Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание доминантных маркеров для растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание доминантных маркеров для растений"

■. и

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

СМИРНОВ Олег Пвенальевкч

УДК 577.21

СОЗДАНИЕ ДОМИНАНТНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ РАСТЕНИЯ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1968

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии растений Института молекулярной биологии АН СССР.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор К.Г.Скрябин, кандидат биологических наук В.М.Захарьев.

\

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Я.И.Бурьяни кандидат биологических наук В.И.Негрук.

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики АН СССР.

Залргса диссертации соЬтоится 1988 г.

в часов на заседании Специализированного Учёного совета

Д.002.79.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу: 1Г7984, Москва, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ АН СССР.

Автореферат разослан 1988 года.

Учёный секретарь

/ / * П / " А /I /

кандидат химических наук ' А.М.Крицын

I " 1 " ^

>

: • •'•Актуальность те ум. Мэлекулярная биология растений открмла

.....новый путь конструирования генов с желавший характеристиками

и введения их в растения, что может б ять аффективнее традиционных методов сехекдеи. Разработаннне в последнее время методы переноса генов в внешне растения дали исследователю мощный инструмент для выяснения закономерностей, лежащих в оенове таких фундаментальных процессов передачи генетической информации, как транскрипция и трансляция»

В отличив от прокариот, у высших эукариот, особенно у рае* тений, процесс* транскрипции и трансляции на молекулярном уровне остаются во многом неисследованными. Несмотря на имеющиеся данные о регуляторнкх элементах промоторов и важной роли в трансляции нуклеотидов, окружающих стартовый Аиб-кодон мРНК, всё ещё кет четкого представления о структурной организации Ь'-нетранслируемой последовательности мРНК и ее функции при инищации транслядеи.

Изучение механизмов, контролирующих работу генов, позволит создавать эффективные системы экспрессии гетерологичнкх генов, кодируицих определен}«* целевые белки.

Цель и задачи работ». Цель работ - конструирование генно-инженерными методами доминантных маркеров растений, содержащих различные нуклеотидные последовательности в еблдатя ыныфниры трансляции. В соетветствии с этим были поставлены следующие задачи: клонировать регуляторы»учаетки - промотор и терминатор - гена нопалинсинтетазы из Т-ДНК И •плаэмиды АегоЬэс+епил ium^fac{ens , который конститутивно работает » растениях; получить набор делеций в районе ДТб-кодона; создать векторные молекулы, позволяющие экспрессировать чужеродные гены в растени-

ях; сконструировать доминантные маркеры для растений (гены устойчивости к канамицину) с разной первичной структурой в районе ATQ-кодона.

В качестве компонентов маркерных генов были выбраны промотор хорошо изученного гена нопалинсинтетазы, а также ген неомицинфосфотрансферазы из Tub, экспрессию которого можно легко определить как in vivo, по устойчивости клеток к канамицину, так и in vitro, по активности фермента в клеточном экстракте.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получен набор гибридных маркерных генов nos-neo для растений, у которых расстояние от инициирующего AUG-кодона до кэп~ сайта мРНК составляет от 17 до 71 нуклеотида. Ряд генов nos-neo содержит дополнительный "ложный" (то есть не попадающий в рамку считывания) AUG-триплет в 5'-нетранслируе-мой последовательности, находящийся на том же расстоянии от 5' -конца мРНК, что и инициирующий AUG-кодан в других конструкциях.

tía основании результатов функционального анализа полученных гибридных генов доказано, что в кишечной палочке работает не промотор гена нопалинсинтетазы, как предполагалось ранее (Herrera-Estrella L. et al., 1963), а другой промотор, расположенный в 5'-концевом участке гибридного гена. Уровень экспрессии генов nos-rao в агробактерии отличается от уровня их экспрессии в E.coli, uto подтверждает имеющиеся данные о различии систем транскрипции и трансляции у E.coli и агробактерии.

Практическая ценность работы заключается в том, что полученные векторные молекулы ДНК, содержащие различные варианты nos-промотора и nos-терминатора могут служить основой при

конструировании гибридных генов, конститутивно работающих в растениях. Кроме того, анализ экспрессии в растительных клетках полученных гибридных маркерных генов позволит оценить влияние на экспрессию структуры мРНК в районе AUG-кодона и выбрать конструкцию, обеспечивающую максимальный уровень экспрессии.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов. Материал изложен на 60 страницах машинописного текста, включает 16 рисунков и 2 таблицы. Список использованной литературы содержит 115 наименований.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на заседав ниях отдела генетической инженерии и на конкурсе научных работ молодых ученых Института молекулярной биологии; ыатериаг-лы были представлены на I Международном конгрессе по молекулярной биологии растений, Саванна, США, 1985; на теиатической выставке "Биотехнология - народному хозяйству" на ВДНХ СССР, Москва, 1965; на У Всесоюзном биохимическом съезде, Киев, 1966; на международном симпозиуме по генетической инженерии растений, Пущино, 1987.

Материалы и нетодм.

В работе использованы штаммы Escherichia coli КВ02 и Р"а~дМ15гесА; Agrobacterium tumefaciens С58 и GV3850.

Среды. Для E.coli применяли среды Yï или dît , для агробактерии - среду РА (4 г/л пептона, 2 ыМ сульфата магния, pH 7,2); все культуры выращивали на чашках со средой YT,

содержащей 1,5 % агара.

Выделение плазмидннх ДНК. Выделение пл&зиид из E.coli проводили щелочным методом. Плазмиды иа агробактерии вццеляли по методу, разработанному в Гентском университете: после инкубирования в течение 24-48 часов при 28°С клетки лизировали с помощью проназы и гидроксида натрия. Доводили pH до 8,5 раствором трис-HCI pH 7,0, добавляли хлорид натрия до IM, осаждали. Затем осаждали ДНК с помощью ПЭГ 6000 и проводили ультрацантрифугирование в градиенте хлористого цезия.

Молекулярное клонирование, идентификацию рекомбинантных клонов методом гибридизации in situ бактериальных колоний, быстрое разрушение колоний E.coli для определения наличия вставок в плазмидах проводили по Маниатису Т. и др. (1984),

Обработку ДНК нуклеазой Bal 31 проводили в буфере, содержащем 6 Mil трис~НС1 pH 8,1, 600 мМ NaCI, 12 мМ CaClg, 12 мЫ UeCI2 при 30°С. Реакцию останавливали, добавляя ЭДТА до концентрации 50 мМ, 20 мкг тРНК и помещая пробирку в лед.

Нуклеотидную последовательность ДНК определяли по методу Максама-Гилберта (1977, 1980).

Коньюгационный перенос плазмид из E.coli в агробактерию проводили по методу Van Haute Е. et al. (1983).

Активность наомипинфосфотрансферазм в клеточных экстрактах определяли по методу An G. et al. (1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Клонирование регуляторнжх участков гена нопалинсинтета» зм.

Поскольку ген нопалинсинтетази из Т-ДНК Т1»»плазмиди аг~ робактерии является конститутивным (он экспреасируется во веех

тканях растения), его регулигорные участки - промотор и терминатор - весьма удобны для создания маркерных генов растений.

На основе известной рестрикционной карты плазмидн pTiCSB и локализации гена нопалинсинтетазн (Depicfcer А. et ai., 1980, 1982) нами был получен клон, содержащий полный структурный ген в Mind III "фрагменте размером 3,3 тысячи пар нуклеотидов.

По данным нуклеотидной последовательности гена нопалинсинтетазн (Bepickeг А. et al-, 1982), его промотор находится в Sau ЗА1-фрагменте размером 345 пар нуклеотидов, а терминатор (участки полиаденнлирования и терминации транскрипции) - во фрагменте размером 249 пар нуклеотидов.

Sau ЗА1~фрагмент ДНК, содержащий tios-промотор, клонировали в ВатН1-сайт вектора pUCI9,a его ориентацию определяли путем ееквенирования ДНК. Полученная плазмида была обозначена р0£7 (рис.1). Поскольку клонированный фрагмент содержал, кроме промотора, первые 16 кодонов гена нопалинсинтетазн, чтобы удалить структурную часть гена и получить набор делеций в нетранслируемой ¿'-последовательности, плазмиду р0£7 расцепляли рестриктазой EcoRI, обрабатывали нуклеазой Bai 31, репа-рировали концы с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимераан I и лидировали с BainHI-линкером. После расщепления рестриктазами BawHI и HinclIII фрагменты ДНК соответствующего размера влюиро-вали из Ь% ШиГ и лигировали с вектором pUCI9, расщепленным этими рестриктазами. Затем определяли нуклеотидную последовательность полученных делеционннх вариантов nos-промотора со стороны ЕсоИ-сайта (рис.1).

В работе использовали два терминатор-содержащих фрагмента. Первый - BwiHI-HindIII-Фрагыент размером 1,1 тысячи пар нуклеотидов. содержащий 3'-конец гена нопалинсинтетазы (плазмида

б/

...taaggîcaoîa?cagotagoaaatatttottgtoaaaaatgctocactgacgttooafaaattc +1

cootcggtatcoaattagAGTCrCATATTCACTCTCAATCCAAATAATÍfSSX ÎÎS ScA ATT ...

Л If t M t

11 12 18 19 20 13 15 16

(29) (30) (32) (25) (26)

(34) (35)

Рис.1 Конструирование слааыид, содержащих делеции в 5'»концевой чаети гена ноналинсинтетазы. а - схема лолучения делений в плаэмиде pÛS7, содержащей промотор и первые 16 кодонов гена nos. Pnos « нромотор гена nos, стрелкой укавана его ориентация; б - делеции в 5' «-районе гона nos. Транскрибируемая последовательность изображена заглавными буквами, транслируете кодоны - вразрадку. Стрелками обозначены левые границы делеций, цифрами -номера плазмид р05, еодержащих такой "укороченный" промотор. Ним в скобках даны немера плавмид, содержащих соответствующий жромотор и терминатор гена nos. Звев-дочками выделены нуклеетиды, необходимые для инициации транскрипции и трансляции.

pGS6); второй - S au ЗА1-фрагмент размером 249 п.н., клонированный в векторе рUR222, а затем в pUCI9 с целью создания ВатН1~сайта перед участком терминации транскрипции (плазмида

PÛS28).

В плазмиды, несущие различные варианты 5'-концевой области гена нопалинсинтетазы, клонировали по ВаячЩ-ЕсоШ-сайтам фрагменты ДНК, содержащие термихнатор этого гена (рис.2). Плазмида рО?25 и pOS26 имеют в своем составе "большой" термина-тор-содержащий фрагмент, а остальные - "малый".

Полученные векторы экспрессии в растениях (pOS25, pOS26, pOS29, p0S30, pOS32, pOS34 и pOS35) имеют структуру "промо-тор-ВаялН1»-теркинатор",что позволяет путем клонирования в ВатЩ-с&йт помещать под контроль этих регуляторных участков различные структурные гены.

Ген, клонированный в плазмидах pQS26 и р0£35, будет находиться под полным контролем nos-промотора, а его трансляция будет начинаться с AUQ-кодона гена nos; остальные плазмиды обеспечивают лишь транскрипционный контроль экспрессии клонированных генов, что позволяет проверять эффективность различных участков инициации трансляции структурных генов.

2. Получение гибридных генов nos-neo.

В качестве маркерного гена был использован ген неомицин-фосфотрансферазы neo из Тп5 с известной нуклеотидной последовательностью ; ген был клонирован в pBR322 в лаборатории генетической инженерии растений А.Ш.Ташпулатовым, » плазмида рШ. Структурная часть гена иео (около 800 п.н.) находится в BtflII-SmaI-фрагменте, причем BglII-сайт расположен в 5'-нетранслируемой последовательности. А.Ш.Хашпулатовым бил

Рис.2 Схема получения векторов экспрессии, содержащих промотор и терминатор гена нопалинсинтетазн. Сайты рестрик-таа обозначены следующим образом: В, BaanHI; Б, EcoRI; Н, Hindlll; 3, Sali. Pnos, T„os - промотор и терминатор гена поз, стрелкой указана их ориентация.

удален промотор гена neo вместе с участком Шайна-Дальгарно (плаэмида рАТ4), либо вместе с первыми пятью кодонами (плаз-мида рАТ2), вместо которых был присоединен BamHI-линкер.

С целью уменьшения размера маркерного гена из незначащей 3'-концевой области был удален фрагмент величиной около 550 пар нуклеотидов. Полученная плазмида рАТ4с( и плазмиды рА.Т1 и рАТ2 были использованы для получения гибридных генов nos-Jieo.

В BainHI-сайт плазмиды p0S26 клонировали ВатН1«4»рагмвнт плазмиды рАТ2, в ВатЩ-сайты плазмид pOS25, 29, 30, 32, 34 - BglII-Ba»HI-4parMeHT плазмиды pATI, а в BamHI-сайты плазмид pOS25, 30 и 32 - BawHl «фрагмент плазмида pAT4d, так чтобы трансляция гена неомицинфосфотрансферазы начиналась с AUG-кодона гена nos (в случае плазмиды pOS26) или с его собственного AUG-кодона (рис.3). Плазмиды, в которые был клонирован BglII-BamHI-«&parMeHT pAIi. обозначили p05...Veo; плаз-миду p0S26, содержащую ген neo, также обозначили pOS26Neo; а плазмиды, в которые был клонирован ВатиН1-4рагмент pAT4d, обозначили p03..Jfaod. Ориентацию клонированных ВамН1«>фрагментов определяли с помощью рестрикционного анализа.

Первичную структуру про моторных районов полученных девяти плазмид, несущих гибридные гены nos-neo, определяли по методу Максама-Гилберта от сайта рестриктазы Ddel, расположенного перед GAAT-блоком гена nos на расстоянии 80 нуклеотидов от стартовой точки транскрипции.

На рис.4 приведены нуклеотидные последовательности мест соединения промоторов гена nos и структурных областей гена neo в полученных гибридных генах nos »neo. Три из девяти полученных нами конструкций по структуре 5'-района гена анало—

Рис.3 Схема получения гибридных генов nos-neo.

Сайты рестриктаз обозначены следующий образом: В, BawHI; Bf, BglII; Е, EcoRI. Pnos, înos - промотор и терминатор гена nos. Стрелками указаны ориентации структурных элементов гибридных генов. Расположение гена neo обозначено штриховкой.

а/

pOS26Nao...TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCA ATG GCA АТС CGG АТС CGG GGA TTG ...

pOS25Neo...TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC ATG ATT ...

p0325Meod..TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCCGGATCCGCCGC ATG ATT GAA ...

p0332Neo...TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCCGGATCTGATCAAOAOACAGOATQAGGATCGTTTCGC ATG ATT GAA ...

pOS32Heod..TCCAATTAGAOTCTCATATTCACTCTCCOGATCCOGCGC ATG ATT GAA ...

pOS3QNeo...TCCAATTAGAGTCCCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC ATG ATT GAA ...

pOS3QNeod..TCCAATTAGAGTCCCGGATCCGOCOC ATO ATT GAA ...

pOS29Neo...TCCCGGATCTOATCAAOAGACAOOATGAGGATCGTTTCGC ATG ATT GAA ...

6/

PGA471.....TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTOCA ATG GCA ATT ACC TTA TCC GCA ACT TCT TTA

CCT ATT TCC GCC cgg ato cgg GCA GGT ... PMOH129..♦.TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC ATG ... pLGV23Neo. .TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGGATCTGATCAAGAOACAGOATGAOGATCGTTTCGC ATG ... PMOM177....TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCAGATCCTAGACGATCGTTTCGC ATO ATT GAA ... Bin19......TCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATctKcaKKatctKKKatcKtttCKC ATG ATT GAA ...

Рис.4 a - нуклеотидные последовательности гибридных генов nos-neo в районе AXQ-кодона в плаэмидах серий pOS.. Meo и pOS.. .Neod; б - структура генов nos-neo в районе ATG-кодона в плаэмидах PG147I, pLGV23Keo, BinI9, рМ0К129 и рШШ77 (по литературным данным). Последовательность гена nos , сохранившаяся после обработки нуклеазой Bal 31, подчеркнута; транслируемые кодоны даны «разрядку. Подчеркнуты инициирующий и "ложный" АК-кодоны. Мелким шрифтом даны последовательности, выведенные из схем опытов (без прямого определения первичной структуры).

/

гичны маркерным генам, описанным в литературе. Имеются также некоторые отличия в терминатор-содержащем фрагменте, и в размере фрагмента, содержащего структурную часть гена neo, что обусловлено различными схемами клонирования.

В плазмиде pOS26«eo, как и в pGA47I, единственным инициирующим кодоном является AÎG гена nos, однако pOS26Neo содержит не 14, а 3 кодона гена nos, после которых через BamHI-лин-кер следует не 9-й, а 6-й кодон гена neo. В остальных конструкциях инициирующим кодоном является ATG гена neo. В ряде конструкций, как и в исходном бактериальном гене neo, перед инициирующим кодоном имеется дополнительный ATG-триплет, не попадающий в рамку считывания. Этот "ложный" триплет может индуцировать синтез пептида из семи аминокислот, затрудняя тем самым правильную инициацию трансляции. В плазмидах pûS25Neod, p0S30Neod и pOS32Veod этот ATG-триплет удален. Судя по литературным данным, удаление этого триплета ведет к увеличению экспрессии гена (Rogers S.G. et al., 1985).

Интересно отметить, что "ложный" AUGr-триплет мРНК должен быть в силу фланкирующих нуклеотидов (ACAGGAUGA) более предпочтителен, чем инициирующий кодон (UUCGCAUGA). при сравнении с предложенной консенсусной последовательностью CCqCCAUQG (Коя.к к., 1984). И действительно, как показано в ряде работ, вектор BinI9 (Bevan M., 1984), по сравнению с pLGV23Neo (Deshaces Д. et al ., 1985), повышает устойчивость клеток табака к канамицину лишь в 2,5 раза, в то время как вектор pQ447I ( An G. et al., 1985), где трансляция начинается с более "удобного" AUG-кодона гена nos (CUGCAAUQQ), - еще в 1,5 раза (к сожалению, в этом случае максимальная критическая концентрация антибиотика не определялась). Однако ген nos-neo плаамиды

рЮШ.77, аналогичный Bin 19, экспреасируется в клетках петунии в 5-6 раз сильнее, чем ген рМ0М129, аналогичный plGY23Neo (Rogers ¿.б. et al., 1985). Такое различие в результатах трудно объяснить; по-видимому• оно всё же не связано с тем, что использован другой растительный объект. Следует указать, что в описанных векторах разница в расстоянии от AUGr-кодона до 5'-конца мРНК составляла от 12 до 35 нуклеотидов (рис.4,6), что может, если исходить из модифицированной "сканирующей модели" инициации трансляции (Kozak М., 1981), влиять на эффективность трансляции.

Полученные в настоящей работе плаэмиды дадут возможность оценить in vivo эффект как расстояния от AUQ-кодона до 5'-конца мРНК (p0SZ9f/eo~p0¿30Neo~p0S32t/«o-p0SZ5l^eo; p0:S30Veod-pQS32Weod-pQS25tfeod)f тан и нуклеотидного окружения AUQ-кодо-на (pOS26Neo-pOS32Weod), а также влияние дополнительного ложного AUG-триплета (p0$26Veo-p0S30Veo-p0S32Weod-pQS29Afeo) при условии равноудаленности AUG-кодона от 5'-конца мРНК. Интересными в этом отношении могут быть опыты по электропорированию протопластов препаратами плазмидных ДНК с измерением транзитной экспрессии.

3. Перенос гибридных генов в агробактериальный вектор рСУ3850.

Полученные маркерные гены были перенесены в рекембинантный вектор pGV3850 (Zamkyski Р. et al., 1983), способный осуществлять перенос Т-ДНК в растительный геном, методом конъюгации с использованием плазмид-помощников. Так как плаэмиды на основе CoIEI репликона не способны реплицироваться в агробакте-рии, то при соответствующей еелекции будут отбираться только те клетки, в которых произошла интеграция перенесенной плавми-

ды в pGV3850.

Частота переноса маркерных генов составляла около ЮГ* или почти в 50 раз ниже, чем частота переноса контрольной плазмиды pATI. Это объясняется тем, что pATI получена на основе p3R322 и имеет Ьож-угесток, играющий важную роль в конь-вгационном переносе, а маркерные гены были клонированы в векторе pUCI9, в котором bom-участок инактивирован. Однако это не представляет трудностей при отборе клеток агробактерий, содержащих коинтеграты p(ÍV3850 и полученных нами плазмид.

Отбор коинтегратов проводили на среде, содержащей рифам-пицин, к котороцу устойчива агробактерия, и 20 мг/л канами-цина. Клетки агробактерий, несущие различные маркерные гены или контрольную плазмиду pATI в составе pSV3850, были одинаково устойчивы к 200 мг/л канамицина, но на концентрации 500 мг/л их рост немного снижался. Это согласуется с данными о том, что в агробактерии в малом количестве обнаруживается транскрипт гена nos (Jarvssens А■ et aï., 1984).

Полученные штаммы агробактерии могут быть использованы для заражения листовых пластинок (дисков) или протопластов растений с целью получения трансформированных растений.

4. Экспрессия генов nos-neo в E.coli.

Эукариотический промотор в принципе не должен работать в бактериях. Однако в евязи с высказанным предположением, что noî-промотор работает ж E.coli (Herrera-Estrella i. et al., 1983), нами была проверена экспрессия полученных конструкций в клетках E.coli. При этом мы считали, что уровень устойчивости клеток к канамицину в определенном диапазоне концентраций антибиотика пропорционален активности фермента в клеточном экстракте, что было подтверждено экспериментально. Сравнивая

уровни устойчивости к канамицину клеток, трансформированных разными конструкциями генов, можно сделать вывод и об уровнях транскрипции и трансляции генов (конечно, это будут качественные оценки).

Устойчивость клеток к канамицину определяли путем высева ночных культур в разведении 1:100, по одной капле (около I04 клеток) на чашки с разными концентрациями антибиотика и отмечая наличие или отсутствие роста.

Как оказалось, клетки E.coli, несущие маркерные гены, проявляли разную степень устойчивости к канамицину (табл.1).

Таблица I

Устойчивость к канамицину клеток E.coli, несущих маркерные гены nos-ne о

структура гена в районе A'iii-кодона концентрация

канамиш 1ка,

количество делетиро- последова- мг/>

ванных нуклеотидов в тельность позво- подав-

nos-промоторе, по Шайна-Даль- ляющая ляющая

сравнению с плазми- гарно клеткам рост

дой pOS26 расти клеток

- м - 2

p0S26Mso 0 нет - 2

p0S25f/eo 10 нет 2 5

p0S32Afeo 26 нет 2 5

p0S30Veo 39 нет 5 10

pOS25Neo pOSWeo 10 есть 10 25

pLGV23Veo 10 есть 10 25

pQS32A/eo 26 есть 75 100

p0S3CWeo 39 есть 100-150 200

pQS29#eo 50 есть 50 75

pATI - есть 500

Если ген содержал последовательность Шайна-Дальгарно, то устойчивость клеток в целой была выше; длл обоих типов плазмид (Afeo и jVeod) при увеличении размера делеции в n.os -промоторе, то есть при "перемещении" ATG-кодона к точке инициации транскрипции, устойчивость клеток к канамицину возрастала, за исключением плазмиды pQS29//eo. Устойчивость E.coli, несущей pLGV23Weo, соетветствовала литературным данным (Herrera-Estrelln L. et al., 1983). Плазмида p0526Weo не придавала клеткам E.coli устойчивости, что противоречит данным (An. С. et al., 1985), согласно которым вектор pGA47I (рис.4,б) придает E.coli устойчивость к 10 мг/л канамицина.

Причина разной степени устойчивости клеток E.coli, несущих маркерные гены, к канамицину, возможно, заключается в том, что при создании генов nos-neo в месте соединения промотора nos и гена neo возникает бактериальный промотор, у которого роль блока Прибнова может играть последовательность TCTGiAT, находящаяся в 5'-нетранслируемой области гена neo, и если в подсоединяемом nos-промоторе будет содержаться более-менее функциональный -35-й район гомологии, то образуется "искусственный" промотор.

Полученные данные по устойчивости к канамицину клеток E.coli, несущих плазмиды pQS26Veo, p0S25Veo, p0£32Weo и р0£30№во, доказывают, что в кишечной палочке функционирует не iws-промотор, как предполагалось ранее, а другой бактериальный промотор, возникающий при конструировании гибридных генов. Как отмечалось, клетки агробактерии, несущие маркерные ввны, устойчивы к высоким концентрациям канамицина в одинаковой степени. Это указывает на то, что сигналы регуляции экспрессии генов в E.coli и агробактерии, как отмечалось в обзо-

ре Пирузян Э.С. и Андрианова В.М. (1985), различаются.

ВЫВОДЫ

1. Клонированы регуляторные участки (промотор, терминатор) гена нопалинсинтетазы, работающего в растениях; получен набор делеций в районе ATGr-кодона гена.

2. Созданы векторные молекулы, содержащие "кассеты экспрессии", обеспечивающие работу в растениях генов, клонированных в ВашЩ-сайт.

3. Сконструированы гибридные маркерные гены nos-neo для растений, содержащие различные нуклеотидные последовательности в области инициации трансляции. Анализ работы этих конструкций в растительных клетках даст возможность оценить влияние структуры мРНК в районе AUGr-кодона на экспрессию гена.

4. Полученные маркерные гены с разной эффективностью экс-прессируются в E.coli; разница в их экспрессии в агробактерии не обнаружена. Сделан вывод о различии системы регуляции экспрессии у E.coli и агробактерии.

5. Маркерные гены перенесены в агробактерии и включены в состав рекомбинантного вектора pGV3850. Они могут быть использо- . ваны для заражения листовых пластинок (дисков) или протопластов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Zakharyev V.M., Muradov A.Z., Smirnov O.Yu., Tashpulatov A.S., Skryabin K.G., Bayev A.A. Construction of the intermediate vectors for expression in higher plants. Abstracts of the first international congress of plant molecular biology. The University of Georgia, USA, 1985, p.114.

2. Захарьев В.И., Цурадов А.З., Смирнов О.Ю., Ташпулатов А.Ш., Федорова O.E., Скрябин К.Г., Баев A.A. Создание промежуточных векторов экспрессии для растений. У Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы стендовых сообщений, 11.: Наука, 1986, Т.2, с.430.

3. Смирнов О.Ю., Ташпулатов A.1U., Захарьев В.Ы., Скрябин К.Г. Конструирование гибридов N05-WPT - маркерных генов растений. - Биоорганическая химия, 1987, 13, №6, с.1142-1145.