Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика рекомбинантных штаммов Bacillus subtilus, продуцирующих L-фенилаланин

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика рекомбинантных штаммов Bacillus subtilus, продуцирующих L-фенилаланин"

)

всероссшскш нтко-иссадоватешзсш! институт

ген5тию1 и селекции пш.шлшж ижгоогт.щиа.юз

Нз правах рукописи УДК 577.112.387.2:579.852.11 Для служебного пользования' Экз. № 2

55¿ПОЛЬСКАЯ Татьяна Абрамовна

ПОЛУЧЕНИЕ И ШАКТЕШСТШСА. РШМНШШХ ШГШЮЗ ВАСИНЕ ЗЦБТШБ, ПРОДУЩРУЕЩИХ 1НЕШЯШНИН

ОЗ.00.15 - Гензтпка

диссертация на соискание ученой степени - кандидага биологических наук

Москва - 1994

Работа ашолнена в лаборатории генетики и селекции продуцентов аминокислот Всероссийского научно-исследовательского института

д

генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: доктор биологически наук, профессор Жданова Н.И.

О^ицпаяьныэ оппоненты: доктор биологических наук, профессор Перумов Д.1. кандидат биологических паук Клячко Е.В.

Ведущая организация - Институт общей генетики РАЛ.

Защита состоится 1934 г. в час на засе-

дании Специализированного совета Д 098.12.01 при Всероссийском научно-исследовательском енсж/тэ генетики и селекции громиаленннх микроорганизмов по адресу: 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВШЕ£тенетика.

Автореферат разослан "30" Олрёс/Л 1994 г.

Ученый секретарь Спешализзрозанкого совета, кандидат биологических наук

В.И.Щзрбакова

ОБЩАЯ ХШКТЕРИетЖА ГАБСТИ

Актуальность тег>д. ь-фзнплаланан относится к аезажнимкм ами-Есхзслотам, необходим для вуад медыдан и пищевой прсмшшэнностгг; Интерес'к этой аминокислоте в последнее время повышел в связи с тем. что ь-фенялалаган является одшм из хошюяентов дадептидннх заменителей сахара:аспартамг (Ь-а-аспаршл-фзниаланиЕ метиловый ьфир) и других.

Микробиологический способ производства ишнакислс* дает воз-моннссть получения биологически активэдх Хг-изачеров на основе дэ-шевого к доступного сырья. В известна микробиологических способах получения х-фенилаланина иаиболеэ эффективными продуцентами этой зшнокислсты являются Escherichia coli й глуташтпродуаяруклгие ко-ринебактерии. Продуцента:, холучезшв па основе Bacillus subtilis, уступают ш по уровню продукции. Вместе с тем, 2.subtilia является традиционно используемым з шшробиолопггесгсой и пидавоЗ промышленности макроорганизком, хсроио изучен -с ьшекулярно-баалсгической, генетической, биохимической и Знгиологичзской точек зрения. В частности, тщательно исследован путь биосинтеза ароматических аминокислот и его основные регуляторные механизмы у этого мзхроорганиз-ма. На основе бацилл в нашем институте, а также японской фирмой Ajinomoto Co. inc. получена эффективные продуцента другой ароматической аминокислота - ь-трицтофана. Наконец, B.subtilis безопасны с точки зрения экологических требований, имеют статус GEIS (generally regarded as sate), что является необходимым условием для применения бактерий в производстве продуктов, потребляема человеком. Все это делает B.subtilis перспективным объектом для создания эффективного продуцента 1-фенилаланша. —

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование - возможности получения эффективнкх продуцентов Ь-фзвилаланина на основе B.subtilis. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

-получить на основе штаммов B.subtilis. продуцирующих L-триптофан, рекомбинантные штамма,' способные к сверхсинтезу Ь-фенилаланЕна;

-использовать метод ступенчатого отбора для получения мутантов с увелетеннш уровней синтеза Х-фзнилаланина;

-изучить регуляторвые нарушения, определившие способность к сверхсизтезу Ь-фенилаланина, среда которых выявить наиболее значимые для продукции;

-получить рекомбинангныз плазмидные продуцент 1г-феннлаланина, используя гибриднш плазмиды^с генами в.виМШз, контролирующая биосинтез ароматических аминокислот;

-изучить влияние амплификации генов, кодирующих фермзнты биосинтеза ароматических: аминокислот, на уровень удельной активности-этап, ферментов в клетках плазшднцх продуцентов и на уровень продукции 1н£с-нилаланкаа, выявить стадии биосинтеза, лимитирующие синтез х-фенЕлалавина у штаммов Е.аиМШз, отобрать шагмидные продуцента ь-йеншаланша, превышающие по уровню продукции бес-плазшдаые анаммн.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые у, штампов в.еиЫ;111е - продуцентов 1-гршгофана иоток общих предшественников ароматических аыинокаплот был переориентирован на синтез ь-фенилаяашва путем введения гена агоН, кодирующего высокоактивную ЗЫ, к дефзк.ТЕЭГо гена 1;грЕ, блокирующего синтез триптофана. На основе продуцирующих х-фешлалашн штаммов В.БиЪ-ЬШв получены рекокбинантнае штаммы, содержащие плазмиды с генами, кодирующими наиболее значимые для биосинтеза ь-фенилаланина ферменты: рЬеД (ГЩГ). агоА-6 СДАГФС - низкоекшвная ХЫ), аго1 (ШК), агоН (высокоактивная Показано, что амплификация генов агоА-с, агоХ и агоН приводит к увызнсниа в 2 - 60 раз уровня удельной активности со-ответстБ/щих. ферментов в клетках плазмидных продуцентов, не повышая уровень продукции Зг-фенилаланша. Амплификация гена рЬеА увеличивает (в 4 - 1000 раз) удельную активность ЦЦТ у всех продуцентов 1г-фешлаланина, но уровень продукции возрастает только у низ-коактивннх продуцентов. В клетки продуцирунцих фенилаланин анало-горезистентшх мутантов введены шазмида, содержащие искусственный аго!-с-рЬеА шерон. У рекомбинавтннх штаммов уровень удельной активности ДДМС повысился в 5 - 6 раз, ЕЩТ -.в 400 -1000 раз, при этом уровень продукции Ь-фенилаланина возрос на 20 - БОЯ, а кон-

версия сахара - почти вдвое.

Получены аналогорезистентные куганты рекомбинантннх штаммов B.subtilisj продуцирующие в лабораториях ферментерах ь-фэнилаланщ •в количестве ло 18 г/л,-что значительно превосходит известные из литературы уровни продукции полученных на основе ьгсго шкроорга-низма штаммов. На штаммы 11-27.. 19Б и 1254 получены авторские свидетельства ш I3802I2 и IS9SÜ56. Создана рекомбзшантше штаммы, содержащие плазмида с искусственным ароЛ-G-pheA оперонои и продуцирующие ь-феннлаланиз в количестве до 25 г/л. Англогорезистентвыо и шшзмвднпе штаммы положены в основу лабораторных регламентов на производство кристаллического Ь-фешыаланша.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материатов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения и выводов. Материал излокен на/¿"^стр.машинописного текста, включает/^ рисунка? п ¿2. таблица/. Список цитированной литературы содержит /35 наименования.

Апробация работы. Результаты работа были представлены на конференции молодых учзшх БШИгенетнки "Генетика и биохимия микроорганизмов - биотехнологии" (Москва, I98S), гт республиканской науч-но-теоретическоа конференции молодых ученых и специалистов микробиологов (Ташкент, 1989), совместных семинарах с учеными фирмы "АЛЖШТО" (Москва, I99I-I993, Токио, 1992-1993), семинаре секции . "Биотехнология продуцентов метаболитов" ВЕШгенетика (Москва, 1994), 2-ой научной конференции ВНИИгенвтики (Москва, 1994).

. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ • •

В работе использованы штаммы B.subtilis: АТСС6051 Marburg (Дубнау, США), W-23, 168 tap02, SB29 trpC2 tyrA29, SB112 trpC2 pheA112 (ВКШ), QB936 aroG932 trpC2 ald-1 leuA8 reo24, 118 аго111б reoE4, WB22813 aroAG reoB4. 21 amjr4 recE4 (Иоиантас D.B., БНЩге-reтшса), WB3:55 trpE5 (Нестер, СКА), аналогорезистентные штаммы-продуценты Ь-триптофана 3557, 924, 12-14 , 5000, 27 , 47 (Велшшани-на Г.А., ИШгенетика) -

В рэбогз использованы плазмиди рЕ194 (ДуЗнау, США), рСВ20 (Сорокин A.B., ШШгзнетика), pJ«J2, pELi2i , рН2А24, РНЕА32, рВЕА/,2. РНЕ32Э, p3G4l, pBAG7 (Иомантас Ю.В.,БШЙгенетака), р!К39 (Хайканссш М;Я., ВШИгенетика), рЮ321 (Нидненко Б.Е., ВШИгензтика), piK5l (Стойнова Н.В., ВШИгзйеглкг), рСВН5, pAGF7, jAGP9, РАСР5И7 О&закВ.Э., ВНИИгенегика).

Среди. Для выращивания бактериальных' -культур использовали бульон йжшгерэ юи Ъ-Оульон. Минимальной средой служила среда Спицайзена. Соответствующе твердаз среда содержали 1.5$ агара. Для анализа продукции фешлалашна использовали ферментационную среду следулпего состава (г/л): сахароза - 100 - 160, кукурузный экстракт - ЗО.КН2РОл - 0,6, К2НРОл - 1,4, 1Г&С1 - 0,5, HgS04 - 1,0, мочевина -5,0, pli - 7,0.

В качестве мутагена использовали раствор iî-мзтал-и-нктро-№-аггрозогуаниданз.

СпосоОаосгь ита.-.мов шделять аминокислота оценивала в условиях глубшзой ферментации. Ферментацию проводили в пробирках или колбах на качалке цри 32°С в течете 72- 96 часов.

Фзтагемацию в лабораторных ферментерах проводила Бачина Т.А. Сахарозу шосшш в среду в вида подпитка в режиме лшлпгарозания. Вместо можвлнн использовали сернокислый аммоний. Ферментацию вели при 32°С в течение 80 часов.

Количественное определение фенилалашна проводили методом бумажной зроиатографга в системе растворителей бутанол - уксусная кислота - вода в соотношении 40:10:23 или методом тонкослойной хроматогрфш на пластинках siluïol ОТ 254 s системе растворителей изопродажл - ашигк в соотношении 7:3. Количественное определение тирозина зцоводаш по методу Паули, а триптофана - колориметрическим метода (Opienska-Blauth J. et ai.,1963). Контрольные измерения проводом на аминокислотном анализаторе.

Вид&жзшэ хромосомной ДНК B.subtllis проводили по методу Мар-мура <Иахиг Г., 1963).

Сяаашную ЦЖ выделяли по модифицированному методу щелочной денатурата Еирибойка и Доли (Bimboin and Doli, 1979)

Траасфощацид штаммов B.subtixis проводили го модифицированному методу Анатностопулоса и Сшщайзена (Aoagnostopoulos and

Spizizen, 1961).

Опенку сегрегационной стабильности длазмид проведали следующим сбрэзои: анализируемую культуру (о косяка или из ферментационной культуральной кчдкосте) насевали на агаризоБанзув среду Хот- • тивгера. Br-гоосние после 24-48 часов инкубзши прк 37°С отдельные холениз (ICO холоннй) пересегали шгодом реплик на ерздз с добав-кэ7Я соответствущях антабиотихов и без них. Через 24-48 часов пн-кубирозания при 37°С оценивали соотношение колоний, внроекпх на среде с антибиотиком и без него.

При приготовлении Екстрактсз клеток для определена активности Дкр^ентов бактериальшэ культура внрацивали на среде СшщгЗзепа с 5J5 го объему ш и необходимыми добавкам. Клетки, накэдяшиеся в поздней логарифмической фазе роста, отмывали Sris-BCl ели фосфатным буфером, pH 7,5, осаадалк центрифугированием и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе (use, Англия) при амплитуде 10-12 мк 3 минуты на холоду, а затем центрифугировали при 10000 об/мин 30 минут. Для отделения от низкомолекулярных соединенна ферментный препарат подвергали диализу в течение 18 часов или проводили гель-' фильграцд» на сефадексз G-25.

- активность ДАГФ-синтазн (ДШС) определяли по модифицированному методу Голлуба и Залкина (Gollub and Zalkin, 1970); шжошат-киназы (ПК) - по методу ДкайТОВДе Л Дхордона (Jaitonde and Jordan, 1958) ;хоризкатмутазн (ХМ) - по иодафящрованному метсду Коттона и Гибсона (Cotton and Gibson, 1965); дрефеватдегидратаза (ШТ) - по методике Коатса и Нестера (Coats and Nester, 1967) о учетом модификаций, предложенных Риплом и Гловером (Riepl and Glover, 1978); антраЕНлатеинтазн (AC) - по методу Нейнэ и Иенсеяа (Kane and Jensen, 1970). ' ' '

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Биосинтез арокатическиг аминокислот у B.subtiiis, как л у друга? микроорганизмов, включает в себя общи* или гаикяяатный путь, сосгояггчй из 7 реаэдй! превращения зритрозо-4-Лосфага я фосфоенол-пирувата в хоривмовую кислоту. Хоризмэвая кислота явдзется точкой

разветвления гг/тей синтеза нескольких ароматических соединений, з частности, трзх. гтеношслот (рис.1).

Рисунок I. Путь биосинтеза ароматические аминокислот у B.subtilis.

