Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Молекулярно-генетическое изучение устойчивости к киле Brassica rapa L.

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое изучение устойчивости к киле Brassica rapa L."

На правах рукописи

НГУЕН Минь Ли

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К КИЛЕ BRASSICA RAPA L.

Специальность: 06.01.05 - Селекция и семеноводство сельскохозяйственных

растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

005559064

i z 2П1.5

Москва-2015

005559064

Работа выполнена на кафедре селекции и семеноводства садовых культур ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева» в 2011-2014 гг.

Научный руководитель: Монахос Сократ Григорьевич

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, заведующий кафедрой селекции и семеноводства садовых культур Официальные оппоненты: Игнатов Александр Николаевич

доктор биологических наук, ФГБУН Центр "Биоинженерия" Российской академии наук,

заведующий лабораторией молекулярной фитопатологии Домблидес Артур Сергеевич кандидат сельскохозяйственных наук, ФГБНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур, заведующий сектором молекулярно-генетический исследований лаборатории генетики и цитологии Ведущая организация: Российский государственный аграрный заочный

университет

Защита диссертации состоится <$£у> « ^¿(JZi'T®- » 2015 года в «/^.'£0» часов на заседании диссертационного совета Д 0d6.022.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район, д. Верея, строение 500, ВНИИО.

Факс: (496) 462-43-64;

E-mail: vniio@vandex.ru. сайт: www.vmioh.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского овощеводства.^

сцсксфЯ-

Автореферат разослан «)/■>> « ' »2015 года

Ученый секретарь S/ffi Л__, Девочкина Наталия Леонидовна

диссертационного совета "

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В настоящее время в ситуации сильной конкуренции на рынке семян капустных культур селекционные компании стремятся к повышению своей конкурентоспособности за счёт применения инновационных биотехнологических методов в селекционном процессе. При этом отмечается большое значение методов маркер - опосредованного отбора или селекции с помощью молекулярных маркеров (Brumlop S., Finckh M.R., 2010; Narasimhulu R. et al., 2013) и создания растений удвоенных гаплоидов (Takahashi Y. et al., 2011; Zhang Y. et al., 2012).

В мировой практике производства капустных культур большой ущерб наносят разные вредоносные заболевания. Одной из них является кила, борьба с которой возможна только методом создания устойчивых сортов и гибридов F1 (Монахос Г.Ф., Монахос С.Г. 2009).

В селекции капусты пекинской на устойчивость к киле в течение более двадцати лет проводят интенсивные работы по созданию и внедрению молекулярных маркеров генов устойчивости, так как только с помощью маркеров можно «пирамидировать» несколько генов в одном генотипе для обеспечения высокой и надежной устойчивости к болезни.

В пределах вида В. гара с помощью молекулярных маркеров выявлено, по меньшей мере, восемь локусов устойчивости к киле Crrl (Kikuchi М. et al., 1999), Crr2 (Suwabe К. et al., 2003), Crr3 (Hirai M. et al., 2004), Crr4 (Suwabe K. et al., 2006), CRa (Hayashida N. et al., 2008), CRb (Piao Z. et al., 2004), CRc, Crk (Sakamoto K. et al., 2008), которые локализованы на 5 группах сцепления. Несмотря на определенные успехи, конечная цель пока еще не достигнута - до сих пор отсутствуют универсальные маркеры локусов устойчивости для использования в практике селекционного процесса. Таким образом, работа по поиску высокоэффективных генов устойчивости к киле и разработке их эффективных молекулярных маркеров для ускорения и повышения эффективности селекционного процесса на устойчивость к возбудителю килы Plasmodiophora brassicae Wor. остается актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явились изучение и разработка системы маркер-опосредованного отбора капустных растений по признаку устойчивости к киле и уровню плоидности для применения в практической селекции.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить генетику устойчивости к киле линий капусты пекинской и линий европейского турнепса, доноров генов устойчивости;

2. Оценить эффективность опубликованных молекулярных маркеров

картированных локусов устойчивости к киле в расщепляющихся популяциях коллекции линий капусты пекинской и турнепса;

3. Изучить и создать высокоспецифичный молекулярный SCAR маркер, тесно связанный с геном устойчивости к киле;

4. Определить генетическое положение в группе сцепления генетической карты В. rapa маркированного локуса устойчивости к киле;

5. Провести скрининг наличия/отсутствия выявленного SCAR маркера гена устойчивости в коллекции устойчивых и восприимчивых к киле инбредных линий и Fl гибридов капусты пекинской, и в отдаленных скрещиваниях между В. oleracea и гибрида (В. rapwB. napus);

6. Изучить эффективность использования признака «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» для дифференциации растений видов Brassica, различающихся по уровню плоидности.

Научная новизна

На коллекции инбредных линий капусты пекинской и европейского турнепса дана оценка эффективности отдельных генов устойчивости к киле В. rapa.

С помощью высокоспецифичного и тесно сцепленного с одним из генов устойчивости SCAR маркера Tau_cBrCR404 проведена дифференциация линий капусты пекинской по генам устойчивости и выявлены линии, пригодные для поиска и разработки маркеров других генов устойчивости к киле В. rapa.

В генетической коллекции капусты пекинской и европейского турнепса выявлен новый ранее неизвестный высокоэффективный ген устойчивости к киле, картированный в 5-й группе сцепления В. rapa и обозначенный CrrÄ5.

Впервые на генотипах капустных растений В. rapa, В. oleracea и. В. napus представлены данные о зависимости проявления признака «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» от внешнего фактора (температура воздуха), стадии онтогенетического развития (возраст растения) и биологии растения (продолжительность вегетационного периода), а также его связь с уровнем плоидности растений.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан высокоэффективный ДНК маркер Tau_cBrCR404, пригодный для маркер-опосредованного отбора в селекционных программах, направленных на создание устойчивых к киле капустных культур.

Получены уточненные данные по наследованию устойчивости к киле и уровню обеспечиваемой устойчивости отдельными генами инбредных линий капусты пекинской и линий европейского турнепса.

Охарактеризована эффективность опубликованных молекулярных маркеров известных картированных локусов устойчивости к киле В. rapa.

Получены сведения о новом ранее неизвестном гене устойчивости к киле CrrAS и его локализации в 5-й группе сцепления В. rapa.

Представлены данные об эффективности применения метода подсчета числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и стабильности проявления данного признака у капустных культур.

Методология н методы исследования

Для изучения генетики устойчивости киле использовали метод оценки устойчивости к киле на инфекционном фоне (Монахос Г.Ф. и др., 2009).

Работу по маркированию генов устойчивости проводили с помощью метода выделения ДНК - ЦТАБ (Murray M.G., Thompson W.F., 1980), метода массового сегрегационного анализа (BSA) (Michelmore R.W. et al., 1991), полимеразной цепной реакции (ПЦР), электрофореза, клонирования фрагмента ДНК и секвенирования ПЦР продукта. Для определения степени сцепления между маркером и геном и картирования локуса устойчивости использовали программу MapDisto 1.7.6.5.1.1 (XL2010) (LorieuxM., 2012).

Определение числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в клетках меристематических тканей кончиков корешков и в делящихся клетках пыльников молодых бутонов проводили цитологическим анализом (Savitsky H., 1966; Пухальский В.А. и др., 2007).

Положения, выносимые на защиту:

1. Наследование устойчивости к киле инбредных линий капусты пекинской моногенное доминантное, инбредных линий европейского турнепса - полимерное доминантное;

2. Разработанный высокоспецифичный ДНК маркер Tau_cBrCR404, позволяет дифференцировать устойчивые и восприимчивые генотипы капусты пекинской в расщепляющихся популяциях и в генетических коллекциях, является эффективным в маркер-опосредованном отборе;

3. Маркированный ген устойчивости к киле СггА5 капусты пекинской (линия 20-2сс1-132) располагается на А05 группе сцепления В. rapa и является новым, ранее неизвестным;

4. Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц является стабильным в проявлении маркерным признаком тесно связанным с плоидностью растений капустных культур В. rapa, В. oleracea и В. napus, а подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц — высокоэффективным методом оценки плоидности растений капусты пекинской, капусты белокочанной и рапса.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Статистическую обработку полученных данных фенотипического расщепления в изучении генетики устойчивости к киле проводили с помощью критерия хи-квадрат.

Достоверность различий числа хлоропластов под влиянием различных факторов, температуры среды, возраста и уровня плоидности растения, определяли с использованием доверительного интервала на основе t-распределения Стьюдента при уровне значимости 0,05 (Доспехов Б.А., 1985) и программу Microsoft Excel 2010.

Основные положения работы были представлены на научной конференции молодых ученных и специалистов РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2012; 2013); международной научно-практической конференции (VI Квасниковские чтения) в ГНУ ВНИИ овощеводства Россельхозакадемии (Московская обл., 2013); XI молодежной научной конференции: Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (Москва, 2011); международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученных МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2011; 2010); научной конференции студентов РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2009; 2010; 2011); Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых аграрных вузов Центрального федерального округа (Курск, 2011).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 в рецензируемых научных журналах и изданиях для опубликования основных научных результатов диссертаций ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, рекомендаций, списка сокращений, содержит 15 таблиц, 44 рисунка, 11 приложений. Список литературы включает 183 наименования, в том числе 157 работ иностранных авторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Генетический анализ устойчивости к киле

В исследовании проводили оценку степени устойчивости к киле восьми инбредных линий капусты пекинской коллекции ООО «Селекционная станция имени H.H. Тимофеева» и одной линии-удвоенного гаплоида. Все линии несут в себе гены устойчивости, которые переданы из зарубежных килоустойчивых гибридов капусты пекинской и линии-дифференциатора европейского турнепса ЕСД04.

В результате проведенного исследования изученные линии капусты пекинской разделены на две группы по степени устойчивости: группа с высокой устойчивостью (20-2сс1-132, ТПВ1-1(8)11, Т52-433, 22ч4н1-1011, Ха6223, Чи1с1212, Xa642DH) и группа с низкой устойчивостью (20-ЗСе2-2, Кн70-1156).

В изучении генетики устойчивости использовали три комбинации скрещивания устойчивых и восприимчивых линий капусты пекинской 20-2сс1-132хЕС-1, Xa642DHx MchDH, Кн70хкит1-3с153. В генетическом анализе оценивали потомства Fl, BC1S или F2.

Установлено, что в линиях капусты пекинской 20-2сс1-132 и Xa642DH устойчивость к киле контролируется одним высокоэффективным доминантным геном. В линии Кн70 устойчивость контролируется одним геном с невысокой эффективностью и наследуемым по типу неполного доминирования.

В качестве материала для изучения наследования признака устойчивости в инбредных линиях ЕСД04-05, ЕСД04-10 европейского турнепса служили их потомства, полученные от скрещивания этих линий с восприимчивой инбредной линией капусты пекинской Кит1-3с153 Fl, F2 и BC1S.

Установлено, что у линии ЕСД04-05 устойчивость контролируется двумя доминантными генами и одним геном с неполным доминированием. Устойчивость линии ЕСД04-10 может быть объяснена двумя возможными вариантами действия генов: два независимо доминантных гена или два доминантных гена в сочетании с одним геном с неполным доминированием.

2. Маркирование генов устойчивости к киле

Оценка эффективности известных маркеров локусов устойчивости к киле на

селекционных популяциях

Для оценки эффективности 14 опубликованных молекулярных маркеров шести картированных локусов устойчивости к киле вида В. rapa (Crrl, Crr2, СггЗ, CRa, CRb, CRc) использовали смеси ДНК каждой родительской линии, устойчивых и восприимчивых потомств Fl, BC1S двух комбинаций скрещиваний ЕС-1х20-2сс1-132 и Кит1-Зс153хЕСД04-10.

Все 14 маркеров разделены на три группы по уровню полиморфизма и продуктам амплификации. Первая группа включает в себя мономорфные маркеры, которые не дают продуктов амплификации: m6R, OPS11-1S, OPS11-2S, BRMS-100. Вторая группа представляет собой мономорфные маркеры: НС352 SCAR, BRMS-096, BRMS-297. В третью группу входят маркеры CRS 10-CRS 11, SCAR91 f-SCARp636r, BRMS-088, BrSTS-78, E493So, TCR-05, TCR-10, которые полиморфны для устойчивых и восприимчивых родительских линий, при этом мономорфны для устойчивых и восприимчивых смесей ДНК потомств BC1S.

На основе полученных результатов оценки маркеров в двух комбинациях скрещиваний можно сделать вывод, что все проанализированные известные маркеры шести локусов устойчивости не могут быть применены в селекционном процессе при использовании устойчивой инбредной линии европейского турнепса

ЕСД04-10 и устойчивой инбредной линии капусты пекинской 20-2сс1-132 в качестве доноров устойчивости.

Поиск R4PD маркера, тесно сцепленного с геном устойчивости к киле

С целью маркирования высокоэффективного доминантного гена устойчивости к киле проводили массовый сегрегационный анализ расщепляющегося беккроссного потомства BC1S от скрещивания линий 20-2сс1-132 и ЕС-1. В работе были использованы 22 пары SSR праймеров (К. Suwabe, 2006) и 288 RAPD праймеров из списка стандартных маркеров NAPS (NAPS unit standard primers).

В результате анализа выделен RAPD маркер «394RAPD430» размером 430 п.н. (рис. 1), наиболее близко расположенный к гену устойчивости, с частотой рекомбинации 2,9 сМ.

Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймером 394ЮШЭ: стрелкой обозначен полиморфный фрагмент размером 430 п.н., М-маркер молекулярного веса 100 п.н., ^устойчивое растение популяции ВС18 [(ЕС-1х20-2сс1-132)1хЕС-1], Э-восприимчивое растение ВС13 [(ЕС-1х20-2сс1-132)1хЕС-1].

Секвенирование и анализ последовательности КАРИ маркера

С целью изучения нуклеотидной последовательности маркера 394КАРВ430 из агарозного геля выделили фрагмент размером 430 п.н., амплифицированный с 394ИАРБ праймером, успешно клонировали и секвенировали его (рис. 2).

5TCACGCAGTTTAATAAACTAATATATCATCGATCCAATCCGTAAATaAATATCAAAAATCAA GATTTGATAAGACGACGCAAAAGAGAAGAGGACACKjAGCATCTCAGAATCGAAAACCCCATT TrrATCTrCACTAGCAATCAAAGTGCAAGGATAACAATTTTTCATGGAATTCATCACCGATTGC TCCACCACCCTCGAACTAGAAAAAAAAATCAAAACAAGCCTCTAGAAAAATCTACCTTATACT AATCATAACCCATCAAACATCAGACGAAGGAACCAGTCAGTCAAAAGGCTTGGAGAAATATT TATACATGGCGCCGACAAAAAAAAACAAGACAAAACCCTACTCTTCTGTTTGGTAACGTATAT ATCTTAATCCATAATACGGAAAGGACTAAAACCTTTGATACTCTAACTGCGTGA3'

Рисунок 2. Последовательность нуклеотидов маркера 394RAPD430,

При анализе полученной последовательности в генетической базе данных вида В. rapa (chromosome vi.5), полученных при секвенировании генома сорта капусты пекинской Chiifu-401 (Cheng F. et al, 2011), с помощью программы blastn показано, что она имеет высокое сходство с одной последовательностью хромосомы А05 при значении Е = 7е-52 и с последовательностью хромосомы А04 при значении Е = 3е-23. Исходя из этого, можно предположить, что данный маркер и сцепленный с ним ген устойчивости к киле локализуется с высокой

вероятностью на хромосоме А05 и с меньшей вероятностью на хромосоме А04 вида В. rapa.

Конвертирование RAPD маркера в SCAR маркер

Известно, что использование RAPD маркеров в селекционном процессе ограничено некоторыми недостатками. Маркеры имеют доминантный характер, т.е. не способны отличить гетерозиготы от гомозигот. Результаты анализа с RAPD праймерами в значительной мере зависят от условий проведения амплификации таких как квалификация сотрудников, качество ДНК и др.

В данной работе для повышения эффективности маркирования гена устойчивости к киле проводили конвертирование 394RAPD43o маркера в SCAR маркер. На основе известной последовательности фрагмента размером 430 п.н., амплифицированного 394RAPD праймером, с помощью программы Primer3 были созданы четыре комбинации SCAR праймеров, состоящих из двух прямых ВгСг-026F, BrCr-085F и двух обратных праймеров BrCr-429R, BrCr-427R.

Один из маркеров Tau_cBrCR404 четко различает устойчивые и восприимчивые образцы капусты пекинской и репы по фрагменту размером 404 п.н. При этом в потомствах от скрещивания капусты пекинской (линии 20-2сс1-132, и ЕС-1) он имеет доминантный характер (рис. 3), тогда как в потомствах от скрещивания турнепса с капустой пекинской (ЕСД04-10 и Кит1-3с15) - ко-доминантный.

Tau_cBi€R4W

Та»

ЕСД F1 Rbc Sbc К

Sbc Е

Рисунок 3. Электрофореграмма продуктов амплификации с маркером Tau_cBrCR404: стрелками обозначен целевой фрагмент, М-маркер молекулярного веса 100 п.н.; С - 20-2сс1-132, Е - ЕС-1, F1 - F1 потомство, Rbc - устойчивый BC1S, Sbc - восприимчивый BC1S; ЕСД -ЕСД04-10, F1 - Кит1-Зс15хЕСД04-10, Rbc - устойчивый BC1S, Sbc - восприимчивый BC1S, К -Кит1-3с15.

Анализ SCAR маркера Tau_cBrCR404 на 103 растениях расщепляющейся популяции BC1S [(ЕС-1х20-2сс1-132)хЕС-1] показал, что расщепление полностью соответствует распределению исходного RAPD маркера 394RAPD, тем самым, была проведена его верификация.

Картирование гена устойчивости

Создание фрагмента генетической карты В. rapa и локализацию маркера и связанного с ним высокоэффективного гена устойчивости к киле, переданного в капусту пекинскую 20-2сс1-132 из европейского турнепса ЕСД04 проводили с

использованием 286 RAPD, 22 SSR, 54 InDel маркеров. В качестве картирующей популяции служила расщепляющаяся популяция BC1S от скрещивания устойчивой и восприимчивой инбредных линий капусты пекинской 20-2сс1-132 и ЕС-1.

В результате работы выявлено, что ген устойчивости к киле и его маркер Tau_cBrCR404 локализуются на 5-ой хромосоме В. rapa (рис. 4). Известно, что все опубликованные картированные гены устойчивости к киле вида В. rapa локализованы в пяти группах сцепления А01, А02, АОЗ, А06, А08 (Piao Z. et al., 2009), однако, в данном исследовании ген устойчивости линии 20-2сс1-132 картирован на хромосоме А05. Кроме этого, в результате оценки эффективности ранее опубликованных маркеров локусов устойчивости к киле показано, что все изученные маркеры не идентифицируют локус устойчивости линии 20-2сс1-132. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что выявленный ген в данном исследовании у линии 20-2сс1-132 является новым и отличающимся от других известных ранее локусов устойчивости вида В. rapa, и обозначен С,ггА5.

ФЩ 0,е~

(122,4) Ш -

год-

32.9" 40,7-

<7,8-

76,0 -

117,6-

Локус BriDtOU.i

— BrlD 10131

Гев устойчивости CrrAS »-* Та îï_cBrCR40 4

— 256RAPD

• 337RAPD

- 369RAPD

36RAPD

Рисунок 4. Генетическое положение гена устойчивости к киле СггА5 на группе сцепления А05, в скобках обозначено соответствующее положение маркера в группе сцепления А05 вида В. rapa по Wang Y. et al. (2011); cM - сантиморганиды

Оценка эффективности маркера Tau_cBrCR404

Оценку возможности применения маркера Tau_cBrCR404 в селекционном процессе проводили скринингом коллекции инбредных линий и F1 гибридов на

наличие маркированного локуса устойчивости. Для оценки разработанного маркера Таи_сВгСК404 использовали смеси ДНК пяти растений каждой линии или коммерческого гибрида Результаты анализа представлены в таблице 1.

В результате анализа с использованием данного маркера все устойчивые линии и гибриды можно разделить на две группы: первая группа устойчивых генотипов, содержащая маркер Таи_сВгС11404; вторая группа устойчивых генотипов, не содержащая маркер. Это можно объяснить тем, что донором устойчивости к киле у капусты пекинской является европейский турнепс, который содержит, по крайней мере, три гена устойчивости и соответственно гены и их количество у разных линий - реципиентов могут быть неодинаковым.

Таблица 1. Результаты оценки эффективности маркера Таи_сВгСк4()4 и скрининг коллекции родительских линий и И гибридов на наличие маркированного локуса __устойчивости СггА5

Наименование Устойчивость Таи сВ Наименование Устойчивое Гаи сВгС

линии,гибрида к киле гСИ404 линпи,гибрида ть к киле 1*404

20-2П.1-Ш а * 21-ЗСе1 Я -

И1ИЧ25) н + 20-ЗСе2 Я -

111К1 (К.. к (ХаЮхЧи4)6262 Я -

П1ВН40) к * (Ха11*Чи4)6452 я -

шнг-М; к + (Ха10хЧи4)541 я -

(»:{-] - швыф» к ЙШШИ! ЕС 1 я

Г<|ги-м1ы1 Нпггем к ШШрШШ К 2 &

К'4кп к - Кя11-3с153 Й

2111 ¡ЙШЙШЙЙН - ( .4-5 р -

ТПВ 1-1(20) я - Роиеп - й

22чн1 я - I-1 Маленькие ч> ли ..........А ....... _

НСК1-171 я - 1 1 ФИ щи иик ■ л

Ст4ки41 я - Р1 Ника я -

Кн70 я - Р1 Гидра я -

72-11431 я - Р1 Нежность я -

Т52 я - Г; 1 Билко я -

Чи1 я - Ь'1 Текила я -

21ок4 я - Килатон я -

Примечание: Я - устойчивость к киле, 8 - восприимчивость к киле, (+): присутствие маркера Таи_сВгСК404, (-): отсутствие маркера Таи_сВгСЯ404.

Маркер Таи_сВгСЫ404 позволяет полностью идентифицировать восприимчивые линии и гибриды. Проведенный скрининг позволил дифференцировать линии и гибриды капусты пекинской по содержащимся в них генам устойчивости к киле. Устойчивые образцы, не имеющие маркера Таи_сВгСК404, а соответственно и локуса устойчивости 5 группы сцепления Сп~А5, являются материалом для поиска и разработки молекулярных маркеров других генов.

3. Определение плоидности растений капустных культур методом подсчета числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц

Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (ЗКУ) капусты пекинской (В. rapa)

В результате исследования между числом хлоропластов и плоидностью растений пекинской капусты установлен высокий коэффициент корреляции (г). Он составил 0,889 для популяции MEDH; 0,918 для популяции (MxE)DH; 0,929 для популяции XMDH; 0,94 для популяции Xa622DH; 0,922 для популяции MlchDH; 0.934 для популяций КитОН и TT1B36DH, при этом отмечено отсутствие перекрытия числа хлоропластов между растениями разных уровней плоидности, и также отсутствие дифференциации по этому признаку внутри каждого уровня плоидности.

При подсчете числа хлоропластов растений-регенерантов семи популяций капусты пекинской, полученных из разных генотипов методом культуры микроспор, выявлено, число хлоропластов гаплоидов находится в пределах от 5,3±0,6 до 6,1±0,6 шт., а удвоенных гаплоидов в пределах от 9,5±0,6 до 10,5±2,1 шт.

Достоверное различие числа хлоропластов в ЗКУ гаплоидных растений и удвоенных гаплоидов (УГ) позволяет использовать данный метод в определении плоидности растений, полученных гаплоидными технологиями (рис. 5). Отмечено, что у капусты пекинской растения-регенеранты одного уровня плоидности, полученные от различных генотипов, не отличаются по числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц.

И гаплоид □ удвоенный гаплоид

14

12

10

о 6

3

I

1

Í1

Í

h

I

MEDH

XMDH Xa622DH MlchDH KirrDH ТПВЗШН

(MxE)DH

Рисунок 5. Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц гаплоидных и УГ растений капусты пекинской (В. rapa).

Число хлоропластое в замыкающих клетках устьиц рапса (В. пария)

В результате подсчета числа хлоропластов ЗКУ галоидных и дигаплоидных растений рапса в популяции РС23БН среднее число хлоропластов гаплоидных растений составило 9,6±0,6 шт., дигаплоидных растений - 16,6±1,2 шт.; гаплоидных растений ЛимГШ - 9,7±0,7 шт., дигаплоидных растений ЛимПМ -16,9±0,7 шт.; гаплоидных растений СевБН- 10.1±0,7 шт., дигаплоидных растений СевОН - 17,0±0,7 шт.; гаплоидных растений ГалБН- 10,0±0,6 шт., дигаплоидных растений ГалЦН — 17,2±0,6 шт. (рис. 6).

Установили высокий коэффициент корреляции между числом хлоропластов и плоидностью растений, он составил 0.943 для популяции РС23 011; 0,918 для популяции ЛимБН; 0,964 для популяции СевОН; 0,968 для популяции ГалБН. Полученные результаты подтверждают эффективность метода подсчета числа хлоропластов для определения плоидности растений рапса (А парт).

Статистическая обработка полученных данных показала отсутствие изменчивости числа хлоропластов в пределах одной плоидности.

20 18 16 I 34

112 3

о ш

i

ll

rf

-I

□ гаплоцд □дигашгоид

CeBDH ГалОН Северянин

Рисунок 6. Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц гаплоидных и дигаплоидных

растений рапса (В. napusj.

Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц капусты белокочанной

(В. oleracea)

При изучении 8 популяций растений-регенерантов капусты белокочанной, полученных в культуре изолированных микроспор, ФарОН, СюрОН, НазБН, 3tDH, BioDI [, MopDI-I и ПарБН дифференцировали три уровня плоидности: гаплоид (п=9), удвоенный гаплоид (2п=18), тетраплоид (4п=36) (рис. 7), что подтверждено результатами цитологического анализа.

Коэффициенты корреляции между числом хлоропластов и плоидностью

растений этих популяций были высокими и варьировались от 0,95 для популяции ПарБН до 0,995 для популяции БюВН. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что метод подсчета числа хлоропластов эффективен для определения плоидности растений капусты белокочанной.

35

О гаплоид Оудвоекый гаплоид □ тетраплоид

= 25

с:

£

я 20

ФарШ СюрШ ПарОН

ЭтЭН БюБН МорОН

Рисунок 7. Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц гаплоидных, УГ и тетраплоидных растений капусты белокочанной (В. окгасеа).

У растений Агр1)Н I и АгрОН2на стадии одного-двух листьев и в фазе цветения число хлоропластов варьировало в пределах от 6,9±0,76 до 7,1±1.0 шт. Эта величина была существенно меньше, чем у гибрида Агрессор (11,1±1,1 шт. и 12,0 ±1,5 шт.). Это говорит о том, что эти два растения являлись гаплоидными (п=9). При этом подсчет числа хромосом клеток корневых меристем показал, что эти растения представлены удвоенными гаплоидами, что отличалось от результата подсчета хлоропластов. Однако при подсчете числа хромосом в делящихся клетках пыльников молодых бутонов показано, что эти растения имели 9 хромосом (п=9). Это подтверждает, что растения являлись гаплоидными, и это соответствовало результату подсчета хлоропластов. В фазе цветения подтвердилась гаплоидная природа этих растений — они формировали мелкие стерильные цветки.

Полученные результаты можно объяснить тем, что в культуре изолированных микроспор растения с набором хромосом 2п=18 получены в результате спонтанного удвоения числа хромосом гаплоидов, в результате чего возможно возникновение химер. В данном случае наблюдали различия в наборе хромосом между корнем (подземным органом), листьями и генеративными органами (надземными органами) растений.

Таким образом, метод подсчета числа хлоропластов позволяет точно и быстро определить плоидность надземной части растений, и имеет преимущество над методом прямого подсчета хромосом меристематических клеток корешков при определении плоидности растений-регенерантов, полученных в культуре тканей и клеток.

Влияние температуры, стадии развития и срока созревания растений на число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц

Влияние температуры. В работе изучали влияние температуры на число хлоропластов, для этого выращивали по 4 растения каждого коммерческого гибрида капусты пекинской (В. rapa) F1 Гидра, F1 Нежность, белокочанной капусты (В. oleráceo) СБ-3 F1, Валентина F1 и сорта рапса (В. napus) Северянин при температурах 22 °С и 8 °С. Результаты подсчета на молодых листьях показали, что число хлоропластов в ЗКУ изученных гибридов и сорта не отличалось при изученных температурах (рис. 8), что свидетельствует об отсутствии влияния температуры на число хлоропластов.

Рисунок 8. Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц растений гибридов Гидра F1, Нежность F1 капусты пекинской (В. rapa), СБ-3 F1 и Валентина F1 капусты белокочанной (В. oleráceo) и сорта Северянин рапса (В. napus) при температурах 8 °С и 22 °С.

Влияние стадии развития растения. Проводили изучение числа хлоропластов на двух растениях каждого образца линии капусты пекинской Ха622, линии капусты белокочанной Бю1б и сорта рапса Северянин в стадии 4-х настоящих листьев и в стадии цветения (рис. 9).

Показано, что фактор «стадия развития растения» не оказывает влияния на изменчивость изученного признака у капустных культур, и, вероятно, что изменчивость этого признака в большей степени связана с генетической изменчивостью и размером генома.

Хаб22 Бю1б Северянин

Рисунок 9. Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц растений капусты пекинской (В. rapa), капусты белокочанной (В. oleracea) и рапса (В. парт) в стадии 4-х настоящих листьев (20 дней после всходов) и в стадии цветения (30 дней после яровизации).

Связь срока созревания растения с числом хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. В результате изучения числа хлоропластов у трех капустных культур выявили, что у капусты пекинской (В. rapa) и рапса (В. napus) этот признак не отличается между генотипами, тогда как у капусты белокочанной он сильно варьируется. Поэтому проанализировали связь данного признака и срока созревания растений у капусты белокочанной.

При сопоставлении числа хлоропластов между группами линий, отличающихся по сроку созревания, выявили существенные различия между группой раннеспелых линий и группой позднеспелых линий. Тогда как между группами раннеспелых линий и среднеспелых линий, а также между среднеспелыми и позднеспелыми линиями нет достоверного различия по изучаемом}' признаку (рис. 10). Среднее число хлоропластов раннеспелых линий составило 17,0±1,9 шт., среднеспелых- 12,6±1,5 шт., позднеспелых - 15,3±1,5 шт.

Раннеспелые лннии Среднеспелые линии Позднеспелые линии (80-100 дней) (110-140 дней) (150-180 дней)

Рисунок 10. Среднее число хлоропластов раннеспелых, среднеспелых и позднеспелых инбредных линий капусты белокочанной (В. oleracea).

Таким образом, выявили, что число хлоропластов белокочанной капусты (В. oleráceo) является генотип-специфичным, также установили связь между изучаемым признаком и сроком созревания растений, позднеспелые линии имеют меньшее число хлоропластов, чем раннеспелые линии.

ВЫВОДЫ

1. Выделена группа линий капусты пекинской с высокой устойчивостью к киле: 20-2сс1-132, ТПВ1-1(8)11, Т52-433, 22ч4н1-1011, Ха6223, Чи1с1212, Xa642DH, которые целесообразно использовать для дальнейшей селекции по созданию F1 килоустойчивых гибридов или в качестве доноров устойчивости.

2. Установлено, что у линий европейского турнепса ЕСД04-05 и ЕСД04-10, устойчивость к киле контролируется тремя независимыми полимерными генами, два из которых доминантные, а один действует по типу неполного доминирования.

3. Показано, что 14 опубликованных молекулярных маркеров шести картированных локусов устойчивости Crrl, Crr2, СггЗ, CRa, CRb, CRc не могут быть применены в процессе селекции на устойчивость к киле с использованием инбредной линии 20-2сс1-132 и дифференциатора европейского турнепса ECD04 в качестве донора устойчивости.

4. Разработан SCAR маркер Tau_cBrCR404, тесно сцепленный (2,9 сМ) с высокоэффективным геном устойчивости у линии капусты пекинской 20-2сс1-132. Маркер проявляет доминантный характер наследования в популяциях от скрещивания восприимчивой и устойчивой капусты пекинской (ЕС-1 х 20-2сс1-132) и кодоминатный — в популяциях от скрещивания восприимчивой капусты пекинской и устойчивого турнепса (Кит1-Зс15хЕСД04-10).

5. Маркер Tau_cBrCR404 имеет высокую эффективность в дифференциации инбредных линий и гибридов F1 капусты пекинской по идентифицированному гену устойчивости и в маркер-опосредованном беккросировании при интродукции гена устойчивости к киле в капусту белокочанную с использованием В. rapa в качестве донора гена устойчивости.

6. Выявлен новый высокоэффективный ген устойчивости к киле СггА5 генома АА В. rapa (у линии капусты пекинской 20-2сс1-132), отличающийся от других картированных генов. Определено положение гена устойчивости и его маркера Tau_cBrCR404 в группе сцепления А05 генетической карты В. rapa.

7. Использование метода подсчёта числа хлоропластов в ЗКУ позволяет точно и быстро определять плоидность растений капусты пекинской (В. rapa), капусты белокочанной (В. oleráceo), рапса (В. парт), полученных в культуре тканей и клеток. Установлены высокие коэффициенты корреляции между числом хлоропластов в ЗКУ и уровнем плоидности у капусты пекинской (В. rapa) 0,89-

0,94; у капусты белокочанной (В. oleráceo) 0,95-0,99; у рапса {В. napus) 0,92-0,97.

8. Установлено, что число хлоропластов в ЗКУ диплоидных растений капусты пекинской (В. rapa) находится в пределах от 9,5±0,6 шт. до 10,5±2,1 шт., у диплоидных растений рапса — от 16,б±1,2 шт. до 17,2±0,6 шт. Число хлоропластов не является генотип-специфичным признаком у данных культур. У капусты белокочанной (В. oleráceo) число хлоропластов в ЗКУ растений одного уровня плоидности сильно варьируется в зависимости от генотипа. Растения раннеспелых линий содержат большее число хлоропластов, чем позднеспелых.

9. Выявлено отсутствие влияния температуры воздуха при культивировании растений и стадии развития растений на число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц трех видов капустных культур, капусты пекинской (В. rapa), капусты белокочанной (В. oleráceo) и рапса (В. napus).

РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Использовать в качестве исходного материала для селекции на устойчивость к киле линии капусты пекинской 20-2ccl-132, Xa642DH с высокой доминантной моногенной устойчивостью.

2. Использовать маркер Tau_cBrCR404 гена устойчивости к киле (праймеры F: TCATCGATCCAATCCGTAA, R: CACGCAGTTAGAGTATCAAAGG) в маркер-опосредованном отборе при селекции на устойчивость капустных культур.

3. Использовать линии капусты пекинской 22чн1, HCKI-171, Ст4ки41, Кн70, 72-11431, Т52, Чи1, 21ок4, 21-ЗСе1, 20-ЗСе2, (Ха10хЧи4)6262, (Xal 1 хЧи4)6452, (Ха10хЧи4)541, ТПВ1-1(20) для поиска и разработки молекулярных маркеров других генов устойчивости к киле.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Монахос, С.Г. Селекционная ценность генов устойчивости к киле линий Brassica rapa L. и эффективность молекулярных маркеров картированных локусов / С.Г. Монахос, М.Л. Нгуен // Известия ТСХА. - 2013. - Выпуск 6. - С. 68-81.

2. Монахос, С.Г. Селекция капусты пекинской с использованием биотехнологических методов / С.Г. Монахос, М.Л. Нгуен // Картофель и овощи. -2014.-№ 9.-С. 35-36.

3. Монахос С.Г. Связь плоидности с числом хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у диплоидных и амфидиплоидных видов Brassica / С.Г. Монахос, М.Л. Нгуен, A.B. Безбожная, Г.Ф. Монахос // Сельскохозяйственная биология. -2014.-№5.-С. 44-54.

Публикации в научных сборниках и материалах конференций:

1. Нгуен Минь Ли. Определение плоидности капустных растений подсчетом числа хлоропластов замыкающих клеток устьиц / Минь Ли Нгуен // Научная конференции молодых ученных и специалистов, посвященная 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева: Сборник статей. - М.: Издательство РГАУ-МСХА, 2014.-С. 41-42.

2. Нгуен Минь Ли. Маркер-опосредованный отбор (MAS) в селекции на устойчивость на устойчивость к киле у В. rapa / Минь Ли Нгуен // Научная конференции молодых ученных и специалистов, посвещенная 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова: Сборник статей. - М.: Издательство РГАУ-МСХА, 2013.-С. 78-79.

3. Монахос, С.Г. Маркирование гена устойчивости к киле у капусты пекинской / С.Г. Монахос, Нгуен Минь Ли // Капустные овощные культуры. Актуальные вопросы селекции и семеноводства. Современные технологии выращивания: сборник материалов Международной научно-практической конференции, 12-14 октября 2010 г. - Краснодар: Просвещение-Юг, 2012. - С. 4448.

4. Нгуен Минь Ли. Разработка SCAR маркера гена устойчивости к киле у капусты пекинской {Brassica rapa ssp. Pekinensis (Lour.) Hanelt.) / Нгуен Минь Ли, С.Г. Монахос // XI молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва-20И. - С. 35-36.

5. Нгуен Минь Ли. Конвертирование RAPD маркера гена устойчивости к киле у капусты пекинской (Brassica rapa ssp. Pekinensis (Lour.) Rupr.) в SCAR маркер / Нгуен Мннь Ли // XVIII международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученных; 11-15 апреля 2011 г.; Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова: Тезис докладов. - М.: МАКС Пресс, 2011. - С. 83-84.

6. Нгуен Минь Ли. Разработка SCAR маркера гена устойчивости к киле у капусты пекинской (Brassica rapa ssp. pekinensis (Lour.) Rupr.) / Сборник студенческих научных работ. Вып. 17. М.: РГАУ — МСХА имени К.А. Тимирязева, 2011. — С. 58-60.

7. Нгуен Минь Ли. Поиск и разработка молекулярных маркеров генов устойчивости к киле у капус ты пекинской / Нгуен Минь Ли // Сборник докладов III Всероссийской научной практической конференции. Томск, 19-21 мая 2010 года. - Томск: ТПУ, 2010. - С. 308-311.

Отпечатано с готового оргинал-макета

Подписано в печать 15.01.2015г. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,16. Тираж 100 экз. Заказ 15.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул.,44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-14-92