Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование генов lysC asd Corynebacterium glutamicum. Интеграция клонированных генов в att- сайт фга л хромосомы E. coli

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование генов lysC asd Corynebacterium glutamicum. Интеграция клонированных генов в att- сайт фга л хромосомы E. coli"

Т6 од

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК. 579.871.1:579.252.5.

Передельчух Михаил Юрьевич

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ 1узС И аггй СогупеЬас^ег 1ига в11^ат1сига. ИНТЕГРАЦИЯ КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ В а«-САЯГ ФАГА х ХРОМОСОМЫ Е. со 11*

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1994

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики НИИ генетики в селекции промышленных микроорганизмов

Научный руководитель член-корр. РАН В.Г. Дсбаоов

V.

Официальные оппоненты д.б.н. C.B. Каменева

к.О.н. -A.B. Орехов

Ведущая организация Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 17 мая 1994 года в 14.00 на заседании специализированного совета Д038.12.01 при НИИ генетики и селекции прмы пшенных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й'Дорожный проезд, 1.

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке НИИ генетик:! и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан 15 апреля 1ЭЭ4 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В.И. Щербакова-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность трцц. Значительную долю продукции прсмцслепной отехнолопш составляют аминокислоты аспарапшсзого семейства, ровой рынок которых оценивается в несколько миллиардов долларов, адициоыннш промышленными продуцентами этих аминокислот является 'утаматпродуцирунцие коринеОактерш. Так, например, объем пропз-дства лизина коринебахтериями, еще недавно составлявший 100 тысяч >нн в год, ныне, по оценкам специалистов, удвоился. Промышленные •аммы коркнебахтерий, обеспечивалцие достаточно зыссий уровень ¡одукции, Оыли получены классическими селекционными методами. >здание систем вектор-хозяин для клонирования в кориневахтериях, а шее разработка методов трансфорлацшг коринебактерШ. позволяют гаструировать еще более продуктивные штаммы.

Основой для генно-инженерного конструирования штамов-продуктов является использование генов, кодирующих ферменты для оптирующих этапов биосинтеза. Амплификация этих геноз приводит к зеличению активности соответствующих ферментов и усиленна метабо-1ческого патока в направлении конечного продукта. Яро.у.е того, аличие клонированного гена позволяет проводить его модификацию с эмощыо сайг-специфического мутагенеза. Стсвда вытекает необхода-эсть клонирования и изучения коринебактериалъных генсв, детерли-ируэдих ключевые ферменты аминокислотных биоспнтетичесзих путей.

Продует гека 2y.sC - аспартокиназа (АТФ:Ь-аспартат-4нросфотранс-ераза, КФ 2.7.2.4),- катализирует реакцию фосфэрилирования аспара-кновой кислоты в биосинтезе лизина, треонина, изолейцша и метио-ина. Изучение этого метаболического пути у коринебактерий показа-о, что именно эта реакция является его "узким мостон", а 1узС -лычевым геном в биосинтезе лизина у коринебактерий.

Плазмидкне векторы позволяют увеличить молярную делю клониро-анного фрагмента, однако их существенным недостатком звляются пе-зстройки, и делеции. Часто клетки с делетированными плззмидаки или тратившие их получаж селективное преимущество перед исходными и итесняют их в процессе роста, что приводит к стиаетттп гродуктивпо-:ти бистетзатогических процессов. При интеграции г.е в шэмосому чу-:еродная ДНК менее подаетжена перестройкам и делециям. Поэтому раз-¡гботка векторов, позволяющих интегрировать чугерсетун ДНК в хро-юсому, в настоящее время являзтея одним из ьзгзых пата^вленкй раз-1ития биотехнологии.

