Структурно-функциональное исследование гена ДАГФ-синтазы хоризмутазы Bacillus subtilis

Хазак, Владимир Эмильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональное исследование гена ДАГФ-синтазы хоризмутазы Bacillus subtilis
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное исследование гена ДАГФ-синтазы хоризмутазы Bacillus subtilis"

. •. U

(Ii - j -

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики _и селекции промышленных микроорганизмов_

На правах рукописи

ХАЗАК ВЛАДИМИР ЭМИЛЬЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА ДАГФ-СИНТАЗЫ ХОРНЗМАТМУТАЗЫ

Bacillus subtilis

03.00.03 — Молекулярная биология

/ АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992 г.

Работа выполнена в секторе развития методологии Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

" Научный руководитель—кандидат биологических наук А. П. Болотин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Д. А. Перумов; кандидат биологических наук М. М. Гусятинер.

Ведущее учреждение — Институт общей генетики РАН.

Защита состоится 10 ноября 1992 г. в_час. на

заседании Специализированного совета Д098.12.01 при Всесрюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1,,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИгенетика.

Автореферат разослан__ 1992 г.

Ученый секретарь- •' _ л

Специализированного совета,

кандидат биологических наук ....

В, И. ЩЕРБАКОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ¡ ©ТДЭЛ /

Актуальность токн. Гйгаматний биосннтетический путь является осиошшм источником образования ароматически совд!Ш8НИй из карбогидратшх предшественников в зшвой природе. Конечными продуктами данной разветвленной цапи биохимических реакций пвлявтсп в частности ароматические е.чшю кислоты (фэпнлалашн, ;'1гриз1Ш, триптодан), о тактш ряд важнейших метаболитов оромачиче^кой лрцродц, таких нее ivrra.rjmi Е и К, фолизвая кислота, убихиноп и пластохшюи, некоу-грко пвталлохелаты (эптерохелгш). Перечисленные г.;лп вещества за тпкиетошшм тирозина, сЗразуодпося только в клеткях микроорганизмов и растений, относятся к группе пвзс?!втгимт' фактирол питания. Учитывал важность перечисленных Binse соединений ароматической природа для медицины, ютеринарип п сельского хозяйства, Оши„ разработай! прс«'Ш'лбпглп технологии получения данных веществ , с использованием »'^.ро организмов. Среди исиользущяхся для этих целей различных е'Лдоп бактерий штам\?ы бацилл, в частности и. г.иьии s, обладай1, па паи взгляд, определенными преимуществам: разработаны технологии крупномасштабного выращивания биомассы и выделения Тфодуктов; штаммы B.subtiiis безопасны с точки зрения экологических требований ; по степени изученности с молекулярио-Сиологичоской и генетической точек зрения отот организм уступает только е. coi i.

Организация иикиматного биьг.тоггети'1Тес;:гт,о пути у rs.subíuis обладает рядом характерных особенностей. Ушшальпым отличием, описаншшм Benl.l еу, R. ПЛ. ИИЛЯе'ГСЛ СуИ.ОСТВОВаПИО у В. subt.il t з 168 полиферментного комплекса, вклелп^зго ДАГФ -сшггязнуп, хоризматмутазпуо и гжгааткипазпут активности. Первые две фермептативтю активности расположены на одной полипептидной цепи и кодируются а-оА-агоз геном. ДАГФ-сингаза i.recr особое мачете поскольку катализирует червую реакцию мэтаОоинеского ччгаимагпого пути. Хориэччтчутаза, катализирующая пр^ррйЬ'снио хсризмать в препонах, обуславливает раздоление общего «йис^тетческогс íiccojm на отдельные пути биосинтеза: тиросина ц I"'1 Ij.^híihhu, трлп'о^я^т и изохоризмата. В отличии от ДЛ РФ-синтез др; гиг. ¡ííuoocv1 .-^чг-чоь я растений, ¡шгибируюцкхся по ¡финципу oOpcvr-к связи одал ц несколькими ароматическими амшокис нотами, ЯМ4»'- -"Л'.езг; ч,?сыи1г 168 инх'чбируется двумм интермочиат;-^; ¡мттлзти^еегчто

бпостпотического пути: профонатом ix хоризматом.

По дашшм биохитчосюы исследований, продсташгаиних Llewellyn, D. et al. 1980, ДАГФ-СШТаза ИЗ ШТаММЭ B.subtllls АТСС 60S1 Harburg, ИСХОДНОМ ДЛЯ D. subtllis 168, ПВЛЯ6ТСЯ

монофуц-сциональной, кодируется aroA гоном ц отличается по ряду параметров ингиОдрования.

Прикладные задачи, связаннее с повышением продуктивности штаммов-продуцентов ароматических аминокислот, могут бить решэни путем увеличения эффективности экспрессии генов, кодирующих ферменты "ключевых" этапов биосинтеза. Для биосинтеза ароматических ашшокислот у B.subtnis такими ферментвми на сегодняшний день принято считать ДАГФ-синтазу, хоризматмутазу и пре^енатдегидратазу (для фвнилалагаша). Использование шсокозф&ктивнцх, охарактеризованных в i слетках бацилл промоторов, а также объединение "клвчевих" генов биосинтеза в едание структуры искусственных онеронов под контролем "сильных" промоторов, может бить перспективным аэдходом в . решении подобшх прикладных пробломм.

Таким образом. уникальные особенности ДМ'Ф-синтазы хоризматмутазы в. subtil is 168, сущоствешшо отличия у аналогичного белка из исходного родительского штамма в. ^uttuis дтсс cosí Marburg, а такаю практический интерес, обусловлещшй использованием свойств данного фермента при получении штаммов-продуцэнтов ароматических аминокислот, определили usai шгазрес к изучению структурно-^ункциональнлх характеристик aroA-aroó И aro А ТОНОВ, КОДНруЮЦИХ ЭТИ ÖOJIKII.

Цель п задачи исследования. Целью работы было изученло структура, СВОЙСТВ И экспрессии aroA-aroG гона B.subtllls I&9 И агоА гена

B.subtllls ДТСС 60S1 Marburg.

Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи:

- оиредолепие первичной нуклеотидной последовательности гена агоА—aroG B.subtllls 168;

- изучение организации промоторной области гена агсд-этб в.subtiiis 168;

- сравнигелышй анализ структур aroA-aroG гена В. subtil Is 168 я агоЛ гена B.subtllls АТСС 6051 Marburg;

- нзучошта свойств экоорессионной единицы ешвозз из области

р81Шг:ацШ1 стрептококковой шюэчвдн р£М1зоэ5;

- изучению экспрессии тепа ДАГФ-сшггэзн хоризматмутязп в.subtilis под контролем eu10o3s;

- получение плазшд, содзржащпх лишеняий собственного промотора

ГеП aroA-aroG И phcA ГСП В. amylol i quef acloris 13 С0СТ8ВЭ НСКУССТШШПЛХ оперонои rplU-orfX-rpmA'-aroA-aroG-phöA;

- исследование экспрессии генэ ДЛГФ-синтази ' хорирт.таутазн B.subtiiis под ко!ггролом промотора раборомалыгаго оперона rplU-orfX-rpmA' В. amylol iquof aci еп>з ;

- изучен«?, влияния различая* факторов из з(1фзкткшзсть ^скросслч агод-лг л гона d составе искусственного опермна.

