, лейкотриены в4, с4> 15-гидроксиэйкозатетраеновая кислота).

10. Ациклический эйкозаноид 15-гидроксиэйкозатетраеновая кислота модулирует разнонаправленно пластичность холинорецепторов нейронов ШаЗ н ЛПаЗ виноградной улитки в экспериментальной модели привыкания. Коротколатентный (менее 70 мин) эффект зйкозаноида (ослабление пластичности) обусловлен тормогешем синтеза N0, сбЯР и 5-липоксигеназЕых эйкозаноидов. Длиннолатентный (более 70 мин) эффект (усилёние пластичности) связан с активацце синтеза ко, сбир, 5-липоксигеназных эйкозаноидов, потенцйацией мобилизаций Са2+ по каналам, управляемым рецепторами инозитол-1,4,5-трифосфата и рианодиновыми рецепторам.

11. Внутриклеточный механизм ослабления ошатвым каша-агонистом бремазоцином пластичности холкнорецепторов нейрона ППаЗ виноградной улитки в экспериментальной модели привыкания включает: ингибирование . инозитол-1,4,5-трифосфат-зависшгай мобилизации депонированного Са2+ и последующего связывания с кальмодулином, а такке торможение синтеза ациклических эйкозаноидов.

12. Бкгакгамид тормозят холнЕорецепторы нейронов Р1, гг, 4 и Р5/6 садовой улитки через активацию фосфолицаз си А^ ш-синтазы, растворимой гуанглатциклазы и лшюксигеназ, повышаших базальвый внутриклеточный уровень ко, сС-чр , арахидоновой кислоты, ациклических эйкозаноидов, инозитол-1,4,5-тр*фосфзта и индуцируемой им мобилизации Са2+ с последущей активацией кальмодулзша и са2+/каль?юдулин-зависк.юй прото:ппа1назы II.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОПУЫШКОШШХ РАБОТ ПО ТЕЦЕ ДИССЕРТАЦИИ

Гусельников В.И., Пивоваров. A.C., Механизмы привыкания электровозбудпмой мембраны коркового нейрона// Еурн. высш. нервн. деят. 1979. Т. 29. J5 2. С. 358-370. (Neurosoi. Behav. Physiol. 1980. Т. 10. N 6. P. 552-561.)

Пивоваров A.C., Гусельников B.K. Изменение входного сопротивления коркового нейрона и порога раздражения его электровозбудимой мембраны деполяризующим током в процессе привыкания// Журн. высш. нервн. деят. 1979. Т. 29. Д 3. С. 619-630. (Neurosoi. Behav. Physiol. 1981.. Т. 11. N-2. P. 141-150.)

Пивоваров A.C., Гусельников В.И. Генерализованное торможение нейрона, вызванное фотогенной судорожной электрической активностью// Докл. АН СССР. 1979. Т. 245. JS 5. С. I267-I27I.

Гусельников В.И., Пивоваров A.C. Пластичность нервной клетки при обучении// Биол. науки. 1980. & 4. С. 66-81.

Пивоваров A.C., Валоушкова В. Изменения возбудимости электровозбудиыой мембраны ,и ионных токов действия во время привыкания к внутриклеточным раздражениям тектального нейрона черепахи// Еиол. Еауки. 1980. Je 7. С. 55-63.

Пивоваров A.C., Цагарели М.Г., Гусельников В.И. Пластические изменения ответов хемо- и электровозбудимой мембран коркового нейрона после ортодромной тетанизации// Яурн. высш. нервн. деят. '1981. Т. 31. 4. X!.'789-802; " '

Пивоваров A.C., Цагарели М.Г. Посттетанические изменения входного сопротивления коркового нейрона// Докл. АН СССР. 1981. Т. 259. J6 4. С. 1016-1020.

Пивоваров A.C., Цагарели М.Г. Посттетанические изменения порога раздражения электровозбудимой мембраны коркового нейрона деполяризующим током// Журн. высш. нервн. деят. 1981. Т. 31. & 5. С. 1063-1070.

Пивоваров A.C., Цагарели М.Г. Изменение чувствительности хемовозбудиыой мембраны и возбудимости спайкгенерирущвй мембраны коркового нейрона после его внутриклеточной тетанизации// Изв. АН ГССР, сер. биол. 1981. Т. 7. JS 6. С. 493-501.

Пивоваров A.C., Беспалова Ж.Д., Бакалкин Г.Я. ■ Торможение электрической активности зрительной коры левого и правого полушарий энкефалинами// Докл. АН СССР. .1981. Т. 261. ik I. С. 240-244.