Цель работа.. Основной задачей настоящей работы было клонирование гена lysC Corynebacterlum glut&micun с целью использования егс в дальнейшем для конструирования генношкенерных коринебактериаль-ннх штаммов-продуцентов лизина. Наряду с вышеуказанной ставились такие зада«, как получение рекомбинантных штаммов с повышенной экспрессией ггна lysc; получение путем олигонуклеатцд-направленного мутагенеза «угантного аллеля гена lysc, детерминирующего устойчивую к ретроингиафованив аспартокиназу, и его экспрессия в коринебакте-риальных клапсах; исследование окружения гена lysc на хромосоме; разработка системы сайт-специфической интеграции чужеродной ДНК в xattB-сайт зромосомы Е. coll и интеграция в него генов lysC и asd С. glutamlcu*.

Научная нсвизна -работы. Клонированы гены asd и lysC с. glutami-cum. В связи с низкой эффективностью прямого клонирования в клетках коринебактерй библиотеки генов С. glutaalcum получали в клетках Е. coll с использованием фазмиднкх векторов, наиболее удобных для скрининга по комплементации мутаций. Субклонирование гена .lysc в составе биряпшконного вектора pNS2 для Е. coll и коринебактерий, сконструированного Ю.Г. Ростовой , позволило в шесть раз повысить активность аспаргокиназа в коринебактериальных клетках. Методом олигону1аеотвднаправлешюго' мутагенеза получен' мутантный' аллель гена lysc, кодирулций нечувствительную к ретроингибированию аспаротскиназу: Мутантшй ген субклонирован в составе вектора pNS2 и экспрессирован в клетках с. glutamlcum.

Исследован участок хромосомн, сцепленный с геном lysc (определена нуклеотжцная последовательность фрагмента ДНК размером 100Q п.н. ). Компьютерный анализ последовательности позволил сделать вызод о том, что кластер генов lysc и asd сцеплен на хромосоме С. glutaalcum с геном, кодирующим интегральный белок.

Сконструированы плазмидные векторы plNS32 и pBRlK для сайт-спэ-цифпческой «нтеграции чужеродной ДНК в xattfi-сайт хромосомы В. coll. С помочью вектора pBRlK гены lysC и asd С. g-lutamicua интегрированы в wtts-сайт хромосомы Е. coll.

Практическая ценность работы. Клонированные гены lys С и asd с. glutaalcum используются в лаборатории селекции продуцентов алсшо-кислот НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов для ' получения шринебактериальных "продуцентов лизина. Промышленный итакм-продуцент лизина Brevlbacterluia flavun 531, содержавший рекоибинантиую плазмиду с этими генами, в пилотных экспериментах

величия продукте лизина на 105 относительно оесиазмилного тамма. Сконструированные в ходе раооты интегративные илазьшшые екторы pius32 и pBRlK являются удобными инструментами для Ейт-спеии^этссксЯ интеграции чужеродной ДКЧ в *.агг-сайт хромосомы . coll и могут быть использованы для решения как каучЕых, так и аучно-прахтических задач.

Структура работы. Диссертация состоит из зведеиил, экспервлеы-альнои части, содержащей главы "Материалы и методы" и "Результаты . обсуждение", выводов и списка цитированной лктератург, зюпоча-гаего 120 наименований. Работа изложена на : ift страницах, включает т рисунков и 7 таблиц.

Еубликадкя. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

СОДЕРгАНИЕ РАБОТЫ

Методы генной иакенераи, как известно, позволяют: повысить зкс-.рессию гена, продут которого катализирует лимитируг^ую стадию иосинтеза, путем его амплификации на многокопийном веккзре. Клюквой стадией биосинтеза еуиеокислот у коранебактериЗ является ¡закция фосфорилирования аспартата, катализируемая белковым проектом гена lysc - ферментом аспартокиназой. Поэтому одвгй из задач ¡энной работы было клонирование гена lysС С. griutamlcian.

