Влияние уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина клетками Escherichia coli.

Фомина, Светлана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина клетками Escherichia coli.
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина клетками Escherichia coli."

На правах рукописи

Фомина Светлана Александровна

Влияние уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина клетками Escherichia coli

03.00.15-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Лаборатории №1 Закрытого Акционерного Общества «Научно-исследовательского Института Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»),

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук

М.Г. Лунц

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Кандидат биологических наук

Р.С. Шакулов Л.В. Неумывакин

Ведущая организация:

МГУ имени М.В. Ломоносова, кафедра генетики

Защита диссертации состоится «31» мая 2005 года в 14-00 часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат разослан «_> апреля 2005 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

L-Пролин (C5H9NO2)- это неполярная иминокислота, которая наряду с L-аминокислотами является структурным компонентом клеточных белков. Благодаря уникальности своего ковалентно замкнутого пятичленного кольца расположение проляна в составе белка обеспечивает возможность реализации конформаций, нетипичных при нахождении в этих участках других аминокислот. Так, пролин не может располагаться в а-спиралях, а также, хотя иногда и встречается в составе концевых остатков ß-структурных сегментов белка, тем не менее, не способен к стабилизации этой структуры водородными связями. С другой стороны, именно специфическими структурными особенностями пролина обусловлена возможность формирования таких макромолекулярных структур, как, например, тройная спираль коллагена. В этом белке высших эукариот доля пролина и продукта его посттрансляционной модификации гидроксипролина составляет более 30% ото всех аминокислотных остатков.

Помимо своей роли структурного компонента белков, пролин является также и универсальным осмо- и криопротектором в клетке.

В настоящее время L-пролин широко используется в медицине в составе аминокислотных смесей для парентерального питания и как основа для создания нейролептических препаратов, а также в пищевой промышленности в качестве антиоксиданта и ароматизатора. Пролин также является коммерчески привлекательным для фармакологии и косметологии. С развитием биотехнологии и генной инженерии растений путь биосинтеза пролина быстро стал объектом повышенного практического интереса, поскольку коммерческая ценность сорта определяется, в том числе, и его устойчивостью к засухе и засоленности почвы, а на эти факторы, по-видимому, можно влиять изменением эффективности образования организмом пролина.

Таким образом, получение промышленных штаммов-продуцентов L-пролина на основе хорошо изученного бактериального штамма E.coli К12, а также создание набора генетических конструкций, содержащих как нативные, так и мутантные гены биосинтеза L-пролина, является актуальным и экономически обоснованным.

Цель и задачи исследования.

Основной целью настоящей работы являлось изучение влияния уровня экспрессии генов как собственно пути биосинтеза L-пролина, так и генов путей центрального метаболизма на продукцию L-пролина клетками E.coli. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- повысить уровень биосинтеза L-пролина за счет введения мутаций по

генам биосинтеза, приводящим к снятию ретроингибирования

соответствующих ферментов пролином, и амплификации мутантных

4М<РК

РОС. HV!«0H4>i!. ¡ля b»U '"::)'F.KA C.üü-ipikjic

генов, а также блокирования известных потенциальных путей деградации L-пролина;

- создать стабильные генетические конструкции, несущие гены ферментов пути биосинтеза L-пролина;

- подобрать оптимальный уровень синтеза предшественников L-пролина за счет изменения экспрессии соответствующих генов центрального метаболизма;

- минимизировать накопление побочных продуктов биосинтеза L-пролина.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В настоящей работе была получена и идентифицирована мутация в гене ргоВ*, приводящая к высокому уровню десенсибилизации его продукта - у-глутамилкиназы, pro] 17 (Ala—* Val), и обеспечивающая осмоустойчивость мутантных клеток. Мутация является новой для E.coli и приводит к сверхсинтезу L-пролина.

Показано, что наличие двух рамок считывания с неизвестными функциями - Ь0245 и yaßV - повышает стабильность плазмиды, содержащей ргоВ*А оперон, при этом компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка, кодируемого Ь0245, показал его схожесть с частью аминокислотной последовательности продукта гена parА, используемого в коммерческих векторах для повышения их стабильности.

Найдено оптимальное соотношение уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе структурных предшественников пролина: gdhA,ppc, sucAB.

Помимо традиционной амплификации генов для этой цели была успешно применена методика изменения уровня экспрессии генов sucAB путем модификации их промотора непосредственно в бактериальной хромосоме.

Получен бесплазмидный штамм-продуцент ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты), которая в определенных условиях ферментации является побочным продуктом, образующимся при биосинтезе L-пролина.

Апробация работы.

Диссертационная работа была апробирована на Смотре-конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» в июне 2004 года и на семинаре секции Ученого совета «Генетика микроорганизмов» ФГУП ГосНИИГенетика в марте 2005 года. Материалы диссертационной работы докладывались на VII-ой Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003), а также были представлены на 1-ом Международном Конгрессе "Биотехнология" (Москва, 2002).

Структура работы.

Диссертация изложена на 112 страницах печатного текста, включая 12 рисунков и 15 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы (145 наименований).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Усиление биосинтеза L-пролина в штамме E.coli К12 за счет снятия ретроингибирования ферментов его синтеза, амплификации содержащих необходимые мутации генов этих ферментов, а также блокирования известных путей деградации L-пролина.

1.1. Путь биосинтеза и катаболизма L-пролина у E.coli.

Путь биосинтеза пролина относительно прост, универсален и хорошо изучен. У E.coli, как и у большинства бактерий, пролин образуется из глутаминовой кислоты в результате четырех последовательных реакций, катализируемых ферментами: у-глутамилкиназой (ГК; продукт генаргоВ; ЕС

2.7.2.11), у-глутам илфосфатреду ктазой (ГФР; продукт генаргоА; ЕС 1.2.1.41) и пирролин-5-карбоксилатредуктазой (П5КР; продукт генаргоС; ЕС 1.5.1.2). Оставшаяся, третья по счету реакция структурной перестройки глутамат-5-полуальдегида в Д'-пирролин-б-карбоксилат, протекает самопроизвольно. Путь биосинтеза пролина представлен на Рисунке 1. Ключевой фермент биосинтеза пролина - у-глутамилкиназа (ГК) ингибируется L-пролином по типу обратной связи. Эксперименты с очищенным ферментом показали, что, помимо ретроингибирования пролином, активность ГК в меньшей степени регулируется глутаминовой кислотой и АДФ, таким образом осуществляя тонкую настройку синтеза пролина по отношению к субстрату и к доступной энергии (Smith, C.J. et al., 1984).

Гены ргоВ и ргоА составляют оперон, в то время как ген ргоС расположен на хромосоме отдельно и достаточно далеко — 5,596 - в центисомах -ргоВА и 8,796 - ргоС, соответственно. Аналогичным образом, продукты генов ргоВ и ргоА составляют мультиферментный комплекс у-глутамилкиназа-ГФ-редуктаза = [(РгоВ)6][(РгоА)4], а ген ргоС кодирует независимый фермент пирролин-5-карбоксилатредуктазу [ProC]i0.

Бактерия Esherichia coli способна использовать пролин как единственный источник углерода и азота в клетке. Для утилизации пролина требуется экспрессия двух генов. Ген putP кодирует пролиновую пермеазу. Ген pulA кодирует бифункциональный фермент с активностями пролиндегидрогеназы (ЕС 1.5.99.8) и дегидрогеназы пирролин-5-карбоксиловой кислоты (ЕС

1.5.1.12), катализирующий окисление пролина до глутамата. Кроме того, белок PutA является транскрипционным репрессором, регулирующим экспрессию put оперона в зависимости от концентрации пролина в клетке.

Очевидно, что для увеличения уровня накопления пролина бактериальными клетками первостепенной задачей является блокирование его деградации, повышение эффективности его биосинтеза за счет снятия ретроингибирования пролином соответствующих ферментов и амплификация их генов, а также увеличения скорости синтеза как структурных предшественников пролина, так и энергетических доноров соответствующих биосинтетических реакций.

~0ÜC

H MK,

,•300"

proB

Itcin Iii

ATP ЛИ>

"ooc

н НЯ)

Ъ-г-лувшалл -фосфат

S ^ WADPH + H*

ШШдГ

proA N-kadp' + p,

'cocr

СПОНТЛИКО

(8) -1-ПИИЮИИИ-5-мфбокемяат

-tiadph + h*

|FT 13 1 2\ ^

рГОС I^NMJP*

'cocr

Sv--4'

L-проли*

H HH,

,CHO

Рис.1. Путь биосинтеза L-пролина в ExolL

1.2. Селекция и свойства аналогорезистеятных мутантов штамма E.coli К12 - продуцентов пролина.

Одним из классических приемов конструирования бактериальных штаммов-продуцентов аминокислот является многоэтапная селекция с использованием структурных аналогов соответствующей аминокислоты. Как правило, отбираемые варианты несут мутации, снимающие негативную регуляцию биосинтеза целевой аминокислоты. В нашем случае можно было ожидать селекцию мутантов по генам биосинтеза, белковые продукты которых (а именно РгоВ) утратили способность к ретроингибированию конечным продуктом - пролином. В этих экспериментах были использованы следующие аналоги: 3,4-дегидропролин (DP), азетидин-2 карбоксиловую кислота (АС) и тиапролин (TP), являющиеся также и ингибиторами роста для E.coli. Эффективность воздействия этих соединений на клетку обусловлена их способностью конкурировать с пролином. Возникшие на среде с аналогами колонии клеток, устойчивых к действию структурных аналогов пролина, содержат мутации, приводящие к сверхсинтезу пролина.

В качестве родительского штамма для отбора, в конечном счете, мутантов, устойчивых к аналогам пролина, был взят штамм 55ilvA", производный от E.coli Kl2 продуцент глутаминовой кислоты (Glu) (8 г/л в

пробирочной ферментации). Использование исходного штамма, обладающего способностью к эффективному биосинтезу Glu, для конструирования на последующих этапах продуцента пролина, объяснялось тем, что, как видно из Рис. 1, Glu является прямым метаболическим предшественником Pro. На основе этого штамма первоначально селекционным путем был отобран вариант, неспособный усваивать пролин как единственный источник углерода. Для этого обработанную мутагеном (нитрозогуанидином) суспензию клеток исходного штамма высевали на минимальную среду с индикатором -трифенилтетразолий хлоридом (TTC) и L-пролином (Wood J.M., 1981). Неокрашенные колонии не катаболизировали пролин. Среди полученных таким образом мутантов по утилизации пролина был выбран штамм 1-22, не утративший способности к продукции Glu, уровень накопления которой для нового варианта, также как и для родительского штамма, составил 8 г/л в условиях пробирочной ферментации. Можно было ожидать, что отсутствие способности к росту бактериальных клеток на среде, содержащей Pro в качестве единственного источника углерода, у данного штамма связано с инактивацией гена (генов), ответственных за катаболизм Pro, т.е. первая из поставленных задач была выполнена.