Цагарели Пивоваров A.C. Изменение входного

сопротивления коркового нейрона после внутриклеточной тетанизации// Изв.' АН ГССР, сер. биол. 1982. Т. 8. J; I. С. 10-14.

Пивоваров А.С., Цагарели М.Г. Возбудимость электровозбудимой мембраш коркового нейрона после его внутриклеточной тетанизации гиперполяркзунцим током// Журн. выси, нервн. деят. 1982. Т. 32. й 4. С. 773-775. -

Cuselnüov У.Х., Pivovarov A.S. Plasticity oí cortical neurons during learning: physiological mechanisms// International Brain Research Organization lionograph Series. Vol. 9. -Neuronal Plasticity and Memory Format ion/ Ed.. C. Ajmone Marsan & H. Ziatthies. N.Y.: Raven Press, 1982. P. 37-62.

Пивоваров А.С. Индукция пластических изменений возбудимости нейронных электрогенных мембран при привыкании// Журн. выси, кервн. деят. 1983. Т. 33. й I. С. 138-145.

Пивоваров А.С., Дроздова Е.И. Чувствительность нейронов зрительной коры черепахи Втуз orbicularis к биологически активным соединениям// Журн. эволщ. биохим. физиол. 1983. Т. 19. & I. С. 68-73.

Пивозаров А.С., йзместьев В.И. Модуляция привыкания монокомпонентными растворами агошетов опиатных мю-, дельта-, каппа- и сигаа-рецепторов// Журн. выси, нервн". деят.. 1984. Т.'34. й I. С. 98-106.

Пивоваров А.С., Йзместьев В.И. Взаимодействие разных типов опиатных рецепторов нейронов коры черепахи при их активации специфическими агонисташ// Нурн. высш. нервн. деят. 1984. Т. 34. й2. С. 317-322.

Pivovarov A.S., Izrae3tyev Y.I.. Different role oí opiate mu-, delta-, kappa- and signa-receptora in modification oí habituation of orthodromic evo&ed potential in the turtle vitrual cortex. Brain Res. 1934. Vol. 300. If 2. P. 257-273.

Пивоваров А.С., Сагаяелидзе Г.Н. Модуляция ионаг.ш кальция кратковременной пластичности холиворецептивной мембраны Еэйронов моллюска// !урн. высш. нервн. деят. 1986. Т. 36. й 5. С. 947-955.

(Neurosci. Behav. Physiol. 1987. Vol. 17. И 4. P. 283-296.)

2+

Pivovarov A.S., Saganelidze Q.N. Effect of Ca on short-term plasticity of cholinoreceptive membrane in snail neurons// Advances in the Biosciences, Vol. 59. Learning and Heisory: Hechaniems of Information Storage in the Kervous System/ Ed. H.Iiatthies. Oxford, V.Y.. Beijing: Pergaaon Presi, 1986. ?. 73-77.

Пивоваров A.C., Изместьев Б.И. Влияние блокада дофаминовых., серотониновых и холкнорйцеиторов на модификацию ошгаидаык привыкания в зрительной коре черепахи// Журн. высш. нервн. дзят. 1987. Т. 37. Je 6. С. I099-II09.

Пивоваров A.C., Саганелидзе Г.Н. Различия в привыкании никотиновых и ыускаршювнх холинорецепторов нейрона ППа4 виноградной улитки// Дурн. высш. нервн. деят. 1987. Т. 37. Jé 3. С. 528-536. (Neurosci. Behav. Physiol. 19SS. Vol. 18. И 2. P. 139-146.)

. Саганелидзе Г.Н.. Пивоваров A.C. Привыкание нейрона Ша4 виноградной улитки к локальным аппликациям ацетилхолпна на различные зоны соматической мембраны// Изв. АН ГССР, сер. биол. 1987. Т. 13. Л 6. С. 372-379.

Романенко O.K., Пивоваров A.C., Бакалкш Г.Я. Влияние опиатного антагониста налоксона на электрическую активность идентифицированных нейронов виноградной. улитки// Биол. науки. 1987. JÊ 6. С. 50-55.

Пивоваров A.C., Саганелидзе Г.Н. Идентификация никотиновых и мускариновых холинорецепторов coin нейрона ППа4 виноградной улитки// Нейрофизиология. 1988. Т. 20. J6 2. С. 203-212.

Пивоваров A.C., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Изучение роли циклического 3' ,5'-аденозпныонофосфата в угашении- реакций вдейтифицированных нейронов ' вшоградной улитки на ацешлхолнн// Биол. науки. 1988. № II. С. 54-61.