ГЛШОЗА i

I

L-АСПАРТАТ

| аспартокиназа tlysC)

L-p-АСПАРТИЛФОСФАТ

I аспартатполузльдегид-' дегидрогеназа (esd)

L-р-ПОЛУАЛЬДЕГИД

АСПАРДГКНОВОН КИСЛОТЫ

. дигидродипкколинат-I синтетаза IdapA1

L-2,3-ДКГИДРОДШИКОЛИНАТ

I I

ЛйЗИН

з

Поскольку тт lysc с. elutaalcùm не экспрвссирувтся в клетках Е. coll. на первом этапе работы провели клонирование сцепленного с ним гена asd' по южшементаши соответствующей мутации в клетках £. coll. Для поиска гена asd была сконструирована клонотека EcoRi- фрагментов хромосом штамма C.elùtoaicua 77 на фазмидном вектоое xpsl5 в клетках вташ. 1£з?г е. coll. Для отбора фазмвд, содержащих кори-небактериальный ген asd,. использовался asdTmau штамм SH309 е. coll. в клетки которого П.В.Смирновым предварительно был введен дикий аллель гена ви1А, что позволило использовать его для трансдукшш фагом х. После лизогенизации фагом х эти клетки использовали для поиска фазмвд, юсувдх ген asd коринебактерий. Для комплементацион-ного анализа трксдуктанты высевались на L-arap, содергавший Ар и отбирались клеш по признаку asd*. Дпг. того, чтдбы подтвердить,"что фазмада xpasdi одного из атих клолов содержала фрагаент коринебак-тердальной хромссс^, была проведена блот-гкбридизация по Саузерну хромосомной Дй С. giutaalcua 77 с ДНК фазмвды xpasdi в качестве зонда. В составе хрсмосомы были вдтаифшшрованы все EcoRi-фрагмен-ты Фазмиды. Это подтвердило, что xpasd содеркит коринебактериальный

oal /ittbiçuuzK 8 * f &жфагал ces Я

¡а>Х1-аюагпе»глрогг0С9-^'~~ _ JStflM. "•"¿АН* да» /снцаюга л

' -I s

т.п.». /¡ны ааигх Casif

fiS2 e/tuui

ruew

£ &XMCE £

|, .."y

Xi ЛЕС

fttж

I_i

Рис. 1. A. Клонарование генов asd и lysc .с. glut&alCam 77.'

Б. Респикционная карта плазмиды р92. в - BamHl. е - EcoRl Ее - ЕЫ136И, М - ид. S - Sali. X - Xhol, Xb - ХЬей.

А

гэн asd. Из фазмиди \pASPi был выделен BamHl -фрагмент ДН5 размером 8,5 т.п.н., содержавший плазмидную часть фазмидзсго вектора и фрагмент хромосомной ДНК размером 5,8 т.п.н. (рис. И. В результате монсмолекулярнсго лкгирования данного фр<лтэта сшла получена шшзмвда р92, которая комплементировала мутацию asd б метках атамма SH3ü9. Затем Sail-фрагмент этой плазмиды был субкижирован в Онрепликошшй вектор ркли для коринебактериЯ и с. coíJ. Полученной таким образом плазмидой pKASiS трансформировали клггкк птамма дикого типа С. glutanicum АТСС13032. Измерение активности аспарто-киназц показало, что она увеличилась с 22,3 нмоль/мпсиай в лкзате бесплазмвдннх клеток до 39 нмоль/мгхмин в лизатс трансф^мировавных клеток. Это позволило сделать епбод о tcü. что кжнированннй фрагмент хромосомы С. glut&mlcum 77 солергап полную последовательность гена lysc.

2^_Экспрессия_гена_1^5С_в_коринебжтери

Экспрессия клонированного гена JysC из мутантяого штамма С. glutamicum 77 з составе бирепликонного вектора рклн увеличивала активность аспартокиназы на 755 по сравнению с Сесплазюшними клетками исходного мутэнтного штамма. Следует отметить, что в результате мутаций активность'аспартокиназы ь клетках C.gíutaaícum 77 била вдвое ниже относительно уровня активность фермента в клетках дикого типа С. glutamícum АТСС13032. Таким образом, экспрессия клонированного на векторе рКАП гена приводила к незначительному увеличению активности аспартокиназы по сравнении с активностью фермента в клетках штамма дикого типа. Л г я обеспечения более высокого уровня окспрессии гена 1у:3 в коринебахтериальнкх клетках был использован сконструированный В.Г. Яэстовой биреплысонный вектор для коринебак-терий и Е. coll, в состава которого был клонирозан ген lysC из штамма дикого типа. Клонирование осуцостгляли по схемг, использованной при клонировании генов из штамма C.gJutanieum 77. Из сконструированной фазкздной библиотеки по кстгтслементачии мутадай asá отбирали рекомбинанпше клона, содержавшие гэнн asd и lysC. Фрагмент рекомЗинантной фагмиды xpASD4, несущий ген JysC, субклоннрозали на векторе рН32. Полученной планикдой pVTE3 трансформировали клетки с. glutanicum АТСС13032. Уровень активности аспартокиназы в клетках дикого типа С. glutamlcua £ГСС13032 с плазмидой pWTE3 был в шесть раз выше по сравнении с уровнем активности фермента в бесплазмидных клетках (табл.1).

Таблица 1. Удельная активность аспартокиназы*.

Штамм С.е1и-гаш1сит (плазмида) Удельная нмаль/мин I активность х мг белка II Относительная акт-ть, г, в присутствии 10 мМ лизина и 10 мМ тиеонина

13032 45,7 21.4 10

13032 (рИ321 24-.2 г _ 15.3 • 16

13032 1рУТЕЗ) 236,5 140.4 12

13032 ( рИиЕ2) 623.5 319.0 122

Активность аспартокиназы определяли в стандартных условиях в присутствии 400 мЫ (I) и 100 мМ (II) 1.-асшраганавой кислоты. Относительная актизность вырахэна в 2 от активности II. измеренной в отсутствие аминокислот.

з^олггону^естаднгдразлднный цутагензз уена^уяс.

Для получения мутантного аллеля гена 1узС, кодирующего устойчивую к ретроингабированшо аспартокиназу, был проведои плигонуклео-тиднаправленныИ мутагенез. Пр! введении мутантногс генг., клонированного на вешорэ р№2. в клетки штамма дикого типа С. ешашсит АТСС13032, они приобретали устойчивость к аналогу лизша аминоэ^ил-цистеину. Измерение активности аспартокиназы показало, что мутант-ный фермент не'ингибировался смесью треонина и "лизина (таил. 1).

Посл-ть гена 1у5С С^1игаш1сиш 13032

Посл-ть мутагевизи-руидего олигонукле-отида

Посл-ть гена после мутагенеза

ТЬОКУЭБУЕВСТ .СТТСТССАСААССТСТСТТСТСТАСААСАССССАСС.

(тса^гшс-^сЬА^с^^а^аадасг^с

. СГТСТССАСААССТСТАТТСТСТАСААСАССССАСС. УЬО'МУУЗУЕОСТ

1узС ра хромосоме с. к1иЬат1сит.

В ходе работа была определена нуклеотадная последовательность-ность фрагмента ДНК размером 1 т.п.к. ирзггеаш от гена 1увС. Компьютерный аняпиа последовательности позволил идентифицировать открытую рашу считивания и наличие инициаторных сигналов. При анализе потенциального белкового продукта в его составе были обнаружены трзнсмекбранные сегменты, что позволило классифицировать его как интегральный белок.