ДШС

¡¡К

пят I

Прсфзмт

АС

хоризмаг ->

—: —»трютойан

ГЩГ

фенилаяаЕкн тирозин

ДДГСС - 3-дезонсн-1ьара(31шогептулозо-7 фсфатсингаса

ЦК - ШгКЕШТКЕназа

АС - антранияатсиятаза

В! - хоризаатмутаза

ВДГ - префенагдегздратаза

ЦДГ - префенатдегщзогеназа

Регудщдя биосинтеза ароматических ешшжеслс? имеет у B.stibtili3 ряд характерных особенностей, отличающих ее от механизма регуляции у других ышфоорганизмов. Штамм B.subtilis AICC6051 Marburg шэет 2 формы Х14 - внсоко- к назкоакизЕвую. Лабораторные вта>.аи могут иметь ка>: обе дормы ХМ (птаым я-23). так и только низкоактЕЕзуХ) форму (тташ 1БЗ в его производные). Ген araa-G ко-дарует бвдгакцяоЕальшй белек с Д&К50 и X» (визкоактивной) активностями, который образует трнфуЕкцгокальваЯ комплекс с кодируемой гено» arol щ. Активность ДАШ) и ¡ПК гЕгибируется прафзнатом и, в меньшей степени, хоризыатсм, синтез бЕфункциональЕого фермента и ШК репрессируется пса взращивании зслэток в среде с тирозином, репрессия усиливается з присутствии фенздаланина. Синтез высокоактивной И (ген ахсН) репрессируется в присутствии всех трех ароматических акшокиелот, а .активность обеих форм Ж инпзбируется префе-

патом. Активность перзого фермента собственного синтеза фзЕипал'а-нина ПДТ (ген рЬеА) ¡ыгкбЕоуется феншшанинсм и тршттс^ансм, контроля сттоза этого фермента у В.виЫ;111з не обнаружено. Активность 1ЩГ (ген 1;угА) регулируется тирсзтмом п фэязлаланЕЕом. Все фсргйЗЕ'ГН биосинтеза триптофана синтезируются ктрдширэзаннэ под контролем трзштофшг; этот кз эйектор иптиблрует активность первого' фзрмеята -¿С (ген -ЬгрЕ).

1.БОЛУЧ21ЕЕ т1>>Л?<РКЩИС <ЕШЛШКМ кггшгез ВаеШиз аиМШЕ; И НЬУЧЕНЙЕ РИУШ'СРКЫХ МРУЩЕЮ®, ОПРЕДРйШЩЕ СЗЕРХСКН-ТЕЗ АШЮКИСЛОТЫ У ШВТЕЕИИГ МтаШ'ОБ.

1.1.Долучвннб продуцентов >Йедигал£двна хак тззяоформантов пролщептов ь-трзптрйанз.

Дня получения продуцентов х-фенлпалашшз в качестве родительских штаммов были использованы получение в кашей лаборатории в итоге длительной егулезчзтсй селекции мутанта в.еиьъшв, способные к сверхснытезу ь-тсштсаака в количестве 8-10 г/л. Продуцента х-стнотофаза характеризовалась дерепрессироьаЕкш синтезом фор-гзнтоз тристофановсго огоренэ и снихетоЗ чувствительностью АС к ингибирсзавго тргпгофапо;.;, мели только нкзкоактизную форму ХМ, которая способствовала прелмушествзнному использованию общих прад-шествешаков ароматических амишиисло? на сжез грпптс.Зана. Физи-олоппескЕС особенности мтяммов- продуцентов триптофана позволяли предполагать, что указанные ктаыда имею изненегоч з регуляции ак-тизяояти ТЩ, а, еоемсжно, и фараантоз общего нута гйюсантеза аро-катячеокмх ежркпеле?, Это могло бы облегчить получо^ж иуталтоз, сшообных к сверхсингезу фааила танина, и явилось оснсг.аниом для внберз продуцентов треттойшз в качзстзз исходят дня .получения продуцентов й?нилалаЕГ22. Так как нельзя бито" исключить возлюгнос-ти рззлтага ыезду цродуцентами грштейага г:з разных лзний езлек-цек, было испсльзовсю несколько тгиаз штаммоз.

Ч'гоб^ пелучгть ез кгег^сь. продущгрткотх 1р2ПГЭфаН, ПрОДУЦбН-

чв ус^талс^йэ, сюдезапэ презде всего создать предаоенлго: для сг.:р>"эегзз^ счой ашнетслога, увз-^гэив колргаеитво префзнатг,, непосредственного предастчензш» сштеза Ззничлззвпа ь тарозгна

(что достигается введением кодирующего зысокоактивЕую Ж гена агоН) и устранив способность сшиезпрозать триптофан введением дефектного гена trpE (¿С). Ген агоН входит в триптофановую группу сцепления,, что делает возможным совместный перенос генов агоН-к tl*pE.

ЧгоСа объединить оба указанных гена аа хромосоме, штамм и-23, имевдий дае формы 2Ы, то есть дахие аллели генов агоН и aroG, трансформировали хромосомной ДНК из штамма таз432 trpE5 агоН по коа-грессш с плазмидой рЕ194 (Еа*, тер"). В результате был отобран штамм 39, у которого отсутствовала активность АС, а активность ХЫ имела высокий уровень, как и у штамма-реципиента (табл.1). Таблица I.

Активность хоризматмутазы и антранвлатсинтазы у штаммов B.subtilis

Штамм Характеристика Генотш сдельная активность нмоль/шн. мг белка

Хм АС

168 • лабораторный штамм trpC'aroH" 0.8 0.47

W-23 лабораторный штамм протогроф 42.3 н.о.

39 зрансформзнг штамма Я-2Э trpS'aroH* 51.0 0

12-14 продуцент триптофана агоН" 0.92 25.7

924 продуцент триптофана агоН" 0.99 45.0

34-16 таансформант штамма 12-24 trpS'aroH* 35.2 0

4S-2 трансформант штамма 924 trpB"aroH+ 39.5 0

На следящем этапе работы стояла задача ввести ген агоН и My-тан тный гея trpE в продуценты триптофана с помощью ДНК, выделенной из штамма" 39. Чтобы отобрать трансфорланта, получившие ген агоН, ш воспользовались данными о . более высокой устойчивости к D-тирозину (DT) штаммов B.subtiiiis, содержащих высокоактивную форму ХМ, в сравнении с штаммами, ямевдиии только низкоактивнуш форму (СЬашрпеу гай Jensen, 1969). ДНК, выделенную из штамма 39, использовали для трансформации 7 полученных на разных этапах селекции продуцентов триптофана. 728 резистектннх к DT траксфзрмантов были провергш на потребность в триптофане для роста и на способность накашивать в среде ароматические аминокислоты. Почти 94% трансформантов требовали для роста триптофан, то есть, .очевидно,

имели генотип arrti tips, что согласуется с даншак о сцяиенности этих .-.¡аркерэв. Это презолсзение подтверждает данные тгйя.1, где прздагазязнн удельше активности ХМ и АС у продуцентов триптофана 12-14 к Э24 и у устойчива? к D-тирозину, зуксатро|яшс по трлктсфг-ну трансформэнтоз 34-16 (рецшшгат 12-14) з 49-2 (рэцшиант 924). Удельная активность ХМ тргнсфзрмантсв близка к акгивностх фермента штаммч ff-23, обладающего обеим формами ХМ, а йютззосте АС не на-йшдаэтея. Большая часть ауксотрофшх по триптофану тргнеформан-тов1 получэзанх о-т акзлогэрззистантЕНХ предуцр.нтов трялтофеяа, продуцировала главным образом фэнилалакин (до 3.1 г/л) и небольшие количества тирозига (0.5 - 1.0 г/л), и ляпь IS трансфорхантов на-кашив&ч в культуррдъной жидкости приблизительно одинаковые ;:оли-чесгва фекилолгнина и тирозина (1.0 - 1.5 т/л).

1.2.Отбор устойчивых к штокишегу С штатов.