Именно штамм 1-22 и был использован в дальнейшем для нескольких этапов селекции вариантов, устойчивых к структурным аналогам пролина. Отбор новых штаммов проводили на минимальной среде с добавлением аналогов в концентрации от 0,1 г/л - на первом этапе селекции, до 1,5 г/л - на последующих. Отметим, что некоторые из отобранных в этих условиях штаммы были устойчивы к концентрациям до 3 г/л. При проведении экспериментов по селекции мы модифицировали традиционную схему, добавляя в состав минимальной среды с аналогом, также и увеличенное (400мМ) количество NaCl, принимая во внимание тот факт, что пролин является еще и осмопротектором. Отобранные таким образом варианты, устойчивые к аналогам пролина, были исследованы в дальнейшем на способность к накоплению пролина в среде культивирования. Действительно, около 20% аналогорезистентных мутантов являлись одновременно и продуцентами пролина. Уровень накопления Pro лучшим из проверенных вариантов, штаммом 240-18, составил 8 г/л в стандартной пробирочной ферментации, при сохранении этим штаммом также способности к накоплению относительно больших количеств (6,5 г/л) Glu. Данные по продукции аминокислот указанными штаммами приведены в Таблице I.

Таблица 1. Продуктивность родительского ппамма и его производных,

Штамм Глутамат, г/л Пролин, г/л

55ilvA' (ile) 8 0

1-22 (ile") 8 0

240-18 (ile) 6,5 8

В дальнейшем, действительно, было показано, что по крайней мере одна из мутаций в отобранном таким образом штамме 240-18 обусловлена

модификацией гена proB, приводящей к значительному снижению способности его белкового продукта к ретроингибированию пролином.

1.3. Получение ауксотрофных Рго--мутантов E.coli К12 методом пенициллинового обогащения.

Для последующего молекулярного клонирования, исследования структуры и амплификации генов биосинтеза пролина из полученных аналогорезистентных штаммов, способных к сверхсинтезу Pro, представлялось необходимым иметь мутантные штаммы E.coli К12, у которых инактивированы гены биосинтеза пролина. Для отбора такого рода мутантов, мы применили классический метод пенициллинового обогащения, разработанный Девисом, Ледербергом и Циндером в 1948 году. В отобранных на минимальной среде (без пролина), мутантах Pro- первоначально был определен уровень ферментативной активности продуктов трех известных генов биосинтеза пролина. Как видно из Таблицы 2, в экстрактах двух из полученных мутантов уровень активности двух ферментов биосинтеза пролина (РгоВ - для штамма К12ргоВ- и РгоС - для штамма К12ргоС~) были ниже предела точности определения, что позволяло предполагать инактивацию именно этих генов в соответствующих штаммах.

Таблица 2. Значения активностей ферментов пути биосинтеза пролина в полученных штаммах-ауксотрофах Pro'.

Штамм РгоВ (глутамалкииаза); нм/мин/мг РгоА (глутамилфосфатреду ктаза); нм/мин/мг РгоС (пирролин-5-карбоксилатредуктаза); нм/мин/мг

Е coli К12 13 н.д. 350

Е coli К 12ргоВ~ 0 н.д. 310

E.coli К12ргоСГ 14 1,9 0

Окончательно природа данных мутаций была подтверждена в результате комплементации пролиновой ауксотрофности в этих штаммах после введения в них имевшихся в нашем распоряжении рекомбинантных плазмид, содержащих в своем составе либо оперонргоВА из хромосомы E.coli К12 дикого типа, либо ген ргоС из того же штамма.

1.4. Клонирование оперона ргоВА штамма-продуцента пролина E.coli 240-18 в составе мини-Mu.

Для выделения и первичного изучения генов биосинтеза пролина из описанного в разделе 1.2 штамма 240-18 был использован метод клонирования in vivo, основанный на способности фага-транпозона Mu к репликативной транспозиции и интеграции практически в любую точку генома E.coli.

Именно этот подход был нами использован для клонирования генов биосинтеза пролина из штамма 240-18. Для этого вектор Mu d5005 вводился в клетки 240-18, репликативная транспозиция обеспечивалась повышением до 42°С температуры культивирования, после чего выделялся препарат

плазмидной ДНК, которым была проведена трансформация полученного нами мутантного штамма E.coli К12ргоВ , содержащего дополнительно плазмиду-помощник с геном фагового репрессора. Целевые трансформанты были отобраны по способности к росту на минимальной среде, не содержавшей пролина. Отметим при этом, что часть из отобранных таким образом Рго+-вариантов не только не нуждалась сама в добавлении пролина для эффективного роста на минимальной среде, но и обладала способностью «подкармливать» пролином окружающие их Pro ""-клетки, то есть являлась продуцентами Pro. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид, выделенных из этих трансформантов, показал, что все они содержали фрагменты ДНК, ожидаемые для известного участка хромосомы E.coli К12 с опероном ргоВА.

Кроме того, проведенные измерения ферментативной активности продукта гена ргоВ - у-глутамилкиназы (ГК) в экстрактах полученных штаммов показали, что чувствительность этого фермента к ингибированию пролином значительно снижена по сравнению с ферментом дикого типа (Рисунок 2). Как видно из Рисунка 2, концентрации L-пролина, вызывающие 50% ингибирование активности мутантного РгоВ и фермента дикого типа отличаются более чем в 600 раз.

Эти результаты явились, во-первых, прямым подтверждением нашего предположения, что мутация устойчивости к аналогам пролина в штамме 24018 действительно приводит к изменению в гене ргоВ, следствием которого является нарушение способности к ретроингибированию пролином у его белкового продукта - РгоВ . А во-вторых, что одно только наличие мутантного гена ргоВ* уже само по себе может приводить к повышенному синтезу пролина клетками E.coli дикого типа.

Рис. 2. Кривая иягибироваиия пролином активности природной (РгоВ) и мутантной (РгоВ ) глутамилкиназ.

Кривая ингибировання активности природной н мутантной ГК L-пролином

1.5. Минимизация фрагмента хромосомы штамма 240-18, содержащего ргоВ*А оперон.

Выделенный в описанных в предыдущем разделе экспериментах фрагмент хромосомы штамма 240-18 сргоВ*А-опероном имел длину ~12 тысяч пар нуклеодидов (т.п.н.) и для удобства последующей работы был переклонирован в состав различных плазмидных векторов, как предназначенных для локализации клонированного фрагмента ДНК в составе рекомбинантной плазмиды в клетке, так и интегративных, задачей которых является обеспечить интеграцию целевого фрагмента в бактериальный геном.

Также для удобства последующей работы с плазмидами были предприняты попытки уменьшения размера клонированного фрагмента. Однако оказалось, что клонированиергоВ*А-оперона в виде Ряй-Рвй-фрагмента длиной около 3 т.п.н. приводило к нестабильности получаемых рекомбинантных плазмид на основе хорошо известного вектора рВЮ22. Как видно из данных, представленных в Таблице 3, лишь менее 30% клеток исходно плазмидного штамма Е.соН К12ргоВ~[рВК322ргоВ*А(Рз11-Рз11)] сохраняли рекомбинантную плазмиду после культивирования в жидкой неселективной среде (ЬВ-бульон без добавления антибиотика) в течение ночи. Интересно отметить, что существенно более стабильную плазмиду удалось создать при сохранении в ее составе фрагмента с ргоВ*А опероном и еще двумя открытых рамками считывания с неизвестными функциями их потенциальных белковых продуктов - Ъ0245 и уа/1¥ (см. Таблицу 3). При этом сохранение лишь одной из этих неизвестных рамок считывания - Ь0245 уже значительно стабилизировало рекомбинантную плазмиду с мутантным пролиновым опероном, однако наличие также и второго неизвестного гена давало максимальный эффект.

Таблица 3. Оценка стабильности полученных рекомбинантных плазмид с мутантным пролиновым опероном.

Плазмиды Доля клеток, сохранивших рекомбинантную плазмиду после культивирования в жидкой неселективной среде в течение ночи

рВЯ322ргоВ*А (Pstl-PstI) 28±5 %

pBR322proB*A, Ь0245, yafW 92±3 %

pBR322proB*A, Ь0245 86±2 %

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей гипотетического белка, который может кодироваться геном Ъ0245, и его гомологов выявило схожесть указанной группы белков с белком РагА из Corynebacterium glutamicum. Известно, что кодирующий его ген par А широко применяется для повышения стабильности различных плазмид, по-видимому, за счет участия его белкового продукта в процессе распределения плазмид между дочерними клетками в процессе деления (Bignell С., Thomas С.М., 2001).

Именно фрагмент, названный 1-4ES, содержащийргоВ*А оперон и открытые рамки считывания Ь0245 viyaJWm хромосомы штамма 240-18,

использовался в наших дальнейших экспериментах по конструированию всех типов рекомбинантных плазмид.

1.6. Конструирование плазмид, содержащих гены биосинтеза пролина.

• Для исследования влияния дозы генов биосинтеза пролина на накопление

Pro штаммами-продуцентами было осуществлено конструирование серии рекомбинантных плазмид, содержащих ргоб*/4-онерон, ген ргоС либо комбинацию ргоВ*А+ргоС, на основе векторов различной копийности.

В качестве донораргоВ*А-оперона использовался описанный в п. 1.5. фрагмент 1-4ES, а ген pro С был получен в результате амплификации с помощью полимеразной цепной реакции, используя в качестве матрицы хромосомальную ДНК клеток E.coli К12. После амплификации фрагмент ДНК с геном ргоС был клонирован в малокопийный вектор pMWl 19, и его биологическая активность в составе плазмиды была подтверждена по появлению прототрофности плазмидного штамма, созданного на основе E.coli К12ргоС~в качестве реципиента.

В качестве векторов различной копийности использовали:

> pMWl 19 - имеющую репликон pSClOl (6-8 копий на хромосомный эквивалент);

> pBR322 и pAYCTERl - (16-20 копий на хромосомный эквивалент);

> pUC19 - (более 50 копий на хромосомный эквивалент).

Созданные на основе этих векторов рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагмент 1-4ES с/?го2?*/1-опероном, были обозначены pMWl-4ES, pBRl-4ES, pAYCTERl*, pUC2, соответственно. Физико-генетические карты некоторых из этих плазмид приведены на Рисунке 3.

Созданная на основе pMWl 19 рекомбинантная плазмида с геном ргоС была обозначена — pMWproC. Добавление этого гена в состав плазмиды pMWl -4ES, уже содержавшейргоВ*А-оперон, привело к созданию новой рекомбинантной ДНК, которая была обозначена - pMWBACN.

Для дальнейшей Mu-зависимой интеграции генов биосинтеза пролина в состав бактериальной хромосомы на основе разработанных в Институте интегративных векторов стандартными генно-инженерными методами были созданы также рекомбинантные плазмиды с фрагментом 1-4ES (ргоВ*А, Ь0245 и yafW), которые были обозначены как pMDpro и pMIVpro.

Рис. 3. Примеры полученных рекомбинантных плазмид.

1.7. Идентификация мутации в генергоВ*.

Для определения локализации полученной мутации в гене ргоВ*, была определена нуклеотидная последовательность фрагментов хромосомы штаммов 240-18,1-22 и 55ilvA (свойства этих бактериальных штаммов приведены в Таблице 1), содержащих структурную часть этого цистрона, а также по 100 нуклеотидов с 5' и 3'-концов от соответствующей открытой рамки считывания.

Сравнительный анализ определенных нуклеотидных последовательностей показал, что если в геноме штаммов 55ilvA и 1-22 структура гена ргоВ соответствует известной из литературы для гена E.coli MG1655, то в ргоВ* штамма 240-18 в положении 349 последовательности этого гена произошла замена А G, что привело к соответствующей замене Alain Valn7в первичной структуре РгоВ*. Отметим, что А1ац7 входит в состав консервативного участка (R-LNAR) глутамилкиназ различных микроорганизмов, что показано на Рисунке 4.

Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей РгоВ из различных микроорганизмов (программа Multalin version 5.4.1).

117

E.coli 79

Sh flexne.ni 79

Yr Dseudotuberculosig 79 Hm.influen2ae 78

Ab.pleuropneumonias 76 Ps.aeruginosa 83

Mb.flagellatus 83

Chb.violaceim 83

Gb.metallireducers 84 De.radiodurans 75

Consensus

Высокое значение консенсуса >90% - черный фон Среднее значение консенсуса 50-90% - с^рмй фон Низкое значение консенсуса <50% - белый фон

Как уже было сказано, РгоВ является первым ферментом терминального пути биосинтеза пролина, подверженным ретроингибированию пролином. Мутации, нарушающие способность фермента к ретроингибированию, приводят обычно к повышению продукции клетками Pro, а также, в ряде

случаев и к повышению осморезистентности бактерий. К моменту выполнения нашей работы для E.coli было описано 3 таких мутации в генергоВ:

1. Leués Gly65 - в результате замены А Т в положении 194 последовательности гена, что приводило, как к сверхсинтезу пролина, так и к повышению осмоустойчивости (Неумывакин, Л.В. и др., 1990);

2. Aspio7 Asnt07 - мутация, известная какproBIA, возникшая в результате замены G А в положении 319 последовательности гена, и которая проявляется в способности мутантного штамма к сверхсинтезу пролина, и в повышенной осмоустойчивости (Csonka L.N. et ai, 1988);

3. G1u,43 А1а]4з - мутация, известная как DHPR, возникшая при замене А

С в положении 427 нуклеотидной последовательности гена, которая приводит к повышению уровня синтеза пролина, но не повышает осморезистентность (Rushlow, К.Е. et al., 1984). Таким образом, обнаруженная нами мутация в геноме штамма 240-18, которую мы обозначили как proBl 17, являлась новой ргоВ* мутацией для Escherichia coli. Локализация всех описанных выше мутаций ргоВ* схематически изображена на Рисунке 5, а осморезистентность соответствующих мутантных штаммов и изменения способности ферментов к ретроингибированию суммированы в Таблице 4.

Рис. 5 Локализация известных и полученной в нашей работе мутаций ргоВ* E.coli К12.

Gp Ap(Q) Ajto

Leu Asp Ala Glu

------Ц-4-4-—-----

165 |l07 |117 [143 367

CjVG |JAT|VTT G^G

CTG AAT GTT GCG

proB osm proB74 РГОВ117 DHPR

Таблица 4. Свойства мутаций proB* E.coli K12.

Мутация Осморезистентность мутантного штамма Отношение концентраций L-пролина, вызывающих 50% ингибнрование ГК ГК мугантная/П^поиоодная Kcoli

ргоВот (лит. данные) + 200

ргиВ1А (лит. данные) + 300

ОНРк (лит. данные) - 100

ргоВт (данная работа) + 600

Из Таблицы 4 видно, что полученная нами мутацияргоВ\ 17 приводит к максимальной, по сравнению с другими известными мутациями, устойчивости РгоВ* к ретроингибированию пролином, а также, как и две другие известные мутации, повышает осморезистентность клеток.

Для того чтобы подтвердить, что возрастание осморезистентности бактериальных клеток, действительно связано только с мутацией в гене ргоВ, мутантный ргоВ*А-оперон в составе созданной нами рекомбинантной плазмиды, был введен в клетки как дикого типа (штамм В7), так и штамма 55ПуА, который являлся исходным при селекции варианта 240-18. Полученные таким образом плазмидные штаммы были проверены на осмочувствительность на минимальной среде с добавлением различных концентраций №С1 (Таблица 5). Как видно из Таблицы 5, введение плазмиды с содержащим мутацию ргоВ\17 опероном ргоВ*А значительно повышает осмоустойчивость соответствующих клеток-трансформантов, по сравнению с клетками штаммов-реципиентов.

Таблица 5. Влияние введения плазмиды с ргоВ*А опероном на подавление роста бактериальных клеток в минимальной среде с различными концентрациями №аС1.

Штамм Рост OD 540, о.е. Остаточный рост (%) в присутствии NaCI

0.4 M NaCl 0.5М NaCl 0.6M NaCl

В7(дикий тип) 27,0 26 13 7

55ilvA" 25,0 9 4 3

В7 ÎpMWl-4ES] 26,8 90 69 44

5 5 il v А ÏPMW1-4ES1 25,8 61 26 5

1.8. Амплификация генов пути биосинтеза пролина в клетках штамма E.coli 240-18.

С целью увеличения числа копий мутантногоргоВ*А-оперона в геноме штамма 240-18 была проведена Mu-зависимая интеграция фрагмента 1-4ES в бактериальную хромосому. Для этого была использована стандартная интегративная система, разработанная в нашем Институте под руководством проф. В.З. Ахвердяна (Зименков и др., 2004), а в качестве интегративной рекомбинантной плазмиды - созданная нами pMDpro (см. раздел 1.6), несущая интегрируемый фрагмент 1-4ES, фланкированный участками Mu-attL/R.

Полученный в ходе проведенной интеграции новый штамм, обозначенный как 12В А20, имел в своем составе уже две копии мутантного ргоВ*А-оперона, что привело, как к примерно 2-кратному возрастанию активности глутамилкиназы (ГК) в экстрактах соответствующих клеток, так и к увеличению (до 13 г/л) накопления пролина в среде культивирования бактерий при проведении стандартной ферментации в пробирках (см. Таблицу 6). Отметим также, что если в результате ферментации штамма 240-18 кроме Pro в среде накаливалось значительное количество Glu, то при культивировании

нового штамма 12ВА20 увеличение количества Pro в среде сопровождалось снижением концентрации образующегося Glu до следовых количеств.

Дальнейшее увеличение числа копий ргоВ*А-оперона путем введения в клетки 12ВА20 малокопийной рекомбинантной плазмиды pMWl-4ES еще более увеличило активность ГК в экстрактах плазмидного штамма, а также увеличило до 30 г/л концентрацию синтезируемого в процессе ферментации Pro (см. Таблицу 6). При этом отметим, что одновременное увеличения числа копий иргоВ*А-оперона, и генаргоС, обеспеченное введением в 12ВА20 плазмиды pMWproBACN, практически никак не сказалось на продуктивности нового штамма по сравнению с 12В А20 [pMWl-4ES].

Еще большего уровня ферментативной активности РгоВ* удалось добиться в результате трансформации клеток 12ВА20 многокопийной плазмидой pBR322 [1-4ES], однако уровень накопления пролина при этом не повысился (см. Таблицу 6).

Таблица 6. Влияние уровня активности ГК на продукцию L-пролина.

Штамм Удельная активность ГК, (нм/мян/мг) Пролин, г/л

12В А20 14±2 13±1

12ВА20 [pMWl-4ES] 56±2 30±1

12ВА20 [pMWproBACN] 58±2 31±1

12ВА20 [pBR3221-4ES] 102±3 28±1

Тем самым можно полагать, что при уровнях активности РгоВ*АС, обеспеченных в клетках 12ВА20 [pMWproBACN], работа этих ферментов уже не является узким местом в процессе биосинтеза пролина. С другой стороны, в специальных экспериментах, проведенных в мини-ферментерах, было показано, что дальнейшее увеличение эффективности биосинтеза пролина этим плазмидным штаммом-продуцентом может быть достигнуто при добавлении в среду культивирования бактерий непосредственного метаболического предшественника пролина - глутаминовой кислоты.

2. Оптимизация уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе предшественников пролина.

2.1. Клонирование и интеграция в хромосому штамма 12ВА20 дополнительных копий гена gdhA.

У E.coli существует два альтернативных пути фиксации аммония с образованием глутамата. Это путь с использованием глутаматдегидрогеназы (ГДГ) (продукт rem gdhA), но, поскольку фермент обладает невысоким сродством к (NH4>+, этот путь неэффективен в условиях недостатка аммония в среде. Второй путь, так называемый путь GOGAT - глутаминсинтетаза плюс глутаматсинтаза (gltBD и glnA) - предпочтителен, когда в клетке возникает избыток энергии, и дефицит азота в среде. Поскольку первый путь экономичнее на 10-20% с точки зрения расходования внутриклеточных источников энергии (Helling, R.B. 1994), а недостаток азота в среде в условиях промышленных

ферментаций не представляет серьезной проблемы, то изучение влияния амплификации гена gdhA на биосинтез пролина является практически обоснованным.

На основе вектора pMWl 19 нами были сконструированы рекомбинантные плазмиды - рМWgdhA с геном gdhA с собственным промотором, а также pMWl-4ESgdhA, содержащую ген gdhA и фрагмент 1-4ES с мутантным оперономргоВ*А. Трансформация клеток штамма 12ВА20 указанными плазмидами приводила к резкому падению продукции пролина и заметному ухудшению скорости роста полученных штаммов. По аналогии с полученными ранее результатами о значительном возрастании активности ферментов при расположении соответствующих генов на плазмидах с pMW-репликоном (см. раздел 1.8 и Таблицу 6), можно предположить, что использование таких плазмид в случае гена gdhA не является оптимальным и более эффективным может оказаться меньшее возрастание активности GdhA, которое достигается путем интеграции дополнительной копии целевого цистрона в бактериальную хромосому.

Для этих целей была сконструирована интегративная плазмида pMTVgdh и проведена Mu-зависимая интеграция гена gdhA в хромосому штамма 12ВА20. Для независимо полученных штаммов-интегрантов были определены ферментативная активность GdhA в клеточных экстрактах и накопление пролина в процессе стандартной ферментации. Как видно из данных, представленных в Таблице 7, действительно, активность GdhA в различных штаммах была повышена по сравнению исходным уровнем в 2 - 9 раз. При этом максимальное накопление Pro в процессе ферментации было зарегистрировано для одного из штаммов, имевшего промежуточное значение уровня активности GdhA.

Таблица 7. Результаты интеграции гена gdhA в хромосому штамма 12ВА20.

Интегранты Удельная Пролин, г/л OD540,

активность ГДГ, Пробирочная о.е.

(нм/мин/мг) ферментация

12BA20gdh2 318 10 9,0

12BA20gdh6 586 14 6,4

12BA20gdh7 1366 следы 6,0

12ВА20 145 13 13,3

Путем трансформации полученного штамма интегранта 12BA20gdh6 рекомбинантной гогазмидой pMWl-4ES был получен новый штамм 12BA20gdh6 [pMWl-4ES], ферментация которого в мини-ферментерах показала, что он способен на 16% более эффективно синтезировать Pro при росте на среде с глюкозой в качестве источника углерода, чем изогенный ему штамм 12В А20 [pMWl-4ES], не имеющей дополнительной копии гена gdhA в составе хромосомы.

2.2. Анализ потоков распределения углерода в штаммах с амплифи-цированными генами ргоВ*А и gdhA с помощью ЯМР спектроскопии.

Можно предположить, что функционирование белковых продуктов амплифицированных генов привело к существенному перераспределению потока углерода в центральном метаболизме штаммов-продуцентов пролина. Для проверки этого предположения в нашей работе был использован так называемый METAFoR (METabolic Analysis Flux Ratio), основанный на исследовании спектров ЯМР гидролизатов клеточных белков бактерий, выращенных на среде, содержащей определенную долю (ТАс'^-меченой глюкозы в качестве источника углерода. В настоящее время существуют алгоритмы, позволяющие на основе данных ЯМР-спектров о расположении тяжелых изотопов углерода в определенных позициях аминокислот, установить долю молекул интермедиатов центрального метаболизма, синтезированных в альтернативных цепочках метаболических реакций. Тем самым можно судить об относительной эффективности протекания этих альтернативных реакций метаболизма глюкозы в данном организме при данных условиях его культивирования.

Этот метод был применен нами для исследования штаммов как дикого типа (W3110), так и полученных на его основе плазмидного продуцента пролина - 12ВА20 [pMWl-4ES], содержащего амплифицированный ргоВ*Аоперон, а также изогенный ему плазмидный штамм, в котором дополнительно амплифицирован теш gdhA - 12ВА20 [pMWl-4ESgdhA], и который в результате этого значительно снизил уровень синтеза пролина и имел существенно ухудшенные ростовые характеристики (см. раздел 2.1.). Непосредственное получение ЯМР-спектров проводилось сотрудниками лаборатории проф. A.C. Арсеньева (ИБХ им. Акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Некоторые из полученных в этих экспериментах результатов представлены в Таблице 8.

Таблица 8. Доля молекул некоторых интермедиатов аминокислотного синтеза, образованных в альтернативных ветвях центрального метаболизма различных штаммов Е.соИ.

Название кластера реакций Эффективность образования интермедиата в указанной цепи метаболических реакций для разных штаммов, %

W3110 12ВА20 [pMWl-4ES] 12ВА20 [pMWl -4ESgdhА]

PEP из гликолиза 81 74 72

ОАА из PEP 43 80 100

ОАА из ТСА 57 20 0

Как видно из Таблицы 8, во всех проанализированных штаммах процесс гликолиза является основным путем утилизации Glc-6P в клетке, однако некоторое усиление альтернативного ему пентозо-фосфатного пути наблюдается в плазмидных штаммах (снижение доли PEP из гликолиза). Это наблюдение хорошо согласуется и с наиболее значимыми изменениями в распределении потоков углерода, проявляющихся в этих штаммах в том, что

существенно изменился характер образования оксалацетата (ОАА). В плазмидных штаммах (80-100)% всех молекул ОАА образуется непосредственно из интермедиата гликолиза - PEP, в то время как поток углерода в цикле трикарбоновых кислот (по-видимому, на этапе от а-кетоглутарата до оксалоацетата) оказывается существенно уменьшен в штамме-продуценте пролина из за значительного оттока а-кетоглутарат в глутамат и далее в пролин, а в штамме с дополнительно увеличенной активностью GdhA цикл ТСА оказывается практически разорванным. По-видимому, именно разрыв цикла ТСА, возникший при этом дефицит сукцинил СоА и образующейся энергии и привел к описанным выше значительным ухудшениям ростовых характеристик и продуктивности штамма 12ВА20 [pMWl-4EsgdhA].

Как описано в разделе 2.1, нам удалось увеличить продуктивность Pro в штамме 12BA20gdh6 [pMWl-4ES], в котором по сравнению с 12ВА20 [pMWl-4ES], уровень активности GdhA значительно повышен, однако существенно в меньшей степени, чем в 12ВА20 [pMWl-4ESgdhA]. Этот факт позволил предположить, что эффективность поток углерода в ТСА в новом штамме имеет промежуточное значение между 0 и 20%, существенно более оптимальное для продуктивности, но в то же время достаточное для сохранения высоких ростовых характеристик соответствующей бактериальной культуры.

Можно было попытаться на фоне увеличенной активности GdhA в штамме 12BA20gdh6 [pMWl-4ES] попытаться еще больше оптимизировать распределение а-кетоглутарата между его использованием в качестве предшественника Glu (и далее в Pro), и его превращением в сукцинил СоА в реакциях ТСА. Для этих целей предполагалось оптимизировать уровень экспрессии генов sucAB путем изменения эффективности их промотора.

2.3. Оптимизация уровня экспрессии генов sucAB путем замены их нативного промотора в составе бактериальной хромосомы.

В E.coli а-кетоглутарат, превращаемый а-кетоглутаратдегидрогеназой в сукционил-СоА в цикле Кребса, является в то же время и предшественником Glu. Для того, чтобы компенсировать выявленный недостаток потока углерода через цикл Кребса в штаммах с амплифицированными генами ргоВ*А и gdhA, была проведена замена природного промотора генов sucAB в штамме 12BA20gdh6 на Р,ос —подобные промоторы различной «силы» из библиотеки, полученной путем рандомизации области «-35» сильного Р(ас. промотора и сконструированной в лаборатории проф. Машко C.B. (Каташкина и др., 2005).

а-Кетоглутаратдегидрогеназа представляет собой мультиферментный комплекс, состоящий из неспецифического компонента ЕЗ, липоамидцегидрогеназы, кодируемой геном IpdA (этот компонент используется также и пируватдегидрогеназой) и специфического компонента Е1о и Е2о, кодируемого двумя структурными генами sucAB, которые в E.coli входят в состав оперона sdhCDAB-sucABCD. Транскрипция генов этого оперона осуществляется как с главного промотора - Р1£д, так и с нескольких внутренних промоторов, один из которых Рыса расположен в межцистронной области между генами sdhB и sucA. Предположительно, за счет функционирования РпсЛ

транскрипция генов висАВ может дополнительно регулироваться, независимо от проксимальных генов оперона. На Рисунке 6 изображена схема замены природного промотора РмЫ на кассету, содержащую искусственный гибридный промотор Р1ас'.

Рис. 6. Схема замены природного промотора Ршсл на искусственный гибридный промотор Р/Я£.

яаЬС яисАВ

»dhB Cm"

gam

«-зг "-Ю" Г+i sucA ИИ ШЗ Bg» О,«

Р(ЯС* sucAB

cccti

laattaatcatcggctcjitataa ;gtgtgg|attgtgagcg|

Промоторы Puc-sucAB отличаются от промотора Puc "-35" областью (рандомизированные нуклеотиды выделены

Для замены на в хромосоме природного промотора Psuc/) были выбраны три промотора из полученной коллекции, отличающиеся по силе не менее, чем на порядок: высокоэффективный промотор Р(ос, имеющий каноническую для промоторов E.coli структуру областей «-35» и «-10», а также два «ослабленных» промотора Р,цС.2 и Psuc-2i- Эксперименты по замене промоторов в составе бактериальной хромосомы проводились на основе Red-зависимой системы рекомбинации бактериофага X по методу (Datsenko, Wanner,2000) с модификациями, разработанными в нашем Институте (Каташкина и др, 2005).

Данные активностей а-кетоглутаратдегидрогеназы в полученных после замены промотора PsucA штаммах на основе 12BA20gdh6 приведены на Рисунке 7.

Рис. 7. Удельная активность а-кетоглутаратдегидрогеназы в экстрактах клеток штаммов 12ВА20ё(1Ьб с различными промоторами.

Активность а-кетоглутаратдегидрогеназы в штамме 12BA20gdh6 с различными промоторами

Tac 2 21 природный

промоторы

Из Рисунка 7 видно, что в результате введения промотора ?шс, уровень активности а-кетоглутаратдегидрогеназы возрос более, чем в три раза, по сравнению с природным промотором Psuc В то же время замена природного Р, промотора на Psuc.2 и Psuc-2i привела к снижению уровня активности SucAB (до 1,8 раза в случае PSUc-2i)-

В штамм 2BA20gdh6 и в его производные с модифицированным PSUCÂ промотором была произведена трансформация плазмиды, содержащей гены пути биосинтеза пролина pAYCTERl*. Результаты ферментаций с использованием полученных штаммов приведены в Таблице 8.

Таблица 8. Изменение уровней накопления пролина и глутамата при замене природного РтсЛ промотора на Рtaa Pjuc-2 и Psuc-2i в штамме 2BA20gdh6 [pAYCTERl*].

Штамм Активность a-кетоглутарат дегидрогеназы нм/мин/мг Pro, г/л Glu, г/л Конверсия (Glu+Pro),% к контрольном штамму

12В A20gdh6Psuc-tac [pAYCTERl*] 301 21.1 0 91

12BA20gdh6P,uc.2 [pAYCTERl*] 74,7 14.0 20.5 118

12BA20gdh6Psuc.2i [pAYCTERl*] 57 12.5 25.2 125

12BA20gdh6 [pAYCTERl *] (контроль) 92 18.0 8.1 100

Как видно из Таблицы 8, штамм 12BA20g£&6Psuc.tac[pAYCTERl*] с повышенной активностью SucAB - утратил способность к накоплению Glu, при этом уровень накопления Pro повысился. При понижении активности SucAB

возрастает уровень накопления Glu (до 3 раз при введении самого слабого Psuc. 21), но выход Pro падает пропорционально уменьшению активности SucAB.

Как и ожидалось, самая высокая конверсия глюкозы в Glu + Pro зарегистрирована для штамма с самым низким уровнем активности SucAB.

Нам представляется, что использованная методика изменения уровня экспрессии генов, продукты которых влияют на перераспределение потока предшественников в участках разветвления клеточного метаболизма может быть чрезвычайно перспективна, поскольку не приводит к нежелательным ауксотрофностям (как в случае полной инактивации sucAB генов) и не требует введения дополнительных рекомбинантных плазмид в клетки штамма-продуцента.

2.4. Клонирование и интеграция в хромосому штамма 12ВА20 гена ррс. Определение оптимальной активности

фосфоенолпируваткарбоксилазы в клетке для биосинтеза пролина.

Было изучено влияние амплификации и некоторых других генов центрального метаболизма на биосинтез пролина. Максимальное влияние на продукцию L-пролина оказала амплификация гена ррс, кодирующего фосфоенолпируват (PEP) карбоксилазу, регуляторный фермент, который усиливает тем самым метаболический поток через цикл Кребса и непосредственно участвует в пути биосинтеза пролина. Была сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая ген ррс под собственным промотором совместно с опероном proB*A - pMWl-4ESppclO, а также использованы интегративные плазмиды, полученные из лаборатории проф. Ахвердяна В.З. (рМррс с геном ррс под собственным промотором и рМгррс с геном ррс под промотором Рг) для интеграции гена ррс в геном наших штаммов-продуцентов пролина. Данные по измеренному уровню активности PEP карбоксилазы в полученных интегрантах и трансформантах приведены в Таблице 9.

Таблица 9. Активность PEP карбоксилазы в штаммах на основе 12ВА20, полученных при интеграции гена ррс в хромосому, или введения плазмиды с геном ррс.

Интегранты Удельная активность PEP карбоксилазы, нм/мин/мг Промотор

3-83 2140 Рг

3-35 1290 Рг

3-45 962 Рг

3-37 572 Рг

2-4 513 Рррс

12В А20 (контроль) 116 р

Трансформант 220 р ррс

12ВА20 [pMWpro-BAppclOl

Из Таблицы 9 видно, что активность РЕР карбоксилазы в полученных интегрантах повышена в 4-10 раз по сравнению с контролем и в 2 раза в трансформанте плазмидой р^П^ргоВАррсЮ.

Несколько штаммов-интегрантов были трансформированы плазмидой, содержащей мутантный ргоВ*А оперон рМШ-4Е8. Результаты ферментации полученных трансформантов приведены в Таблице 10.

Таблица 10. Влияние амплификации гена ррс на продукцию L-пролина.

Штамм Конверсия глюкозы в про-лин, % по отношению к контрольном штамму

2-26 [pMWl-4ES] 107

3-35 [pMWl-4ES] 109

3-83 [pMWl-4ES] 110

12ВА20 [pMWl-4ESppclO] 119

12BA20 [pMWl-4ES] (контроль) 100

Как видно из Таблицы 10, увеличение активности Ррс во всех проверенных вариантах дало положительный эффект на процесс накопления Pro в среде культивирования. Однако максимально эффективным оказалось лишь минимальное (2-кратное) увеличение активности этого фермента, обеспеченное введением соответствующего гена с собственным промотором в составе малокопийной рекомбинантной плазмиды.

При совместной амплификации гена gdhA за счет интеграции в хромосому и гена ррс при его расположении на плазмиде конверсия глюкозы в Pro у штамма 12BA20gdh6 [pMWl-4ESppclO] возросла на 35% по сравнению с контрольным штаммом 12ВА20 [pMWl-4ES] (100%) при добавлении в ферментационную среду Glu.

2.5. Роль глутаматдеркарбоксилазы в пути биосинтеза L-пролина.

В ряде ферментаций при анализе состава культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии, рядом с пятном пролина наблюдалось дополнительное пятно другого цвета. Было показано, что это вещество является у-аминомасляной кислотой (ГАМК). ГАМК считается одним из основных веществ-нейромедиаторов у млекопитающих, широко используется в фармацевтике. В Escherichia coli ГАМК синтезируется из глутаминовой кислоты, эта реакция катализируется глутаматдекарбоксилазой, кодируемой двумя генами-gadA и gadB. Изучение зависимости продукции ГАМК от концентрации изолейцина в ферментационной среде, показало, что с увеличением концентрации lie продукция ГАМК возрастает. Интересно, что в штамме - продуценте пролина 12ВА20 с увеличением концентрации Не

продукция Pro стремительно падает, то же самое происходит и с продукцией Glu в родительском штамме 1-22 - продуценте глутаминовой кислоты. Соответствующие данные пробирочной ферментации представлены в Таблице 11.

Таблица 11. Зависимость продукции Pro, Glu и ГАМК от концентрации Пе в среде культивирования штаммов-продуцентов Pro (12ВА20) и Glu (1-22).

Штамм Изолейцин, 50 мкг/мл Изолейцин 200 мкг/мл

OD54 0 Pro, г/л Glu, г/л ГАМК, г/л OD54Û Pro, г/л Glu, г/л ГАМК, г/л

12В А20 16.9 12.7 следы 0 25.6 <2 0 7.8

1-22 20.0 0 8 0 25.2 0 2 6,5

Поскольку глутаматдекарбоксилаза конкурирует с глутаматкиназой -первым ферментом пути биосинтеза пролина за субстрат (Glu), то, согласно ожиданиям, делеция генов gadA и gadB привела к незначительному повышению выхода Pro у штамма 12ВА20 (см. Таблицу 12).

Таблица 12. Влияние делении генов gadA и gadB на продукцию ГАМК и Pro.

Штамм Изолейцин, 50 мкг/мл Изолейцин, 200 мкг/мл

OD540 Pro, г/л ГАМК, г/л OD540 Pro, г/л ГАМК, г/л

12ВА20 16,9 12,7 0 25,6 <2 7,8

12ВА20 AgadA3 17,2 13,3 0 25,2 <2 0

Как видно из Таблицы 12, делеция генов gadA и gadB в хромосоме штамма 12ВА20 не только привела к исчезновению ГАМК, потенциально нежелательного побочного продукта при культивировании продуцента Pro, но и несколько повысила уровень накопления самого Pro новым штаммом продуцентом.

В то же время было показано, что с помощью изменения концентрации Пе в среде культивирования некоторых из созданных нами бесплазмидных штаммов может быть обеспечено накопление значительных количеств (более 8 г/л в стандартной пробирочной ферментации) ГАМК. В свою очередь, это может представлять определенный практический интерес для организации микробиологического производства этого соединения для фармацевтической и медицинской промышленности.

выводы.

1. Селекцией штаммов на устойчивость к аналогам Pro была получена и в дальнейшем идентифицирована новая мутация в ргоВ - ргоВ*, кодирующем первый фермент специфического пути биосинтеза Pro Эта мутация, proBl 17, обусловлена заменой А1ац7 —»-Valii7 в консервативном районе у-глутамилкиназ, сохраняет удельная активность фермента и повышает более чем в 600 раз уровень его устойчивости к ретроингибированию пролином. Показано, что наличие мутантного гена ргоВ* приводит к сверхсинтезу Pro и обеспечивает осморезистентностъ содержащих его клеток.

2. Обнаружено, что нестабильность рекомбинантных плазмид, содержащих короткий (3 т.п.н.) фрагмент хромосомы Е coli с мутантным ргоВ*А-опероном, может быть устранена введением в их состав более длинного (4,5 т.п.н.) фрагмента, имеющего также две рамки считывания с неизвестными функциями - Ь0245 и yaßV. Выявлен высокий уровень гомологии гипотетического белка, кодируемого Ь0245, с белком РагА из Corynebacterium glutamicum, участие которого в процессе распределения плазмид между дочерними клетками при деления известно из литературы.

3 METAFoR анализ ЯМР спектров [С13]-атомов углерода в определенных позициях аминокислот гидролизата белков показал, что в клетках продуцентов Pro наряду с некоторым увеличением потока углерода в пентозо-фосфатном пути метаболизма по сравнению с клетками дикого типа, наиболее явным метаболическим изменением является значительное снижение доли молекул оксалацетата (ОАА), образующихся в реакциях цикла трикарбоновых кислот. При этом если доля таких молекул ОАА уменьшается с 20% - для одного из продуцентов Pro, до 0% - за счет излишнего увеличения активности GdhA, то это приводит как к уменьшению накопления клетками Pro, так и к ухудшению ростовых характеристик бактериальной культуры.

4. Проведена оптимизация уровня экспрессии генов proB*A, gdhA, ррс, sucAB, кодирующих ферменты биосинтеза как непосредственных структурных предшественников Т.-пролина, так и необходимых для этого молекул-макроэргов. Такая оптимизация обеспечила создание штамма Е coli - высокоэффективного продуцент пролина, имеющего практическое значение для микробиологической промышленности.

5. Для оптимизации использовали амплификацию целевых генов в составе рекомбинантных плазмид различной копийности, Mu-зависимую интеграцию дополнительных копий генов в бактериальный геном, а также, впервые при создании практически важных продуцентов аминокислот, применили замену нативных регуляторных областей на промоторы различной силы непосредственно в месте локализации соответствующих генов в хромосоме.

6 Показана возможность использования некоторых из созданных в работе бактериальных штаммов в качестве продуцентов гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), которая накапливается в больших количествах при культивировании этих бактерий в средах, содержащих Не. Полученные штаммы и разработанные условия сверхсинтеза ГАМК могут иметь практический интерес для микробиологического производства ГАМК и последующего использования этого соединения в фармацевтической и медицинской промышленности.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Новикова А.Е., Анисимова О.С., Турчин К.Ф., Фомина С А., Лунц М.Г., Дег-терев Е.В. 2005. "Идентификация и анализ у-аминомасляной кислоты в куль-туральных жидкостях штаммов-продуцентов". Химико-Фармацевтический журнал, Том 39, № 4, стр .79-83.

2. Фомина С.А., Киверо А.Д., Беневоленский М.С. Влияние амплификации генов ргоВА и (proBA, gdhA) на распределение потока углерода в центральном метаболизме клеток Е. coli К12. 7-ая Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века" 14 -18 апреля 2003 года. Секция "Молекулярная биология" Сборник тезисов. Пущино, 2003. с. 195.

3. Фомина С.А., Киверо А.Д., Беневоленский М.С. Эффект амплификации генов pro В, proA gdhA на перераспределение потоков углерода в центральном метаболизме клеток Е. coli.

1-й Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». 14-18 октября 2002, Москва. Секция 3. Биотехнология и промышленность. Сборник тезисов. Стр. 188-189.

4. Лунц М.Г., Фомина С.В., Леонова Т.В., Гусятинер М.М Бактерия, обладающая способностью к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-арганина, и способ получения L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина. Патент РФ № 2207371, выдан 27 июня 2003. Дата приоритета -26.09.2000.

US20020058315А1, JP2002136286A2, ЕР1172433А1, CN1346885A, BR0104270А

5. Фомина С.В., Новикова А.Е., Лунц М.Г., Гусятинер М.М. Способ получения гамма-аминомасляной кислоты. Патент РФ № 2241036, выдан 27.11.2004 г. Дата приоритета - 25.06.2002.

6. Фомина С. А., Ворошилова Э.Б., Скороходова А.Ю., Лунц М.Г. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, содержащей неактивный ген gadB. Патентная заявка РФ № 2003105268, дата публикации 27.10.2004. Дата приоритета - 26.02.2003.

7. Каташкина Ж.И., Лунц М.Г., Дорошенко В.Г., Фомина С.А., Скороходова А.Ю., Ивановская Л.В., Машко С.В. Способ получения L-аминокислот с использованием бактерий с оптимизированным уровнем генной экспрессии. Патентная заявка РФ № 2003106551. Дата публикации 27.09.2004. Дата приоритета -12.03.2003.

Принято к исполнению 25/04/2005 Исполнено 26/04/2005

Заказ № 788 Тираж: 90 экз..

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2005-4 45256

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фомина, Светлана Александровна

ВВЕДЕНИЕ

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Путь биосинтеза L-пролина

1.1. у-Глутамилкиназа

1.2. у-Глутамилфосфатредуктаза

1.3. Пирролин-5-карбоксилатредуктаза

1.4. Обходной путь образования Ь-глутамат-5-полуальдегида в клетках Е. 11 coli

1.5. Организация генов пути биосинтеза пролина

1.6. Пары токсин-антитоксин

1.7. Регуляция пути биосинтеза пролина

2. Транспорт и деградация пролина

2.1. Транспорт пролина и осморезистентность

2.2. Деградация пролина

3. Продуценты пролина

4. Предшественники пролина

4.1. Глутаминовая кислота - структурный предшественник пролина

4.1.1. Глутаматдегидрогеназа

4.1.2. Глутаматдекарбоксилазы

4.2. а-Кетоглутаратдегидрогеназа.

4.3. Фосфопируваткарбоксилаза 29 Часть II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды и среды

1.1. Получение мутантов

1.2. Получение мутантов, резистентных к структурным аналогам 35 пролина.

2. Методы и ферменты, использованные при работе с ДНК

2.1. Трансформация, трансдукция, клонирование in vivo

3. Ферментации

3.1. Определение концентрации аминокислот в культуральной жидкости

4. Определение активностей ферментов

4.1. Приготовление экстрактов клеток для определения активности 37 1>* ферментов

4.2. Определение активности у-глутамилкиназы (ГК)

4.3. Определение активности у-глутамилфосфатредуктазы (ГФР)

4.4. Определение активности Д'-пирролин-б-карбоксилатредуктазы

4.5. Определение активности фосфопируваткарбоксилазы (ФПК)

4.6. Определение активности а-кетоглутаратдегидрогеназы

4.7. Определение активности глутаматдегидрогеназы (ГДГ)

5. Использованные программы компьютерного анализа. 41 Часть III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Усиление биосинтеза L-пролина в штамме Е. coli К12 за счет снятия 42 ретроингибирования ферментов этого пути, амплификации содержащих необходимые мутации генов пути биосинтеза пролина, а также блокирования известных путей деградации L-пролина.

1.1. Селекция и свойства полученных аналогорезистентных мутантов 42 штамма E.coli К12 - продуцентов пролина.

1.2. Получение ауксотрофных мутантов Е. coli К12 по L-пролину 45 пенициллиновым методом обогащения.

4 1.3. Клонирование in vivo фрагментов хромосомы Е. coli, комплементирующих пролиновую ауксоторофность.

1.4. Минимизация фрагмента хромосомы штамма 240-18, содержащего 49 ргоВ*А оперон.

1.5. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей 50 белков, кодируемых генами Ь0245 nyafW.

1.6. Конструирование плазмид, содержащих гены биосинтеза пролина.

1.7. Идентификация мутации в генергоВ*.

1.8. Результаты амплификации генов пути биосинтеза пролина в клетках 60 штамма Е. coli 240-18.

2. Оптимизация уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты, 62 участвующие в синтезе предшественников пролина.

2.1. Клонирование и интеграция в хромосому штамма 12ВА20 62 дополнительных копий гена gdhA.

2.2. Анализ потоков распределения углерода штаммах с 65 амплифицированными генами ргоВ*А и gdhA с помощью ЯМР спектроскопии.

2.3. Оптимизация уровня экспрессии генов sucAB путем замены их 68 нативного промотора в составе бактериальной хромосомы.

2.4. Клонирование и интеграция в хромосому штамма 12ВА20 генаррс. 76 * Определение оптимальной активности фосфоенолпируваткарбоксилазы в клетке для биосинтеза пролина.

2.5. Роль глутаматдеркарбоксилазы в пути биосинтеза L-пролина. 78 ВЫВОДЫ 87 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина клетками Escherichia coli."

L-Пролин (C5H9N02)-3to неполярная аминокислота, наряду с другими аминокислотами является строительным материалом клеточных белков. Несмотря на то, что пролин является заменимой аминокислотой, он выполняет в клетке несколько различных функций: является источником углерода и азота, выполняет структурную функцию в белках, благодаря уникальному пятичленному кольцу обеспечивает поворот в белковой а-спирали или располагается на краю (3-слоя. Известно, например, что в коллагене более трети аминокислотных остатков приходится на пролин и гидроксипролин, эти аминокислоты также стабилизируют тройную спираль коллагена по отношению к действию протеаз. Благодаря своей структурной функции L-пролин является коммерчески привлекательным для фармакологии и косметологии, а также для производства пищевых добавок.

Другой важной функцией пролина является его роль универсального осмопротектора в клетке, поэтому, с развитием биотехнологии, путь биосинтеза пролина быстро стал объектом генетических экспериментов, особенно в растениях, где коммерческая ценность сорта определяется в том числе его устойчивостью к засухе и засоленности почвы.

Недавно были опубликованы данные о практическом использовании еще одной функции пролина в клетке. В статье Морита [Morita Y. et al., 2002] приведены данные о том, что пролин является не менее эффективным криопротектором, чем глицерин и трегалоза в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и внутриклеточное накопление пролина приводит к значительному повышению процента выживаемости клеток дрожжей после замораживания до -20°С, что имеет большое значение, в частности для производства полуфабрикатов из теста.

L-пролин широко используется в медицине в составе аминокислотных смесей для парентерального питания и как основа для создания нейролептических препаратов, а также в пищевой промышленности в качестве антиоксиданта и ароматизатора.

Путь биосинтеза пролина в разных группах живых организмов имеет лишь незначительные отличия. Таким образом, изучение влияния уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина в хорошо изученном штамме E.coli К12, а также создание спектра генетических конструкций, содержащих гены биосинтеза L-пролина, в том числе мутированные с повышением активности кодируемых ими ферментов, является актуальным и экономически обоснованным.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- повысить уровень биосинтеза L-пролина за счет введения мутаций по генам биосинтеза, приводящим к снятию ретроингибирования соответствующих ферментов пролином, и амплификации мутантных генов, а также блокирования известных потенциальных путей деградации L-пролина;

- создать стабильные генетические конструкции, несущие гены ферментов пути биосинтеза L-пролина;

- минимизировать накопление побочных продуктов биосинтеза L-пролина.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Путь биосинтеза пролина.

В живых организмах синтез L-пролина осуществляется несколькими путями - у бактерий и у растительных клеток в условиях осмотического стресса основным предшественником пролина является глутамат, в животных и некоторых растительных клетках пролин синтезируется из орнитина.

Поскольку пролин является первичным метаболитом, то путь его биосинтеза относительно прост, универсален и хорошо изучен. У Escherichia coli, как и у большинства бактерий, L-пролин образуется из L-глутамата в результате четырех последовательных реакций, катализируемых ферментами: у-глутамилкиназой (ПС; продукт генаргоВ; ЕС 2.7.2.11), у-глутамилфосфатредуктазой (ГФР; продукт гена pro А; ЕС 1.2.1.41) и пирролин-5-карбоксилатредуктазой (П5КР; продукт генаргоС\ ЕС 1.5.1.2). Оставшаяся, третья по счету реакция структурной перестройки глутамат-5-полу альдегид а в Д'-пирролин-З-карбоксилат, протекает самопроизвольно. Ключевой фермент биосинтеза пролина - у-глутамилкиназа ингибируется L-пролином по принципу обратной связи. Эксперименты с очищенным ферментом показали, что, помимо ингибирования пролином, активность ГК в меньшей степени регулируется глутаматом и АДФ, таким образом осуществляя тонкую настройку синтеза пролина по отношению к субстрату и к доступной энергии [Smith, C.J. et ah, 1984]. Путь биосинтеза L-пролина в клетках Escherichia coli представлен на Рисунке 1.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Фомина, Светлана Александровна

выводы.

1. Селекцией штаммов на устойчивость к аналогам Pro была получена и в дальнейшем идентифицирована новая мутация в ргоВ - ргоВ*, кодирующем первый фермент специфического пути биосинтеза Pro. Эта новая для Е. coli мутация, ргоВ117, обусловлена заменой А1ац7—»Уа1ц7 в консервативном районе у-глутамилкиназ, сохраняет удельная активность фермента и повышает более чем в 600 раз уровень его устойчивости к ретроингибированию пролином. Показано, что наличие мутантного гена ргоВ* приводит к сверхсинтезу Pro и обеспечивает осморезистентность содержащих его клеток.

2. Обнаружено, что нестабильность рекомбинантных плазмид, содержащих короткий (3 т.п.н.) фрагмент хромосомы E.coli с мутантным ргоВ *Л-опероном, может быть устранена введением в их состав более длинного (4,5 т.п.н.) фрагмента, имеющего также две рамки считывания с неизвестными функциями - Ь0245 и yaJW. Выявлен высокий уровень гомологии гипотетического белка, кодируемого Ь0245, с белком РагА из Corynebacterium glutamicum, участие которого в процессе распределения плазмид между дочерними клетками при деления известно из литературы.

3. METAFoR анализ ЯМР спектров [С13]-атомов углерода в определенных позициях аминокислот гидролизата белков показал, что в клетках продуцентов Pro наряду с некоторым увеличением потока углерода в пентозо-фосфатном пути метаболизма по сравнению с клетками дикого типа, наиболее явным метаболическим изменением является значительное снижение доли молекул оксалацетата (ОАА), образующихся в реакциях цикла трикарбоновых кислот. При этом если доля таких молекул ОАА уменьшается с 20% - для одного из продуцентов Pro, до 0% - за счет излишнего увеличения активности GdhA, то это приводит как к уменьшению накопления клетками Pro, так и к ухудшению ростовых характеристик бактериальной культуры.

4. Проведена оптимизация уровня экспрессии генов proB*A, gdhA, ррс, sucAB, кодирующих ферменты биосинтеза как непосредственных структурных предшественников L-пролина, так и необходимых для этого молекул-макроэргов. Такая оптимизация обеспечила создание штамма E.coli - высокоэффективного продуцента пролина, имеющего практическое значение для микробиологической промышленности.

5. Для оптимизации использовали амплификацию целевых генов в составе рекомбинантных плазмид различной копийности, Ми-зависимую интеграцию дополнительных копий генов в бактериальный геном, а также, впервые при создании практически важных продуцентов аминокислот, применили замену нативных регуляторных областей на промоторы различной силы непосредственно в месте локализации соответствующих генов в хромосоме.

6. Показана возможность использования некоторых из созданных в работе бактериальных штаммов в качестве продуцентов гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), которая накапливается в больших количествах при культивировании этих бактерий в средах, содержащих Не. Полученные штаммы и разработанные условия сверхсинтеза ГАМК могут иметь практический интерес для микробиологического производства ГАМК и последующего использования этого соединения в фармацевтической и медицинской промышленности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фомина, Светлана Александровна, Москва

1. Неумывакин JI.B., Кобец Н.С., Пирузян Э.С. 1990. Получение спонтанного мутанта Escherichia coli, способного к сверхсинтезу пролина и устойчивого к повышенной концентрации NaCl. Генетика, т.26, №8, стр. 1370-1379.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М. Мир, 480с.

3. Миллер Дж. 1976, Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, стр.136,

4. Abelson Р.Н. and Vogel H.J. 1955. Amino acid biosynthesis in Torulopsis utilis and Neurospora crassa. J. Biol. Chem., 213, 355-364.

5. Adams, E., and L. Frank. 1980. Metabolism of proline and the hydroxyprolines. Annu. Rev. Biochem.49:1005-1061.

6. Ahmad, F., K. Downey, J. Schultz, R.W. Voellmy (eds.) 1984. "Advances in gene technology: Molecular genetics of plants and animals"; Academic Press: NY, NY, pp 273-294.

7. Aizenman, E., Engelberg-Kulka, H., and G. Glaser, 1996. An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by guanosine 3',5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:60596063.

8. Allen, S. W., A. Senti-Willis, and S. R. Maloy. 1993. DNA sequence of the putA gene from Salmonella typhimurium: a bifiinctional membrane-associated dehydrogenase that binds DNA. Nucleic Acids Res. 21:1676.

9. Ankri S, Serebrijski I, Reyes O, Leblon G. 1996. Mutations in the Corynebacterium glutamicum proline biosynthetic pathway: a natural bypass of th proA step. J Bacteriol. Aug;178(15):4412-9.

10. Archibold, E. R., and L. S. Williams. 1972. Regulation of synthesis of methionyl-, prolyl- and threonyl-transfer ribonucleic acid synthetases of Escherichia coli. J. Bacteriol. 109:1020-1026.

11. Bachmann, B. J. 1990. Linkage map of Escherichia coli K-12, edition 8. Microbiol. Rev. 54:130-197.

12. Baich, A. 1969. Proline synthesis in Escherichia coli. A proline-inhibitable glutamic acid kinase. Biochim. Biophys. Acta 192:462-467.

13. Baich, A., and D. J. Pierson. 1965. Control of proline synthesis in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 104:397^04.

14. Becerril, В., F. Valle, E. Merino, L. Riba, and F. Bolivar. 1985. Repetitive extragenic palindromic (REP) sequences in the Escherichia coli gdhA gene. Gene 37:53-62.

15. Berg, С. M., and J. J. Rossi. 1974. Proline excretion and indirect suppression in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 118:928-939.