AATATrTCAGACAAAACTCACACCTCCTACTTCCCCACCAAUU I 1АСТСАЛСТАСССТ

CAATCAAGTCCAAAGCAATCTCCTCCCCCTCCTTTTCCCCCTACCATCGCCATTAACAAT

CCCATGCCGCACCCTGCTCACACACCCCATCCCCCTCCCCACCCCAAAACATCCCTCCCT

AACCAGCTCACCTTTACTCAATGCTCTCATGACACCGATGTGCTCCCCACGC ATG ACT

U . S

ACC т CCC A АТС M CTC L CCA A TAT Y TTC F ТТЛ L CAA Q АСА T СТА V CCA A CTT L CCT G TTC F

CGC G ACC T CTC L TTC L СТА V CTG V CAA Q CCA F CTC V CTT L CTC V CTC L TCC s CTC 'L ATG M

TTC F ACC T CTC L CCG P CTC L TCA s CCA A CCA R TTC F AAT N CGC G TAC Y CGA R СТА L CCC R

CCA P. ACT T CAA E АТС I TTC F TGG W CCT A ACC T CTC L CTC L ACC T СТА V CCC A GTC V CCC G

АТС I ATG M АТС I GTT V TTC L CGA G CCC R CCC p CTT L CCC. p GGA G AAC N CCC p CAC H CCC P

CCA P CTC L CAT D CGA R TGG W ATT I CCA P СТА V CTT L TTA L GTC V CGC G GTT V CCA A СТА V

ATG M CCT G CCA G ATG К TGG V CTG L CTT L CCC A CAA E TAC Y СТА V TTA L AAC К AAC K- CAC D

AAA К CCC A CTC L АТС I CTT L CGT G CTT L CTG V ACC T CGT G CCA A TTC L TTT F CCC G TAC Y

СТА V CCA A CTC V ATG M TCC s AAA К CCC A CCG A CTC V CAT D CTT L TTT F CTC V СЛТ H CAA Q

CCC G ATA I acg T gga G CTC "L АТС I TTC L AAC N TGG W CAA E CGC G TAC Y CGC G • СТА L ' АТС I

CTC 1 ACC T CCA A TTA L CTT L CGA G АСА T АТС I CTG V CAC Q CAC Q TAT Y TCC S TTT F AAC N

OCT A CCC g CAA E СТА L СЛА Q AAA К TCG S СТА L CCC p CCC A АТС u ACC T ATT CCC I A CAA E

CCA P ATT I CTT V CCC TTC F ACT С* TTC L CCC g TAC y TTC l CTT V CTC L CCC g CAA E aaa 1С

TTC F CAA CT CTC V CTC V gac D TGG W CAA E TCC V АТС I CCC A АТС ti CGC G АТС I GCA A СТА L

CTC T CTC V ATG V. ATT I GTT V ТСС s ЛСС T ATT i CCA A CTG L TCT S CCT R ACA ACC T S АСА T

ATG CCG CCC CCA TCC AAA ACC TAA AACTCCAAACTTCCCCCCCACACATCAC MPAGSKH-

ACCACTGCAACTGCCCGTCCAAAAGCTTTTTTAAA

Последовательность нуклеатщгав Sspi-Drai фрагмента ЛНК upstream гена lysC на хромосоме С. glutamlcum АТСС13032.

xn-ttgrcafl? xpcuocom Е. coli.

Одним кз основных направления развития технологии рекомбипантных ДНК, во многой определявшим ее прогресс, является получение новнх векторов Д£2 клонирования. Традиционные векторы, сконструированные на основе природных шизмвд. могут . автономно реплицироваться в бактериальной кльтке. Это свойство л позволяет увеличить молярную долю клонированного фрагмента чужеродной ДНК, а танке облегчает его выделеню и очистку. Однако, в таких векторах могут происходить перестройки и делзшш клонированного фрагмента, что особенно вероятно та больших размерах фрагмента и при наличии в его составе позторяжвдося участков. Часто клетки с делегированными плазмидами ей утратившие их получают селективное преимущество перед исходами и вытесняют их в процессе роста. Попытки преодолеть эту нестабильность привели к возникновению нового направления генетической инженерии, связанного с получением так называемых химерных хромосом. При интеграции в хромосому клетки-хозяина чужеродная ДНК менее падверкена перестройкам и делециям, чем в составе плазмвдных векторов. Встраивание чужеродной ДНК в хромосому бактерий происходит с помощью четырех различных механизмов: гомологичной рекомбинации, сайт-специфической рекомбинации, транспозиции"и незаконной рекомбинации. Для получения химерных хромосом чаще используется гомологичная рекомбинация. Однако, эффективность "гомологичной рекомбинации может быть на несколько порядков нижа эффективности сайт-специфической рекомбинации, опосредованной функционированием системы интеграции умеренных бактериофагов. По этой причине в последнее время для различных микроорганизмов i актиноми-цетов, ризоай, £. coli) были сконструированы интегративные алаз-мидные векторы, в которых используются модули сайт-специфической интеграции умеренных бактериофагов. Для Е. coll описаны плазмиднне системы длз сайт-специфической интеграции в хромосому, в которах используетсе иетегративный модуль фага х. Особенностью этих систем является использование пары цлазмид, одна из которых содержит ген Int, а другая, которая является собственно йнтегратившш вектором,- vit'tP-сайт. Однако, в некоторых случаях использование интегратившг системы, состоящей из двух плазмид, неспраЕдано. Поэтому нами Саяи сконструированы интегратиьнне плазмиднне векторы для E.coll на о сноб е кассеты, несущей ген int и attP-сайт фага х In els.

а

Для конструирования интегративной кассеты Hlndlll-Hlidli фраг-мэнт ДНК фага * размером 1,4 т.п.н., содержавший ДНК гена int и atíP-cайт ( 27479-28925 п.н.), был клонирован в палилинкерный участок плазмиды pTZiSR, расщепленной эндонуклеазами рестрикции Hindiп и Suai (рис. 2А). Фаговый ген int, таким образом, мог зкспрессиро-ваться с Р1ас- ДНК плазмэды pint расщепляли по сайту Hindin, обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы Е.coll и лигировали вместе с' обработанным таким же образом BamHi-фрагментом ДНК плазмиды pUC4K, содеркавшим ген устойчивости к кана1лицину aph. Полученным лигатом трансформировали компетентные клетки. Отобранные по признаку KmR колонии содержали плазмиду piNTK. ДНК плазмиды plNTK была расщеплена эвдонуклеазой рестрикции PvulI па два фрагмента, один из которых содержал последовательность .определявшего устойчивость к ампициллину гена Ыа и плазмидннй репликон pMBi, а другой - интегративную кассету, содержавшую гены aph и lnt, а такке сцепленный с последним xattP-сайт. Оба фрагмента были элнированы из агарозного геля и по 0,1 мкг ДНК каждого из фрагментов было использовано в реакциях мономолекулярного лигирования. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки штамма LE392 Е. coll. Клетки, в хромосому которых произошла интеграция нерэплицирутацейся ' интегративной кассеты, стбирались по признаку Kma , а трансформиро- -ванные лигированным фрагментом, содержавшим плазмидный репликон и ген Ыа - по признаку Арй. Такая схема эксперимента позволила оценить эффективность сайт-специфической интеграции кассеты в xattВ-сайт хромосомы относительно частоты . трансфорлации лигиро-занной в тех же условиях кольцевой ДНК, содержавшей плазмидный репликон. Полученный результат (85 KmR клонов и 1780 Ара клонов) показал, что эффективность интеграции составила примерно 57..

Результата гибридизация по Сауззрну хромосомной ДНК иптеграктов (1E392INTK) подтвердили', что интегративная кассета находилась в составе хромосомы.

Для контроля сайт-специфичности интеграции П.В. Смирновым была проведена траясдукция фагом Т4 фрагмента хромосомы, включавшего фрагмент плазмиды plNTK и сцепленные с ним гены galK и gaIT кз £aiK~galT~ птамма LE392INTK в gal" птамм SH.509. в результате

. о _

трансдукщш все Km хлонн приобрели признак'gal , следовательно ген aph был интегрирован в'xatts-сайт, тесно сцепленный на хромосоме Е. coll с ганами galK и sa17.

Для изучения стабильности наследования признака КпГ' глет га выра-

г

ар/г аш

Рис.г. Л.Конструирование интегративноП кассеты. Б.Конструирование вектора ршзэг и его интеграция в хромосому, в - ваш)И, е - Еспзбл, иг - шпсш, 1ИпЗ - 111псШ1, Р - Р-уиИ, Э - 5та1. 7 - ЕсоНУ.

щивали в течение 20 генераций в зшдкой среде lb, не содержавшей канамишша, высевали на чашки с агаризованной средой lb • без антибиотика, а затем пересевали на чашки с канамшшном. Из 836 клонов 831 (>99z) сохранил устойчивость к антибиотику, что показало высокую стабильность интегрированной ДНК.

Современная стратегия интеграции чужеродной ДНК в хромосому предполагает использование векторов, неспособных к репликации в клетке-хозяине. Как правило для реализации этой стратегии используются два подхода. В первом случае клонирование фрагмента чужеродной ДНК, предназначенной для интеграции, проводят в одном хозяине, а затем трансформирует полученной плазмидой клетки, в которых она не реплицируется. Такой подход, однако, имеет свои недостатки. Показано, что эффективность интеграции могла существенно падать при использовании разных хозяев. Причиной этого, как полагает, являлись различия в действии систем рестрикции-модификации данной пары бактерий-хозяев.

При другом подходе, позволяющем обойти эти трудности, клонирование 'и интеграция вектора проводятся в одном хозяине. Процедура подготовки ДНК к интеграции в этом' случае включает "физическое удаление плазмвдного решикона и последующее за этим мономолекулярное лигирование концов образовавшегося фрагмента ДНК. Интегра-тивный вектор таким образом состоит из двух функциональных частей: плазмидного репликона, который необходимо удалить перед интеграцией, и фрагмента ДНК, предназначенного для интеграции в хромосому. При конструировании интегративных векторов для Е. coll мы использовали оба подхода.

Для конструирования интегративного вектора pins32 интегративная кассета была клонирована в Ecliзбп-сайт плазмиды piJ702, реплицирующейся в Streptomyces (рис. 2Б). Клонирование проводилось в клетках S. llvldans ТК64 И.А. Сладковой. Для интеграции з хромосому Е. coll плазмидной ДНК piNS32, выделенной из S. llvldans, трансформировали компетентные клетки Е. coll XLi-biue. Интегрантов отбирали по признаку устойчивости к канамицину. Для контроля сайт-специфичности интеграции была проведена блот-габридизация по Саузерну хромосомной ДНК интегрантов. В качестве зонда использоваллась ДНК длазмдды piNS32. с помощью гибридизации в составе хромосомной ДНК интегрантов были идентифицированы три EcoRV-фрагмекта, гомологичные

последовательности plNS32, размером 1.6; 2.8 и 9.6 т.п.н. Сопоставление размеров фрагментов и рестршгционвой карай хромосомы £. coli в районе ^att-сайта подтвердило, что интеграция прошла в Natts-сайт.

7-1 _ Кркртруиров ание. вееторв_ЕВК1К^^2С£ра1щя_гекрв_1:^Е_и_азй

Для конструирования вектора pBRlK и интеграции с его помощью генов lysC и asd С. glutamlcum в хромосому Е. coll мы использовали подход, при котором необходимо удаление илазшщнсго репликона. Плазмидный вектор pERlK получили, субклонировав ннтегративную кассету в Pvull-сайт плазмиды pBR322 (рис. 3). ДНК полученной плазмиды pBRiK расщепили авдонуклеазой рестрикций chei и лигирова-ли с БсИЗбИ-фрагментом ппазкиды р92, содержав так ДНК генов lysC и asd С. g-lutamicuin. Для интеграции в хромосому ДНК полученной плазмиды pBRiKASD расцепляли эцгануклеазамд рестрикции £cli 3611 и Seal, элшровали не содержавший orí фрагмент, проводили мономолекулярное лигирование и трансформировали лигатом клетки E.coll xli-biue. Для контроля интеграции в хромосому реципиентных клеток из КшЕ-клонов выделяли хромосомную ДНК, расщепляли ее авдонуклеазой рестрикции Mlul и проводили блот-гибридизайию '"по Сгузерну, используя в качестве зондов ДНК плазмиды pBRiKASD. Результаты i-ибри-дизационного эксперимента подтвердили, что в хромосому решшиент-ных клеток произошла интеграция фрагмента ДНК плазмиды pBRiKASD, имевшего в своем составе гены 1уьС и asd С. glutamlcum.

Хрансдукция фагом 24GT7 фрагмента хромосомной ДНК штамма, полученного в результате интеграции фрагмента плазмиды pBRiKASD в asd" штамм SH309, показала, что при приобретении реципиентнымк клетками устойчивости к антибиотику, они также приобретали признак asd+. Это подтвердило, что экспрессия именно коринебактериального гена asd в составе хромосомы Е. coll определяла Dap" фенотип транедуктантов.

Интеграция в хромосому Е. coll коринебактериальных генов показала, что сконструированные нами иптегративние векторы могут быть использованы для сайт-спегмфичаской интеграции чужеродной ДНК в xattB сайт хромосомы Е. coll при конструировании штаммов с полезными признаками.

А

pIMTK pBR322 pBHIK [

P I

lacZ'

aph

att lnt

P I

Plac

or1 bla

tet

orí

bla

P I

T

tet

Б p92

Ec

aph att ínt plac orl He

bla

I

lacZ" asd

lysC

orl bla

E/Ec

I_

pBRIKASD £_

Ec/E I

Ec X

Sc I

asd lysC aph att lnt orl bla pbla Ec. Sc I T4DNA ligase

Ec/Sc

X

^mi

att В

7 £ZZ?

bio

I

/ 7 rw

Ж7 ¿ZJ

gal

attl- lnt p£Ja asd lysC aph attR bio

Рис. 3. А. Конструирование интегративного вектора pBRlK.

Б. Интеграция генов asd и lysC з xattfi-сайт Е. coll. Е - Ebel. Ее - ЕсПЗбИ. Р - PvuII. Sc - Seal.

I

«

вывода

1. Клогсфовалы гены lysC и asd С. glutanlcum.

2. Экспрессия гена lysc, клонированного на сирешшконном вектора, позволила увеличить активность аспартоюшазы в пленках с. frlutemicLin в шесть раз по сравнению с активностью фермента в Оесплазмидном штамме.

3. Методом олигонуклеотидналравленнсго мутагенеза получен мутачт-ный аллель гена lysC. кодирукхй аспартокингзу, пеувствктель-ную к ингибированию лизином и треонином-

4. Определена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего потенциальный интегральный белок с. glutualcim, сцепленного с геном lysc.

5. Сконструированы плазмиднне интегративные векторы plNS32 и pBRiK, позволяющие путем сайт-специфической рекомбинации встраивать чужеродную ДНК в xatîB-сайт хромосомы £. coll.

6. OparaieET ДНК, содержащий гены lysC и asd С. gvlutamlcuia, интегрирован в xattB-сайт хромосомы Е. coll.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. М.Ю.Передельчук, Н.О.БукаяоЕ, Ю.В.Смирнов, Ю.Г.Ростова, Н.Д. Федорова, А.Л.Окорокоз, М.М.Гусятинер, Н.К Янковский. Клонирование генов asd и lysC Corynebacterlum glutamlcum. Молекулярная генетика, микробиология и вкрусол'Ьгий', 1992, N5-6: 25-27."

2. Ю.Г.Ростова, М.Ю.Передельчук, А.Л.Окороков, М.М.Гусятинер, •В.Г.Дебабов. Конструирование челночного Еектора для коркнебак-терий и E.coli. Клонировакие и изучение экспрессии гена lys С. Биотехнология, 1993, N4: 11-14.

3. М.Ю.Передельчук, Н.Д.Федорова, Ю.В.Смирнов, В.Г.Дебабов. Интеграция генов lys с и asd Corynebacterlua çlutamlcum в att-сайт фага хромосомы Е. coll. Биотехнология, 1994, Ni: 12-15.