Пауггал новизне н пррхтичоскал значимость. Определена пзрвичпвл

иуИЛеОТИДд-'У! НОСЛРДОВйТОЛЫ'ОСТЬ гона aroA-aroG D. subtilis 168,

кодарукцего ба^ункционольцнА фермент ишшмашого биосшгготнческого пути ЛАГ5-сгаггозу торпзмагиутазу. Охарактеризовала

структурпо-:Г:ун!':';гйналы1о;1 организация продукта гена ^roA-aroG; обнаружена определенная гомология л-концусой • часта бк^ушсщгэналыюго inрмоптз с хорязматмутазлыш частя:,ni болкоп, кодируема! tугА И pheA ГСП2Ж1 К. coli и агон ГвЦОМ В. subtilis АТСС G051 Marburg; БНЯВЛеНЗ СУ^ОСТЕОППаЯ ГОМОЛОГИЯ С-ЗЮВДЭЕОЛ 40CTH

Д&ГФ-синтази хормематмутози с белком даОФ-сшпазоЗ е. coli, катализирущим аналогичную с ДАГФ-сшггозой в. subtiles реакция альдолыюй конденсации, но всплечешшм в путь биосинтеза клеточной стенки е. сои . в результате клонирования и секвешхровашш показана функциональная и структурная ндецтнчпость продуктов гонов

aroA-aroG В. subtilis 168 И агоА ГвН8 В.subtilis АТСС 6031

Marburg. Определена точка стврта транскрипции и предполагаемая организация промоторпой области гена агоА-агоо ц метках в.subtilis. Охарактеризована экспрвсснонная елиаяич ешэоэ5 из области репликации стрептококковой плазмидч рБМ19озз. ешоозэ лепользованя при ИУучеччГ зкспрессии агоА генов 1^0 л Marburg штаммов в.subtiii*. Геялизоваиа задача конструирования искусственного onipoua, содержащего рч гении чу in биосинтеза фенилаленшге: агоА ^¡og ген в. subtuis л pheA ген в, .ir-vi oi i qt »i ^--lens иод гонгролем npofcirapa рябосомалыюго опорона

rplU-ci-ГУг-ртЛ в. amylol i quef ас! eno. r,')",y".'>;i>№ в рпбПТО шшз'-ядн,

содерзэдж* эИвктинио эзадоссзрдоДОсгг ген ЛАГФ-саггсм

хорнзматмутази, могут бить попользованы при конструировании штаммов-продуцентов ароматических аминокислот.

Структура и обгем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: вводе пш. материалы и методы, результаты и обсуждения ( глав), вывода, список литературы ( наименования); и

содержат Í?P рисунков и ¿^таблиц. Объем pactara с.

Апробация работы. Результаты рабе-" были представлена на конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущно, 1988, 1992), "Структура и функции биополимеров" (Львов, 1989), 5-ой международной конференции по бациллам {Аполомарис, США, 1989), "Генетическая трансформация и экспрессия" (Кентербери, Великобритания, 1988), II-ом европейском симпозиума по генетической трансформации (Будапешт, Венгрия, 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

I. Определение нуклеотидной последовательности фрагменте ДНК,

Содержащего aroA-aroG ген В. süfcí-i lis 168.

Ген aroA-aroG B.subttiis 168 был~Тйонирован'Иомантасом П. В. (ВНШгенетико) в составе плазмиды pbas7 (рис.1 ,а). Опредолеше нуклеотидной по ело дона твлъностя aroA-aroG гена проводилось ио модифицированному методу Сэнгера с использованием ДНК-полимеразы фага Т7. Для етого: фрагмента ДНК плазмидц pbag7, ограниченные сайтами EooRi, EcoRi-Psti н Есогv была субклолированы в состава татевидных фагов miзп-piе и mi3mpi9. Локализация гена aroA-aroG на КЙОШфОВаННОМ фрОГМВНТО ДИК хромосомы В. subUlis 168 и стратэгия его секвэяированпя приведены на рис.2. 95% первичной нущтеотидпой последовательности исходного фрагмента ДНК хромосомы в. subiiiisI68 были определены по обеим нитям. Полная поолмоютельность ДНК, определенная в экегюремоэтах по соквенпровашт, представлена не рис.З. Размер прочитанного фраз цента ДНК составил 2035 пор оснований. Он содерга: 3 открытых рекам C4Hi'¡jre:i;ii¡: orfa- размером 324 п.о., orfb-размером 375 п.о и orfc- размером ТТ02 и.о.. По?, с к гомология сроди известных на сехюддоцпптй дань последовательностей пептидов не выявил структур, имавгах бляглиэ к кодируемым crfa и orfb первичные аминокислотные последовательности.

Гэг. 1. ?trip«tç:;5io-rfEtfn<ciif ири iu»M рШ7|а), рБШ2}(6). piSPÍ(t). I, irai!!; , tílll; S, 8ыН1; K.ïcoII; S. ЬоИ-, P, fsll

i ■ > >» •->

A—

<-«

<—i

fit !. lemumi » ctpaiern cenmpoiami arol-aroS rm £.sibtftil 158. I, IcoII; F, FstI; !, Icoll. 23456АУСТ

SI AC

ST T Л. A A' 1 С

с л

A A A A

Fie.». Otpueiem тош ciapra трэшриин гем ircí-jroí B.sétilis 1(1 с B.subtilis. '« romee пазник рВШ). 1, 2, 3-Koctfoln iptheM SF3-Î 3'-tKJTCT6CTTMT!TSC»T-5', гКртдммшсгд с tit tum ? "bülis aro593¿ Isjí! t«cH, ctiefjutrt шзщ) pfl- , t, 5, 6-iocrpoJta SP3-Í, r«5pu«'CBausro с frí ira«« » y\Ul" arpG9î2 hulî reell #t;SMlt|- jermml ttítpo/i; f, 5, Л - сшеес inme "pBJGî t кн к npa(»e[3 [прав влсщ««атшю(П

HîC'ta, стершего стерт | ч:-'»»' st?í-jr:6 ma ! jijv,.ilî! 15! Ггч! нгчн цч'чргт ■

■И II _Hí_

ItUmtccUtlIfqtuliltititÚMílCCiKrituittlcsCiMjiCiCEnt^l^nlutticliiictfdiitttMilcHt КС

mi tiiittttfííifí/cffiicifisttfiitt п.

Mil llttllltltlIlllItltlIFIFtlIlttCF 1!

•(lMl|(<tMiCUttmt»lt{t|l||U|lltltlliE|tllttC«|a«(«<l»||C|tlt(C|V(tcU|l«<Ci;<(C4ír4C«t|rK( Bl «Fl I I I I I I • 1 I I I Г I I Г I С I I I I I ( I I « Г I I ( t I I II «Ti I I « < 1 t I 1 I I I I 1 I « I I t I f I I I I t I I I I I f 1 I > M >IH|[W|c4CiU(M<MU[|i'(^lll(cwU4U!|l|llt|t|ttu<№U№ii|№iilt4«t|lctlcl|lM Ml

gin i i i с с i • i i i < i e i i » 4 i i i i > i i i i i i i i i « с i it mu i i i i i i i i i i i s F i i r i i « it « i i i i i i i s a i t n

tllLcitUt4*MUULI||IU»4ci4aH|t»tC4iUUcltc>lcc4UC«'(<«IU'Mtf|ul*:(Uif«tl»uutuc Ul

an, i i t t ei f i i • i i i i i i i i i t t r i i ( i i

mi i i i i i i i i t hi

aiUiKlcuttfiitafuUWmuiuMMjciucMtUlutclllTlclutt'.'.tiUuuucclliiiultjcccluutnt Wl

ItJS IS

ltl4Mtt(CIUtU<lttmtUbu(UU»|4tf[«fl*<UM<l4«|tllltiUutUUluutUt»lUT!TCCUtluut III

' fflMt K-l

»Ы'Ч*С -IS V>4|bbt*(«4cktl(M4li ' IIITfllllllS II

UctUU|tUCH|e*tfilMfU{«w*Wwu4ut<4e41l*u<ll4*MMMtMtBi»t4i|tt4(i<ct(tU4IMC* 'И ■Ы I *!url alU ""BS"

нЛчЛ I I I I I I I I 1 I I I I I I I ■ I I I I I < I I I I I I t I I I II lUtlCututUuttUt«utftt«mttM{MK(M44|MUll|Um|l|*tcl|tM4c|>4lultac^UUMEC| III l'-tu|tc4etuallt|l«t-t' lilat M l

inl ine F I F f I I I t I I I I 1 I I I I I 1 F I I I t t I t I I I I I I II

V'Cct4Aal.Uta.ll|l4T iiIki K it

.1.1.1* i I « i i i I I I I < « i с i I I ! i i i i i t i I I i I i i g с Kl aaMatleiia«uiiecMcw«lttlt4l4tc||cn«tit|cut44a|CUtla|ea<|tafct<U4lccct|(4ct<4aaaaaMaai| IJM

Till

aidant llllllCtlllltlltlllCLIIItllllllll III

fl{U*altttl|elt|l'IMCiltUa|»tqtatMtK«Uclalttita4||Cll|IMt4l41cctlcW4tUUta«i|4(«|t| Uli ataianC I I I I ( t I I I I I ! I F 1 I I I I I L I I I I I I I I I I I I I Iii

|.l|Htlt|atit4|ciflUt«(l4MalclUMIaej(ctcaUt4aaltaftltl|IKUutt|a4tc.tUaalUl|a|4ltcaata I III atal at<C « I I I I I I I I I I I I I Г I I > I I I I I I t I I I t I I 1 1 III tlcaaiattltiaatl<cl<aMt4IKII4c(|t|Maaa|cca|(<tlUl|aw<l4|l<ll|<4<MtfiUUl|MttcaUut«tt|f 1IH -

ball

«alai* I I I I 1 I I I I I I I I t I I f t I T t I F I I I I I I I 1 t I HI

• fl«cr|alllt|aaacaa|aaac|c«Ut4cca(tcllt|tta«l4tU4eatUHea(letlet|i|.ecUtlKt(ca|.«fcl«a«|C4tU 1Ш. »alar* I I t •> I I I 1 I I I I I » I I I I I I.I I « « I I I F I F I ■ 111 fa|i|atclf{|c((alU41aal|(cl|.||llcK»tla№cltc4l<|aaetlUt<.CUl(ttaa|.auli|t«.tUïtlu(tc(Haa It»

1»«

ml .!* I I I I I I F I I I I > i Iii

ilniUiat|McU..lica.tt|t|auctiaai|ctu<tUuewtna«M«lccic4l|cljcïtvtutU4ctuctc|Uullul IUI I t№lUtl|lt|C|lll(||lt«|-! I:."":!:! !::::::::! it imt «-:

I •uluattttcui.tt{u(ta<(c-l ltt..r Ц П

Гк.Мпшндш ittitüiiiiiinicn tpirmta Ut manija pHSI, ttjiwim irii-iroG rti l.sabtltls l(i. Oneieii calm )шыш rtcifiiîu Iralll, Icoll, Icol? i Pit I. iiuuicniiii mcieitutcaioct» СШ. №! i irol-iroS ■tiieneia • ojiiSjueuci ид». Crftjiaii wj mmiuml locnjoututigc»« oitatattia 11К)»;Ш1Ш rump«. Jmm ciapra !|ii(i|imi itll tin iroft'ltoG tmmi ». CSiacri -!( i -35 «pmiepo» irci-uoS riu ■ CETI щит |(М«ш liiiii«. Olli тиши с (¡Мши iliiMiui -IBS. Отшш цишцш зама I ttintw tin iroi-iroû S.sabtUlä ttcc (KI Harlan. Намяк emttmem шгнгишш 18-1, 15-C, iS-И, tS-12, SPÎ-Î,

ICÍÍJUOIIHi! l;l "f.UiSIJ Н?|||||||Ш.

2. Анализ структуру открытой рамкл считывания orfc.

orfc расположена в области гсжду 644 и 1742 (Нуклеотидами секвенированного фрагмента ДНК (рис.3) и насчитывает в своем составе 1098 п.о.. Интересной особенностью данной открытой рамки считывания являемся существование 3 мотканидавых atg-кодопов на 5'-конце структурной части рамки, В соответствии с этил возможно образпанио трех белков, насчитывавших к своем состярз 350 , 361 и ЗБ6 «м-жнсюлот соответственно. Для гыяспения вопроса какой из этих кодонов в действительности является инициирующим бал проведен впвлсз лидорно" вокодирующой областл orfc.

лиалкз чаете/ встречаемости кодопов в мШС orfc позволяет сдолчть закталеиве о том, что существует заметное предпочтение •-рчплвтам, имеющим at и третьей позиции, перед синонимичными по салолу трлт';.8тв'гл с g^c. Этот факт предопределен общим повышенным содержанием а+т в кодирующей часта роист. ' Исключение из описанной ссхономерности СОСТаР.ШШТ КОДОНЫ ДЛЯ Arg, Asn и Phe.

Гшведзшшй сравнительный анализ частот встрочаогзости кодонов у 12 генов, входящие в состав "ароматического супра-огорона" B.subtilis говорит о том, что кодош, присутствуйте в структурной части orfc, относятся к разряду наиболее часто исшльзущ^лся синонимов.

Волок, предсказанный из сксвопса csfc, имеет молекулярную кассу, на 1,868 кДа превкиавдув мол.вес ДАГФ-синтазы хоризмятмутасы, определенный экспериментально. Длила белка, кодируемого открытой ранкой считывания orfc, превышает определенную экспериментально па 30 аминокислот. Количества ргдшокислотнш: остатков Lys, Arg, Asp, Glu, Pro, Gly, Ala, Val, Met, Leu, Туг, phe, суз и Try йшi идентичны или отличались но более чем па три. Су!Ц')ТГВ0ШШ9 РАЗЛИЧИЯ были отмэчеш ТОЛЬКО ДЛЯ ТЫ , Ser И ISO. Белок, кодируемая orfc, содержит па с-конце ai а, тогда как по экспериментальным данным с-концевой аминокислотой ДАГФ-синтазаы хоризмотмутазн b.sumiiis 163 является Arg. Таким 'обвезем, несмотря нэ ii&'KOTo j.tir> отличил белок, кодируемый opfc, имеет близкий смипояисло^шЛ состав и -молекулярную массу с данными, опубликованными ранее.

' »-концевая часть белка, кодируемого orfc от I до приблизительно 100 аминокислотного остатка имеет определенную гомологию ó хорюматмута^ишт частями önh икцяоналышх фирмзнтог, кодируемых соответственно pheA H tугЛ ГО'Г.ЧМИ E.coli, а также с

монофункциопалыюЛ х.ор!К£..атмут<;::-'й, кодируемой агон геном

в. subtiiis Marburg 00*51. ТвП № ;i3h90 Z". 6ffj;0 оонаружспо

существенной гомологии с кааосрушс^гоиальи.лй хоризматмутазой дрожжей Sa.cc^;rorayc«s . cer&visia-e. БОЛбО Нв СуЩвСТВОВБЛО

сколько нчб;*дь определенного соотс^тс.твия с друглщ хоризмвт-утштзирукидом формантами, которнь образов? группу весьма близких по пврвичпой аминокислотной последовательности белков. По-видимому, столь необычайно широкое разнообразие иорвичных структур ферментов, позволяет им служить в качества вффэктивных катализаторов дал чутазных превращений. Детальное множествешюе выравнивание хорйгглатмутузних чо-тей бежа, копируемого orfc, хоризматмутазы прифенитдегидратазы л хоркзматмутазы префенатдегидрогеназы е.соп, а также монофункциональной хоразматмутазн В.subtl 1 i ь Marburg АТСС 6051 виявило наибольшую степень гомологии w области 1-50 вмикмыслотн белка orfc в. subtiiis 168. Ко .наш взгляд, именно эта область мозют принимать участие в формировании активного центра, обеспечивающего преврацонкё хоризматя и првфепат к одновременно являющегося сайтом для иш'ибкровэпг..': не принципу обратной сы,зи ДАГФ-синтазы хорлемзумутази B.rubtiüs 168 хоризматом и префенатом.

ДАГФ-смнтйлг. хорнзмэтмутаза в. subtiiis I6S обладает уникальной особенностью активировать другой . фермой!1 ароматического биосшгсетического "'ути - шлкимагкияазу. Этот фермент способен нормально ¿¡уяящюпирогать у в. subtiiis только в состапэ трифермеагаого комплекса, вмотавдего в себя бифункционсльную ДАГ£-сштазу хоризкятмутазу и шикиматкиназу. Мягкий протеолиз, приводящий к уд^язгта хорлгматмутазной и сохранении ДАГФ-синтезксй активности, аЗуола'аливэл неспособность оставшейся части фермента активировать ¡тжи:.<тгкиназу. По-видимому, сайт активации тякимзткиыазы. располо^а в облвсти 50 - 100 г>чшокасл</пгого остатка бепка, нодигу --»ого orfc, поскольку данная область не имеет существенной, т -«слегли г, чувйотными структурами других хорязматмутаз.

с-концаоал чг.оть яулжшкы'стной поелвдот^тельносчгя белка orf не имеет существенного стада'ва с извзогннмл аминокислотным последовательностями изофорч .-.сои, но чроявляе

определенную гомолог®? i эга^кислсмсч) последовательность З-дезокси-о-машго- сктуж'Хп.п 'юсЛсг с;;:: тюк e.col

(ДМОФ-синтвзн). Дэтвльгсл- вь тав с-:;пнц/вой п.эотч белке

кодируемого открытой рамкой счятыовпил orfc в.subtuis 168 и ДМОФ-синтазы е. сои выявило наибольшую степень гомологии в области 150-220 аминокислотного остатка белка orfc.

З-дезокси-о-матю-октулосонат 8-фосфат сюттаза осуществляет аналогичную с ДАГФ-шятазой альдольпуи конденсации, используя в качестве субстрата о-арабипозу 5-фосфо? и фофосфоенолпируват, с образованием З-дззокси-о-манно-октулосонат 8-фосфатя. В случае ДАГФ-сиптаси в качестве одного го субстратов используются тот же самый фофосфоенолпируват и зритрозо-4-фосфат, предшествующий гомолог в семойстпе D-альдоз, содержащий 4 атома углерода в молекуле вместо С у арабджпн. даОФ-сшггаза кодируется м-з-гоном и катализирует одну из стадий биосинтеза наружной клеточной стенки

Е. coll .

Ряд плазмпд, полученных в данной работо и содержащих фрагмент ДНК orfc, кодирующий только с-концевую часть белка, обуславливал значимей уровень ДАГ5-синтиз7гоа активности, не ингибируемый префенатом в клетках з.гл-ми;» .-геле.

Поскольку нарушение целостности orfc путем клонирования Фрагментов ДНК в Рзы или есскс сейт плязкзди pbag7 риводало к потере агоА-згоЗ ЦОШТОПО у 0. subtllls ûroGÇi32 Л D. subtllls агоАб, а тагам приведенной выго анализ пооледовотолыюсти crfc позволяет паи сделать вывод о том, что эта открыла рамка считывания Представляет собой структурную часть гена aroA-aroG, кодирующего ДАГФ-синтазу хоризматмуи'зу b.subtnis 168.

Анализ первичной нуклеотидаой последовательности, расположенной после orfc привел к обнаружения в этой облвсти па расстояний 10 нуклеотидов от терминирующего стоп-кодона таа совершенного инвертировашюго повтора. Для данной структуры характерно наличие <зс-богатой области ципталыгой симметрии , за которой следует блок из 4 т. Такие структуры способна выполнять роль р-независимых терминаторов в. s чьи и s.

з. Анализ области инициации трансляции агоА-агоз гена.

В области, с" координатами 654 - 666 п.о, fрис.3), была обнаружена последовательность, частично комплементарная 3'-концу IRs-pPHK B.subiniï. Донный гнз-сайт расположен перед третьим от начала мотиотпювим лтг,-кодош>!, находящимся в позиции 668. Это позволяет ним сделать шт.-д об шпщиирующеЛ природе данного ATG-KtVT'Hn.

Для последовательности ЕаШш-Долгзрно сяг: характерно наличие 8 комплементарных основ шей, причем 6 no mix рзсло-тсгеш непосредственно друг за другом. Расстояние кззщу прдоолагзомцм последним s в консенсусе ggagg а стартоиьа aus кодовом мРНК составляет 7 оснований. Спейсерная область да содержит оснований <з и С. Расчет возможных вторичных структур, выполненный на ПЭВМ с помощью программы dna sun (ВНИИгенетика), не выявил в этой области наличия вторичных структур с высоким локальным потенциалом спаривания. Таким образом, данный RBS-сайт мсаэт обуславливать достаточно высокий уровень экспрессии гена в клзткаг в. subtuis.

4. Старт транскрипции aroA-aroG гзкз В. subUlis 168.

Методом удлинения цраймара (Primer exterttion) определена точка качала транскрипции гена ДАГФ-синтэтазы хоризматаутазн в клетках b.subtilis 168.

Суммарную РНК выделяли из клеток штамма в.зиьни® агооэзг, ieuA8, recE4, содержащего плазквду pBAG7. Далеэ проводилась стандартная процедура отжига выделенной тотальной мРНК с меченным r3ZР праймэром 5РЗ-2 (рис.3), комплемэтарним последовательности структурной части aroA-aroG гена. С помоцыв обратной транскриптази в присутствии сизси dNTP достраивали прайкерную ДНК (процесс останавливается по достижении ферментом 5'-конца комплементарной праймеру мРНК, т.е. мРНК соответствующей структуре гона ДАГФ-синтази хоразматмутази в. subuiis 168). На ркс.4 представлен радиоавтограф геля, на которой параллельно реакциям достройки праЯмора приводится сиквенс ДНК плазмида pbag7. Уникальная полоса, располсзгенная на расстоянии 98 нуклеотадов от начала праймерв, соответствовала а в позиции 625.

5. Промоторная Область aroA-aroG гена в. subtil is. icq.

Hi расстоянии 7 нуклеотадов от старта транскрипции гена

aroA-aroG раСПОДОЖвНа обЛЭСТЬ TAagAT, 4 ИЗ 6 ИУКЛВОТИДОВ КОТОРОЙ

идентичны блоку "-I0" канонического промотора, узнаваемого в метках в.subtuis холоферментом РНК-полимеразы е»4Э. Если принять TAagAT за "-IQ", то в качестве блока "-35" можно. рассматривать последовательность ттссса, расположенную ; на расстоянии 17 нуклеотадов от "-I0". Данная структура также имеет 4 идентичных нуклэотада из 6 с канонической -35 областью промотора, узнаваемого вегетативной w43 субъединицей РНК-полимеразы бацилл.

Для случал ОДЭПТ1фЩИрОЕГ<П1ШГО наш проштора aroA-aroG Г81Ш АТ-содэр:аШю в области шгду -35 и -50 составило 80%, АТ-содзрж1ПП19 в области шгда последовательностям! \ -G и +1 -£5,63, а степень гомологкз мвау$у возможной консепсусной послодоватрльностыз с центром в позиции -IG составила только I из 5 оснопанпГ. пос.гатря па значителшув внроадзипость бокса. Важно отметить, что пэречнслзшпга гите параштры оцокп oft {активности использовагия щпгжглроп - *3 у бацилл нэ ш.юют гесткнх границ.

Дангао по уровни ДМ'Ф-силтазкой ii хоризматмутазной активностей у в.-jbuiis агосэзг (pbagzí представленные кш

СВИДеТ[;ЛЬС'1ЬуЫТ, ЧТО С0бСТВ8ШИЙ промотор aroA-aroG ГОИЗ ПВСШТрЛ

на судзствэпше отличия от "оптимальной структур;*", узнаваемой </43-суС'ьедпшщеа РШ'-полпмзрази в.subtilis, обуславл1шает сравнительно гпсокую степень ь-Игштквпостн инициации транскрипция

In vivo у В.subtilis.

G. Регуляция Э!'. ЧрбСОИЛ агоА-агов ГОКО у В. subtilis,

Кпд клйяеъчх ферментов бдасиивза ароматических аминокислот г.онгролируется как на уровне активности фермента, так п при помощи изменения афЕэктилпости зкснрессии соответствуйте гвнов. В частности ДЛЯ aroA-nroG ГбНЗ В. subtilis I6C Nester et al. 1980 било показано существование аффекта репрессии, обусловленного бэлюм, получившим назвшгае тлр-зсвнсимого апорепрессора.

В 5'КОНЦВВОЙ нбтранслпгруемэй части aroA-aroG гена В. subtilis 168 в области -50-30 основания от точки старта транскрипции поми была обпарузгона последовательность, содержащая пуклеотцдц g и с па расстоянии 14 пар оснований. Возможно данная область Молекулы ДНК можзт распознаваться tyв-зависимым впорепрессором и выполнять фугспрш "тир-бокса". Подоб1ше структуры "тир-боксов" былп обнаружит также у ряда генов ипкиматйого биосинтетического пути

П. culi: лго", tyrR, агор, tyr.H, tyrF-, aroF, aroLM, aroF-tyrA.

Экспрессия псих в»шеперечист.;шшх гонов e. coi i подвержена репрессия при добавлешга и окружающую сроду тирозина.

По-видимомуч с точки зрешя регуляции транскрипции важным является тот факт, что "тир-Р.л:с" aroA-at-oG гена в. subtilis 168 с 3' конца ичу..'окаотся с -35 областью проштора гена, а со стороны Ь' Komi'; . рпгпоткин непосредственно сразу :за структурой шк'ппкршенпого тшергированного повтора (рис.О). Возможно, что pacii лпожонис Д!|ШЮ1'о инвертированного повтора в пепосредстпешюй

Ia. t-a t-a t-a t-a fl-t

§z| 0 Ф -1

agtagag ttGtaHtcogtalllGC&tnggaattacttataqTAAGATflcatgat

-35 - 10

mRNA start „ ,„ л .

Met See Asn

AactacaaaataaaaaatgaatgtgcaggQAZ^QGAtgaaaaaaatgagcaac <=0

RBS

Pic.S. tiniimii i jiitpial «(«en iioi-aroi reia B.subtilis 16! Bujeieiy oSiatii «poioropa, |uctoi (киши с piíicouai, cipjnifi itni!|itniri шерпршашго ooeio;i reía 4iol-»rot B.saltllh 1SS. (uiiini в ■ С, пони пришагает crpjiTf pF ■uj-ftia' imvii er река», ciapra ipaici,i¡uii - «. Ирсдстшш l-toiiieiii часть (eiia 1Ш-СИШ1 loriiutifiaiB B.stbtill] 1(1.

a).

2101 tttctg tgc tgtttagtgaatgattagcagaaatatagagagtaagattttaattaatta 2160

3161 ttagggggagaaggagagagtagcccgaaaac tt ttagttggcttggactgaecgaagtg £280

.-35

2231 aqqqaaaqqctactaaaacqtcoaqqqqcaqtqaqaqcqaaacgaacac ttqatctttta 2280

. . -10 . -35 -35.

3281 aqt tgc tatet, tttatacatcaataaaqtatjct tat ttqtcctattgattaqataqcaq 2340

, -10 .-10 . . . S.D. .

23M tataataqc tttataqaqtaqqtcatttaaqttqaqcataat aqqaGGflTCCAGATCTGGQTCC

ВЙМН1

BGLII

S).

fie l. Ifiitoiuui lociiituituioru ncipeccioiiii uium 1019015 (i) Щши иреншгнм« oíiacti ipum.'t SÍ-aocieioiiTtiiiocti, Clin uuiaui perrpiuaj lull ■ Belli; рестщцюиогнетима! iapta »ант ДОШ Belli; I, BitíI; I.lcoll; 1, IcoHT; P, Fstl.

ишзости от -35 области промотора aroA-ai ces гена обусловлено его частием в процессе инициации транскрипции в качестве ©гуляторного элемента.

. Создание искусстве ШШХ систем экспрессии aroA-aroG гена .subtiiis 168 в бациллах. '

Ген ДАГФ-синтазы хоризматмутязи в.subtil is 168 имеет сложную истему регуляции инициации транскрипции. Для изучения

ффективности экспрессии aroA-aroG гена. расположенного под оптролсм ЗКСПрОССИОЛЫХ сигналов, лншошшх подобной сложной истемы регуляции, нами была использована экспрессионная единица u19035 стрептококковой плазмиди psmiqoss.

Л. EU1Q035 из области репликации стрептококковой пл^змиды

SM19035. - ~ ~~~~~' ~

Ранее были описаны -выделонио и структура минимального фрагмента ПК плазмиди pSMi9035, определяющего ее способность реплицироваться клетках в. subtii is. в области, лежащей за белковой рамкой, эдируемой этим Фрагментом ДНК, были обнаружили несколько эследовательностей, напоминающих вегетативные промоторы в, subtiiis сайт связывания с рибосомой (рис.6,а). Удобство расположения этой кспроссионной единицы навело нас на мысль о возможности ее ^пользования для экспрессии гетерологичных генов в в. subtnis. энная экспрессионная единица была названа ешэозз.

.2. Изучение эффективности промоторов экснрессионной единицы

_ —-J— :

Для характеристики эффективности предполагаемой промоторной 5ласти в клетках в. subtiiis в качестве генв-репортера был шользован бес.нромоторшй ген а-амилапи В. amylollquefacleris. По явим дашгам эффективность промоторов kuiоозз в i,3-1,4 раза выше Ивктивности собственного промоторе гена «-амилазы ятУ1ы .<?ns. Клетки в. subtiiis ai, несущие плазмвду pavai.s боспромоторлнм геном и-пмилазн иод контролем Ешвозз, синтезируют > {>00 мг активной с амилазы на 1л среды ТУ-

3. Изучения эффективности работы RBs-сайта зкспрессионной

WÎIHlUji'OÏQOri'i.

Чтобы проверить, работает ли в в.subtiiis

го-пэслэдоштолыюсть, пэресекаЕщаяся с ваты сяйтэг .6,), ¡ ыспользопа-Ш фрагмент ДНК, кодирующий рапрвссор фаг.. ? - xcies Источником • этого фрагмента слушал ф

M13tgl30CPrBamHICI8S7ifnfî)PstI . ПО ДаШГ./Ы SDS-ЭЛОКТрофоре

экстракта клоток B..subtiiis si, содержании шгпзэду paski.b мутаплшм геном касзт под коптролзм ешэозз, продукц ci-роцроссора ■ в клетках в. subtiiis составляет около впутршгхоточи^го водорастворимого болка . xcies7 способ фопать работу pr-npoM^.'^v-o в -г,тих клетке.

ü плазгадэ рсв22 (рас.6,и) встраивание по участкам узнавспя ВатШ и Bgiii позволяет помещать зкспреесируемне оОласп; кодируаддз белок, . на различных расстояшшх от £ последовате льпо.сти.

8. Кспо|гьзоЕа1гдэ экспрессиошюй единица слеозз для из/Япония

УРОВНЯ ЕЮТВШСШ aroA-aroS Г'ЛЮ В lUIBTICaX В. subtil 1 s . ~ ~

Для изучения зксяресиш ;.rcA-aroG rous под-контролем fcu1 эо; наш с помощью штода гюлиморазной цепной рошсции (ПЦР) öl осуществлен сайт-паправлошшй мутагенез гена ДЛГг-счгнте; хоризматмутази в.subtiiis 168. На основании дпшшх по нуклготилк последовательностп aroA-aroG бНЛИ ' СкШТОЕИрОМПЦ Д! олигонуклеотвда ag-k и ag-c2, флашсирукщив структург/ы ¡асть j-ùhî Структура олигонлиеотидов представлена ir рис.; Амшпфтцировапннй в ПЦР эксперименте фрагу.чцу гена ДАГ^-синта; хоризматмутазы бил лиавн собствешого промот'-па и р-нозависимо: терминатора, расположенного за структурной частью агоА-аГ< (позиция 175G-I777, рис.3). Рекомбинантная плазмлда рсва-полученная и результата субклопировашш амшш^шдированно: фрагмента в составэ вектора ревгг по nniii сайт; комплемэптировалп aroGSüS И агоАб МУТЭЦИИ СЛОТШТСТВ/ВДИХ reel штаммов г subtiiis. Результнруюц"п дот-сичгяаная хоризматмутазная активности в клетках в.subtiiis, ico ыотазг reel СРСВА7Э представлены в Таблице 9. Уровень активности ДАГФ-синти в клетках в. subtil is aroG932 г есЕ4 СрСВА7Э ПрИбЛИЗИТоЛЬ соответствовал активности ДАГФ-синтазы в клетках исходного штам в. subt.ii is 168., Уроьонь хорИзматмутазной активности у в. ьиып агоОЭЭг гесЕ4 СрСВА70 КорреЛИрУЮТ С ДЛШШМИ Jli) ХОрИЗМВТМуТШН активности, определяв дай агое геном п в. subtil js Ш1.

и. Использование рибосомэлыгого промотора гена грш ату1о11яиоГас1епз ДЛЯ ЭКСПреССИИ агоА-агоб Г0НЭ У В.эчЬиНэ,

Сравнительно швПсокйй уровень экспрессии агоА-агоэ гена з. subt.ii:1а 1БВ под контроле« еш.0035 цаг.ел нас па ьшель об гспользовшеш плагмцдц рНЕлзгз, содэржпцеа одш пз '"ключешх" :'е;топ биосинтеза ароматических аминокислот у в.зиышз рЬеА ген трефенатдегидратази под контролем промотора риск)сомальпого гена

-рЮ В. ату1о11чиеГас1епв. ОбЪвДИНвНИО ДВУХ (агоА-агоС И рЬеА)

'ключевых" генов никимптпого Ояосиптетаческого пути в составе ккусственного опзроно па основе плазггади рНЕАзгз, а тага® гзучоиио факторов, влияющих на объективность экспрессии указашшх ■■енов в полученной оперенной структуре, явилось задачей, решенной 1а последующих этапах диссертационпой работа.

[0. Описание рекомбинантной плазмиды рнеаззз.