Шгаыш-продуцентн триптофана, нсяользованше нами в качество рецшиентЕых, были получены как itttcR производите чувствительного к Mite штата 1гёс.4р.В течение хгомедуицеЗ многоступенчатой селекции зтот признак не контролировался. Оказалось, что среди полученных наш' грансформаитоз встречались как устойчивые к site з концентрации 5-10x1 о^мг/мл, так и чувствительные. Среди 31 штаг,зла, полученного при естественной рассеве одного из устойчишх к Kite клонов трансформиста 34-16, было отобрано 5 клонов вздзляюцих в среду Еа -50 - 70$ больше фзЕШВланина, Последущаэ проверка показала, что признак чувствительности/ устойчивости к Hits нз коррелирует со способностью продущтовать фепилаланш. Зозксаво, 5 отобранных КЛОНОВ ЯВЛЯЕТСЯ потомкаги ОДНОЙ КЛбТКЕ, У KOTOpcS повышение продукции произошло в результате нёвнявленноЗ »лугацех.

В дальнейшем при г-улиЕвкрованЕЗ на минимальной ерздз у пяти joioeob, накапливающих повышенное количество ознилалэшш (4,5 -•5,0 г/л), обнаружили часигену» ■ потребность""в пуринах (гнозине, эденинё, гипоксашгияз, но не гуепаяэ), которой- нз ЯсОлгогали ни у шта:,ма 34-16. ни у продуцентов трщгаофава. Добавленso пара-ашшобензойзой кислоты в среду не склизло иотрзбноста в пуринах, то есть этг: потсебность вшивалась не недостатком хорикзта - общего для синтеза ароматически аминокислот и пара-гмЕгобензсйной

кислоты субстрата.

Для дальнейшей работы из пяти указанных клонов бал отобран штамм 5, продуцирующий феаыгалаша в количестве 5.0 г/л и тирозин - менее 0.5 г/л. От штамма 5 получили спонтанные ревертанты, не требунщне для роста пуриня. Все 13 полученные мутантов были устойчивы к Hite с накапливали в среде фегилалашш в количестве 2,1 -3,6 г/л,то есть снизили прадукцю до урошя "грзЕСформаята 34-16. Таким образом, потребность в пуринах коррелирует с повышенный уровнем продукции фенилалашгаа.

Рисунок Z. Схема селекции продуцентов ($еяилалгнина.

|12-14| 0.8 г/л*(трицтофан-3 г/л)

|34-1б| зи г/л Т"2

_J .5.0 г/л

~ТТ

| 8;-10| 8.1 Г/Л 4/\8

9-5 г/л|11 |

1 5

10.2Т/л[ГТ^271

УМ

I 33 I 9.8 Г/Л

r^ix

М-11 I 10.5 г/л

8.5 Г/Л 19Ü

37П

7

11.0 Г/Л 126' И

¡2468 | 13,о г/л

1 - трансформация

2 - отбор на устойчивость к митошдау С

3 - получение мутантов, устойчивых к пФФА (9 мг/мл) 4- получение мутантов, устойчивых к И? (0.1 мг/мл)

5 - получение мутантов, устойчивых к п£ФА (9.5 мг/мл)

6 - получение прототрофнм ревертантов

7 - получение аунсотрофа по тирозину

8 - получение мутантов,устойчивых к смеси ГФ и ГТ (2 и I мг/мл)

9 - получение мутантов, устойчивых к рТА (9 мг/мл)

*(и далее)- содергание фзнглаланина в культуральной явдкосги

ю

1.3.Селекция tf/тантов, реЕиотентшх к аналогам арсыатическзх аминокислот.

Штамм 5, накашшвашиа в культуральной нидаости фенилаланин в. количестве 5 кг/мл, был ксгользовчн для дальнейшей селекционной работа, направленной на повышение уровня продукции этой аминокислоты. Схема селекции продуцентов фенялаланяна, ведущих свою родословную от продуцента триптофана 12-14, представлена на рисунке 2.

В результате нескольких гтагоз отбора с пргменеыгеи IIP в качестве мужагзна и аналогов ароматических амнЕскисгот: йара-фгорфенилалэяина (р5Щ), Б-ырозина (DD, DL-гидроксаюта фенила-ланина URS), БЬ-гидроксакага тирозина (ГТ), ß-DL-тиезилалгнина С6ТА) и оценкк в сда.ей сложности около 1700 кланов, вкросинг на "редах с аналогами. Сила полутени две линии продуцентов фенилала-шша с близки! уровнем продукции лучзшх птаммов: IC-IG.5 г/л ери культиадравзниа в колозх. Указанный уровень продукция в два раза превышал уровень продукции втадаа 5, использованного в качестве исходного для получения ачалогорезистевттах мутантов.

1.4 .Получение прэтетрофте, продуцентов фензлалзнива.

Все полученные наьн гаалогорэзисгевтннб мутанты - цродуценты фзншгалекина. как л иташ 5,пуадаииоь для роста в трштофане, что требезало его добавления в фэриеятацтсетро среду. Мн рассчитывали, что у получения: от аналогорезистентннх мутзнтсв реаергатоз по. гену trpE сохранится высокий уровень продукции феннлглашша, поскольку высокая активность ХМ и значительные нарушения в регуляции синтеза фенилэланкна предотвратят СЕерхсинтьз триптофана дауе при восстановленной,активг^спг АС. У штамма 11-27 получим 100 реЕер-тантов и проварили да урошс накопления фенилалвнина: прототрофные ста'.ш продуцировали 7,0 - 8,5 г/л фашлаланкна, Et? .наделяя з ерр-да* триптофан. Am дальнейшей работа взяли гташ ISIÜ и его естественный взриантг""й711, продуцирующие Ери культцвЕровании в колбах до 8,6 г/л фешмаланина, то есть на 17% кэньше родительского ауксо-трофного по триптофану штадаа.

Измерения активности АС показали, что ургвень удельной активности фермента у продуцента фешлгдазша 37П в 4- 5 рс-з превосхо-

дет уровень удельно® активности шгашов дикого типа, но при этом почти в S раз ниже ашшаости АС продуцента триптофана 12-14. Возможно, это результат негодной реверсии гена trpE в сочетании с эффектом мутации в регуляторю:.: тане mtr у исходного для работы продуцента тршггефана.

Как ш и создали, АС прототрефного штамма 37П, в отличие от частично десаЕслОшягЕровгнногс к действии4 триптофана фермента продуцента триптофана 12-14, ИЕГИбнруэтся очень4 малага концентрациями триптофана, как а АС в шташах Б.sub-tills дикого типа. Это сзойство ¿С в сочетании с высокой аккшностьв 2М, исагальзуицей тот же субстрат, очевидно, оОьяснявт неспособность ттаглт к сверхсинтезу триптофана, что благоприятствует продукции'Фзнрлалаагна.

1.5 .Получение ауксотрЯиых по тирозину продуцентов фзнил-аланика.

Евэдевив в продуцирующие фенилапанин штаммы B.subtilis ауксо-трофностя ш гарозЕну долнно способствовать повынешш уровня сверхсиЕтеза фенилаланина, поскольку, во-первых, исключает расход црефзЕовой гаслога на сиЕтез тирозина, к, во-вторых, позволяет снизить репрессию синтеза ДАЖЗ, Ш и высокоактивной ХМ, вызываемую тцрозиноа. Исходя из этого, от прототрофаого штамма 37П и аук-сотрофного ш триптофану штамма 11-27 получили мутанты, нувдавдие-ся для роста в тирозина, и отобрали штамм Т264 (Тут") и 2468 , продуцировавшие II и 13 г/л фенилаланина, соответственно. При «ультивирозанзи в лабораторных ферментерах оба штамма накапливает фвнидаланин в колич&ствэ 17-18 г/л. Потребность в тирозине возм82>ается в ферментационной среде за счет кукурузного экстракта, входящего в ее состав.

1.6.Изучение основных ферментов биосинтеза фенилаланина.

1.6.1.Активность ш £ штаммов - продуцентов фенилаланина, Как ввдао ез табл.2, ЦЦГ продуцента триптофана 12-14, исходного для селекция продуцентов фенилаланина, частично утратила чувствительность к ЕнгкОярозанвд феяилалананом и триптофаном. Кроме того, уровень удаплой активности ЦДГ в этом штамме преачиает уровень удельной -акяшости фермента в штамме дикого тша на 85%. •Указан-

нке свойства ПЛГ обусловив начальннй уроЕзнь продукции фенилала-нина (3 г/л) у подученных на основе продуцента триптофана транс-форыазтзв, олравдаз тем самым выбор исходного этажа.

ЦЦТ всза получэЕни ог штамма 12-14 продуцентов фенилалашша но уроввя удельной активности на 50-8055 превызает фермент дикого тша и застично десйзсжйшкирозэна к действию триптофана. По ал-лостзрическим свойствам ЩТ шташа 5 не отличается от фзрмента штамма 34-16, а фермент его устойчивого к пШ мутанта 8-10 нечувствителен к значительно болкшш концентрациям фенилалазина ' (5 и 10 мМ). У авалогорезлстентныг производных стажа 8-10 ПДТ ни по уровню удельной активности, на по своим сеойотеэм существенно не отличается от фзрмзнта штамма 8-10. Таблица 2.

Активность ЩГ У штаммов в.5иЫ;1112- продуцентов йенглалавнна.

штамм удельная активность ЩГ кмоль/мш мг относительная активность в $ в присутствии

ь-феннлаланина ь-триптофана 2.5 мМ

0.5 мМ 5 ыМ 10 мМ 25 мМ

168 2.7 5 0 н.о. н.о. 0

12-14 5.0 72 10 9 н.о. 34

34-16 4.3 70 12 9 н.о. 30

5 4.2 65 15 " н.о. н.о. н.о.

8-10 4.? 100 98 90 74 н.о.

33 4.2 н.о. 102 • 105 90 н.о.

1-11 4.5 н.о. 109 ПО - 91 40 •

11-27 3.9 н.о. 100 104 95 39

264Т 4.3 н.о. 103 < н.о. 93 43

Отсутствие различий в свойствах ПДТ у штаммов 34-16-и 5 сви детельствует о том, что увеличение уровня продукции фенилаланина у штамма 5 на сзязано с изменениями 1ЩГ (см. раздел 1.2). Утратой чувствительности ПЦГ к ретроингибированию у штамма 8-10, по-видимому, объясняется увеличение уровня продукции по сравнению с родительским штаммом 5. Последующая селекция с прямэнешем нескольких аналогов ароматических аминокислот не привела к изменении

исследуемых в данной работе свойств 1ЩГ (уровень удельной активности и алясстетЕческая регуляция фермента), хотя и способствовала повышению продукции фенилаланина на 25-3055.

1.в.2.1ктиввость ДАГФС х италмов - продуцентов фенилаланана. .Из данных, представленных в табл.3, видно, что удельная активность ДАГФС у трансформанга 34-16 и его мутантов 33 и II снижена в сравнении с птаммаш АГСС6051 Marburg, 1-22 и КЗ. Возможно, снижение удельной активности ДАГФС у продуцентов вызвано репрессией синтеза фермента избытком фепилаланкна совместно с тирозином (прототрофше по тирозину продуценты феншаланша нчделяит в срэду около 0,5 г/л этой аминокислот). Ауксотрофноеть по тирозину у штаммов 2Б"1 и 2468 создает условия для физиологической дерзпрессии синтеза Д.4ГФС, что выражается в увеличении удельной активности этого фермента по сравнению с другими продуцента фенйлаланшш.

Таблица 3. Активность ' ДАГФС у B.&ttbtilis 168, Vf-23 и анэлогоргзистентных к ауксотрофных мутантов.

Штамм Удельная активность ¿¿/мен мг белка Относительная активность в % в присутствии

0.25м!А прэфсната 0.25мМ хоригмата

163 15.9 21 59

ATCCS05I 15.5 21 42

12-14 II.5 23 58

34-16 5.3 22 н.о.

33 9.0 20 51

II 8.5 н.о. н.о.

264'Г 13.3 26 50

2463 14.4 и.о. н.о.

Тирозин в ростовой среде на 40- 50% слшгает уровень удельной активности ДАГФС у взятых-в качестве контрольных по отношении) к продуцентам фенилаланина штаммов: 168 1,грС2, ЗВ29 1;грС2 tyгЛ29, БВ112 1ггрС2 рЬ.сА112, но только на 15% - активность Д4ГЗХ5 у штамма 2в4Т. Фенилалавкн практически Ее злияет на синтез ДДЧЮ как у перечисленных выээ лабораторных штаммов, так я у продуцентов фенил-

адалина. Совместно тирозин и фэнилаланнн подавляют синтез ДАГФС почти в 4 раза у штаммов 168, SB29, SB112, 12-14 и 8-10, но у име-ищх разну» удельнув активность ДАГ5С мутантов II, 33 и 264Т уро- . вень активности фермента снижается лишь на 30- 25%. Как будет видно из разделов 1.5.3 и 1.6.4, при выращивании клеток продуцентов фенилаланина в среде с добавками тирозина и фенилаланина репрессия контролируемого этими аминокислотами синтеза ШК и высокоактивной ХН проявляется в той ке степени, что ж у ста:,с,ta B.subtilis 166. Из этого ¡¿окно сделать вывод, что у аналогсрезистентных продуцентов фенилаланина транспорт ароматических аминокислот в клетки не нарушен, а имеются, по-видимому, варушэния в регуляции синтеза ДАГФС-

.Активность ДДГФС у B.subtilis 168 и его производных ингибкру-ется пргфеновой и хоризмоЕбй кислотами. У изученных нами продуцентов фенилаланина, как и у продуцента триптофана 12-14, контроль активности ДАГФС префзнатом и хоризматом сохранился (табл.3).

1.6.3.Активность ПК 2 штаммов - продуцентов фенилаланина. Изучение активности ШК у штамма 168, продуцента триптофана 12-14, а также у продуцента фенилаланина 264Т показало, что тирозин совместно с фенилаланином репрессирует синтез ПК у штаммов- продуцентов ароматических аминокислот в той же степени, что и у штамма дикого типа, а сам фермент сохранил чувствительность к ингибированшо префенатом и хоризматом

1.6.4.Активность ХМ j штаммоз - продуцентов фенилаланина. У полученного в результате ступенчатой селекции штамма 2S4T регуляция синтеза высокоактивной Ж не претерпела изменений. В то же время у штаммов 11-27 и'его производного 264F обнаружена частичная десенсибилизация высокоактивной ХМ к действии префената. У штамма 33 из второй линии селекции, имеющего одинаковую с штаммом 11-27 продуктивность, Ш чувствительна к префенату.

2.ИЗ-УЧННИЕ ШЯШЯ ЖШШКАЦШ ГЕНОВ, КОДИРУЩК ФЕРйЧГЫ ЕКОСКНЕЕЗА ШШШЕЭ!, КА НРОЩЩЮ ЭТОЙ МШШКИСЛОТЫ ЩЛМШМ* В.5иЪ1;:Шз.

2.1.Влияше ачазщд. соде-оказщх гены рпеЛ и агоА-С на .активность ферментов и ктдстшюо Фенидаланина иташ.Э1.а: в.оиЫ-дцз-

В работе исхшьзовали шзаз:жды с геном рЪеА, клошрозаиным из продуцзнта фзишалзьнаа в.эиъ-Шае 11-27 к иг устойчивого к пЗФА ■ Етамма 3.аау1оПс;ие'г;1ег13 А-46. ДНК Б.ац71оИолае1'аа1епз попользовали для уменьшения вероятности рекомбинации при введении плаз.-сзд в клетки прэдуцЕрущах фзнилаланин штаммов В.виЪШхб. Как ш показали ранее, ген рЬ.еА из иташа 11-27 кодировал десенсибилизированную к феналалЕЕКну z частично к тршпсфану ЩГГ. Фермент ктамма А-46 частично утратил чувствительность к ингнбированию фепилслани-

еом.

В клетках лабораторного атаке,;а В.сиЬ11\1Е БВ112 ЪгрСЭ р>еА гесЕ4 амплификация генп рЪеА из штаммов в.епйЛШз п-27 (рН2А21, РНЕА24) И В.аиуа&ИаиеХао^ем ¿.-46 (рЕЕА32, р5ЕА42) приводила :: —. увеличении актязности ЛЖ в 2 - 50 раз. Наибольшую активность ЩЦ', в 50 раз превышавшую активность фермента, в донорном сташе, обеспечивала плазгвда рН5А32. Высокую активность ццг определяло, как было показано йэнгытасоы Ю.В., наличие на клонированном в составе зтой цлазШ'да фрагменте ДНК В. ашуХо 1 хдие Г а.с аепз рибоеокгзльного прсмотора гр1и, с которого и осуществлялась транскрипция раеА гена. В дальнейшем тем ке автором ез этой гшазмидц была получена плазмида рНЕА323, в который ген рЬеА был поставлен под прямой контроль рибссо;„ал1шго промотора 1р1и. Это привело к увеличении активности ВДГ в шта-же БВ112 рНЕА323 в 1090 раз.

Плазмидаш рЕЕГ>1, рЕЕА24, рВЕд32, рЕЕА42 Ж рНЕАЗЗЗ бюш трансфорлированы продуцирукяие фзнияаланин птамгш В-виЫ;Ш.в 3416, 11-27 и Т2В4. Введение гшазмид с геном рйеА как из В.БиМаНв, так и из В.ашу1о11Ц1егас1е11Б способствовало увеличению продукции а'лшокислоти б 1.4- 2.15 раза (с 3.1 до 6.5 - 6.7 г/л) только у сравнительно малопродуктивного шташа 34-16, у внеокоактзвжх продуцентов уровень продукции практически не изменился. При этом активность ЦШ? у мазмидннх продуцентов многократно (в 3- 14С0 раз) превпшает уровень активности фермента у рецшиентннх зтаымов. Этот

результат свидетельствует, что у высокоактивных продуцентов фенил-алашна активность ПЕГ не лимитирует синтез этой аминокислоты.

Плазмидой pBG41, содержавшей ген arol-G из штамма B.subtilis . 1ба, .трансформировали, штзййш- продуценты .фенилаланина 24-16, 7Z6Í и 2468, что привело к увеличению уроетя активности ДАГФС в 2 - 4 раза и не сказалось на уровне продукции.

Совместное ввздевив плазмид рНЕА.32 и pBG4i .содержащих, соответственно, мутантвый ген phsA из B.amyloliqueíaciens и дикий ген агоА-о из B.subtilis в штамм-продуцент Т264 не привело к увеличении уровня продукции фенилаланина. 7435 клеток в конце Ферментации сохраняли оба плазмидшх маркера. При этом в штамме, содержащем две плазмиды, актишость 1ЩГ возросла в 12 раз, а активность ДАГФС была на 303 ниже, чем в реципиенте. Возможно, снижение уровня активности ДАГФС объясняется структурной нестабильностью плазмиды, или присутствие двух рекомоинангных плазмид с высоким уровнем экспрессии клонированных генов оказывает большую нагрузку на метаболизм клеток.

2.2 .Свойства гаоЕ4 мутанта продуцирувдегс фенил ал анин штамма B.subtilis Т264. Чтобы исключить вероятность весьма характерной для B.subtilis структурной нестабильности плазмид в клетках продуцентов фенилаланина, был получен штамм с мутацией в гене гееЕ4.

От шташа Т264, используя плазмиду рВТ69 с дефектным геном гесЕ4 (Gasseil and Alonso, 1989), получили два мутанта !Г2б4гесЕ4: iCm", чувствительные к митомицину С. Оказалось, что гесЕ4- мутанты штамма Т264 не способны нормально растила стандартной ферментационной среде ТФС. Рост восстанавливался при добавлении в среду ТФС аденина, однако и в этих условиях продукция фенилаланина у гесЕ4 мутантов была на 25-30% ниже, чем у родительс-" - кого шташа T2S4. Наиболее продуктивный клон среди естественного рассева шташа Т2б4гэсЕ4: :CaR, названный Тгес1 -3, продуцировал хотя и сниженное по сравнению с родительским гес+ штаммом, но весьма значительное количество фзнаталашна (8 г/л), что делало его пригодным для работ по исследовании влияния амплификации генов ароматического биосинтеза на активность ферментов и уровень продукции фенилаланина.

2.3.Влиышв ампдификашш генов атюматкческого биосинтеза на активность ферментов я уровень щюдукцст фешшаланинь тквзиа Preoi-3- •-..■.. , • -

Итамм Ггео1 -3 Снл трансформирован плйзывдакш, содерма^коги гэ-ен ароматического биосинтеза: рН2А323 (гзы pheA :-:з В.£ffiyloliquoísoiens А-46), pBAG7 (г£н aroA-G 43 b.subtílis 168), рВАйОП (ген arel из В. subí ¿Lie 11-27) Е pCBHJ (ген агоН из B.subtílis AICCÓ051). Все геш, крсмэ раьА, кодирозали белки з ал-лостерическсй регуляцией дикого типа. Из ДоНшп ta б л. 4 вадно; что многократное увеличение активноси? фзриентов в кы--лсэх илазмэдел: продуцентов не сопровождается увеличением уровня продукции фенила-ланина.

Затем штамм Treol-З трансформировала плазшдаш, содэркащыз искусственный aioA-G-phsA опзрон, состоящий из ыутантного гена » pheA B.a-ayloliqneXaciens н гзе2 aroA-G B-subtillp ПОД контролем rpiu , промотора (Хазах В.Э., 1992). Елазыиды pAGP7, pAGP9 Е PAGP5.17 ьмелк' различную структуру ДВН в aroA-G-pheA области: плэзкцда рАйР5-17 содержала природную структуру Дай гена &roA-G E.oubtilis, ген агоА-с плазмид pAGP7 ж pAGP9 кодировал балок, у которого С-концзюй аланин задней, на аргднш и добавлено еще S аминокислот. Пцаылгда pAG?9 - кроме того, содержала в области еш-цкацзи трансляции фрагкент ДНК размером 3Ь я.о. Введение плаз;,ид с искусственным опероном в штамм Ггес1-3 привело к увеличению активности ДАГ13 е 10, 2 и 5 раз, сосеггетсгЕэньо. Активности 30!, ::ак л следовало ожидать.. практически не изменилась, поскольку вводклея ген aroA-G, кодирухщай нгзкеакгивиув Sí, не> фоне высокой активнее-тн ХМ, обеспечиваемой присутствием в штанге-продуценте йгнилала^л-на гена агоН. Активность ЦДТ е ззтаммах 2гес1-3 рЛ0Г7- рАСРЗ и PAGP5.17 многократно превышает уровень активности фермента в бес-плазмздном штамме. Еведеше 2-х из. 3-х плазмид с Ескусственлак опероном поблеяло на продукгзЕИосзь шязша ?írecl-3 (табл.4): итг;.!-ei Treol-3 pAGP9 i£ 5?гес1-3 pAGP5.1V вшшшнезэт на среде тфс на 502 больше фгшишвяэш, чем рецпхЕЗптпй етзея. ' .

У всех шизивднах продуцентов контролировалась сегрегационная стабильность пдазйид ь килце фэрненчадш (9S часов культив^рова-

пия). Устойчивость :с антибиотику сохраняли SO - 33S клеток транс-фотллазтоз, содерззщих различные шазмвдц. Таким образом, у плаз-мидных производнчх штамма' Trscl -3 практически отсутствовала плаз-, •мидная нестабильность, как сегрегэдаонная, так и структурная (вследствие мутации в гене гее24).

Таблица 4, Активности клетевых щеры&нтоз биосинтеза и уровень продукции фзнидалананг у штамма в.sub tilis Егео1-3 и его плазггад-ных вариантов.

Ялазмвда Клонированные гены Удельная активность, вМЛят/мг Фенилалакин

г ДГЗЮ - ГК ЗМ щг г/л

- - 6.1 15 42.5 4.5 7.8

рВАС?7 aroA-G 132. 55. 4.S 2.4

рНЕА323 pheA 6. 46. 5040. 8.9

рСБН5 агсН 260. 4.2 7.8

pAROU arol 51 6.2

рАС?7 aroA-G pheA 65. 4-5 5400. 7:6

pAGFS aroA-G pileA 12.3 40 ЗбОО. 12.0

рАС5Р5-17 агоА-G ph.eA 35.7 43 1400. 11.5

2.4.Влияние плазмяд, содержащих геш ароматического биосинтеза, на продукции фенидаланина и активность ферментов в штаммах Т264 и 2468.

Как видно из табл.Б, введение плазмид рВА07, рЯЕ323, рАб?э pAGP5.1T в итакш Т264 и 2468 привело к таким же количественным изменениям в активности ДАГФС и ВДТ, что-и в геоЕ4 производном штамма Т264 (Егес1-3). В отличие от ктамма 5?гес1-3 введение плаз-мида р2А87 (ген агоА-О)- з ¡птаммы Т264 и 2468 не привело к снижении уровня продукции. Присутствие плазмздн рНЕА323 (ген рЬеА)в клетках этих штачмов, как и в 5гес1-з, не оказало заметного влияния на накопление фенилаланзша. Зато уровень продукции фенилаланинз у ре-комбинантяых итадаюв, содержада: плаемвдн рА0Р9 и рАбР5.17 с искусственным оперонсм агоА-ЧЗ-рЬеЛ, существенно возрос, достигнув 19.9 г/л у штамма 2468 рАСР5.17.

В лаборатории ферментерах штамм 2468 рАбР517 накапливал в

культуральной зшдкости до 25 г/л фенилалашша, конверсия сахара достигала 23$. В этих же условиях бесплазмщщый штамм синтезировал 18 г/л феналаланива с конверсией 13?..

Таблица 5. Уровень'продукции фзнилалашша я активности ферментов ДаГФС и ВДТ у штаммов В.еиЬгШй Т264 И 2468-

Штамм Плазмада Клонированные <1енилал2нин Удельная активность

гены г/л пЫЛшн/мг белка

ДАГФС дяг

Т264 - - 9.9 8.2 4.2

рВАС7 агоА-0 9.1 65.6 4.0

РЕЕА32Э рНеА 11.2 7.3 5450.

р!СР9 агоА-0 р1геА . 16.1 22.1 Э420.

24бв~ pAGP5.1T агоА-б рЬеА 16.3 42.1 1512.

- - - 13-1 12.2 5-4

рБАС7 сл-оА-б 14.2 81.8 4-1

рНКА.323 рЬеА 14.8 11.0 5204-

рАЙР9 агоАНЗ рЬеА 19-2 35-3: 3265.

РАСР5.П атоА-Ч} рЬеА 19-5 48-9 2006.

Примечание: данные по уровню накопления февилаланина получены при культивировании на среде ТФСс добавлением ОЛмг/мл триптофана и 0.01мг/ил эритромицина.

При культивировании в течение 72 часов бег дополнительных до банок эритромицина в ферментационную среду (концентрация внесенного с посевным материалом антибиотика не прешшала 0.5 мкг/мл) устойчивость к эритромицину сохранят 7456 клетох штамма 24Ь8 р!СР9, 9156 клеток штамма 2463 рАСР5.17, 7156 - штамма Т264 РАСР9, 84$-штамма Г264 рАОР5-17- В случае внрадаванкя посевного материала и проведения ферментации в услоеиях отсутствия антибиотика, устойчивость к Ел сохраняли лишь 236 клеток штамма 2438 рА£?5.17. Плазмада pAGP5.1T, по-видимому, сохраняет относигедьнув структурами стабильность при пересевах: после 5 пассахей на среде с эритромицином около 605Е клеток сохранят: высокий уровень продукции. Таким образом, введение плазмид с агоА-о-р}геД опероном в клетки тташюв, не имеющих мутации в гене гесЕ4, щкевло к некоторой структурной не-

' стабильности шгазмид, однако уровень этой нестабильное™ не препятствовал достижении уровня продукции фенилаланина, значительно превышавшего показателя продукции плазмидзых производных штамма Егез1-3. • '

Данные об амшгафикацнн генов ароматического биосинтеза в клетках продуцентов фепилаланинз позволяет сделать езвод, что после устранеиш ретроингибфовашя клтевого для биосинтеза фенилаланина фермента 1ЩГ продукция этой аминокислота у мутантов в.виЬ-ЬШз ограничивалась активностью первого фермента шикиматного пути"биосинтеза - ДОТС. Частичная дерепрессия синтеза ДАГФС, достигнутая главным образом за счет тирозинозой ауксотрофности, позволила увеличить уровень продукции, однако и в высокопродуктивных беспдгз-шгднтпс. штаммах синтез фенгогалаяша сдерживала недостаточная активность дагас, сохранившей чувствительность к аллсстбричэсзшм.эффекторам. ¿далифшсацгя одного гена атоА-о в клетках продуцентов не привела к существенному увеличении уровня прсдухциа вследствие ин~ газирования активности ДАГФС префеяатсм и хоризматом. Введение плазмвда с клонированным мутанхнш геном рЬеА, повлекшее за собой многократное увеличение активности 1ЩГ и создавшее потенциальную возможность для снижения ингябированая ДАГФС, такне' не повысило продукцию фенилаланина, по крайней мере при культивировании в стандартных услозиях. Претшой этого была, видало, недостаточно высокая экспрессия гена агоА-С- Введение плазмвды с искусственным опероЕом агоАЧЗ-рЬэА привело: 1)к увеличению количества фермента с ДАГФС активностью; 3)сважеЕШ> ингибирования этого фермента за счет повышения расхода основного аллостерического эффектора - префената вследствие возросшей активности ВДГ. Кроме того, в клетках плаз-мадного продуцента недостаток префецата мог вызвать повышение активности Ж и ХМ. По-видпмсму, это и привело к повышению у продуцентов, содержащих плазмида с искусственным опероном, уровня продукции я конверсии сахара. По уровню продукция фенилаланина при культивировании в колбах получение в данной работе длазмидные шгвммн значительно превосходят известные на настоящий момент штаммы В.зиЫ;Шв - продуценты этой аминокислота и сравнима с наиболее продуктивными штаммами, полученными на основа других микроорганизмов.

швода

1. Показана воздакаость получения продуцента Ь-фешлалгвина на основе мутанта в.шЬШаз - продуцента Ь-тршпофана введением последнему методом генетической трансформации гена агоН (высокоактивная ХМ) и дефектного гена ЪгрЕ (антраЕигатсинтаза). Это позволило переориентировать поток общих предшественников' ароматических аминокислот на синтез х-фенилаланша ж ь-тирозиаа г в сочетэнш с имевшейся у реципиента частичной десзнсабЕлвзацией ВДГ к ретроин-гибированшо обеспечило сверхсинтез 1-феналаланша (до 3 г/л).

2. Обнаружено, что повышенна уровня продукции х-фепилалаянна (до 10 г/л) у полученных от трансформавта аяалсгорезистентЕЫХ мутантов связано с высокой степенью десенсибилизации ЮТ, тогда как ферменты общего ароматического пути в основном сохранили регуляцию дикого типа.

3. Показано, что увеличению уровня продукции ь-фенилаланина у аналогорезистентных мутантов способствует ауксотрофаость по. ь-тирозину, вызывающая частичную дерепрассив первого фермента ши~-киматного пути - ДШВ. Ауксотрофннй по Ь-тирозкиу штамм Т264 продуцирует при культивировании в колбах ь-фезклалашн в количестве II г/л, а двойной ауксотроф по Ъ-тирозину и 1г-трш?офану, штамм 2468 - 13 г/л. При культивировании в лабораторных ферментерах оба штамма накапливают ь-фенилаланин в количестве 18 г/л.

4. У полученных на основе продуцирующих ь-фенилаланин штаммов В.виШИв рекомбинаншк штаммов, содержащих плазмиды с генами агод-б (ДАШЗ - низкоакишная ХМ), аго1 (ШК), агоН (высокоактивная ХМ), в 2 - 60 раз увеличен уровень удельЕой активности соответствующих ферментов, что не сопровождается повышением уровня продукции Ь-фенилаланина. Амплификация мутантного гена рЬеА увеличивает (в 4 - 1000 раз) удельную активность ЛИГ у всех продуцентов Ь-фенилаланша, но уровень продукции возрастает только у низкоак-тиеяых продуцентов, что свидетельствует о лимитации сверхсинтеза

Ir-феналалашша на ранних этапах биосинтеза ароматических аминокислот.

5. Показано, что введение в штаммы-продуценты Хгфэнилаланина. плазмнда с искусственным опероном, содержащим дикий ген aroA-G и мутантный ген pbei, приводит к позшзеншо уровня удельной активности Л&1ЧС в 3 - 6 раз, а ЩГГ - в 400 - 1000 раз, что коррелирует с увеличением уровня продукции ь-фзнилалашша на 20 -50%, а конверсии сахара - почти вдвое. Этот результат свидетельствует, что у бесплазшдных аналогорезистентанх штаммов и у рекомбинантвых итам-мов с амшшфшшрованным геном pheA свэрзгаштез i-фенплаланина лимитировался на этапе, катализируемом ДАГФС.

6. Показано, что мутация в гене гесЕ4, исключающая структурную нестабильность рекомбипантных штаммов, сникает уровень продукции l-фенилалавина у аналогорезнстентного_- штамма и его плазмидных производных. Амплификация генов ароматического биосинтеза приводит к сходным изменениям в уровнях удельных активностей соответствующих ферментов и продукция ь-фенилаланина как у гез+, так и у гео~ штаммов.

7.Получен итамм 2463 рАОР5.17, продуцирунзий Х-фенилалапин в количестве 18 - 19.5 г/л при культивировании в колбах и до 25 г/л в лабораторном ферментере. Конверсия сахара составляет около 20%.

СПИСОК ПУЕШШШ Ю ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Велшазнзша Г.А., Яшольекая Т.Д., Жданова Н.И., Бачина Т.Д., Васильева Н.А.,. Соколов А.К., Рогаль S.P., Шслие А.Ф., Тшо-хша Е.А. Способ излучения ь-феншшазина. // Авт. свидетельство .. . U I3802I2, 1936.

г.Ямпольская Т.А., ВеликкаЕина Г.А., Лдановз ГГ.И., Бачина Т.А., Васильева Е.А.-; Соколов A.F.. Штамм бактетый Baoillus subtilis ВЕШ B-476I - продуцент lr-фенклаланша. //Авт. свидетельство I." 1593056, 1991.

3.Ямпольская Т.а., ВелЕшанина Г.А. Виеяезз увеличения дозы гена преОзенагдегидоатазн на продукция L-фенилалашша у Bacillus subtilis. //feszca 'докладов конференции колодах ученых БНШгенети-ка "Генетика и биохимия микроорганизмов - биотехнологии", Москва, 1986, стр.24. - -

4.Ямпольская Т.А., Ивановская Л.В., Велигаааина Г.А. Изучение гуляции активности к синтеза 3-дезокси-])-арабиногептулозо-7-сфагсиЕтетазы у азалогорезистентннх мутантов Bacillus

subtilis,наделяющих феноаланиа. // Тезисы докладов г." республиканской научно-теоргтичеасой конференции молодых ученых и специа-жстов микробиологов "Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов", Ташкент, 1989, сор. 69.

Б.Савельева Ю.Г., Ямподьская Т.А., Абалашша Е.Е., Иомантас В.В. Клонирование ключевого гена биосинтеза ароматических аминокислот у Bacillus subtilis 168. //Там ка, стр.79.

Отчеты по совместной российско-японской программе "AJIHCGEH"

6.Report К 1, Contract И 3910/9C003, Jme-Deoember, 1990, Moscow,

7-Report Н 2, Contract N 3910/90003, January-June, 1991, lioacow.

8.Report К 3. Contract N 3910/90003, June-December, 1991, Moscow.

9-Report N 5, Contract N 3910/90003, June-Deoeaber, 1992, Moscow.