Пивоваров A.C., Кобылянский А.Г., Бакалкин Г.Я. Латерализация опиоидных рецепторов и их предшзлагаемых лигандов в зрительной коре черепахи// Журн. высш. нервн. деят. 1988. Т. 38. * 2. С. 333-341. (Neurosci. Bahav. Physiol. 1939. Vol. 19. H 1. P. 33-40.)

Котляр Б.И., Пивоваров A.C. Молекулярные механизмы пластичности нейрона при обучении: роль вторичных посредников// Еурн. высш. нервн. деят. 1989. Т. 39. & 2. С. 195-214. (Neurosoi. Behav. Physiol. 1990. Vol. 20. Ii 2. P. 118-135.)

Пивоваров A.C., Саганелидзе Г.Н. Ионные механизмы вызванной ацетилхолином, никотином и мускарином деполяризации нейрона ППа4 виноградной улипсп// Нейрофизиология. 1989. Т. 2I-. JS 3. С. 305-314.

Пивоваров A.C., Саганелидзе Г.Н. Влияние пластических перестроек локальной хемовозбудимой зоны соматической мембраны нейрона ППа4 виноградной улитки на возбудимость соседних хемо- и

элэктровозОудгашх зон// Биол. пауки. 1989. JS 8. С. 41-46.

Пивоваров А.С., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Вторичные посредники в регуляции пластичности нервной клетки при обучении// Биол. науки. 1939. Л 3. С. 75-101.

Пивоваров А.С.., Дроздова Е.И.,, Котляр Б.И., Роль .ЦП® в угаиениа реакций идентифицированных нейронов виноградной улитки на ацетилхолин// Журн. выси, нервн. деят. 1939. Т. 39. й 4.1 С. 728-736. (Neurosci. Behav. Physiol. 1990. Vol. 20. H 4. P. 323-330.)

Пивоваров A.C., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Протеинзшназа С не вовлечена в регуляцяв кратковременной пластичности холинорецепторов нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки// Биол. науки. 1989. JS 10. С. 54-58.

Bakalkin G.Ya., Pivovarov A.S., Kobylansky A.G., NesterenJco P.N., Yarygin K.N. Lateralization of opioid receptors in the turtle visual cortex. Brain Res. 1989. Vol. AGO. N 1-2. P. 268-276.

BakalJcin G.Ya., Pivovarov A.S., Kobylansky A.G., Yarygin K.N., Akparor 7.Xh. Xpsilateral responses induced by Xactor3 present in leit and right hemispheres. Int. J. Neurosci. 1989-Vol. 47. N 3-4. P. 217-230. _ .........

Пивоваров А.С., Котляр Б.И. Регуляция кальцием кратковременной пластичности холинорецепторов нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки// Курн. высш. нервн. деят. 1990. Т. 40. X I. С. 135-142. (Neurosci. Behav. Physiol. 1991. Vol. 21. N 1. P. 1-7.)

Пивоваров А.С., Котляр Б.И. Отрицательное смещение потенциала реверсии вызванного ацетилхолином входящего тока нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки при его угашенпи// Биол. науки. 1990. X 7. С. 70-76.

Пивоваров А.С., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Блокаторы кальмодулина ослабляют кратковременную пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки// Еурн. высш. нервн. деят. 1990. 7. 40. Я I. С. 535-542. (Ileurosci. Benav. Physiol'. 1991. Vol. 21. Я 4. P. 239-295.)

Saganelidze G.N., Pivovarov A.S. Ionic conductance Induced by the activation oi nicotinic and muscarinic cholinergic receptors in Helix neurones// Simpler nervous systems. Studies in Neuroscience. No. 13/ Ed. B.A.Sakharov, ff.Mnloir. Manchester., N.Y.: Manchester Univ. Press, 1991. P. 189-201.

Pivovarov A.S., Drozdova E.I., Kotlyar B.I. Effects oi guanylate cyclase activators on -short-term plasticity of cholinergic receptors or identified neurones of Helix lucortan// Simpler nervous systems. Studies in Neuroscience. Ко. 13/ Ed. D.A.Saüiarov, W.Winlow. Manchester., If.Y.: Manchester Univ. Press,

1991. P. 227-237.

Пивоваров A.C., Дроздова Е.И., Котляр Б.И. Арахидоиовая кислота и ее ациклические производные регулируют кратковременную пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки// Журн. ВЫСШ. нервн. деяг. 1991. Т. 41. J6 4. С. 796-805. (Пейтеsoi. Behav. Physiol. 1992. Vol. 22. N 5. P. 393-400.)

Пивоваров A.C., Дроздова Е.И., Белослудцев Ю.Ю., Демин П.М., Мягкова Г.И. Коротко- и дшшнолатентные эффекты 15-гидроксиэЁкозатетраеновой кислоты на угашение вызванного ацетилхолином входящего тока нейроиов виноградной улитки// Бш. эксперим. биол. мед. 1991. Т. 112. £ 7. С. 3-5.

Пивоваров A.C., Дроздова Е.И., Заболотский Д.А., Мягкова Г.И. Ингибиторы липоксигеназ, эйкозаполииновые кислоты, ослабляют кратковременную пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки// Курн. высш. нервн. деят. 1991. Т. 41. £ 6. С. I2I5-122I. (Neurosci. Behav. Physiol. 1993. Yol. 23. N 2. P. 176-181.)

■ Пивоваров A.C. Холинорецепторы-нейронов виноградной улитки: идентификация, пластичность и ее регуляция опиовдами и вторичными посредниками// Яурн. высш. нервн. деят. 1992. Т. 42. J6 6. С. I27I-I286. (Keurosci. Behav. Physiol. 1994. Yol. 24. N 1. P. 141-151.)

Пивоваров A.C., Дроздова Е.И. Идентификация холинорецепторов на соме нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки// Нейрофизиология.

1992. Т. 24. * I. С. 1Ч--8&.

Пивоваров A.C. Разнонаправленная модуляция опиатными мю- и калпа-агояистами пластичности холинорецепторов нейронов ППаЗ и ЛПаЗ виноградной улитки// Еурн. высш. нервн. деят. 1993. Т. 43. Я 4. С. 826-835.

Пивоваров A.C. Роль вторичных посредников в модуляции 'опиатным каша-аговистом' бремазоцином пластичности холинорецепторов нейрона ППаЗ виноградной улитки// Журн. высш. нервн. деят. 1993. Т. 43. Je 5. С. 953-961.

Пивоваров A.C., Демин П.М., Мягкоза Г.И. Сравнение эффектов 5-гидроксизйкозатетраеновой кислоты и гепокешшна а_ на

пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки// Билл, эксперт*. биол." мед. 1993. Т. 116. Л 10. С. 378-381.

Пивоваров А. С., Эхидо-Вилларреаль У. Влияние снижения мобилизации ■' Са2+ • и его хемоуправляемого входа . в цитоплазму на модуляцию пластичности холинорецепторов нейронов виноградной' улитки 15-гидроксиэйкозатетраеноБОй кислотой// Бюлл. экспершл. биол. мед. 1993. Т. 116. Л II. С. 508-510.

Пивоваров А. С. Влияние дейкотриенов в^, с4, 12-гядроксиэйкозатетраеновоа кислота, трео и эритро-эпимеров гепокошша в^ на пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки// Журн. высш. нервн. деят. 1994. Т. 42. Й 3. С. 575-584.

Пивоваров А.С. Пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки после воздействий на зависимую от инозитол-1,4,5-трифосфата и Са2* мобилизацию депонированного са2+ и уровень фосфатидной кислоты// Журн. высш. нервн. деят. 1994. Т. 44. Л 4-5. С. 796-805.

Пивоваров А.С., Эхидо-Вилларреаль У. Влияние ингибитора лгаюхепгеназ на модуляцию пластичности холинорецепторов I5-HETE// Зурн. высш. нервн. дэят. 1994. Т. 44. JS 4-5. С. 806-811.

Пивоваров А.С. Активаторы G-бэлков повышают пластичность холинорецепторов нейронов виноградной улитки// Курн. выси, нервн. ■ деят. 1994. Т. 44. JS 'б. С. 1070-1076;,

Pivovarov A.S. Regulation oi neuron cholinoreceptor plasticity of Helix lucortm by second messengers and opioids// Conp. Biochcra. Physiol. 1995. Vol. 1100, N 3. P. 229-240.

Пивоваров А.С., Зхидо-Билларрзаль У. Ингибиторы ко синтазы и гуанилатциклазы блокируют модуляцию пластичности холинорецепторов нейронов виноградной улитки 15-гидроксиэйкозатетраеновой кислотой// 'Яурн. выси, нервн. деят. 1995. Т. 45. # 3. С. 558-564.

Pivovarov A.S., Sharma R., Walker R.J. Inhibitory aotion oi SKPYURPanide on acetylcholine rovaptor3 oi Hslix aspsrsa пеигопз: role of second messengers// Gen. Pharmacol. 1995. Vol. 26. N 3. P. 495-505.