Ген рЬеА кодирует фермзнт префонатдегидратазу - первый форшнт з последовательной цепи бнохшшческгос реакций, ведуцих к [внилалашшу из общего для <1еннлалаяша и тирозина предшественника

префената. рь-л-ген из хромосом) селекциошюго штамма 3. ап.у1о1НиеГас1(?п5 (ВШЙГеНВТЯКЗ) С ЧаСТИЧНО СГОГШМ эетроклгибнроваштем прзфзнзтдогидрэтози бил клонирован Помзнтасом Э.В. (ВНИЙгенетика) по комплементации рЬеА -мутации в ита?шз ?.г,иь*.111а рь-?Аиг 1грса гесЕ4 в составе 6.2 т.ц.о. фрагмента ХНК на вектора ревго. На основашт данных гензтпчоской корта 5.Еиьииз 168 и полученных Иомантосом Ю.В. данных по •енптлческоиу картировании ХрОМОСО.") В.йту1о11чиеГас1епз гепу рЬеА тредпествует следующая последовательность генов:

„ро1Уг-гр1и-гртА-зроов-рЬвА, . Известна нуклеотидная

юследовательность' этой области хромосома у в. зиьипз 168. Путем 1ел9ции 2.8 т.и.о. фрагмента ЛИК, ограниченного рдт сайтами и тредположителыто содертс'ЩЭ'Г» зроов-область и- часть гена гргел, ймянтасом П.В. била сконструирована плазмида рНЕАзгз (рис.1,6).

Таким образом, ген рьеА был поставлен под контроль зибоо< 'мяльного промотора в составе искусственного оперона текомбинантной илэзмида рНеазр.з . Это привело по данным 5иохимичоских измвре'мй к : увеличению активности фефзнатдегидратазн в 1000 раз. . Высокая активность

грофвнлтдегидратазн приводит к . появления- фототипической зуксотрофности по ' тирозину у штамма в.гиьуп!, содержащего

рНЕдзгз. Перед структурной частью рьол гоне расположен уникальны сайт узнавания ресгриктазы Pgiii.

II. Конструирование искусственного опорола на осноеэ гена

aroA-aroG B.subtllts и pheA D. amylol i qu^f aci-ïns .

Для субшюпмровапия iï получения эффективной экспресса aroA-aroG iï pheA генов в составе искусственного оперона I] плазмам рНЕдзгз была проведена серил экскэрпмэнтов п сайт-няцрааиэнному кугагонозу гена ДЛГФ-синтсзи хоризматмутоз в --.ubtiiis 16Г). В кпчвствэ нсчодеюй использовалось плазмад рТАПЮ, ссдеужащая AvalII-(¡риГМЭНГ ДНК ШШЗМЛДИ pBAG7 С агоЛ-аго геном." субклонированшг по "uai сайту вектора ptzi9Rjli . результате экспериментов с использованном нолимеразной цошю реикиии я синтетических олигонуклэотидов промотор , расположении в 5' нэтрапслируемоЭ области, и термлнатор, как структура в Э нстранслиртемоП области за структурной частью гена агол-агоо, бил делотироилны. Егедешше с помощью мэтод^ ПНР ватш сайта фланк аруг>ди0 струкгурнув часть aroA-aroG, бчг,: использована дл последующего субклонированил гона п составе вектора рНЕдзгз п Bgixi ccfiry. Татсим оброзсм, пмшшфицировашше atoA-aroG фрагкэд били ВВ0Д9ЫЫ В искусственен!) ont)рои между г pro A* H phe А генам R amyloliquefaciens. ДВШШ9 ИО Структуре ПОЛуЧСННЫХ ВарНВНТОЛ

испильзовашшэ синтетические праймери представлены в Таблица I на рис.7. Полученные в результате рекомбянантные плазмиди pagps pAGP7 (рис Л,и) и pagp9 имвли раЗЛИЧНуЮ структуру ДНК трзнсгенной aroA-aroGrpheA 06Л8СТИ (рИС.7, В). pAGP5 СОДЭрЖЭД природную CTpyKTjpy ДАГФ-синтази хоризматмутазы, в то время кя

ДНЯ pAGP7 и pAGFO Г6Н aroA-aro'j К0ДИр0В8Л 60ЛОК, у КОТОрОГ с-концевой астнин бил замещен на гргинин и добавлено еще аминокислот. * Цели, поставленные наш при проведении подобны модификаций били: а) изучить влияние изменения расстояния меад

CTOII-KO ДОНОМ ar&A-aroG И СТарТОВЫМ КОДОНОМ pheA ГОНОВ H

яктиянг.сть ярефечзтдегидратази, и ^проверить влиянии с-копирвс оПласчгт ДАГФ-итгарн хоризматмутазы ни ее активность.

' Ь . области инициации ТраНСЛЯЩГЛ агоА-аг О« гвнп В СОСТВЕ шшзмт^ч 'гль??. п> сргшнвтш с pagps и pAGpg рпепод<ж дополнят-.. пьннй фрагмент ;пп>' ра^м^юм 09 и.о. (рис.7.б) Гекомбиньнтая пяпзмидо i-лсгг. иосог сайт узиянэния рострикпг fl-jin в области стмка ..-« ••>/• и рь.-д rt»:»*:«. Гекомбинянтчя

Таблица 1.

СаПт-направленный мутагенез гена aroA-aroG.

использованные Изменение Полученные рекспбинантные

прапнеры а-к последовательности плазмиди

гена jroA-aroG (pTZlSBJLl) (рНЕА323)

Е.coli n.subtilia

AG-N ¥ AG-C? нет PTARA7 pAGP5

AG-N +■ AG-Cl ala(367) -> arg + 9AK PAR17 pAGP9

Pr-m AG-C2 ala(367) -> arg + ЭАК pARlO PAGP7

о.)

Рт

грги 0Г«граА' вкДs

рЬвЛ

pagf5

rp«i-> 1 L Г f С i 5 I G I

HSITIltlllQItD -titoiS III- ^'^^^^ll^tcc^tft(clftfttзttlтliшlslт!ifcalcm[ltttш|c^tttщic¡tш|ci[зcr¿ -221 "BlUI/üaill <-Ш->

pSCPJ

rfU'-i ILllfllGtllDITIIIlICiCICi

Й -)aroi3

III- t»r«tti|atccGClIC5!lCCCrGClT5l!l!C!iCmjIililurCl4tittHHti"HiTGi!iai«lIC»i -2J8

fp» I - <-JBS->

'iiiii/e»ii

piGPJ

rpai -> I l J P С i G I t I

ÜSttlllLLIOIiD -larciC III- t4illi(itccititiCitff»itl>tGiii3iiltGifciic)caiatttit>tctlttaiftcii:iiitcegr-e) -IiJ •JlUI/Baill <-BS")

fa P№f5

' »ro«S -) V К V И Д I

Я К 1 ->phtS

1735- iljiJiJtcäJCtctrMlIjHjjjIcliJiJjj'fiH'JIj'c'WM'fJiii'i'iWiC'SiHitc -Ш5 ■ttin02 2 t —RSS—>

pSSPI

(

aroflfi ->VIIV(f!lf|tCSCAI

« к v с 1 l 6 P E-)ph«A 1Г75- gt;ui)tcjj;c](tq;ilctt)>]^tcitgcqc;lfll;gjgi;iii^ii<cAT6ii<;tc;gttittt<t;tctit;i -1355

<----R8S--->

p*CP9 _

JroflS ->VrVK*N|lgS5AI

(IKVCTL6P E-)p ke» ¡17!- ilgjmttiJscitlgqilcttjjgstc^icjCirMqjnnjijj^HcMSjjjjlmliattJjijcräj» -IJ55

(—RBS—->

Pic.7. Сргшзаци icircctit.Horo cotposa, м'гшш irol-artG i pkeV res». GC|ii tteia epra-изаци onjpom Ii). Орган::«!« S'l'iepict обисм atol-aroG reu l cetme hh'jij pMPS, pIGPP, pJGP9|i). Ионии laiitiiciiTue n«ci»«oiauii!ftcti rpti' ■ l-iontltl neu 3№-c*;-ii3i iopi3HT«iru« B.sikUlls. lijtim it-aocaeioHTeinecti, iiuntum i cm-ii>sn, »i-ngniteiii«! tpineit |1I iiiinjli pÄCPT. Cpraujiqii «irtutl oSlicti srol-iroi - fiel i etc-Tiie otaiiu plG?5, piGPT, plGP3|i). 1оизаы iinni'miij tocitjtsnitiHtcii C-itHtiol ti fem мвр-снгаж npij«r«;Hj» i l-mijeiol i? ii 'кhriritrutimi. iidimiiiiiii iiiitiititii а составе (ein >roA-»roC in tipiamt pKPI > pUP} mupur»

плазмвда pAGPdein содержат в составе искусственного онерона фрагмент aroA-aroG ГО На B.subtilis 168, КОДИруВДЗЙ ДА1Ф-СИТГГаЗНУЮ часть бифункционального фермента (позиции 998-1744п.о. рас.З).