16. Bignell C., Thomas C.M., 2001. The bacterial ParA-ParB partitioning proteins. J Biotechnol. Sep 13;91(1): 1-34.

17. Bloom, F., C. J. Smith, J. Jessee, B. Veilleux, and A. H. Deutch. 1983. The use of genetically engineered strains of Escherichia coli for the overproduction of free amino acids: proline as a model system, p.383-394. In K. Downey, R. W. Voellmy, F.

18. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7;72:248-54.

19. Brady, R. A., and L. N. Csonka. 1988. Transcriptional regulation of the proC gene of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 170:2379-2382.

20. Brenchley, J. E., C. A. Baker, and L. G. Patil. 1975. Regulation of the ammonia assimilatory enzymes in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 124:182189.

21. Brown, E. D., and J. M. Wood. 1992. Redesigned purification yields a fully functional putA protein dimer from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 267:1308613092.

22. Buck D., Spencer M.E., Guest J.R. 1986. Cloning and expression of the succinyl-CoA synthetase genes of Escherichia coli К12. J Gen Microbiol. Jun; 132(6): 1753-62.

23. Busiello, V., M. Di Girolamo, С. Cini, and C. De Marco. 1980. b-Selenaproline as competitive inhibitor of proline activation. Biochim. Biophys. Acta 606:347-352.

24. Camarena L., Poggio S., Garcia N., Osorio A. 1998. Transcriptional repression of gdhA in Escherichia coli is mediated by the Nac protein. FEMS Microbiol Lett. Oct l;167(l):51-6.

25. Cairney, J., I. R. Booth, and C. F. Higgins. 1985. Salmonella typhimurium proP gene encodes a transport system for the osmoprotectant betaine. J. Bacterid. 164:1218-1223.

26. Cairney, J., I. R. Booth, and C. F. Higgins. 1985. Osmoregulation of gene expression in Salmonella typhimurium: proU encodes an osmotically induced betaine transport system. J. Bacteriol. 164:1224-1232.

27. Chao YP, Liao JC. 1993. Alteration of growth yield by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. Dec;59(12):4261-5.

28. Chen, С. C., and Т. H. Wilson. 1986. Solubilization and functional reconstitution of the proline transport system of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 261:2599-2604.

29. Chou C.F., Chen C.W. 1992. argJmutations are highly inducible by ethidium bromide in proB strains of Streptomyces lividans: implication of pathway interactions. Biochem Biophys Res Commun. Dec 15;189(2):1101-9.

30. Christensen S.K., Mikkelsen M., Pedersen K., Gerdes K. 2001. RelE, a global inhibitor of translation, is activated during nutritional stress. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec 4;98(25): 14328-33. Epub 2001 Nov 20.

31. Christian, J. H. B. 1955. The influence of nutrition on the water relations of Salmonella oranienburg. Austr. J. Biol. Sci. 8:75-82.

32. Clarke, L., and J. Carbon. 1976. A colony bank containing synthetic ColEl hybrid plasmids representative of the entire E. coli genome. Cell 9:91-99.

33. Condamine, H. 1971. Sur la regulation de la production de proline chez E. coli K12. Ann. Inst. Pasteur 120:126-143.

34. Coulton, J. W., and M. Kapoor. 1973. Studies on the kinetics and regulation of glutamate dehydrogenase of Salmonella typhimurium. Can. J. Microbiol. 19:427438.

35. Csonka, L. N. 1981. Proline over-production results in enhanced osmotolerance in Salmonella typhimurium. Mol. Gen. Genet. 182:82-86.

36. Csonka, L. N. 1982. A third L-proline permease in Salmonella typhimurium which functions in media of elevated osmotic strength. J. Bacteriol. 151:14331443.

37. Csonka, L. N. 1989. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress. Microbiol Rev. Mar;53(l):121-47.

38. Csonka, L. N., and A. Baich. 1983. Proline biosynthesis, p. 35-41. In К. M. Herrmann and R. L. Somerville (ed.), Amino Acids: Biosynthesis and Regulation. Addison-Wesley, Reading, Mass.

39. Csonka L.N., Ikeda T.P., Fletcher S.A., Kustu S. 1994. The accumulation of glutamate is necessary for optimal growth of Salmonella typhimurium in media of high osmolality but not induction of the proU operon. J Bacteriol. Oct; 176(20):6324-33.

40. Csonka, L. N., and A. D. Hanson. 1991. Prokaryotic osmoregulation: genetics and physiology. Annu. Rev. Microbiol. 45:569-606.

41. Cunningham L, Guest JR. 1998. Transcription and transcript processing in the sdhCDAB-sucABCD operon of Escherichia coli. Microbiology. Aug; 144 (Pt 8):2113-23.

42. Dandekar, A.M., and Uratsu S.L. 1988. A single base pair change in proline biosynthesis genes causes osmotic stress tolerance. J. Bacteriol. 170:5943-5945.

43. Datta A.R., Ostroff R., MacQuillan A.M. 1987. Genetic and physical characterization of proBA genes of the marine bacterium Vibrio parahaemolyticus. Appl Environ Microbiol. Dec;53(12):2733-8.

44. De Biase D., Tramonti A., Bossa F., Visca P.1999.The response to stationary-phase stress conditions in Escherichia coli: role and regulation of the glutamic acid decarboxylase system. Mol Microbiol. Jun;32(6):l 198-211.

45. Deutch, A. H., К. E. Rushlow, and C. J. Smith. 1984. Analysis of the Escherichia coli proBA locus by DNA and protein sequencing. Nucleic Acids Res. 12:6337-6355.

46. Deutch, A. H., C. J. Smith, К. E. Rushlow, and P. J. Kretschmer. 1982. Escherichia coli Al-pyrroline-5-carboxylate reductase: gene sequence, protein overproduction and purification. Nucleic Acids Res. 10:7701-7714.

47. Dunlap, V. J., and L. N. Csonka. 1985. Osmotic regulation of L-proline transport in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 163:296-304.

48. Eckhardt, Т., and T. Leisinger. 1975. Isolation and characterization of mutants with a feedback resistant N-acetylglutamate synthase in Escherichia coli К12. Mol. Gen. Genet. 138:225-232.

49. Engelberg-Kulka, H., and G. Glaser, 1999. Addiction modules and programmed cell death and antideah in bacterial cultures. Annu. Rev. Microbiol. 53:43-70.

50. Ekena, K., and S. Maloy. 1990. Regulation of proline utilization in Salmonella typhimurium: how do cells avoid a futile cycle? Mol. Gen. Genet. 220:492-494.

51. Fujita T, Maggio A, Garcia-Rios M, Stauffacher C, Bressan RA, Csonka LN. 2003. Identification of regions of the tomato gamma-glutamyl kinase that are involved in allosteric regulation by proline. J Biol Chem. Apr 18;278(16): 1420310.

52. Fujiwara Т., Kawabata S., Hamada S. 1992. Molecular characterization and expression of the cell-associated glucosyltransferase gene from Streptococcus mutans. Biochem Biophys Res Commun. Sep 30; 187(3): 1432-8.

53. Garcia J.L, Gonzalez de Buitrago G, Barbero J.L. 1985. Hyperproduction of L-proline in Escherichia coli. Microbiologia. Sep; 1(1 -2):43-51.

54. Gerdes, K. 2000. Toxin-antitoxin modules may regulate synthesis of macromolecules during nutritional stress. J. Bacteriol. 182:561-572.

55. Gokarn R.R., Eiteman M.A., Altman E. 2000. Metabolic analysis of Escherichia coli in the presence and absence of the carboxylating enzymes phosphoenolpyruvate carboxylase and pyruvate carboxylase. Appl Environ Microbiol. May;66(5): 1844-50.

56. Gowrishankar, J. 1989. Nucleotide sequence of the osmoregulatory proU operon. J. Bacteriol. 171:1923-1931. (Erratum, 172:1165, 1990.)

57. Groisman E.A., Casadaban M.J. 1987. Cloning of genes from members of the family Enterobacteriaceae with mini-Mu bacteriophage containing plasmid replicons. J Bacteriol. Feb;169(2):687-93.

58. Grant, M. M., A. S. Brown, L. M. Corwin, R. F. Troxler, and C. Franzblau. 1975. Effect of L-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 404:180-187.

59. Hadley, R. G., H. Ming, M. Timmons, K. Yun, and R. C. Deonier. 1983. A partial restriction map of the proA-purE region of the Escherichia coli K-12 chromosome. Gene 22:281-287.

60. Halpern, Y. S., and H. E. Umbarger. 1960. Conversion of ammonia to amino groups in Escherichia coli. J. Bacteriol. 80:285-288.

61. Hansen AM, Qiu Y, Yeh N, Blattner FR, Durfee T, Jin DJ. 2005. SspA is required for acid resistance in stationary phase by downregulation of H-NS in Escherichia coli. Mol Microbiol. May;56(3):719-34.

62. Hayzer, D. J .1983. Sub-cloning of the wild-type proAB region of the Escherichia coli genome. J Gen Microbiol. Oct;129(10):3215-25.

63. Hayzer, D. J., and T. Leisinger. 1980. The gene-enzyme relationships of proline biosynthesis in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 118:287-293.

64. Hayzer, D. J., and T. Leisinger. 1981. Proline biosynthesis in Escherichia coli. Stoichiometry and end-product identification of the reaction catalysed by glutamate semialdehyde dehydrogenase. Biochem. J. 197:269-274.

65. Hayzer, D. J., and T. Leisinger. 1982. Proline biosynthesis in Escherichia coli. Purification and characterization of glutamate semialdehyde dehydrogenase. Eur. J. Biochem. 121:561-565.

66. Hayzer, D. J., and T. Leisinger. 1983. Proline biosynthesis in Escherichia coli. Kinetic and mechanistic properties of glutamate semialdehyde dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta 742:391-398.

67. Hayzer, D. J., and V. Moses. 1978. The enzymes of proline biosynthesis in Escherichia coli. Their molecular weights and the problem of enzyme aggregation. Biochem. J. 173:219-228.

68. Hediger, M. A., D. F. Johnson, D. P. Nierlich, and I. Zabin. 1985. DNA sequence of the lactose operon: the lacA gene and the transcriptional termination region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6414-6418.

69. Helling R.B. 2002. Speed versus efficiency in microbial growth and the role of parallel pathways. J Bacteriol. Feb;184(4):1041-5.

70. Helling R.B. 1998. Pathway choice in glutamate synthesis in Escherichia coli. J Bacteriol. Sep;180(17):4571-5.

71. Helling R.B. 1997. Why does Escherichia coli have two primary pathways for synthesis of glutamate? J Bacteriol. 1994 Aug;176(15):4664-8. Erratum in: J Bacteriol Jul;179(13):4455.

72. Hernandez, P. E., J. A. Ordonez, and B. S. Perez. 1983. Use of the Mud(Ap, lac) bacteriophage to study the regulation of L-proline biosynthetic genes in Escherichia coli K-12. Curr. Microbiol. 9:31-35.

73. Higgins, Ch.F., Cairrei, J., Stinling, D.A., et al. 1987. Osmotic regulation of gene expression: ionic strength as an intracellular signal? TIBS, V12, 9: 339-344.

74. Ни, С.А. A., A. J. Delauney, and D. P. S. Verma. 1992. A bifunctional enzyme (Dl-pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9354-9358.

75. Jakowec, M. W., L. T. Smith, and A. M. Dandekar. 1985. Recombinant plasmid conferring proline overproduction and osmotic tolerance. Appl. Environ. Microbiol. 50:441-446.

76. Janes BK, Pomposiello PJ, Perez-Matos A, Najarian DJ, Goss TJ, Bender RA. 2001. Growth inhibition caused by overexpression of the structural gene for glutamate dehydrogenase (gdhA) from Klebsiella aerogenes. J Bacteriol. Apr;183(8):2709-14.

77. Kosuge, Т., and Hoshino, T. Construction of proline-producing mutant of the extremely thermophilic eubacterium Thermus thermophilic HB27. Appl. Eviron. Microbiol. 64 (1998) 4328-4332.

78. Krishna, R. V., P. Beilstein, and T. Leisinger. 1979. Biosynthesis of proline in Pseudomonas aeruginosa. Properties of y-glutamylphosphate reductase and 1-pyrroline-5-carboxylate reductase. Biochem. J. 181:223-230.

79. Krishna, R. V., and T. Leisinger. 1979. Biosynthesis of proline in Pseudomonas aeruginosa. Partial purification and characterization of y-glutamyl kinase. Biochem. J. 181:215-222.

80. Kuo, Т. Т., and B. A. D. Stocker. 1969. Suppression of proline requirement of proA and proAB deletion mutants in Salmonella typhimurium by mutation to arginine requirement. J. Bacteriol. 98:593-598.

81. Le Rudulier, D., A. R. Strom, A. M. Dandekar, L. T. Smith, and R. C. Valentine. 1984. Molecular biology of osmoregulation. Science 224:1064-1068.

82. Massarelli, I., Forlani, G., Ricca, E., De Felice, M. 2000. Enchanced and feedback-resistant y-glutamyl kinase activity of an Escherichia coli transformant carrying a mutated proB gene of Streptococcus thermophilus. FEMS Microbiol. Lett. 182 143-147.

83. Merino, E., B. Becerril, F. Valle, and F. Bolivar. 1987. Deletion of a repetitive extragenic palindromic (REP) sequence downstream from the structural gene of

84. Escherichia coli glutamate dehydrogenase affects the stability of its mRNA. Gene 58:305-309.

85. Menzel, R., and J. Roth. 1981. Purification of the putA gene product. J. Biol. Chem. 256:9755-9761.

86. Miller, K., and S. Maloy. 1990. DNA sequence of the putP gene from Salmonella typhimurium and predicted structure of proline permease. Nucleic Acids Res. 18:3057.

87. Morita Y., Nakamori S. and Takagi H. 2003. L-proline accumulation and freeze tolerance of Saccharomyces cerevisiae are caused by a mutation in the PROl gene encoding gamma-glutamyl kinase. Appl Environ Microbiol. Jan;69(l):212-9.

88. Murphy КС, Campellone KG, Poteete AR. PCR-mediated gene replacement in Escherichia coli. Gene. 2000 Apr 4;246(l-2):321-30.

89. Nakao, Т., I. Yamato, and Y. Anraku. 1987. Nucleotide sequence of putP, the proline carrier gene of Escherichia coli K12. Mol. Gen. Genet. 208:70-75.

90. Nakamori S., Morioka H., Yoshinaga F. and Yamanaka S. 1981. Fermentative production of L-proline by DL-3,4-Dehydroproline resistant mutants of L-glutamate producing bacteria. Agric. Biol. Chem., 46 (2), 487-491

91. Omori, K., S.-I. Suzuki, Y. Imai, and S. Komatsubara. 1991. Analysis of the Serratia marcescens proBA operon and feedback control of proline biosynthesis. J. Gen. Microbiol. 137:509-517.

92. Omori, K., S.I. Suzuki, Y. Imai, and S. Komatsubara. 1992. Analysis of the mutant proBA operon from a proline-producing strain of Serratia marcescens. J. Gen. Microbiol. 138:693-699.

93. Orser C.S., Goodner B.W., Johnston M., Gelvin S.B., Csonka L.N. 1988. The Escherichia coliproB gene corrects the proline auxotrophy of Saccharomyces cerevisiaeprol mutants. Mol Gen Genet. Apr;212(l):124-8.

94. Ostrovsky de Spicer, P., and S. Maloy. 1993. PutA protein, a membrane-associated flavin dehydrogenase, acts as a redox-dependent transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4295-4298.

95. Pedersen, K., Christensen S.K., and K. Gerdes. 2002. Rapid induction and reversal of a bacteriolstatic condition by controlled expression of toxins and antitoxins. Mol. Microbiol. 45:501-510.

96. Picard F.J., Dillon J.R. 1989. Biochemical and genetic studies with arginine and proline auxotrophs of Neisseria gonorrhoeae. Can J Microbiol. Dec; 35(12):1069-75.

97. Riba, L., B. Becerril, L. Servin-Gonzalez, F. Valle, and F. Bolivar. 1988. Identification of a functional promoter for the Escherichia coli gdhA gene and its regulation. Gene 71:233-246.

98. Rossi, J. J., and С. M. Berg. 1971. Differential recovery of auxotrophs after penicillin enrichment in Escherichia coli. J. Bacteriol. 106:297-300.

99. Rossi, J. J., J. Vender, С. M. Berg, and W. H. Coleman. 1977. Partial purification and some properties of Al-pyrroline-5-carboxylate reductase from Escherichia coli. J. Bacteriol. 129:108-114.

100. Rowland, I., and H. Tristram. 1975. Specificity of the Escherichia coli proline transport system. J. Bacteriol. 123:871-877.

101. Rushlow, К. E., A. H. Deutch, and C. J. Smith. 1984. Identification of a mutation that relieves gamma-glutamyl kinase from allosteric feedback inhibition by proline. Gene 39:109-112.

102. Saier M.H. Jr., and Chin A.M. 1990. Energetics of the bacterial phosphotrnsferase system in sugar transport and regulation of carbon metabolism, p.273-294. In T.A. Krulwich (ed.), The bacteria, vol.XII. Bacterial energetics. Academic press. New-York.

103. Sanderson, К. E., and J. R. Roth. 1988. Linkage map of Salmonella typhimurium, edition VII. Microbiol. Rev. 52:485-532.

104. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. Dec;74 (12):5463-7.

105. Savioz, A., D. J. Jeenes, H. P. Kocher, and D. Haas. 1990. Comparison of proC and other housekeeping genes of Pseudomonas aeruginosa with their counterparts in Escherichia coli. Gene 86:107-111.

106. Seddon, A. P., K. Y. Zhao, and A. Meister. 1989. Activation of glutamate by g-glutamate kinase: formation of y-cis-cycloglutamyl phosphate, an analog of y-glutamyl phosphate. J. Biol. Chem. 264:11326-11335.

107. Serebrijski I, Wojcik F, Reyes O, Leblon G. 1995. Multicopy suppression by asd gene and osmotic stress-dependent complementation by heterologous proA in proA mutants. J Bacteriol. Dec;177(24):7255-60.

108. Schobert B, Tschesche H. 1978. Unusual solution properties of proline and its interaction with proteins.Biochim Biophys Acta. Jun 15;541(2):270-7.

109. Schwacha, A., and R. A. Bender. 1993. The product of the Klebsiella aerogenes nac (nitrogen assimilation control) gene is sufficient for activation of the hut operons and repression of the gdh operon. J. Bacteriol. 175:2116-2124.

110. Sleator, R.D., Gahan, C.G., Hill. 2001. Identification and disruption of the proBA locus in Listeria monocytogenes: role of proline biosynthesis in salt tolerance and murine infection. Appl Environ Microbiol. Jun;67(6):2571-7.

111. Sleator, R.D., Gahan, C.G., Hill, C. 2001. Mutations in the Listerial proB gene leading to proline overproduction: effects on salt tolerance and murine infection. Applied and environmental microbiology, 67(10):4560-4565.

112. Smith, C.J., Deutch, A.H., Rushlow, K.E. 1984.Purification and characteristics of a y-glutamyl kinase involved in Escherichia coli proline biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 67:2692-2698.

113. Smith D.K., Kassam Т., Singh В., Elliott J.F. 1992. Escherichia coli has two homologous glutamate decarboxylase genes that map to distinct loci. J Bacteriol. September; 174 (18): 5820-5826.

114. Stein D.C., Silver L.E., Clark V.L., Young F.E. 1984. Cloning genes for proline biosynthesis from Neisseria gonorrhoeae: identification by interspecific complementation of Escherichia coli mutants. J Bacteriol. May;158(2):696-700.

115. Stamm L.V., Barnes N.Y. 1997. Nucleotide sequences of the proA and proB genes of Treponema pallidum, the syphilis agent. DNA Seq.;8(l-2):63-70.

116. Strecker, H. J. 1957. The interconversion of glutamic acid and proline. I. The formation of Д 1 pyrroline-5-carboxylic acid from glutamic acid in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 225:825-834.

117. Sugiura M, Kisumi M. Proline-hyperproducing strains of Serratia marcescens: enhancement of proline analog-mediated growth inhibition by increasing osmotic stress. Appl Environ Microbiol. 1985 Apr;49(4):782-6.

118. Sugiura, M., T. Takagi, and M. Kisumi. 1985. Proline production by regulatory mutants of Serratia marcescens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 21:213— 219.

119. Tombras Smith, L. 1985. Characterization of a y-glutamyl kinase from Escherichia coli that confers proline overproduction and osmotic tolerance. J. Bacteriol. 164:1088-1093.

120. Tristram, H. 1972. Some aspects of the regulation of amino acid biosynthesis in bacteria. Annu. Proc. Phytochem. Soc. 9:21-48.

121. Tsuchida Т., Kubota K. and Yoshinaga F. 1986. Improvement of L-proline production by sulfoguanidine resistant mutants derived from L-glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem., 50 (9), 2201-2207.

122. US patent 5,573,945. 1996.

123. US patent 5,908,768. 1999.

124. Vogel, H. J., and В. D. Davis. 1952. Glutamic y-semialdehyde and Д1-pyrroline-5-carboxylic acid, intermediates in the biosynthesis of proline. J. Am. Chem. Soc. 74:109-112.

125. Vogel, R. H., and M. J. Kopac. 1959. Glutamic y-semialdehyde in arginine and proline synthesis of Neurospora: a mutant-tracer analysis. Biochim. Biophys. Acta 36:505-510.

126. Vogel HJ. and Bonner D.M. 1954. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S., 40, 688

127. Williams, I., and L. Frank. 1975. Improved chemical synthesis and enzymatic assay of Al-pyrroline-5-carboxylic acid. Anal. Biochem.64:85-97.

128. Yoshinaga F., Konishi S., Okumura S. and Katsuya N. 1966. Studies on the fermentation production of L-proline. Production of L-proline by an isoleucine auxotrophic mutant of Brevibacterium flavum 2247. J. Gen. Appl. Microbiol., 12, 219.

129. Yoshinaga F., Yoshihara Y., Okumura S. and Katsuya N. 1967. Studies on the fermentation production of L-proline. Conditions for L-proline production by Brevibacterium flavum 2247. J. Gen. Appl. Microbiol., 13,25-37.

130. Yoshinaga F. 1969. Studies on thefermentative production of L-proline. Mechanism of L-proline production by Brevibacterium flavum 22A1 No. 14-5. J. Gen. Appl. Microbiol., 15, 387-398.

131. Zelenkiewicz, U. and P. Ceglowski. 2001. Mechanisms of plasmid stable maintenance with special focus on plasmid addiction systems. Acta Biochim. Pol. 48:1003-1023.

Информация о работе

Фомина, Светлана Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Влияние уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина клетками Escherichia coli. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы