Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков"

003481248

На правах рукописи

Копеина Гелина Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

Специальность: 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 9

ГУ

-Г

Москва - 2009

003481248

Работа была выполнена в лаборатории инженерии белка Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории механизмов биосинтеза белка Учреждения Российской академии наук Института белка РАН.

Научные руководители: академик РАН, д.б.н. М.П. Кирпичников,

Защита состоится «12» ноября 2009 г. в 14 ч. На заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан «9» октября 2009 г.

Ученный секретарь диссертационного совета,

к.б.н. Е.Н. Люкманова

Официальные оппоненты:

профессор, д.б.н. С.В. Машко доцент, д.х.н. В.В. Чупин

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

профессор, д.б.н.

Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В течение последних десяти лет широкое применение получили бесклеточные системы продукции рекомбинантных белков. Наиболее распространены и интенсивно изучаемы два типа бесклеточных систем: бактериальная, работающая на основе фракции S30 из Е. coli, и эукариотическая на основе экстракта из зародышей пшеницы (WGE - wheat germ extract). На сегодняшний день выходы целевых белков в этих системах достигают нескольких миллиграммов с миллилитра реакционной смеси, что дает возможность получать белковые объекты в количествах, позволяющих проводить биологические, биохимические и биофизические исследования. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции. Во-первых, в такой системе синтезируется в основном целевой продукт, во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также агентов, позволяющих удерживать сиитезируемый полипептид в растворе, и, в-третьих, можно проводить синтез белков, селективно меченных по определенным аминокислотным остаткам стабильными или радиоактивными изотопами.

Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса. Мутации в их аминокислотной последовательности во многих случаях приводят к возникновению и развитию ряда нервных заболеваний. Изучение этих объектов затруднено в связи с тем, что мембранные белки довольно сложно получить в растворимой форме в достаточных количествах, так как они обладают функциональной активностью и нативной структурой только в мембранном (или мембраномоделирующем) окружении. Поэтому, при продукции в клетках эти белки в большинстве случаев выпадают в осадок и накапливаются в тельцах включения. В бесклеточной системе данную проблему можно решить, добавляя в трансляционную смесь мембраномоделирующие частицы, такие как мицеллы детергентов, липосомы, липид-белковые нанодиски.

Для некоторых структурных исследований с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) требуются белки, меченные стабильными изотопами 13С и/или ,5N по определенным аминокислотным остаткам. Получение селективно меченых белков при клеточной экспрессии часто затруднено из-за возможного перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтеза подобные механизмы перераспределения метки отсутствуют, что позволяет добиться большой селективности включения меток.

Таким образом, исследование принципов работы и способов применения бесклеточных систем для синтеза белков с целью их последующего изучения является актуальной задачей молекулярной биологии, биотехнологии и биофизики.

Цели и задачи исследования. Целями исследования являлись изучение и оптимизация работы бесклеточных систем, оценка влияния определенных агентов

на выход целевого продукта в бесклеточных системах, разработка эффективных систем продукции определенных белков. В качестве модельных объектов были выбраны: зеленый флуоресцирующий белок из Aequorea victoria (GFP), фермент дигидрофолатредуктаза из Escherichia coli (ДГФР), пептидогликан-связывающий белок человека Tag7, внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека а7 типа (а7ВД) и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+ канала KvAP из археи Aeropyrum Pernix (ВСД-KvAP). Для достижения заданных целей было необходимо выполнить следующие задачи:

1. Оптимизировать работу бесклеточных систем на основе экстрактов из Е. coli и зародышей пшеницы для максимального увеличения выхода целевых белков.

2. Изучить формирование полисом как функциональных белоксинтезирующих единиц в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы.

3. Изучить влияние ряда детергентов на синтез белков в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы на примере GFP и ДГФР.

4. Продемонстрировать применимость детергентов для получения белков в растворимой форме в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы на примере Tag 7.

5. Разработать эффективную систему продукции а7ВД на основе бактериальной бесклеточной системы.

6. Продемонстрировать возможность получения селективно меченых мембранных белков в бактериальной бесклеточной системе для структурных исследований методом ЯМР на примере ВСД-KvAP.

Научная новизна и значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, были получены впервые.

1. Изучено формирование полисом как функциональных белоксинтезирующих единиц в оптимизированной бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы.

2. Изучено влияние ряда неионных детергентов на бесклеточную систему на основе экстракта из зародышей пшеницы.

3. Подобраны условия синтеза радиоактивно меченого пептидогликан-связывающего белка человека Tag7 в растворимой форме в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы.

4. На основе бактериального экстракта разработана эффективная бесклеточная система продукции а7ВД в функционально активной форме.

5. Разработана эффективная система продукции ВСД-KvAP с использованием бактериальной бесклеточной системы. Подобраны условия получения селективно меченого белка, а также условия его ренатурации.

Изучение процесса формирования полисом в бесклеточной системе из зародышей пшеницы открывает перспективы для более детального понимания процесса биосинтеза белка у эукариот. Результаты исследования влияния детергентов на пшеничную бесклеточную систему позволяют использовать её в практических целях, например, для синтеза мембранных белков в растворимой форме. Разработка эффективных систем продукции доменов ионных каналов

позволяет получать белковые объекты, в том числе селективно изотопно-меченые варианты, в количествах, достаточных для структурных исследований. Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 8-й международной конференции «РНК-белковые взаимодействия» (Московская область, 2006), международной конференции «Структура, функции и биосинтез белка» (Пущино, 2007), 33-м конгрессе Европейских биохимических сообществ (Афины, Греция, 2008), XVI международном симпозиуме «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2008), XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008), 4-ой международной конференции Европейского нейрохимического общества «Успехи в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Лейпциг, Германия 2009), заочной электронной конференции Российской академии естествознания «Технологии живых систем» (2009), международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья в зарубежном журнале и 1 статья в отечественном журнале

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на _ страницах

машинописного текста, состоит из введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждения), а также заключения и выводов.

Работа проиллюстрирована_рисунками, содержит_таблиц. Библиографический

указатель содержит_источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении рассмотрена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и основные задачи работы, обоснованы практическое применение результатов, а также научная новизна и значимость работы.

В Главе 1 представлен литературный обзор, в котором рассмотрены принципы работы бесклеточных систем, история их открытия, основные методы их оптимального использования для получения рекомбинантных белков. Бесклеточные системы работают на основе содержимого клеток (экстракта), полученного тем или иным способом. Бесклеточные экстракты содержат рибосомы, факторы инициации, элонгации и терминации, они способны транслировать различные мРНК, как про-, так и эукариотического происхождения, и при добавлении компонентов, необходимых для биосинтеза белка (аминокислоты, нуклеозидтрифосфаты), в этих экстрактах начинает синтезироваться белок. Аналитический вариант бесклеточной системы, часто применяемый для тестовых экспериментов (так называемая batch-система), представляет собой находящуюся в одном объеме смесь экстракта, ферментов, матрицы и низкомолекулярных компонентов, таких как аминокислоты, нуклеозидтрифосфаты, соли. Однако для продукции белков в препаративных количествах используется другой вариант бесклеточной системы, - система диализного типа CECF (continuous exchange cell-free). Принцип ее работы заключается в том, что трансляционная смесь, содержащая высокомолекулярные компоненты, отделена от питающего раствора полупроницаемой мембраной, через которую происходит диализ (рис.1). Объем питающего раствора в 10-20 раз превосходит объем трансляционной смеси, поэтому концентрация низкомолекулярных веществ, необходимых для синтеза белка (аминокислоты, нуклеотиды, энергетические компоненты), остается достаточно высокой на протяжении многих часов. Данная система способна синтезировать целевой белок в течение всего времени инкубации (десятки часов), и выход продукта может составить несколько миллиграммов с одного миллилитра трансляционной смеси. Для повышения продуктивности бесклеточной системы необходима оптимизация условий ее работы: подбор концентрации экстракта, аминокислот, нуклеотидов и других компонентов,

Трансляционная »"uprk

Полупроницаемая мембрана

Питающий раствор

Рис. 1. Схема организации работы бесклеточной системы диализного типа СЕСР.

а также подбор генетических конструкций, которые содержат элементы, усиливающие эффективность трансляции.

В литературном обзоре также описаны разнообразные способы решения проблемы агрегации белка, с которой часто сталкиваются исследователи как при экспрессии генов целевых белков в клетках, так и в бесклеточных системах. Кроме того, описаны основные особенности белков-объектов данной работы, для которых были подобраны эффективные системы продукции.

В Главе 2 рассмотрены экспериментальные методики, примененные в работе. Структурные исследования методами спектроскопии ЯМР проводились совместно с Шенкаревым 3.0. и Парамоновым A.C., сотрудниками лаборатории биомолекулярной спектроскопии ЯМР ИБХ РАН.

В Главе 3 изложены основные результаты, полученные в ходе работы.

Формирование полисом в оптимизированной бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы

Для эффективной работы бесклеточной системы на основе экстракта из зародышей пшеницы необходима оптимизация концентрации ионов Mg2+ и К+, а также мРНК. Для определения оптимальных концентраций бесклеточную систему сначала титровали раствором ацетата калия, после чего при уже найденном оптимальном содержании К+ титровали раствором ацетата магния, и, определив оптимальные параметры, подбирали концентрацию мРНК. Эффективность работы системы оценивали по количеству синтезированного белка. Так, например, для мРНК, кодирующей белок люциферазу из Photimis pyralis, были определены следующие оптимальные концентрации калия, магния и мРНК в трансляционной смеси: 100 мМ для К+, 2мМ для Mg2+ и 510 пМ для мРНК. Подобное титрование системы проводили для каждой отдельной матрицы, использовавшейся в работе.

Общеизвестно, что биосинтез белка в клетках происходит на рибосомных комплексах, - полисомах. При этом рибосомы инициируют синтез белка на мРНК, продвигаясь дальше по матрице, заполняют её одна за другой, образуя функциональную белоксинтезирующую единицу. В эукариотических полисомах происходит дополнительное ускорение синтеза белка за счет реинициации. Данный процесс протекает следующим образом: рибосомы в полисоме заканчивают синтез белка на стоп-кодоне и снова инициируют трансляцию на той же самой молекуле мРНК. При этом мРНК циркуляризуется, а эукариотические полисомы приобретают нелинейную, циркулярную форму, например, форму розеток, колец, двойных рядов. В ходе работы бесклеточной системы из зародышей пшеницы также образуются полисомы. Изучение процесса их формирования необходимо для более детального понимания процесса биосинтеза белка. С этой целью были исследованы скорость формирования полисом, их длина и форма.

-1-1-1-1—I—I—I-1—г

23456789 10 11 Объем градиента, мл

10 мин

20 мин

40 мин

120 мин

Рис.2. Профили седиментации трансляционной смеси систем на основе пшеничного экстракта, проработавших в течение 0, 10, 20, 40, 60, 120 и 240 мин: Л - зона легких полисом, С - зона полисом среднего размера, Т - зона тяжелых, плотнозаполненных полисом. Электронно-микроскопические изображения препаратов системы трансляции, проработавших в течение 10, 20,40 и 120 минут.

Содержание полисом в оптимизированной бесклеточной системе анализировали с помощью ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы. Из трансляционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл после 0, 10, 20, 40, 60, 120 и 240 мин от начала работы системы и далее проводили седиментационный анализ (рис.2). В ходе работы была определена длительность одного раунда трансляции (время, которое требуется рибосоме для синтеза одной полипептидной цепи) для белка люциферазы. Один раунд трансляции определяли по времени завершения синтеза люциферазы после добавления ингибитора инициации трансляции эдеина.

Это время составило 8 мин. На профилях седиментации и электронно-микроскопических изображениях (рис.2) можно увидеть, что в первые 10 минут (примерно 1 раунд трансляции для люциферазы) сформировались лишь короткие полисомы размером до 6-7 рибосом. Электронно-микроскопические изображения демонстрируют, что эти полисомы имели линейную форму. В течение 40 минут (примерно 5 раундов трансляции) доля полисом среднего размера (6-12 рибосом) значительно увеличилась, и начали формироваться тяжелые полисомы (свыше 12 рибосом). На фотографиях видно, что полисомы к этому времени приобрели нелинейную конфигурацию (двурядные образования) (рис.2). Седиментационный анализ показал, что через два часа после начала работы системы пик, соответствующий тяжелым полисомам, отчетливо отделялся от пика, соответствующего полисомам средней длины. К трем часам работы в системе уже преобладали тяжелые полисомы, при этом скорость трансляции не менялась. На электронно-микроскопических фотографиях системы, проработавшей два часа, видны плотноупакованные длинные двурядные полисомы. Повторные эксперименты подтвердили, что общее количество полисом с течением времени сначала возрастет (до 60 мин), а потом к трем часам заметно уменьшается. Скорость же трансляции в начале работы (в первые 1-2 раунда трансляции) повышается, а после остается неизменной, что, по-видимому, указывает на увеличение скорости трансляции в длинных плотноупакованных полисомах. Вероятно, данные полисомы (как и полисомы средней длины) являются циркулярными, и поддержание скорости работы системы, несмотря на снижение общего количества полисом, обеспечивается за счет процесса реинициации. Проведенные эксперименты также показали, что в неонтимизированной бесклеточной системе накапливается значительно меньшее количество плотноупакованных полисом, чем в оптимизированной, что и обуславливает меньшую трансляционную активность неоптимизированной системы.

Изучение влияния детергентов на работу бесклеточной системы на основе экстракта из зародышей пшеницы

В настоящее время бесклеточную систему на основе экстракта из зародышей пшеницы все больше применяют не только в фундаментальных исследованиях механизмов трансляции, но и для решения прикладных задач, например, для получения белков с целью их последующего изучения. По мере того как исследователи находят пути для увеличения продуктивности пшеничной бесклеточной системы, её применение в практических целях становится все более оправданным.

Часто при продукции рекомбинантных белков возникает проблема агрегации. Для её решения при синтезе в бесклеточной системе (в отличие от клеточной продукции) в трансляционную смесь добавляют мицеллы детергентов. Влияние различных детергентов на бесклеточную систему на основе бактериального экстракта хорошо изучено. По имеющимся данным некоторые детергенты (например, p-D-октилглюкозид, додецилфосфохолин, додецилсульфат натрия, CHAPS) заметно подавляют работу этой системы, в то время как другие детергенты

(бридж-35, бридж-78, твин-20, дигитонин, тритон-ХЮО) не влияют на конечный выход белкового продукта. Изучение влияния детергентов на бесклеточную систему на основе экстракта из зародышей пшеницы началось относительно недавно, и на сегодняшний день полученные сведения немногочисленны и противоречат друг другу.

Исследование влияния пяти различных детергентов (бридж-35, дигитонин, тритон-ХЮО, нонидет-Р40, P-D-октилглюкозид) на работу бесклеточной системы на основе экстракта из зародышей пшеницы было проведено при изпользовании в качестве модельного белка зелёного флюоресцирующего белка (GFP, green fluorescent protein). Этот белок обладает хорошей растворимостью, имеет характерные пики поглощения (395 нм) и излучения (510 нм), и его концентрацию можно легко определить, сравнивая флуоресценцию в экспериментальном и стандартном образцах. В экспериментах по синтезу GFP использовали следующие концентрации детергентов: 0,2%, 0,5% и 1%. За накоплением активного продукта следили по флюоресценции GFP. Графики зависимости интенсивности флюоресценции синтезированного GFP от концентрации детергента показывают, что в ходе синтеза при использовании детергентов накапливалось значительно меньшее количество функционально активного продукта по сравнению с контрольной системой, где детергент отсутствует (рис. 3 I). В присутствии бридж-35, дигитонина, тритон-ХЮО и нонидет-Р40 снижение выхода активного белка до 30-50% происходило при добавлении 0,2% детергента. Дальнейшее увеличение концентрации детергента не влияло на выход активного продукта (рис. 3 I).

а о

0.2 0,4 0,6 о.е концентрация детергента,

I

0,2 0,4 0,6 0,8 1

концентрация детергента, % II

Рис.3. Концентрационные зависимости количества продукта трансляции от концентрации детергента. По оси ординат отложено количество СРР, синтезированного за 2 часа работы пшеничной бесклеточной системы. I - график зависимости выхода функционально активного продукта, II - график зависимости выхода радиоактивно меченного продукта.

В присутствии Р-Б-октилглюкозида наблюдалась несколько иная картина: количество синтезированного активного продукта монотонно снижалось до 5% с повышением концентрации детергента (рис. 3). Было выдвинуто предположение,

что снижение флюоресценции связано с тем, что в ходе работы системы синтезируется меньшее количество целевого белка. Иными словами, при добавлении детергентов происходит подавление работы бесклеточной системы. Для проверки этого предположения был проведен анализ накопления целевого белка по включению радиоактивной метки [|4С]-лейцина. В присутствии бридж-35, дигитонина, тритон-ХЮО и нонидет-Р40 (в концентрации от 0,2% до 1%) количество синтезированного продукта практически не отличалось от контрольного варианта системы, не содержащей детергент (рис.3 II). В случае же использования Э-октилглюкозида наблюдалось монотонное падение выхода радиоактивного белка с увеличением концентрации детергента (рис.3 II). Таким образом, использование детергентов бридж-35, дигитонина, тритон-ХЮО и нонидет-Р40 не влияло на эффективность синтеза вРР. Напротив, Р-Э-октилглюкозид ингибировал синтез целевого белка. Был сделан вывод, что этот детергент негативно влияет на работу бесклеточной системы трансляции на основе экстракта из зародышей пшеницы, поэтому в дальнейших экспериментах он не использовался.

Для исключения предположения, что в присутствии детергентов бридж-35, дигитонина, тритон-ХЮО и нонидет-Р40 синтезируется неполноразмерный полипептид, был проведен электрофоретический анализ полученных радиоактивных препаратов вБР с последующей радиоавтографией. Результаты показали, что в присутствии этих детергентов синтезируется полноразмерный белок в тех же количествах, что и в контроле. Причиной наблюдаемого снижения активности йРР могло быть прямое влияние детергентов на его спектральные свойства. Для проверки этой гипотезы был проведен анализ активности препарата вРР в растворах исследуемых детергентов. При добавлении детергентов к раствору активного белка и инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут интенсивность флюоресценции вБР не менялась. Следовательно, присутствие детергентов не приводит к изменению функциональной активности ОБР. Были измерены спектр поглощения и спектр излучения вРР, синтезированного в присутствии разных детергентов. Эти характеристики не отличались от характеристик контрольного белка, синтезированного без детергентов, и соответствовали стандартным спектрам вРР. Можно предположить, что структура и окружение флюорофора этого белка не меняются в присутствии детергентов.

Исходя из полученных данных, было выдвинуто предположение, что присутствие детергентов в бесклеточной системе препятствует формированию правильной пространственной структуры полипептидной цепи ОБР, и, как следствие, часть белка синтезируется в функционально неактивной форме. Это предположение было подтверждено электрофоретическим анализом синтезированного белка. Использование мягких условий приготовления образцов вРР для электрофоретического анализа (инкубация при 37°С, а не при 95 °С) позволило добиться разделения активной и неактивной форм белка (рис.4). При этом полоса, соответствующая активному белку, демонстрировала флуоресценцию в ультрафиолетовом свете в условиях ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. Сравнение электрофорограмм и радиоавтографов препаратов ОРР, синтезированных в присутствии бридж-35 в концентрации 0,2% и без него, позволило оценить долю функционально активного белка в обоих случаях (рис.4). Было показано, что в

контрольной системе без детергента большая часть синтезированного ОБР находится в функционально активной форме, в то время как при использовании бридж-35 доля активного белка уменьшалась более чем на 50% (рис.4 II).

Рис.4. Электрофоретический анализ вРР, синтезированного в присутствии детергента и без него.

I - фотография неокрашенного геля в ультрафиолетовом освещении (стрелкой указана полоса флюоресцирующего ОРР, синтезированного без детергентов)

II - радиоавтограф геля: 1 - контроль, 2 - бридж-35 (0,2%).

I_И

I II

Для изучения влияния детергентов на продукцию в пшеничной бесклеточной системе другого модельного белка, была проведена серия экспериментов по синтезу дигидрофолатредуктазы (ДГФР) (рис. 5). ДГФР восстанавливает дигидрофолат до тетрагидрофолата, используя НАДФ-Н2. По снижению оптической плотности в ходе реакции можно определить активность фермента, то есть оценить количество функционально активного белка в растворе. Как и в случае с вРР, синтез дигидрофолатредуктазы в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы проводили в присутствии разных концентраций детергентов (0,2%, 0,5% и 1%). За накоплением продукта следили по ферментативной активности синтезирующегося белка и по включению радиоактивной метки [иС]-лейцина.

концетрация детергента, % концетрация детергента, %

I II

Рис.5. Графики зависимостей количества ДГФР, синтезированного в пшеничной бесклеточной системе, от концентрации детергента. I - график зависимости выхода функционально активного продукта, II - график зависимости выхода радиоактивно меченного продукта.

В присутствии четырёх исследуемых детергентов (бридж-35, дигитонин, тритон-ХЮО и нонидет-Р40) выход функционально активного продукта в системе практически не отличался от контрольной системы, в которую не добавляли детергент (рис. 5 I). Конечное значение активности дигидрофолатредуктазы через два часа работы системы в разных вариантах составило 1,5-2 ед. активности/мл. Накопление радиоактивно меченого белка также не менялось при увеличении концентрации детергентов (рис.5 II). Следовательно, присутствие детергентов не влияет на выход и функциональную активность ДГФР.

Получение пептидогликан-связывающего белка человека Tag7 в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы

Пептидогликан-связывающий белок человека Tag7 относится к семейству белков, имеющих пептидогликан-распознающий домен. Данный класс белков играет важную роль в узнавании клеточных стенок бактерий и активации антибактериального ответа. В лаборатории генетики рака (Институт биологии гена РАН) было обнаружено, что при попытках экспрессии гена Tag7 в клетках Е. coli продуцировалось крайне мало целевого белка, который агрегировал с образованием телец включения. Попытки ренатурировать белок из осадка также оказались неуспешными. Возможно, склонность Tag7 к агрегации обуславливается его способностью образовывать мультимерные комплексы (Kiselev et al, 1998). Поэтому было решено разработать альтернативную систему продукции Tag7. Используя полученные данные о влиянии детергентов на синтез белка в пшеничной бесклеточной системе, был проведен подбор детергентов (бридж-35, дигитонин, тритон-ХЮО и нонидет-Р40) для синтеза Tag7 в растворимой форме.

I II III IV V

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Щ

Рис.6. Радиоавтограф гелей после ДСН-электрофореза образцов Tag7, синтезированных в присутствии детергентов (концентрация детергента 0,2%): I - контроль, II - бридж-35, III -дигитонин, IV - тритон-ХЮО, V - нонидет-Р40. 1 - общая трансляционная смесь, 2 -еупернатант, 3 - осадок.

Как и в случае с GFP и ДГФР, эффективность синтеза радиоактивно меченого белка Tag7 ([14С]-лейцин) в системах трансляции, содержащих детергент, не отличалась от контрольной системы без детергента. Однако, большая часть синтезированного белка Tag7 в контрольной системе без детергента образовывала

агрегаты, которые легко осаждались при центрифугировании (рис. 6 I). Была изучена зависимость доли растворимой фракции синтезированного белка Tag7 от типа использованного детергента (концентрация 0,2%). Эксперименты в аналитическом варианте бесклеточной системы показали, что в присутствии бридж-35 около 60% синтезированного белка оставалась в растворимой форме (рис. 6 II). При использовании дигитонина распределение между растворимой и нерастворимой фракциями синтезированного Tag7 составляло примерно 1:1 (рис.6 III). При добавлении в трансляционную смесь тритон-ХЮО или нонидет-Р40 в супернатанте оставалось лишь около 30% белка (рис.6 IV, V). Повышение концентрации использованных детергентов до 1% не приводило к увеличению растворимой доли синтезированного белка. Таким образом, наибольший выход растворимой фракции Tag7 был получен при использовании бридж-35 в концентрации 0,2%.

Для продукции Tag7 в препаративных количествах была использована бесклеточная система диализного типа (CECF-система). Были использованы оптимальные условия, найденные для синтеза Tag7 в аналитической системе (batch-система). В CECF-системе трансляции на основе экстракта из зародышей пшеницы синтез белка был проведён в присутствии детергента бридж-35 в концентрации 0,2% при добавлении [14С]-лейцина. После синтеза в течение 24 часов трансляционную смесь центрифугировали и анализировали фракции с помощью электрофореза с последующей радиоавтографией. Эксперименты показали, что распределение синтезированного полипептида при добавлении бридж-35 между растворимой и нерастворимой фракциями было примерно такое же, как и в аналитическом варианте, то есть около 60% синтезированного белка оставалось в растворимой форме. Это указывает на возможность использования batch-систем для подбора оптимальных условий препаративного синтеза белка в системах диализного типа.

Продукция внеклеточного домена а7нАХР в бактериальной бесклеточной

системе

На сегодняшний день для получения разнообразных белковых объектов в основном используют именно бактериальную бесклеточную систему, так как она является наиболее продуктивной из существующих бесклеточных систем. Возможность применения бактериальной бесклеточной системы для получения белков, содержащих дисульфидные связи, была исследована на примере внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора а7 типа (а7ВД).

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) играет ключевую роль в возникновении и развитии ряда нервных заболеваний. Эти рецепторы подразделяют на две группы: мышечные, локализованные в скелетном нервно-мышечном соединении, и нейрональные, локализованные в центральной и периферической нервной системе. Каждый рецептор состоит из пяти гомологичных субъединиц, образуя либо гетеро-, либо гомосубъединичные комплексы. Субъединица нАХР состоит из большого внеклеточного ¡V-концевого домена, содержащего две дисульфидные связи и лиганд-связывающий участок, четырех трансмембранных а-спиралей (Ml, М2, МЗ, М4) и цитоплазматической петли, содержащей сайты для фосфорилирования. Исследования нАХР и разработка препаратов для лечения

нервных заболеваний требует высокоэффективных систем продукции отдельных субъединиц и доменов рецептора, создание которых затруднено из-за склонности этих белков к агрегации.

Для максимального увеличения выхода целевого продукта работу бактериальной бесклеточной системы оптимизировали по той же схеме, что и бесклеточную систему на основе экстракта из зародышей пшеницы, т.е. последовательно определяли оптимальные концентрации ионов К+и Mg2+, а также матрицы (в этом случае матрицей служит плазмидная ДНК с соответствующим геном). Кроме того, для увеличения выхода белка были подобраны оптимальные концентрации аминокислот.

На основе полноразмерного гена а7нАХР человека (любезно предоставленного проф. Дж. Линдстромом) были получены последовательности генов исходного а7ВД и его мутантной формы (a7Bfl/DTES), содержащей замены, возможно, приводящие к повышению растворимости домена (рис.9). В первую очередь неспаренный остаток цистеина 116 был заменен на остаток серина. Также была введена замена четырех гидрофобных аминокислотных остатков (Trpl 34-Phe-Pro-Phel37) на гидрофильные Asp-Thr-Glu-Ser по аналогии с ацетилхолин-связывающим белком (АХСБ) из моллюска Lymnaea stagnalis. АХСБ - водорастворимый белок, состоящий из пяти одинаковых субъединиц, имеет 25% гомологии по аминокислотной последовательности с а7ВД и взаимодействует с такими лигандами нАХР, как ацетилхолин, a-конотоксины и а-нейротоксины (Brejc et al., 2001). Ранее было показано, что замена фрагмента внеклеточного домена, заключенного между двумя цистеиновыми остатками 128 и 142 (так называемого Cys-loop фрагмента) на гомологичный участок из АХСБ приводит к повышению растворимости а7ВД (Avramopoulou et al., 2004). При анализе модели а7ВД, предложенной в (Fruchart-Gaillard et al., 2002) было замечено, что фрагмент 134-137 а7ВД имеет гидрофобную природу и, возможно, контактирует с мембранным окружением рецептора. В то же время аналогичный участок молекулы АХСБ содержит только гидрофильные остатки. Было выдвинуто, предположение, что замена четырех вышеупомянутых аминокислотных остатков на остатки Asp-Thr-Glu-Ser гомологичного участка АХСБ будет способствовать увеличению растворимости а7ВД. Исходный и мутантный гены с дополнительной последовательностью, кодирующей 6 остатков гистидина на С-конце молекулы, были клонированы в коммерческий вектор рЕТ22Ь(+) (рис.7).

Т7-громотор иАХР а7ВД Т7-тврм»|атор

-(И |Д-

rts-Тяд

Т7-лромагср нАХР i7Bfl/DTES ТТ-твдаижор

-Ш I II 110-

I Trp Phe Pro Phe i

Asp Thr Glu S«r

Рис.7. Схемы конструкций для экспрессии генов а7ВД и a7B,ZJ/DTES.

ТТ-терыинатор

а7ВД

/ f Ч' 4 Ыа f } О 77-rpoucrrqp

В бактериальной бесклеточной системе были синтезированы а7ВД и a7BJtyDTES, в обоих случаях выходы белков составили 1-1,5 мг/мл. В случае а7ВД практически весь белок агрегировал и выпадал в осадок, в то время как небольшая часть синтезированного a7B/(/DTES оставалась в растворимой форме. Поэтому дальнейшая работа была продолжена с вариантом a7Bfl/DTES.

Причиной агрегации внеклеточного домена, возможно, служили неправильное формирование дисульфидных связей и стремление фрагмента рецептора к самопроизвольной пентамеризации, присущей а7ВД. Для решения проблем агрегации мы применили несколько описанных в литературе подходов: подбор окислительно-восстановительных условий для формирования дисульфидных связей, добавление низкомолекулярного агониста нАХР карбамоилхолина (КБМХ) и добавление детергента. Эксперименты показали, что добавление в трансляционную смесь восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатионов в концентрации 0,1 мМ и 0,5 мМ, соответственно, повышало долю растворимого целевого белка до 30% (рис.8 II). Присутствие 20 мМ карбамоилхолина также приводило к увеличению выхода растворимой фракции до 30% (рис.8 III). Совмещение этих двух подходов не привело к дополнительному увеличению доли растворимого белка (рис.8 IV). Добавление в трансляционную смесь неионного детергента бридж-35 в концентрации 0,5% как агента, препятствующего самопроизвольной пентамеризации, привело к синтезу практически полностью растворимого белка (рис.8 V-VIII). Однако при дальнейшей очистке a7B,H/DTES с помощью металл-афинной хроматографии происходила преципитация белкового препарата.

I II III IV V VI VII VIII

a7B.il/DTES -*■

12 3 12 3 1 2 3 ,1.....2 3 1 2 3 .1 2 Д J_2 3 17 3

Рис.8. Подбор условий для синтеза a7Bfl/DTES в растворимой форме: I - контроль; II - 0,1 шМ GSH / 0,5 mM GSSG; III - 20 mM карбомоилхолин; IV - II+III; V - 0,5% бридж-35; VI - V+II; VII -V+III; VIII - II +III+V. 1 - трансляционная смесь, 2 - супернатант, 3 - осадок. Стрелкой указано положение a7Bfl/DTES

Поэтому были подобраны условия ренатурации a7Bfl/DTES из осадка бесклеточной системы. Были применены различные подходы для растворения осадка, включающие как использование 8 М мочевины, 6 М гуанидинхлорида, так и 1% раствора жесткого анионного детергента лаурилсаркозина натрия (JIC). Наибольшая эффективность растворения a7Bfl/DTES из осадка была достигнута при использовании смеси 4M мочевины и 1% JIC в присутствии ДТТ. Дальнейшая

ренатурация а7ВД/ОТЕ5 происходила на металл-аффинной смоле (М-ЗерИагозе) в результате промывки смесью ОББв/ОЗН и в градиенте понижения концентрации мочевины и ЛС. После чего белок элюировали ступенчатым градиентом имидазола (100 мМ и 500 мМ). Однако полученный белковый препарат, обладал низкой стабильностью в растворе. Тогда был использован вариант ренатурации, в котором 1% ЛС постепенно заменяли на 0,1% Р-додецилмальтозид (ДЦМ) или 0,1% додецилфосфохолин (ДФХ).

В результате были получены стабильные (более 1 месяца при +4°С) белковые препараты с конечным выходом 1 мг белка с 1 мл трансляционной смеси. Препараты а7ВД в ДЦМ и ДФХ были проанализированы с помощью гель-фильтрации (рис.9 II). В случае использования ДЦМ белок находился преимущественно в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов (рис.9 II), а использование ДФХ позволило получить гомогенный (>90%) препарат а7ВД с диаметром частиц около 7 нм, что соответствует размеру мономера а7ВД (диаметр ~5 нм) в комплексе с мицеллой ДФХ (диаметр ~4 нм). Анализ вторичной структуры а7ВДЯ)ТЕ8 в растворе ДФХ методом КД спектроскопии выявил преобладание Р-структуры, что соответствует теоретически рассчитанным данным (рис.9 III).

«Да

116

66.2

z

4Ь

35

1». i

25 X

ч

18.4 о с;

14.4 3 с

I

диаметр Стокса, нм 22.8 14.6 9.4 6.0 -I_L

u-c(p\ier\pa Эксп. 10.4 Теор. 8%

ß-cipjmpa 58.4% 47%

псу п. стр>к'Г. 31.2% 45%

~г

1.5 2.0 2.5 3.0 объем злюции, мл

II

"1-1-

200 220

длина волны,нм

III

Рис.9. I - электрофоретический анализ фракции ренатурированного в ДФХ а7ВД/Г)ТЕ5, элюированной 100 мМ имидазола; II - анализ с помощью гель-фильтрации на смоле Superdex-200 a7Bfl/DTES в растворе ДФХ и ДЦМ; III - КД-спектр a7Bfl/DTES в растворе ДФХ.

Способность а7ВДЛЭТЕ8 в растворе ДФХ взаимодействовать с антагонистами нАХР была исследована методом ЯМР-спектроскопии с использованием [|5Ы]-меченого аналога длинного нейротоксина НТП/ЫТ1 (рис.10). Раствор токсина в ДФХ титровали раствором домена рецептора и по ослаблению сигналов токсина в Ш 15>)-Ш(2С спектре судили о взаимодействии токсина с а7ВД (рис.10). Было показано, что каждая молекула а7ВД специфически связывает две молекулы токсина с эффективной константой около 2 мкМ и сравнительно большой кооперативностью (коэффициент Хилла 1,8).

Таким образом, была разработана новая система бактериальной бесклеточной продукции активного внеклеточного домена а7нАХР. Добавление ДФХ к препарату

белка способствовало стабилизации домена в растворе, сохраняя вторичную структуру, и не препятствовало взаимодействию с антагонистами. Разработка данной системы открывает новые перспективы для структурно-функциональных исследований взаимодействия нАХР с его лигандами.

У

г

Н. м.д.

а7ВД/ОТЕБ, мкМ

Рис.10. Ш 15М-Ш(ЗС спектры ЯМР токсина N111/1 в присутствии мицелл ДФХ при возрастающей концентрации а7ВД/Т)ТЕ5, а также полученная на их основе изотерма связывания. Кривая разведения показана пунктирной линией.

Получение вольт-сенсорного домена К+-канала КуАР в бактериальной бесклеточной системе

Получение белков, селективно меченных стабильными изотопами 13С и 151Ч, имеет большое значение для современных ЯМР-исследований. Использование клеточной продукции для данной цели дорого и малоэффективно из-за возможного перераспределения меченых субстратов в процессе жизнедеятельности клетки. Поэтому для получения селективно меченых белков довольно часто используют бесклеточные системы, добавляя в трансляционную смесь те или иные меченые аминокислоты. Возможность получения селективно меченых мембранных белков в бактериальной бесклеточной системе была изучена на примере вольт-сенсорного домена потенциалозависимого К+ канала КуАР из археи Аегоругит Регтх (ВСД-КуАР).

ВСД-КуАР синтезировали в бактериальной бесклеточной системе в течение 20 часов. Электрофоретический анализ продуктов трансляции показал, что в процессе синтеза практически весь белок агрегирует с образованием осадка. Данные, полученные в лаборатории структурной биологии ИБХ РАН, показали, что ВСД-КуАР в растворе детергента ДФХ при нейтральных значениях рН обладает пространственной структурой, близкой к нативной. Поэтому, для решения проблемы агрегации был опробован бесклеточный синтез ВСД-КуАР в присутствии этого цвиттерионного детергента. Однако, результаты экспериментов показали, что ДФХ значительно подавляет работу бактериальной бесклеточной системы. Ранее было показано (К1атт1 ег а!., 2004), что мягкие неионные детергенты, такие как бридж-35, бридж-58, бридж-98, тритон-ХЮО, твин-20, не столь сильно ингибируют

биосинтез белка в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта. Эти детергенты были опробованы для синтеза ВСД-КуАР. Детергенты вносили в бесклеточную систему в концентрации 2-2,5%, после завершения работы системы трансляционную смесь центрифугировали и анализировали распределение белка между осадком и супернатантом с помощью электрофореза. Наибольший выход растворимой формы ВСД-КуАР наблюдался при синтезе в присутствии бридж-35, что позволило получить 0,6-0,7 мг/мл целевого белка после очистки с помощью металл-аффинной хроматографии. Однако при концентрировании белок был нестабилен и выпадал в осадок, что, возможно, указывало на отсутствие у него правильной пространственной структуры.

Поэтому были подобраны условия ренатурации ВСД-КуАР из осадка бесклеточной системы. Были протестированы различные варианты ренатурации ВСД-КуАР (табл.1). В качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-КуАР имеет трансмембранную гидрофобную часть, для растворения осадка применялись следующие ионные детергенты: додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозин натрия и додецилфосфохолин. Также для ренатурации ВСД-КуАР был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ-201), часто используемый для повышения выхода белка в процессе ренатурации (УиШагсI е1 а!., 1998) .Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе того или иного ионного детергента с добавлением или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле №-8ер1шго8е: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой и постепенно избавлялись от хаотропного агента в результате промывки смолы раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. Затем этот детергент постепенно заменяли на 1% ДФХ, белок элюировали ступенчатым градиентом имидазола (100 мМ, 300 мМ и 500 мМ, все растворы содержали 0,2 % ДФХ).

Табл. 1. Сравнительный анализ разных условий процедуры ренатурации ВСД-КуАР.

Условия растворения осадка Промывка детергентом Наличие агрегатов во фракции ЮОмМ имидазола Выход белка, мг/ с 1 мл трансляционной смеси

2% ЛС 1%ЛС есть 0,66

2% ДСН 1%ДСН есть 0,43

8 М мочевина, 2% ЛС 1%ЛС есть 0,72

8 М мочевина, 2% ДСН 1%ДСН нет 0,63

8 М мочевина, 2% ЛС, 1 М НДСБ 201 1%ЛС, 0,5 М НДСБ 201 есть 0,46

6 М ГГХ, 2% ДФХ, 1 М НДСБ 201 Г/оДФХ, 0,5 М НДСБ 201 есть 0,37

8 М мочевина, 2% ДФХ, 1 М НДСБ 201 1% ДФХ, 0,5 М НДСБ 201 есть 0,59

Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Использование НДСБ-201, как и замена мочевины на гуанидингидрохлорид, или использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка (табл.1). В результате исследований оптимальными были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 8 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0,2% ДФХ с помощью металл-афинной хроматографии. Отсутствие агрегатов ВСД-KvAP в растворе 0,2% ДФХ было подтверждено данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта составил 0,63 мг/мл трансляционной смеси (табл.1). Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции и ренатурации ВСД-KvAP.

Селективно-меченый вариант ВСД-KvAP был получен путем синтеза в бесклеточной системе, содержащей 15Ы-аланин. Для проверки селективности включения изотопной метки по остаткам аланина препарат ВСД-KvAP был проанализирован методом гетероядерной 'Н,15Ы-ЯМР спектроскопии (рис.11 А). Для этого белковый осадок из трансляционной смеси растворяли в трифторэтаноле (TFE). Использование данного органического растворителя с низкой полярностью позволяло добиться полной солюбилизации ВСД-KvAP. Анализ полученных корреляционных ЯМР спектров подтвердил селективное включение изотопной метки: в спектрах наблюдалось только 15 сигналов, соответствующих 15-ти остаткам аланина (рис.11 А). Сравнение спектров ЯМР селективно 15М-А1а-меченого ВСД-KvAP со спектрами тотально 15Ы-меченого белка, полученного в результате экспрессии в Е. coli и также растворенного в TFE, выявило практически полное совпадение химических сдвигов для наблюдаемых кросс-пиков (рис. 11). Эти данные подтвердили идентичность препаратов ВСД-KvAP, полученных как в бесклеточной системе, так и в бактериальной системе продукции. Таким образом, было показано, что в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта можно получать селективно-меченые стабильными изотопами препараты мембранных белков.

Для оценки конформационного состояния ВСД-KvAP, ренатурированного в подобранных ранее условиях, в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта был синтезирован |5Ь'-А1а-меченый белок. Белок ренатурировали описанным выше способом, а затем полученный препарат анализировали методом гетероядерной 'Н,15М-ЯМР спектроскопии (рис.11 В). Было проведено сравнение 'Н,1 ^-корреляционных ЯМР спектров селективно-меченого ренатурированного ВСД-KvAP со спектрами тотально '^-меченого белка, полученного в бактериальной системе экспрессии и по данным ЯМР находящегося в конформации, близкой к наблюдаемой в биологической мембране (Shenkarev et. al„ 2009) (рис. 11 Б). Практически полное совпадение химических сдвигов HN-групп остатков аланина в тотально и селективно меченых образцах белка подтвердило успешную ренатурацию ВСД-KvAP. Однако, в отличие от спектров, наблюдаемых в TFE, в спектрах ренатурированного селективно меченого белка присутствовало более 15-ти сигналов (рис. 11 В).

5- ,SN ВСД-KvAP О # 4

15N-Ala ВСД-KvAP * ä 0

Рис. 11. Фрагаенты 2D Н, N-HSQC ЯМР спектров ВСД-KvAP, селективно |5Ы-меченного по аланину (красные контуры, получен в бесклеточной системе) и тотально меченного изотопом l5N (черные контуры, получен в результате экспрессии в Е. coli). Спектр (А), измеренный в трифторэтаноле, иллюстрирует селективное включение изотопной метки 15N по 15-ти остаткам Ala. Спектры (Б и В), полученные в смешанных мицеллах DPC/LDAO (2:1), иллюстрируют степень ренатурации белка. Сигналы, соответствующие нативной конформации ВСД-KvAP, отмечены крестиками. Дополнительные сигналы соответствуют частично денатурированному состоянию ВСД-KvAP.

1SN-Ala ВСД-KvAP

В

А9в #

Allí А34*

Jf Al40

Мицеллы DPC/LDAO (2:1)

10 9

1н. мл

Эти дополнительные сигналы не наблюдались в спектрах тотально меченого белка, полученного в результате экспрессии в Е. coli, и, вероятно, соответствовали частично денатурированному состоянию ВСД-KvAP. Полученные результаты указали на то, что часть молекул ВСД-KvAP в процессе ренатурации не перешла в конформацию, близкую к нативной. Сравнение интенсивностей сигналов для двух форм ВСД-KvAP показало, что эффективность ренатурации составила около 70%.

выводы

1. Исследовано формирование белоксинтезирующих единиц (полисом) в бесклеточной системе синтеза белков на основе экстракта из зародышей пшеницы. Показано, что формирование двурядных полисом занимает несколько раундов трансляции, при этом с течением времени содержание плотноупакованных тяжелых полисом растет, а общее количество полисом сокращается, не влияя на скорость трансляции целевого белка. Высокая скорость трансляции в плотноупакованных полисомах, вероятно, обеспечивается их циркуляризацией и реинициацией рибосом.

2. Исследовано влияние различных детергентов на работу бесклеточной системы на основе экстракта из зародышей пшеницы. Установлено, что детергенты бридж-35, дигитонин, тритон-ХЮО, нонидет-Р40 в концентрации от 0,2% до 1% не влияют на работу системы. Показано, что присутствие этих детергентов в трансляционной смеси не препятствует синтезу фермента дигидрофолатредуктазы в функционально активной форме, но влияет на сворачивание и/или созревание зелёного флюоресцирующего белка. Установлено, что детергент ß-D-октилглюкозид ингибирует систему трансляции и в концентрации 1% вызывает практически полное подавление синтеза целевых белков.

3. Подобраны условия для синтеза белка Tag7 в бесклеточной системе на основе экстракта из зародышей пшеницы. Установлено, что добавление 0,2% бридж-35 в среду синтеза позволяет получить до 60% целевого белка в растворимой форме. Показано, что выбранные условия подходят для препаративного синтеза Tag7 в бесклеточной системе диализного типа.

4. На основе экстракта Е. coli разработана эффективная система продукции внеклеточного домена нАХР а7 типа. Конечный выход целевого белка составил 0,7 мг с 1 мл трансляционной смеси. Разработана система ренатурации внеклеточного домена. Показано, что использование детергента додецилфосфохолина позволяет стабилизировать домен в растворе, сохраняет его вторичную структуру и не препятствует взаимодействию с антагонистами.

5. На основе экстракта Е. coli разработана эффективная бесклеточная система продукции вольтсенсорного домена К+ канала KvAP. Конечный выход целевого белка составил 0,63 мг с 1 мл трансляционной смеси. Применение додецилфосфохолина в процессе ренатурации позволило получить белок в мономерной растворимой форме. В бактериальной системе диализного типа был осуществлен синтез селективно l5N-Ala-Me4eHoro вольт-сенсорного домена KvAP. Методами гетероядерной спектроскопии ЯМР показано селективное включение изотопной метки. Установлено, что эффективность разработанного метода ренатурации вольт-сенсорного домена составляет 70%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Kopeina G.S.. Afonina Z.A., Gromova K.V., Shirokov V.A., Vasiliev V.D., Spirin A.S. Step-wise formation of eukaryotic double-row polyribosomes and circular translation of polysomal mRNA. Nucleic Acids. Res. (2008); 36(8): 2476-88.

2. Люкманова E. H., Копеина Г. С.. Шулепко М. А., Шенкарев 3. О., Арсеньев А. С., Долгих Д. А., Кирпичников М. П. Бесклеточная продукция внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора. Acta Naturae (2009); №1: 9698.

3. Копеина Г.С.. Широков В.А., Васильев В.Д., Спирин А.С. Формирование плотноупакованных полисом в пшеничной системе трансляции. Ежегодная научная конференция Института белка РАН; (Пущино, Россия 2006).

4. Kopeina G.S.. Shirokov V.A., Afonina Zh.A., Vassilenko K.S., Vasiliev V.D., Spirin A.S. Heavy and super-heavy polysomes in a eukaryotic cell-free translation system. The 8-th International Engelhardt Conference on Molecular Biology "RNA-Protein Interaction". Program and Abstracts (Buran Conference Center, Moscow region 2006); p.66.

5. Shirokov V.A., Kopeina G.S.. Gromova K.V., Afonina Zh.A., Vasiliev V.D., Spirin A.S. Step-wise formation of polyribosomes and circular translation of polysomal mRNA in a long-term eukaryotic cell-free system. International Conference on Protein Biosynthesis, Structure and Function. Program and Abstracts (Pushchino, Russia 2007); p.ll.

6. Kopeina GS. Lyukmanova EN, Shirokov VA, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP. Cellfree expression for production of eukaryotic proteins in a soluble form. 33rd FEBS Congress and lllh IUBMB Conference (Athens, Greece 2008); FEBS Journal, 275 (supp 1); p. 409.

7. Копеина Г.С.. Люкманова E.H., Шулепко M.A., Шенкарев З.О., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Продукция в бесклеточной системе внеклеточного домена никотиновго ацетилхолиновго рецептора. XVI международный симпозиум «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина 2008); с. 233-234.

8. Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О., Шулепко М.А., Копеина Г.С.. Кашеверов И.Е., Крюкова Е.В., Лесовой Д.М., Бочаров Э.В., Косинский Ю., Цетлин В.И., Долгих Д.А., Арсеньев А.С., Кирпичников М.П. Нейротоксины яда змей и никотиновый ацетилхолиновый рецептор: исследование лиганд-рецепторных взаимодействий. Тезисы докладов XX Зимней международной молодежной научной школы «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва 2008).

9. Shulepko M.A., Lyukmanova E.N., Kopeina O.S.. Shenkarev Z.O., Dolgikh D.A., Kasheverov I., Tsetlin V.l., Kirpichnikov M.P.. High level production of extracellular domain of nicotinic acetylcholine receptor in active pentameric form. (2009), J. Neurochem., llO(suppl.l), p. 81.

10. Копеина Г.С., Люкманова E.H., Шингарова Л.Н., Парамонов A.C., Шенкарев З.О., Арсеньев A.C., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение селективно-меченого вольт-сенсорного домена потенциалозависимого ионного канала KvAP в бактериальной бесклеточной системе. Заочная электронная конференция Российской академии естествознания «Технологии живых систем» (2009).

11. Копеина Г.С.. Люкманова E.H., Шулепко М.А., Шенкарев З.О., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Бактериальная и бесклеточная продукция внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора. Тезисы докладов международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва, 2009); с.247 - 249.

Принято к исполнению 8.10.09 Исполнено 9.10.09 Заказ № 945 Тираж 100 экз. Рекламно-производственная компания "Дип-Грин" Москва, Миклухо-маклая 16/10.