Отбор КЛОНОВ B.subUlit. агоОЭЗЗ 1еиА8 гесП4 , НОС М1ЙХ ракомбинаптныэ плазкяды pAgps, pAGP7, рлетэ п pAGP-'ein, производился по способности этих клеток к росту па плопой агаризовашюй среда йшцайзр:«а, содержащей помимо стандартные компонентов 16 мкг/лл вритрокацина, 50 мкг/'«п лейцина и 50 «псг/мл тарбзипа. Данные по :омилиментац;гл агсоэзг и агоАб м/тацпй соответствующих памглоз ь.subtilis предстсчлеш в Теблипя 2.

Результаты измерений уровне.!1,. актдвиооу.; Д^Ф-сшхазы, доргз.ча^кутазп л п"г!-$анатдегидр"тазу в штаммах ь. subtilis

••»п G932 1еиА8 гесЕ4 'Г b.subtilis aroAG гесЕ4, СОДер^ЩЧХ

полученные реког Зинан1; id4 плсьмидц, представленп в Таблице 3. Активность пре<!внатдогч.цратгзи в клетках в. ¿ubuiis aroG-jsa cpAGrcJ, cp/.ersj и с p. s m солешкла от 4.0-52% соответс-грущ"^ СКТИВШСТИ П клетках б .u^tUis агоОЭЗГ. СрНЕАЗгЗ), что однако было достаточным для и^щаю'ч аут'сс тюфности по тирозину рекомблнантшм штаммом. Уровне ЛДГФ-с,ытазноЯ а хориэматмутэзтай активностей в клегкох в. subuiis a rot" 'г, содэр&ащюс рекомбинантпыг шшзюгд" рАЕРЗ и pAGPs, были пр* п :яческя одинаковыми п соответствовала уровши« .1-ливпости рассматриваемого фермента в клипсах d.subtiiis, несувцс: плязмдпу рс.пат, к * родительском штакг^л B.subtilis /.тсс 60S1 Harburg. Уровень ДАГФ-синтазнол и хоризматпутазлоЛ ша'ипюсп, в метках в. suotins а г ошзг с pagptd в ерздшш на порядок иревчлел соответствующие уровни активности для вариантов pagpp, разрэ ц рсвАг, не ьревышаг однако 30 -50% порога актиностей ДАГФ-Сйнтазы хоризматцутазн у B.subtilis aroG932 С pbAG'7.1.

Ипэгзсш'м фактом, на на:: бзгляд, является значительное снижения уроъня ингибированич ДАГФ-синтазы хоризматмутазы в клггеах а.ыиыт-, нэсудах рекомбшюнтше шшомида pagp7 и pAspg. lio-p ч n.Hi.nr.iy, это язлингэ обусловлено эйектитошм превряданием приф^пта в фенил-пировивограодус кислоту высокоактивной пре^он^чдеггдр^лазоЛ, что говлетию за собой сшгание пула енпбодол префрново* ьяслочк (основного иигг'итпрп д&ГФ-скнтагы) 1 клетках ]1г:к ;Äi!i<ui i.jx штаммов.

1 у

Злицэ 2.

(оппликентация признаков ауксотрофности у штаима B.subtilis »roG932,leuA8, гесЕ4 различными рекокбинантныпи плаэпияали

1зяида Релликон Гены >G7 . рВА910 • агоДБ

дополнительны» необходимые коипоненты leu trp tyr phe

:А323 Г5М19035 phefi + + ' +

120 pSM19035 - + + +

!Р1 Р5М19033 aroAG.pheA - . - -

i Р6 PSM19035- aroAG.pheA - - - .

Р7 PSM19035 <aroAG,pheA - + - .

Р9 PSM19035. aroAG.pheA +

лица 3. эмерение-

активности ДйГФ-сиитаэы, хориэпатлутаэы префенатдегидратазы

T АПП Плаэлида I ДАГФ-синтаэа хориэнат префеиет

.subtilis I (+ 2mM икгибир. путаза дегидра-

: Cd + +) префенатогт таэа

CC6051 Marburg : 10.9 34'/. 19 3.6

: (229.1)

trpC2 ; 14.3 16. 77. 0.8 2.7

: (311)

■597.7 .recEl.leu __ : ( 6.0) И.О. 0 4.5

pBAS7 :зо2. 34'/. 16.0 Э.О

pHEA323 : - - t> 4500

pCBA7 : 10.2. 25 У. 0.3 5.В

PAGP5 : îi.o 34'/. 0.4 1832

pAGP9 : 7.8 927. 0.35 2784

pAGP7 : 92. 807. 2.6 2736

: 149. 0.7 1321

pAGPdel11 :(IB.6) 1007. Н.О. 2280

_ : (2.1) 2 ОН.О. и.о.;

рНЕАзгз : (2.1) 11.0. и.о. 4340

pAGP9 : 3.9 И.О. и.о. 3580

! (474) *

pAGPdel11 : (12,8) И.О. и.о. 3600

2.7

12. Влияние вторичной структуры мРНК на инициацию ■ трвнсляща агоА-агоо ¿епа в составе полученных искусственных оперонов.

Таким "образом, на основанш данных Таблицы 3 Щектавчая

ТраНСЛЯЦИЯ ai oA-aroG И pheA ГОНОВ В ООСТ8ВЭ ИСКуССТВвННО' О ОНвроНЭ

была достигнута в варианте с плазмидой рлср?. Различия в уровнях ДДГФ-синтазной и хоризматмутазноЛ активностей d ;аготка.1 в. subt,nis, несущих рекомбинант}"!;' плазмиды с различима вариантами искусственного оперонз, обусловлены, на ниш взгляд, ситуацией с инициацией трансляции агол-.-.röG гена. К фипторагл, вдипицим на эффективность инициации трансляции гепот;, на сегоднвшний день относят: а) структуру облает:: связывоная с рибосомой, б расстояние между rbs и инициирующим atg кодонон, в)пуклеотидный состав области между rbs и atg, г)расстояше мээдг предыдущим стон-кодоном и следу щ>"м стартовым кодопом в оперонной структуре, д)вторичцую структуру мРНК. В соответствии с данным по модифицированном структурам егoA-aroG генов и по организации области гртА' в. subti üs , первые четыре фактора язляитсл постоянными, а перпае три такими же, как и в природном гене. Нами была определена первичная нуклеоткдная последовательность £ облаегч сшдияешш гртА' -агоА-агов гоне в составе искусственны* опероыов плазгяда pagps. pagpt, pagpq (рис.7,6). Гомология можд) последовательностташ гртА' генов В. subtil 1 s ц В. arnylolj auefaeiens составила Солее 90%. В тоже время различия в их структуре могут влиять на характер вторичной структуры мРНК в области инициацш трансляции. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности мРШ в этой области для рекомбинантных плазмид pagps и pagp9 выполненный с помощью пакета программ dna sun, показцвае' возможность формирования достаточно стабильных вторичны? структур затрагивающих район RBs-сайтв и aug кодона генэ агод-агос Наиболее вераятгш вторичные структуры мРНК для сг^яантов pa jps pAGpa представлены ня рис.8,б. Изменение структуры стой области плазмлде рлгр7 путем введения дополпитольннх 39 п.о. (рис.7.б привело к увеличению эффективности трансляции гена. Анани вторичгох структур мРЧК ¿.ч" этого варианта, а также для рвп-ат области природного 'онс в составе шгазмвдн pbagv , указывает п расположение области rbs и кодона гена агод-ж-оз шт возмчш. шпилечннх структур (рис.8,г>.

го

а а

pAGP5, c-~g rbs DAGP9

pBAG7, °o e

а А H

itart

pAGP7 ac--oa

Q—C

а - -5.7 kkal/M u—а

О—с u~а

aaaaugaa i

ocgagu . .

Fic.i. 1(зшш iiipnm tfpKirf! i№ i oiiicri iicüiüii tpi>:inn iroi-ircC reu 1 ctcriit щпц ¡'All 1 flGFT(a), ■ 1 mmt pSSfS, rISP! |6). Oiiicti IIS cUtoi «Sitjesa 1 и««, «6оил«п ицщрк *5S leiiii. Iptw-iti« эверги oEruciiitt ipeiJMaraim itpfHiiii crfftflT

13. Клонирование rena ДАГФ-сянтэзы из стекла B.subtiiis дтсс

B051 Harburg.

Фермент ДАГФ-сшггеза B.subtiiis 158 ингкСкруется" но принципу обратной связи двумя ггптормаднатвга шшошатпого блоспптатдчоского пути: хоризматом и прэфэнатом. Штат в. subtuis 168 был получен из штамма B.subtiiis АТСС 6051 Marburg ПУТ9М МуТЯГЙЯеЗВ реПТГеПОВСКИМ излучением. Одним из отличий родительского штсша B.subtiiis является Присутспзкэ ШСОКОВКТИВНОЙ хордзматмутвзн, КОДЕфувШЙ агсН геном. В то та время на основанпа биохимических исследований Qu: сделан ВИВОД, ЧТО ДАГФ-СИНТаЗЭ у в. subtllis АТСС 0031 Marburg являстсл монофункциональным фэрмэнтсм, ■ нз обяздвглщм хоризматмутазцой активностью и неготгабируемим хоризматом.

Описанные спойства "исходной" ДАГФ-спнтази1 определит интерес к клонированию кодирувдего ее гена. На основанга донных но нуклеотидной последовательности гена aroA-aroG у B.subtiiis ICÖ в эксперименте с использованием' цепной полимерезноЯ реакции и • праймеров ag-n и AG-сг (рнс.З) бил амплифяцирован фрагмент хромосомы штамма b.suwhis атсс sosi Ma.burc из коллекции проф. ^.ДуЛмпу ' (США.). Ami инфицированные фрагменты ДНК Онли субклгнировяны в составе вектора ревгг под контроль экспрессивной едикдцн EU1O03S. Полученная рвкогдбинвнтиая 'пчазмида рсвав точ'г.мнч(>ит1фовала »гсгозг мутацию соответствующего г<?сЕ4 штамма

в. subtiiic. Урзсоль ЛДГ-I— с i liiTb з; го л ;з хортомвтму raoHo'i активности в клегкге. B.svt-tiin г соэз,? срсэ/.у; бил практически родним соотвотствузди уровня-, активности в «матках того а» итак;,и, не су ада рмглЯппгиггцул гтаа'аду рсэл? с агоА-агсз геном в. subtil is 160.

14. СИШЗПС-8И"Ч!1Г> Го-«' '['И-СКПОЗи П. subtil la АТСС nosi н-rburg.

Jpm к 'ркиноа цук>БЬтадноЬ иоследапгтежноста

смл,ч;г}.,и;!Хови1иьЗ <jpar:«bt тепа ДДГФ-¡яютази i.subtin.s aicc &-.51 i^rbL. g с^п в сострво тактора рта эг.лл ь клетках

E.coii. Д1Е' по.-^-чэиюД в .-того илазмида рТАк-л.о 0:>ла использована в кач&ство д»"/£С1г.!Л5льной игирзц»! в вкстримэвгак по сщсынс-оаэлиау. пустая иуклсотддюя пэицдоватвлшост ь структурной части гена лгол сказалась идентично.'! тековоЯ у агол-г.-об го:ю йтам и- б. subtui 168 'м псюшчешем «зшствепной оямса% .-с на т» к иоэ-щза 101Ь (рал.З), по приводящей к изменению шааьодхяк, код-фусмой дьшцч тг;чгле70м. Дашка отлитие моают бить с юза?» 1»а.ч со стзткстичоскоЯ оашбкоЗ в ирздессо ценной колгх>рс'::г>и fjdtiu'ji, так п отражать исходное отличие »год генов лпу* (гтпччов. образом, на основании пэдучегамх дашга" можно

i Owj,1'": о мл' .''гичгоста генов ДАГ>-о;штаз штаммов в. subtnis 160 и

г,iiubt.tii.^ «ее eooi i!..rLurо, а такта о проявлении ДАГФ-скнтязоЯ шг:"-;,'», a.-jbtil.<s *ТСС OOjl Marburg ПриЗМЗТКуТЯЗНОЙ аКТИВИЭСТИ,

что слей rrjjibcwe i ;г;тодооЯ (Щ'ушсционалыюЯ природе этого Сор-'юто.

i'-kboi;.

Т. Определена иергичнчя нуклвотэдная последовательность агоА-лгов гечэ в. si-'btills J6

2. OxapSitTftpH^on^K ПрОШТ<Г aroA-aroO гвня в. s'ibtills IG0, котирована точка ш^'игч'ии транскрипции.

3. Устеновленй огяУ^"У;то-<1>уцкциональная организация продукта arcA-aroG грив п.зиыnis i6f>. н-концевая часть белка, кодируемого «гоА-агов грном, <xSyv. .лшподт хсриз^птмутазнур активность яаГ./Ш'Чионрльного фермоптя; -концевая часть да^б-сьпизц хорязмчтмутази p.suhtms 1<чз определяет даг:--<-:шта-;'туя>

аГТИВч^СП,. •

4. Показана идентичность ДЛ'ЛЛ-сплтаз ил в. «tuiis IG8 л гсходпого дал 160 штамма в. subtil атсс sosi itrburg.

5. Охеракертаована экспрессионнп одплица f.uiаоза из области ии-тахации стрептококковой плазмпда ,.smibo3g.

6. Сконструирован искусственный ОПВрОЯ, содержащий aroA-aroG 'Oil В. subti 1 is 168 И pheA Г9Н В. amy! oliquofaciens ПОД КОНТрОЛеМ Громотора r pi и гена В. amyioliquofacions .

7. Эффективность кш$щ[0ц>п1 грапслвд« aroA-aroG гена .subtiiis IG8 в составе искусстооктаго опоропа определялась овлечешюстьв rqs сайтн i" но и его шцадгарующего лиа кодопа я бразовашш вторячшх cTpvKTyp мРШ(.

СПИСОК РАБОТ, 0;1ЖЙКОВЛНШХ 'Ю ТВ5Е ДИССЕРТАЦИИ

1. Хазэк В.Э.Сорокин A.D.// Окспросснотгая единица для рам-полоааггельшх бактерий. Теоиси icoul). "I!ol;js направления нотехнолопет", Пущнао, I9S3, С.29.

а. Сорокин A.B., Хазак В.Э.// Окспре'осионная единица в области эшпшащш стрептококковой плвзыгды г-^азоэз. Молокуляр. биология, Т.24, 0.993-1000.

з. Хазак В.Э..Болотин Л.П., Рапилова К.'Л., Комонтас В.В., ЭЗЛОП Ю.И.// СрПШШТОЛЫШЙ сналпз агоЛ-ггоЗ гена В. subtllis 168 я •CA гена В. subtl lis АТСС 6051 Kar burg". Тезису KOnJi. "¡¡0Е!.'Э энравлэнпя биотехнологии", Пусцпю, 1932, С.46.

1. Sorokin А. V. , Khaz^-k V. Е. . Veiko V.l'./x Use? of Lambda >gulatory signals for Dociilus subtilis. Abstr. of Fifth itornational Conference for Bacillus, Apolomaris, USA,

27.

lJ. Sorokin A. V., Khaz?k V. E. //Structure of pSM19033 Replication •gion and MLS-Resictanee C-ono. Csnitlc Transformation and :pression, Intercept Ltd. PO Dox, Andover. Hants. SPIO 17G, UK,

>eo. pp. rea-aei. 4

O. Khazak V. E. , Sorokin A. V. // Expression unit from replication gion of pSM19035 and its usage in laeillus subtilis. Abstr. of cond Workshop on S»№ Manipulation in Bacilli. GDH, 1990, p. 23.

7, Bolotin A. P. , Khazak V. E. , Stoynova U.V., Ratmanova К. I. , mantas Y. V. , Kosl ov Yu.I.// Cloning and nucleotide structure of oA-aroG of P. jubtilis 16Э. Abstr. of 11*" European Meeting

Gene-tic transformation. , 1093, Budapest. Hungary, p. 03.

Информация о работе

Хазак, Владимир Эмильевич
кандидата биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы